专题11 基因工程（四川专用）-【好题汇编】2025年高考生物二模试题分类汇编

专题11基因工程 考点概览 考点01基因工程的基本工具和操作程序 考点02基因工程综合 基因工程的基本工具和操作程序考点01 1、（2025·四川德阳·二模）科研人员利用TALEN基因编辑技术构建RPE65基因编辑的家犬，建立RPE65基因突变动物模型，TALEN编辑体系主要由特异性的DNA识别域和非特异性的FokI内切核酸酶构成，DNA识别域由多个TALE蛋白连接而成。该系统能对DNA靶序列进行剪切，造成DNA双链断裂，诱导DNA产生修复，从而达到对基因序列进行改造的目的。下列说法错误的是（    ） A．TALE能识别DNA特异位点，发挥靶向作用 B．FokI内切核酸酶作用于DNA的磷酸二酯键 C．可用显微注射的方式将目的基因导入家犬的受精卵 D．受精卵通过有丝分裂形成体积增大的桑葚胚 【答案】D 【知识点】DNA重组技术的基本工具、将目的基因导入受体细胞 【分析】基因工程技术的基本步骤： （1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。 （2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。 （3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法。 （4）目的基因的检测与鉴定：分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA是否插入目的基因--DNA分子杂交技术；②检测目的基因是否转录出了mRNA--分子杂交技术；③检测目的基因是否翻译成蛋白质--抗原-抗体杂交技术。个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。 【详解】A、“TALEN编辑体系主要由特异性的DNA识别域和非特异性的FokI内切核酸酶构成，DNA识别域由多个TALE蛋白连接而成。该系统能对DNA靶序列进行剪切”，这说明TALE确实能识别DNA的特异位点，并发挥靶向作用，A正确； B、FokI内切核酸酶的作用是切割DNA，而DNA的基本结构单元是核苷酸，核苷酸之间是通过磷酸二酯键连接的。所以，当FokI内切核酸酶切割DNA时，它实际上是在切断磷酸二酯键，B正确； C、在基因工程中，将目的基因导入动物细胞（如家犬的受精卵）的常用方法是显微注射，C正确； D、桑葚胚体积没有更大，D错误。 故选D。 2、（2025·四川雅安·二模）科学的方法及正确的操作是生物学实验成功的关键，下列说法正确的是（　　） A．在淀粉和淀粉酶反应体系中加入蛋白酶可加速淀粉水解 B．用模型建构的方法研究DNA的结构和种群数量变化规律 C．可采用五点取样法选取样方调查城市街道上树木的种群密度 D．鉴定DNA时，在溶有DNA的酒精溶液中加入二苯胺试剂后并沸水浴加热 【答案】B 【知识点】酶促反应的因素及实验、种群密度的调查方法及应用、DNA的粗提取及鉴定的方法 【分析】1、样方法适用于调查植物或活动能力弱，活动范围小的动物。 2、酶是由活细胞产生的具有催化作用的有机物，大多数酶是蛋白质，少数酶是RNA；酶的特性：专一性、高效性、作用条件温和；酶促反应的原理：酶能降低化学反应所需的活化能。 【详解】A、蛋白酶会分解淀粉酶（蛋白质），导致淀粉水解速率降低，而非加速，A错误； B、DNA双螺旋结构通过物理模型研究，种群数量变化通过数学模型研究，均属于模型建构方法，B正确； C、城市街道树木呈线形分布，应采用等距取样法，而非五点取样法，C错误； D、DNA鉴定需在NaCl溶液中加入二苯胺试剂并沸水浴，而非酒精溶液，D错误。 故选B。 3、（2025·四川宜宾·二模）如图是将目的基因导入大肠杆菌内制备“基因工程菌”的示意图，其中引物1-4在含有目的基因的DNA上的结合位置如甲图所示，限制酶BamHI、EcoRI、HindIII在质粒上的识别位点如乙图所示。以下叙述错误的是（    ）    A．PCR过程完成4轮循环，理论上至少需加入引物30个 B．过程①中不能同时使用限制酶EcoRI和BamHI切割质粒 C．在氨苄青霉素培养基上生长的大肠杆菌就是此过程制备的工程菌 D．若已经合成了图甲所示4种引物，应选择引物1和4扩增目的基因 【答案】C 【知识点】PCR扩增的原理与过程、基因表达载体的构建 【分析】基因工程技术的基本步骤：（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法。（4）目的基因的检测与鉴定：分子水平上的检测。 【详解】A、PCR 技术大量扩增目的基因时，新合成的子链上都有一个引物，原模板链不含有引物，故缓冲液中需要加入的引物个数计算公式为2n+1-2，因此PCR过程完成4轮循环，理论上至少需加入引物24+1-2=30个，A正确； B、①是基因表达载体的构建过程；若使用EcoRⅠ切割质粒会将目的基因掐入启动子上游，目的基因不能正确表达；使用HamdⅢ切割质粒将破坏标记基因，不利于目的基因的鉴定和筛选，因此该过程中应使用限制酶 BamHⅠ切割质粒，B正确； C、在氨苄青霉素培养基上生长的大肠杆菌不一定是此过程制备的工程菌，也可能是没有导入目的基因的质粒，C错误； D、由于DNA聚合酶只能从5′→3′延伸子链，从引物的3′开始连接脱氧核苷酸，因此扩增目的基因时应选择引物1和4，D正确。 故选C。 4、（2025·四川成都石室中学·二模）将马铃薯胰蛋白酶抑制剂基因Pin-Ⅱ导入杨树细胞，培育抗虫杨树。如图表示利用含目的基因的DNA分子和Ti质粒构建基因表达载体的过程，图中表示氨苄青霉素抗性基因，表示新霉素抗性基因，箭头表示限制酶的酶切位点，相关酶的识别序列如表所示。下列叙述正确的是（    ） A．利用PCR扩增目的基因时，应该选择引物2和引物3并在引物3'端添加相应酶切位点 B．为使目的基因与质粒高效重组，选用KpnⅠ和HindⅢ比选用KpnⅠ和SmaⅠ效果更好 C．为将表达载体导入农杆菌，可以使用离心法或PEG融合法处理受体细胞 D．成功导入目的基因的杨树细胞既具有氨苄青霉素抗性，又有新霉素抗性 【答案】B 【知识点】PCR扩增的原理与过程、基因表达载体的构建、将目的基因导入受体细胞、目的基因的检测与鉴定 【分析】基因工程包括四个基本程序：目的基因的筛选与获取、基因表达载体的构建、将目的基因导入受体细 胞、目的基因的检测与鉴定。 【详解】A、DNA聚合酶只能从引物的3'端开始连接脱氧核苷酸，利用PCR扩增目的基因时，应该选择引物2和引物3，但应该在引物5'端添加相应酶切位点，A错误； B、为使目的基因与质粒高效重组，选用KpnⅠ和HindⅢ比选用KpnⅠ和SmaⅠ效果更好，因为SmaI切割DNA后形成平末端，T4DNA连接酶连接平末端的效率相对较低，B正确； C、为将表达载体导入农杆菌，可以使用Ca2+处理受体细胞，使其处于能吸收周围环境中DNA分子的状态，然后再将重组质粒导入其中；而离心法或PEG融合法是诱导植物细胞融合的方法，C错误； D、只有T-DNA区段会导入植物受体细胞，因此氨苄青霉素抗性基因不会导入植物受体细胞中，即成功导入目的基因的杨树细胞只能表现出新霉素抗性，D错误。 故选B。 5、（四川省宜宾市第三中学·二模）红细胞生成素（EPO）是体内促进红细胞生成的一种激素物质，是当今最成功的基因工程药物，可用于治疗肾衰性贫血等疾病。由于天然EPO来源极为有限，目前临床使用的红细胞生成素主要来自基因工程技术生产的重组人红细胞生成素（rhEPO）。其简要生产流程如图，下列相关叙述正确的是（    ） A．过程①用到的工具酶有DNA聚合酶、限制酶和DNA连接酶 B．构建的重组表达载体中终止子的作用是终止翻译过程 C．检测重组细胞是否转录出EPO的mRNA常用分子杂交技术 D．用乳腺生物反应器生产EPO可将人EPO基因导入哺乳动物体细胞获得 【答案】C 【知识点】基因表达载体的构建、目的基因的检测与鉴定 【分析】分析题图：图中①表示基因表达载体的构建，②表示将目的基因导入受体细胞。 【详解】A、过程①用到的工具酶有限制酶（切割目的基因和运载体）和DNA连接酶（连接切割后的目的基因和运载体），A错误； B、构建的重组表达载体中终止子的作用是终止转录，B错误； C、检测重组细胞是否转录出EPO的mRNA常用分子杂交技术，若出现DNA-RNA杂交带，则证明转录成功，C正确； D、用乳腺生物反应器生产EPO，先将人EPO基因与乳腺蛋白基因启动子等调控组件重组在一起，再导入哺乳动物的受精卵，D错误。 故选C。 6、（四川省乐山第一中学 二模）实验结果产物能成功检出用阳性（+）表示，无法检出用阴性（一）表示。假阳性是指检查结果是阳性，但实际是阴性；假阴性则与之相反。某流感患者进行甲型病毒检测，下列可导致假阳性结果的是（    ） A．抗原检测—单克隆抗体保存温度过高 B．抗体检测—患者半年内接种过甲流疫苗 C．核酸检测—PCR扩增时变性温度设置过低 D．核酸检测—病毒发生变异与RCR引物不匹配 【答案】B 【知识点】PCR扩增的原理与过程、动物细胞融合与单克隆抗体的制备、蛋白质的变性、疫苗 【分析】甲型病毒检测的方法主要有抗原检测、抗体检测以及核酸检测。 【详解】A、单抗隆抗体的化学本质是蛋白质，若保存温度过高可能导致单克隆抗体的空间结构改变，无法检测出抗原，抗原检测结果为阴性，A错误； B、患者半年内接种过甲流疫苗，体内存在甲流病毒对应的抗体，通过抗体检测结果为阳性，但实际该个体没有感染甲流病毒，实际为阴性，导致假阳性结果，B正确； C、PCR扩增时变性温度设置过低，导致DNA不能解旋形成单链，无法扩增出病毒的核酸，核酸检测结果为阴性，C错误； D、病毒发生变异与RCR引物不匹配，导致无法扩增出病毒对应的核酸，核酸检测结果为阴性，D错误。 故选B。 7、（2025·四川达州·二模）为了提升猪瘟病毒疫苗的效果，科研人员构建了猪瘟病毒p30蛋白基因（p30）与白喉毒素无毒突变基因（CRM197A）的融合基因表达质粒，以生产融合蛋白疫苗。图1为质粒构建、疫苗生产以及效果测试示意图。请回答下列问题： (1)完成图1的过程②需要向反应体系中加入 酶。利用PCR技术扩增p30-CRM197A融合基因时，需要向反应体系中添加的引物是 （选填图中的F1~F4）。 (2)选用大肠杆菌作为受体细胞时，一般先用 处理大肠杆菌，使其处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态。图1中培养导入重组质粒的大肠杆菌时，采用的接种方法是 。 (3)筛选时，科研人员挑选了5个菌落，提取质粒后加入BamHI、HindⅢ酶切、电泳，结果如图2： ①可初步判断 号菌落的质粒中含有p30-CRM197A融合基因。 ②p30基因和CRM197A基因 （填“含”或“不含”）BamHI和HindⅢ酶切位点，理由是 。 (4)科研人员在检测上述菌落时发现某个菌落同时含有空载质粒和融合基因表达质粒，出现此现象的可能原因有： ①有些大肠杆菌同时导入了空载质粒和融合基因表达质粒： ②导入空载质粒的大肠杆菌和导入触合基因表达质粒的大肠杆菌在接种时未分散开，导致 。 (5)为检测融合蛋白疫苗的效果，科研人员将p30蛋白、p30-CRM197A融合蛋白分别注入小鼠体内，一段时间后检测抗体含量，结果如图3所示。据此可判定融合蛋白疫苗效果更好，依据是 。 【答案】(1) DNA聚合酶 F1、F4 (2) Ca2+ 稀释涂布平板法 (3) 2、4 不含 2和4中只有两个条带（或若含有酶切位点，2和4中条带数应多于两条） (4)某个菌落中同时含有空载质粒和融合基因表达质粒 (5)（诱发机体）短时间内产生更多抗体（或作用效果快），长时间维持较高水平抗体（或持续时间长） 【知识点】微生物的接种方法、PCR扩增的原理与过程、将目的基因导入受体细胞、目的基因的检测与鉴定 【分析】基因工程技术的基本步骤： （1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。 （2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。 （3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。 （4）目的基因的检测与鉴定。 【详解】（1）由图可知，图1中②过程，为DNA分子子链延伸过程，所需酶为DNA聚合酶。利用PCR技术扩增p30-CRM197A融合基因时，需选用的引物是F1和F4。 （2）选用大肠杆菌作为受体细胞时，一般先用Ca2+处理大肠杆菌，使其处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态。由图可知，图1中培养导入重组质粒的大肠杆菌时的接种方法是稀释涂布平板法。 （3）①由图1可知，构建成功的融合基因表达质粒经BamHI、Hind Ⅲ酶切含600+500+25=1125个碱基对，结合图2可知，2、4号菌落含有构建成功的融合基因表达质粒。 ②由于2和4中只有两个条带（大的一个条带为志林5900个碱基对的条带，小的一个条带为目的基因的1125个碱基对的条带），所以p30和CRM197A基因不含 BamHI、Hind Ⅲ酶切位点，若含有酶切位点，2和4中条带数应多于两条。 （4）某由图1可知，上述菌落是经稀释涂布平板法获得的，可能在涂布平板时含有不同质粒的细菌未分开，形成一个菌落，导致某个菌落中同时含有空载质粒和融合基因表达质粒。 （5）由图3可知，p30-CRM197A融合蛋白注入小鼠体内后，产生抗体快，维持高抗体量时间长，说明其作为疫苗效果较p30蛋白更好。 8、（2025·四川广安·二模）干旱胁迫是限制作物产量和品质的一个重要影响因素。科研人员通过转基因技术将大肠杆菌的耐旱基因（mtlD）整合进玉米基因组，增强了玉米的抗旱性。据图回答问题。 限制酶 识别序列及切割位点（5'→3'） BamHI G↓GATCC BclI T↓GATCA SmaI CCC↓GGG (1)可采用PCR技术扩增目的基因，PCR扩增的原理是 。在反应体系中除加入模板、dNTP、含Mg2+的缓冲液外，还需要加入 。 (2)为了保证mtlD基因正确连接到质粒中以构建重组质粒，在设计mtlD基因的引物时，应在两种引物的5'端分别添加 限制酶的识别序列，请据此设计转录模板链的引物5'- -3'（含12个碱基序列）。酶切后的目的基因片段和质粒通过 （填“EcoliDNA连接酶”、“T4DNA连接酶”或“E-coliDNA连接酶或T4DNA连接酶”）进行连接。 (3)为检测mtlD基因是否成功插入质粒中，研究人员从受体菌中提取质粒，使用SmaI和 进行双酶切，通过电泳检测酶切结果，若电泳结果出现 个条带，则说明插入成功。 (4)从个体水平上检测耐旱基因是否在玉米体内正常表达，请写出鉴定方法 。 【答案】(1) DNA的半保留复制 引物和耐高温DNA聚合酶（TaqDNA聚合酶） (2) BamHI和SmaI GGATCCATCTAC T4DNA连接酶 (3) BamHI 2 (4)将玉米栽种在干旱的环境中 【知识点】PCR扩增的原理与过程、基因工程的操作程序综合 【分析】PCR反应过程：变性一复性→延伸。变性：当温度上升到90C以上时，双链DNA解聚为单链，复性：温度下降到50℃左右，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合，延伸：72℃左右时，Taq酶有最大活性，可使DNA新链由5'端向3’端延伸。 【详解】（1）PCR扩增的原理是DNA的半保留复制原理，在PCR反应体系中，除加入模板、dNTP（脱氧核苷酸）、含Mg²⁺的缓冲液外，还需要加入引物（为DNA聚合酶提供合成的起始位点）和Taq酶（耐高温DNA聚合酶，能在高温下催化DNA合成） （2）为将图中质粒和mt1D基因正确连接构建重组质粒，设计mt1D基因的引物时，由于目的基因中间有BclⅠ的识别序列，因此不能在引物中设计该序列，而只能选择与该引物能产生相同黏性末端的引物BamHI，即需要在两种引物的5'端分别添加BamHI、SmaⅠ酶的识别序列， 所以在设计mtlD基因的引物的5'端应添加BamHI限制酶的识别序列G↓GATCC ，由于要扩增的是mtlD基因（耐旱基因），转录模板链的引物5'-GGATCCATCTAC-3'，酶切后的目的基因片段和质粒通过T4DNA连接酶进行连接。因为EcoliDNA连接酶只能连接黏性末端，T4DNA连接酶既能连接黏性末端，又能连接平末端。 （3）结合小问2可知，研究人员从受体菌中提取质粒，使用SmaI和BamHI进行双酶切，通过电泳检测酶切结果，若电泳结果出现2个条带，目的基因片段、剩余的质粒大片段，则说明插入成功。 （4）从个体水平上检测耐旱基因是否在玉米体内正常表达，可以将玉米栽种在干旱的环境中，看玉米能否正常生长。 9、（2025·四川成都·二模）相分离是蛋白质具有的一种物理特性，是驱动细胞内各类无膜凝聚体形成的重要机制。研究人员将未知蛋白与不具有相分离特性的Cry2蛋白相连，如果未知蛋白具有相分离特性，则在蓝光照射下会发生凝聚，从而开发出检测蛋白是否有相分离特性的工具。FUS蛋白作为经典的相分离蛋白，经常用作实验对照。为了探究X蛋白是否具备相分离特性，科学家需要构建能同时表达Cry2蛋白和X蛋白的重组质粒，质粒中LacZ基因编码产生的β—半乳糖苷酶可以分解X—gal产生蓝色物质，使菌落呈现蓝色，否则菌落为白色。图1表示质粒的结构，图2表示含有目的基因的DNA片段，其中P1、P2、P3表示引物，其余箭头处表示相关限制酶的识别位点。回答下列问题：    (1)构建重组质粒的过程中需要用到E．coli DNA连接酶，该酶的作用是将具有 的DNA片段连接起来。据图1分析，应选用四种限制酶中的 和 切割质粒，以保证目的基因插入后能够正常表达出Cry2蛋白和X蛋白。 (2)已知X蛋白基因转录得到的mRNA前三个碱基为起始密码子AUG。研究发现在紧邻起始密码子AUG之前加入序列，会显著提高基因的表达效率。利用PCR技术获取X蛋白基因时，为保证X蛋白基因能正确插入载体并高效表达，除选择引物P1外，还需要选择引物 （填“P2”或“P3”），并在该引物5端增加碱基序列5´- -3´ (3)通过琼脂糖凝胶电泳可将不同的DNA片段区分开来，该技术所依据的原理是 。对PCR产物进行电泳检测，结果显示除X蛋白基因条带外，还有多条非特异性条带（引物和模板不完全配对导致）。为减少非特异性条带的产生，可适当 （填“提高”或“降低”）PCR中复性过程的温度。 (4)为筛选出成功导入重组质粒的目标菌，需要将重组质粒与经处理的大肠杆菌混匀，再将大肠杆菌接种到含有四环素和X-gal的培养基上。培养一段时间后，培养基中颜色为 的菌落为目标菌落，原因是 。 (5)为了确认X蛋白的相分离特性，还可以构建两种重组质粒作为对照，对照组质粒与实验组质粒相比，所含基因的差异分别是 、 。 【答案】(1) 互补黏性末端 MunⅠ XhoⅠ (2) P2 GAATTCGCCACC (3) 不同DNA分子的大小和构象不同，在凝胶中的迁移速率不同 提高 (4) 白色 重组质粒中不含LacZ基因，不能编码产生的β-半乳糖苷酶，不能分解X-gal产生蓝色物质 (5) 不含X蛋白基因 用FUS蛋白基因替换X蛋白基因 【知识点】PCR扩增的原理与过程、基因表达载体的构建、目的基因的检测与鉴定、电泳鉴定 【分析】PCR是聚合酶链式反应的简称，指在引物指导下由酶催化的对特定模板(克隆或基因组DNA)的扩增反应，是模拟体内DNA复制过程，在体外特异性扩增DNA片段的一种技术。 【详解】（1）E．coli DNA连接酶只能连接黏性末端，则其作用是将具有互补黏性末端的DNA片段连接起来；据图可知，EcoRI能将CadR切掉，不能选用，SalI位于终止子外，也不能选用，故只能选用MunI和XhoⅠ切割质粒，产生不同的黏性末端，以保证目的基因插入后能够正常表达出Cry2蛋白和X蛋白。 （2）根据图中X蛋白基因的编码链的方向及质粒中启动子方向可知，需要将编码链的5′端靠近启动子，由于X蛋白基因中含有Munl的酶切位点，所以不能用Munl进行切割，但是EcoRI与Mun l切割产生的黏性末端相同，所以可以在设计引物的时候添加EcoRI的识别序列（-GAATTC-），同时也不能选用含有SalI识别序列的引物，所以还需要选择引物P2，并在其5'端增加碱基序列5'GAATTCGCCACC-3'。 （3）不同DNA分子的大小和构象不同，在凝胶中的迁移速率不同，所以可以通过琼脂糖凝胶电泳可将不同的DNA片段区分开来；可适当提高PCR中复性过程的温度，可减少引物和模板不完全配对现象，从而减少非特异性条带的产生。 （4）分析题意可知，LacZ基因编码产生的β-半乳糖苷酶可以分解X-gal产生蓝色物质，使菌落呈现蓝色，重组质粒中导入了目的基因，则重组质粒中不含LacZ基因，不能编码产生的β-半乳糖苷酶，不能分解X-gal产生蓝色物质，培养一段时间后，培养基中颜色为白色的菌落为目标菌落。 （5）由题意可知，对照组质粒与实验组质粒相比，不含有X蛋白基因，此外FUS蛋白作为经典的相分离蛋白，经常用作实验对照，故为了确认X蛋白的相分离特性，还可以构建两种重组质粒作为对照，对照组质粒与实验组质粒相比，所含基因的差异分别是不含X蛋白基因、用FUS蛋白基因替换X蛋白基因。 10、（2025·四川雅安·二模）CRISPR-Cas9是一种源自细菌抵御噬菌体的基因组编辑技术。CRISPR是细菌基因组中的一段特殊DNA序列，Cas9是一种能够切割DNA双链的核酸内切酶。在基因编辑过程中，通过引导RNA（sgRNA）将Cas9引导到目标DNA序列位置，然后Cas9对目标DNA进行切割。为研究AtTPST基因在拟南芥中的功能及其对植株发育的影响，科研人员利用CRISPR-Cas9基因组编辑技术构建敲除载体，通过农杆菌转化法将敲除载体转入拟南芥中，获得靶基因敲除的株系。 (1)利用CRISPR-Cas9技术敲除AtTPST基因的核心工作是 ，该过程需要用到的工具酶有 。 (2)CRISPR-Cas9基因组编辑技术中，科研人员是依据 的部分序列来设计sgRNA。现已知某sgRNA的局部序列为5'-UCCAGAAUC-3'，则其识别序列为 。 (3)科研人员将Cas9基因和sgRNA基因插入到Ti质粒的 区域，目的是 。 (4)CRISPR-Cas9基因组编辑技术在定点编辑基因时存在一个大的弊端，有很大概率会造成一些非目的基因序列的错误剪接和编辑，请分析其原因可能是 。 (5)结合Cas9的蛋白结构，科学家们通过一系列的点突变实验，发现同时突变Cas9的第10位和第840位氨基酸，可以完全破坏Cas9的核酸酶功能不影响Cas9识别sgRNA-DNA复合体的功能，这个cas9被称为dCas9。据图分析，当dCas9—sgRNA复合物结合到DNA的目标位点后，会使转录被阻断的原因是 。    【答案】(1) 基因表达载体的构建 限制酶和DNA连接酶 (2) 目标DNA 5'-GATTCTGGA-3' (3) T-DNA Ti质粒上的T-DNA能转移到被侵染的细胞，并且将其整合到该细胞的染色体DNA上 (4)sgRNA越短，特异性越弱（其他DNA序列也含有互补的序列），造成sgRNA错误结合而出现脱靶现象 (5)dCas9-sgRNA复合物，阻止了RNA聚合酶（RNAP）与目标DNA的结合或移动，进而起到抑制转录的作用 【知识点】基因编辑技术、将目的基因导入受体细胞、基因表达载体的构建、DNA重组技术的基本工具 【分析】基因工程技术的基本步骤包括目的基因的获取；基因表达载体的构建；将目的基因导入受体细胞；目的基因的检测与鉴定。 【详解】（1）利用CRISPR-Cas9技术敲除AtTPST基因，核心工作是基因表达载体的构建（将Cas9基因、sgRNA基因与相关调控元件构建成基因表达载体 ）。因为只有构建好合适的基因表达载体，才能使Cas9基因和sgRNA基因在受体细胞中稳定表达并发挥作用，引导Cas9对目标基因AtTPST进行切割，构建基因表达载体过程需要用到的工具酶有限制酶和DNA连接酶。限制酶用于切割载体和目的基因，以便获得相同的黏性末端或平末端，DNA连接酶用于将切割后的载体和目的基因连接起来，形成重组DNA分子。 （2）科研人员是依据目标DNA 的部分序列来设计sgRNA，因为sgRNA的作用是引导Cas9到目标DNA序列位置进行切割。已知sgRNA的局部序列为5'-UCCAGAAUC-3'，由于RNA与DNA碱基互补配对（A与T配对，U与A配对，C与G配对 ），所以其识别的DNA序列为5'-GATTCTGGA-3'。 （3）科研人员将Cas9基因和sgRNA基因插入到Ti质粒的T-DNA区域，目的是利用农杆菌的转化作用，使Cas9基因和sgRNA基因整合到拟南芥细胞的染色体DNA上 ，因为Ti质粒上的T-DNA能转移到被侵染的细胞，并且将其整合到该细胞的染色体DNA上。 （4）CRISPR-Cas9基因组编辑技术在定点编辑基因时存在非目的基因序列错误剪接和编辑的原因可能是sgRNA越短，特异性越弱（其他DNA序列也含有互补的序列），造成sgRNA错误结合而出现脱靶现象，进而造成非目的基因序列的错误剪接和编辑 。 （5）当dCas9-sgRNA复合物结合到DNA的目标位点后，会使转录被阻断的原因是dCas9-sgRNA复合物结合到DNA目标位点后，占据了RNA聚合酶的结合位点（或阻止了RNA聚合酶（RNAP）与目标DNA的结合或移动 ），使得RNA聚合酶无法启动转录过程，从而阻断了转录 。 11、（2025届四川省攀枝花三中 二模）PCR技术是一种用于放大扩增特定的DNA片段的分子生物学技术，其最大的特点是能将微量的DNA大幅增加。 I.如果已知一小段DNA的序列，可采用PCR的方法，简捷地分析出已知序列两侧的序列，具体流程如图1（以EcoRI酶切为例）所示。 (1)步骤Ⅱ中所用的DNA连接酶的作用是催化形成 ，从而形成环状DNA。 (2)步骤Ⅲ中的复性温度设定是成败的关键，温度过高会破坏 的碱基配对。 (3)若下表所列为已知的DNA序列和设计的一些PCR引物，步骤Ⅲ选用的PCR引物必须是 （填数字“①、②、③、④”）。 DNA序列（虚线处省略了部分核苷酸序列） 已知序列 PCR引物 ①5′-AACTATGCGCTCATGA-3′  ②5′-AGAGGCTACGCATTGC-3′ ③5′-GCAATGCGTAGCCTCT-3′  ④5′-TCATGAGCGCATAGTT-3′ (4)新冠病毒核酸定性检测原理：先以病毒RNA为模板利用 酶合成cDNA，再通过PCR技术扩增相应的DNA片段，然后在扩增产物中加入特异的核酸探针。如果检测到特异的杂交分子则核酸检测为阳性。此方法为RT-PCR技术。 (5)如果探针是带有荧光标记的，即为“实时荧光RT-PCR技术”。在PCR反应体系中，加入的荧光探针与模板DNA的某条链互补结合，探针完整时，报告荧光基团发射的荧光信号被淬灭荧光基团吸收。当子链延伸至探针处，探针被TaqDNA聚合酶降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而发出荧光（如图2所示）。即每扩增1个DNA分子，就有1个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。 ①若最初该反应体系中只有1个DNA分子模板，进行第4次循环时，需要消耗荧光探针 个。 ②检测时，荧光强度一般要达到或超过阈值才能确诊。若检测出现假阴性，推测可能的一个原因 。 【答案】(1)磷酸二酯键 (2)引物与模板链 (3)③④ (4)逆转录酶（反转录酶） (5) 8 通过咽拭子取样不规范或取样所获样本量不足或在样本运输、检测中出现了损坏和污染或病毒相应关键序列发生了基因突变 【知识点】新型冠状病毒及相关、DNA重组技术的基本工具、PCR扩增的原理与过程 【分析】PCR技术的原理是细胞内DNA复制，需要模板、原料、能量、酶、引物等条件。PCR一般要经历三十多次循环，每次循环可以分为变性、复性、延伸三步。从第二轮循环开始，上一次循环的产物也作为模板参与反应。引物是一小段DNA或RNA，它能与DNA母链的一段碱基序列互补配对。 【详解】（1）相邻核苷酸之间的作用键为磷酸二酯键，DNA连接酶的作用是催化形成磷酸二酯键。 （2）复性时是打开的模板DNA单链与引物碱基互补配对，若温度过高，会使碱基间的氢键断裂。 （3）引物是根据目的基因的一段核苷酸序列合成的，且与模板 DNA 链根据碱基互补配对合成，引物和 DNA 模板链的3′ 端根据碱基互补配对原则连接，扩增的不是已知序列，而是未知序列，引物应与模板链的5'端结合，应选择的引物是③④。 （4）以RNA为模板合成DNA是逆转录过程，需要逆转录酶催化。 （5）根据题干信息可知，“荧光信号的累积与PCR产物数量完全同步”，因此计算时需要去除原来亲代的DNA分子，因此若最初该反应体系中只有一个病毒DNA分子，进行第4次循环时，形成了23=8个DNA分子，则进行第4次循环时，需要消耗荧光探针8个。检测出现假阴性，是由于荧光强度没有达到阈值，可能的原因是通过咽拭子取样不规范或取样所获样本量不足或在样本运输、检测中出现了损坏和污染或病毒相应关键序列发生了基因突变。 【点睛】通过PCR技术流程考查PCR过程的理解。通过实时荧光RT-PCR技术，考查信息提取能力、PCR过程、假阴性现象分析能力。 基因工程综合考点02 1、（2025·四川德阳·二模）为了培育既抗除草剂（草甘膦），又抗冻的烟草植株，科学家将抗草甘膦基因（Aro基因，存在EcoRI酶切位点）和抗冻基因（Cor基因，存在Bell酶切位点）采用融合PCR技术（原理如下图所示）连接起来构建为Aro-Cor融合基因并进行了扩增，再将融合基因导入烟草细胞培育既抗除草剂又抗冻的转基因烟草，过程如下。请分析回答：    (1)在将Aro基因和Cor基因融合的过程中，起到搭桥作用的引物2和引物3的碱基序列 （填“相同”或“不相同”），变性后形成的杂交分子在补齐为双链等长的融合基因时的延伸过程，不需要添加引物，其原因是 。为保证构建的Aro-Cor融合基因能正确插入载体中，应该分别在引物1和引物4侧连接 的限制酶识别序列。 (2)上述培育转基因烟草过程中将目的基因导入烟草细胞采用的方法是 ，将农杆菌和烟草细胞按比例充分混匀，3天后转入含有潮霉素而不是四环素抗性基因的选择培养基筛选抗性愈伤组织，原因是 。 (3)植物激素是植物体内产生，能从产生部位运送到作用部位，对植物的 的微量有机物。在培育转基因烟草植株的过程中，培养基中添加的生长素和细胞分裂素会影响植物细胞的发育方向，据此分析，在初次进行实验时，可以尝试调整生长素和细胞分裂素的 来观察其对细胞发育的影响。 【答案】(1) 不相同 两条母链均存在端，使DNA聚合酶能从母链的端开始连接脱氧核苷酸 BamHⅠ和MunⅠ (2) 农杆菌转化法 潮霉素抗性基因随农杆菌的T-DNA进入并整合到植物细胞的染色体DNA上，所以只有选择潮霉素筛选抗性愈伤组织才能筛出成功导入目的基因的植物细胞 (3) 生长发育有显著影响 浓度和比例 【知识点】其他植物激素的产生、分布和功能、植物组织培养技术综合、基因工程的操作程序综合 【分析】PCR原理：在高温作用下，打开DNA双链，每条DNA单链作为母链，以4种游离脱氧核苷酸为原料，合成子链，在引物作用下，DNA聚合酶从引物3'端开始延伸DNA链，即DNA的合成方向是从子链的5'端向3'端延伸的。实际上就是在体外模拟细胞内DNA的复制过程。DNA的复制需要引物，其主要原因是DNA聚合酶只能从3′端延伸DNA链。 【详解】（1）在将Aro基因和Cor基因融合的过程中，起到搭桥作用的引物2和引物3的碱基序列不相同。因为引物2要结合Aro基因的特定序列，引物3要结合Cor基因的特定序列，它们的结合位点不同，所以碱基序列不同。 变性后形成的杂交分子在补齐为双链等长的融合基因时的延伸过程，不需要添加引物，其原因是融合基因的两端序列是已知的，可以根据已知序列合成与两端互补的引物，在第一次延伸反应后产生的新的DNA链两端就可以作为后续延伸反应的模板，不需要额外添加引物，即两条母链均存在端，使DNA聚合酶能从母链的端开始连接脱氧核苷酸 为保证构建的Aro-Cor融合基因能正确插入载体中，由图可以看出，Aro-Cor融合基因两端有EcoR Bcl I,为保证构建的Aro-Cor融合基因能正确插入载体中，应该分别在引物1和引物4侧连接,引物1一端应该链接BamHⅠ，引物4一端应该链接MunⅠ。 （2）图中将目的基因导入烟草细胞采用的方法是农杆菌转化法，转入含有潮霉素而不是四环素抗性基因的选择培养基筛选抗性愈伤组织，原因是潮霉素抗性基因随农杆菌的T-DNA进入并整合到植物细胞的染色体DNA上，所以只有选择潮霉素筛选抗性愈伤组织才能筛出成功导入目的基因的植物细胞 （3）植物激素是植物体内产生，能从产生部位运送到作用部位，对植物的生长发育有显著影响的微量有机物。 在培育转基因烟草植株的过程中，培养基中添加的生长素和细胞分裂素会影响植物细胞的发育方向，据此分析，在初次进行实验时，可以尝试调整生长素和细胞分裂素的浓度或比例来观察其对细胞发育的影响。 2、（2025·四川南充·二模）水孔蛋白作为细胞水分跨膜运输的主要通道蛋白，参与植物的生长及逆境适应过程。为研究天山雪莲水孔蛋白基因（S基因）在低温适应过程中的作用机制，研究人员利用基因工程将S基因导入番茄细胞获得转基因番茄。请回答下列问题：    (1)研究人员设计了携带限制酶位点的特异性引物P1和P2。在PCR时，引物P2将与S基因 （填“A链”或“B链”）的3'端结合；若经过5次循环，得到同时含有引物P1和P2的DNA有 个。 (2)构建重组质粒时，不能用限制酶EcoR I切割大肠杆菌质粒，原因是 ；切割后再用DNA连接酶将具有相同 的S基因和质粒切口连接起来。 (3)通过农杆菌转化法将目的基因导入番茄细胞，在愈伤组织阶段取部分细胞提取总DNA进行PCR和凝胶电泳，此操作的目的是 。 (4)研究人员将转基因番茄和野生型番茄分别放置在0℃和25℃的培养箱中处理8h，结束后采样测定抗逆生理指标（结果见下图2）。据此推测S基因表达显著提高番茄抗寒性的机制是 。    注：丙二醛为植物在遭受逆境下发生膜脂过氧化的产物 【答案】(1) A链 30 ×模板DNA分子数 (2) 用限制酶EcoRI切割会破坏标记基因 黏性末端 (3)从分子水平上检测S基因是否导入到番茄细胞中(或是否插入番茄的染色体上) (4)S基因可通过促进可溶性蛋白、可溶性糖等物质积累，使细胞中结合水比例增加，同时降低膜脂过氧化程度，来提高番茄的抗寒性 【知识点】PCR扩增的原理与过程、基因表达载体的构建、目的基因的检测与鉴定、电泳鉴定 【分析】基因工程的工具： （1）限制酶：能够识别双链DNA分子的某种特定核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断裂。 （2）DNA连接酶：连接的是两个核苷酸之间的磷酸二酯键。 （3）运载体：常用的运载体：质粒、噬菌体的衍生物、动植物病毒。在构建重组质粒时，必须使用限制性核酸内切酶（限制酶）切割质粒使其具有与目的基因相同的黏性末端，之后再用DNA连接酶将目的基因和质粒连接成重组质粒。 【详解】（1）据图1可知，质粒要与S基因构建表达载体，则要用限制酶Sal I、BamH I处理，使用EcoRⅠ会破坏标记基因。S基因的转录方向由右向左，则A链为转录的模板，由此可知，A链的3'端连接在启动子端。据图1可知，引物P2的5'端具有Sal I的识别序列，故引物P2将与S基因A链的3'端结合。假设模板DNA有A个，则A个DNA经5次PCR循环，共获得A25=32A个DNA，其中含有起始DNA链的DNA分子不符合题干条件，故同时含有引物P1和P2的DNA有32A-2A=30A个，即30 ×模板DNA分子数。 （2）据图1可知，用限制酶EcoRI切割会破坏标记基因，故构建重组质粒时，不能用限制酶EcoR I切割大肠杆菌质粒。DNA连接酶能连接具有相同黏性末端的DNA片段，故切割后再用DNA连接酶将具有相同黏性末端的S基因和质粒切口连接起来。 （3）PCR过程在PCR扩增仪中自动完成，完成以后，常采用琼脂糖凝胶电泳来鉴定PCR的产物。故在愈伤组织阶段取部分细胞提取总DNA进行PCR和凝胶电泳，此操作的目的是从分子水平上检测S基因是否导入到番茄细胞中(或是否插入番茄的染色体上)。 （4）依题意，丙二醛为植物在遭受逆境下发生膜脂过氧化的产物，据图2可知，野生型株系在低温下丙二醛含量明显升高，转基因株系在低温下丙二醛含量没有明显升高。可知低温会使细胞发生膜脂过氧化。据图2可知，低温条件下，野生型的株系的可溶性蛋白质和可溶性糖含量都降低，转基因株系的可溶性蛋白质和可溶性糖含量都升高，据此推测S基因表达显著提高番茄抗寒性的机制是：S基因可通过促进可溶性蛋白、可溶性糖等物质积累，使细胞中结合水比例增加，同时降低膜脂过氧化程度，来提高番茄的抗寒性。 3、（2025·四川绵阳·二模）CRISPR/Cas9基因编辑技术已被广泛应用于基因治疗等领域。其基本工具sgRNA/Cas9来源于原核细胞，包括具有导向功能的sgRNA和行使DNA双链切割功能的Cas9蛋白，技术原理如图甲所示。回答下列问题： I.某研究团队以人乳腺癌MDA-MB-231细胞、Lenti-CAS9-sgRNA质粒等为材料，进行原位定点敲除乳腺癌细胞中的人源粘着斑蛋白（VCL）基因，以研究该基因在细胞中的作用，为乳腺癌的治疗提供理论支持。 (1)获取目的基因。经过改造的质粒已经插入了Cas9蛋白基因如图乙，故只需要根据 基因的部分序列人工合成sgRNA基因即可。 (2)构建表达载体。人工合成的sgRNA基因如图丙，需要通过 扩增，为了确保酶切后能正确连接到质粒上（相应酶切序列如图丙），需在引物1的5'端加上碱基序列 ，引物2的5'端加上碱基序列 。 (3)导入受体细胞。利用慢病毒将包含SgRNA基因的重组质粒及相应对照质粒（空质粒）分别转入不同的乳腺癌MDA-MB-231细胞。感染后用 筛选稳转细胞系。设计转入空质粒的乳腺癌细胞的目的是 。 (4)检测与鉴定。获得稳转细胞系，培养3d后收集细胞全部蛋白检测VCL，结果如图丁，显示敲除成功。检测特定蛋白质的原理是 。 Ⅱ、其他应用 (5)敲入目的基因与个体化治疗。通过同源重组修复可插入外源目的基因。正确的操作是：导入基因编辑工具表达载体的同时，导入外源目的基因，且在目的基因两端加上与 相同的序列。 (6)对基因或染色体定位跟踪。将Cas9基因改造成Cas9i基因（表达的Cas9i蛋白丧失切割功能），并与绿色荧光蛋白（GFP）基因融合，表达载体构建关键部分为：—启动子—Cas9i基因—GFP基因—终止子—，最终表达成融合蛋白Cas9i-GFP，利用SgRNA/Cas9i-GFP荧光跟踪特定基因在细胞中的分布。改造Cas9基因的技术属于 （填“基因工程”“蛋白质工程”“酶工程”）。 (7)调控基因表达。转录因子M如果结合到基因上游的调控序列，就会招募转录元件聚集以促进下游基因转录。要通过sgRNA/Cas9i工具促进乳腺癌细胞中的X基因表达，表达载体构建关键部分为： 。 【答案】(1)人源粘着斑蛋白（VCL） (2) PCR 5'AGATCT3' 5'GCTAGC3' (3) 卡拉霉素和潮霉素 在检测敲除效果时作对照 (4)抗原抗体特异结合 (5)Cas9切点两侧碱基序列 (6)蛋白工程 (7)—启动子—Cas9i基因—M基因—终止子— 【知识点】PCR扩增的原理与过程、基因表达载体的构建、将目的基因导入受体细胞、目的基因的检测与鉴定 【分析】1、基因工程的基本操作程序有四步：①目的基因的获取，②基因表达载体的构建，③将目的基因导入受体细胞，④目的基因的检测与鉴定。 2、基因工程的三种工具：限制性核酸内切酶（限制酶）、DNA连接酶、运载体。 3、标记基因的作用是为了鉴别受体细胞中是否含有目的基因，从而将含有目的基因的细胞筛选出来。 【详解】（1）具有导向功能的sgRNA和行使DNA双链切割功能的Cas9蛋白，以人乳腺癌MDA-MB-231细胞、Lenti-CAS9-sgRNA质粒等为材料，进行原位定点敲除乳腺癌细胞中的人源粘着斑蛋白（VCL）基因，获取目的基因。经过改造的质粒已经插入了Cas9蛋白基因如图乙，故只需要根据人源粘着斑蛋白（VCL）基因的部分序列人工合成sgRNA基因即可。 （2）构建表达载体。人工合成的sgRNA基因如图丙，需要通过PCR 扩增，为了确保酶切后能正确连接到质粒上（相应酶切序列如图丙），选用BglⅡ和NheⅠ酶，需在引物1的5端加上碱基序列5'AGATCT3'，引物2的5'端加上碱基序列5'GCTAGC3'。 （3）导入受体细胞。利用慢病毒将包含SgRNA基因的重组质粒及相应对照质粒（空质粒）分别转入不同的乳腺癌MDA-MB-231细胞。根据标记基因，感染后用卡拉霉素和潮霉素筛选稳转细胞系。设计转入空质粒的乳腺癌细胞的目的是在检测敲除效果时作对照。 （4）检测与鉴定。获得稳转细胞系，培养3d后收集细胞全部蛋白检测VCL，结果如图丁，显示敲除成功。检测特定蛋白质的原理是抗原抗体特异结合。 （5）敲入目的基因与个体化治疗。通过同源重组修复可插入外源目的基因。正确的操作是：导入基因编辑工具表达载体的同时，导入外源目的基因，且在目的基因两端加上与Cas9切点两侧碱基序列相同的序列。 （6）对基因或染色体定位跟踪。将Cas9基因改造成Cas9i基因（表达的Cas9i蛋白丧失切割功能），并与绿色荧光蛋白（GFP）基因融合，表达载体构建关键部分为：—启动子—Cas9i基因—GFP基因—终止子—，最终表达成融合蛋白Cas9i-GFP，利用SgRNA/Cas9i-GFP荧光跟踪特定基因在细胞中的分布。改造Cas9基因的技术属于蛋白质工程。 （7）调控基因表达。转录因子M如果结合到基因上游的调控序列，就会招募转录元件聚集以促进下游基因转录。要通过sgRNA/Cas9i工具促进乳腺癌细胞中的X基因表达，表达载体构建关键部分为—启动子—Cas9i基因—M基因—终止子—。 4、（2025·四川成都石室中学·二模）有些人由于乳糖酶分泌少，不能完全消化牛奶中的乳糖，饮用牛奶后易出现腹泻等不适症状，这称为乳糖不耐受。为了解决这一问题，科学家将肠乳糖酶基因导入奶牛受精卵，使获得的转基因奶牛分泌的乳汁中，乳糖的含量大大降低，而其他营养成分不受影响。根据如下操作流程回答相关问题：    (1)为了获得更多的卵母细胞，在进行①过程前，需要用 处理奶牛A，从输卵管中采集卵母细胞后，还需要体外培养至 期，才可以进行③过程。通过图中②过程采集的B奶牛精子不能直接使成熟的卵细胞受精，常要用化学诱导法对奶牛的精子进行 处理，即用一定浓度的 处理。 (2)⑤过程表示将重组质粒导入受体细胞，常用的方法是 。 (3)⑥过程在移植胚胎前，可以选择发育良好、形态正常的 进行胚胎分割。 (4)外源基因插入奶牛受精卵中的DNA上后，导致有的受精卵发育成转基因奶牛，有的会死亡。分析导致受精卵死亡的最可能原因是 。⑦过程的检测结果为 时，说明转基因奶牛D是符合要求的优质牛。 【答案】(1) （外源）促性腺激素 MⅡ 获能 肝素或钙离子载体 (2)显微注射（利用显微注射将目的基因注入受精卵中） (3)囊胚或桑葚胚 (4) 外源基因插入奶牛受精卵中的DNA上后，导致受精卵内生命活动必须的某些基因不能表达 转基因奶牛的乳汁中乳糖的含量大大降低，而其他营养成分不受影响，且乳汁产量也不受影响 【知识点】将目的基因导入受体细胞、动物的体外受精、胚胎移植技术、胚胎分割技术 【分析】基因工程是指按照人们的愿望，进行严格的设计，通过体外DNA重组和转基因技术，赋予生物以新的遗传特性，创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。基因工程是在DNA分子水平上进行设计和施工的，又叫做DNA重组技术。 【详解】（1）为了获得更多的卵母细胞，需要对奶牛A进行促排卵，一般通过注射促性腺激素处理母牛，采集的卵母细胞还需要培养至M Ⅱ中期，才能进行③体外受精作用过程。精子进行受精作用之前需要进行获能处理，即用一定浓度的肝素或钙离子载体处理。 （2）⑤过程表示将重组质粒导入动物受精卵中，常用的方法是利用显微注射法将目的基因注入受精卵中。 （3）在进行胚胎分割时，应选择发育良好、形态正常的桑葚胚或者囊胚。分割囊胚时，需要注意将内细胞团均等分割。 （4）外源基因插入受精卵中的DNA上后，导致受精卵死亡的最可能原因是：外源基因插入奶牛受精卵中的DNA上后，导致受精卵内生命活动必须的某些基因不能表达（合理即可）；⑦过程的检测结果为转基因奶牛的乳汁中乳糖的含量大大降低，而其他营养成分不受影响，且乳汁产量也不受影响时表示转基因成功，说明转基因奶牛D是符合要求的优质牛。 5、（2025·四川邛崃市第一中学·二模）马铃薯在加工过程中，颜色会逐渐变成褐色，称为褐变。研究发现，多酚氧化酶（PPO）是导致马铃薯褐变的关键因素，而StPOT32基因是影响PPO合成的重要基因。研究者利用RNA干扰技术和外源基因清除等技术获取符合转基因生物安全，且抗褐化能力强的转基因马铃薯。请分析回答： (1)导致马铃薯褐变的PPO，其合成需要经历相关基因的 阶段。 (2)研究发现，在dsRNA干扰下，马铃薯褐变受到抑制，推测dsRNA能 （选填“促进”或“抑制”）StPOT32基因的表达。为得到dsRNA，研究者以StPOT32基因作为干涉靶点，使用StPOT32基因的片段StPPOi与含有patatin的P9286质粒构建RNA干扰载体，如图1所示，StPPOi上游的patatin的作用是 。    (3)研究者使用PCR技术验证RNA干扰载体是否成功构建时，需要设计相关引物，请在图2的4个引物中选出相关引物 （填图中序号）。    (4)为检验dsRNA干扰效果，研究者对三组马铃薯块茎的PPO活性进行检测，结果如图3所示，其中B组所用的材料为 。    (5)研究者构建RNA干扰载体所用的P9286质粒中含有外源基因清除系统，并用冷诱导启动子驱动。当该系统激活时，会清除两个融合识别位点LF之间的序列，这样操作的意义是 。 【答案】(1)转录和翻译 (2) 抑制 能启动StPPOi在马铃薯块茎中特异性表达 (3)②和③ (4)转入P9286空载体的马铃薯 (5)可获取符合转基因生物安全的马铃薯，避免外源基因带来转基因食品安全隐患 【知识点】遗传信息的翻译、PCR扩增的原理与过程、基因表达载体的构建、验证性实验与探究性实验 【分析】1、基因工程：按照人们的意愿，把一种一种生物的某个基因提取出来，加以修饰，然后导入到另外一种生物的细胞中，定向的改造生物的遗传性状。 2、基因工程操作的工具： （1）基因的“剪刀”——限制酶：一种限制酶只能识别一种特定的核苷酸序列，并且在特定的切点上切割DNA分子； （2）基因的“针线”——DNA连接酶：在具有相同黏性末端的DNA分子之间形成磷酸二酯键，将两个DNA片段连接起来； （3）基因的运载体：常用的有质粒、噬菌体和动植物病毒等。 【详解】（1）多酚氧化酶（PPO）是蛋白质，合成过程需要经历基因的转录和翻译阶段。 （2）StPOT32基因是影响PPO合成的重要基因，多酚氧化酶（PPO）又是导致马铃薯褐变的关键因素。褐变受到抑制，说明StPOT32基因的表达受到抑制，所以dsRNA应该抑制StPOT32基因的表达。图1中注明patatin是马铃薯块茎中特异性表达的启动子，说明patatin能启动StPPOi在马铃薯块茎中特异性表达。 （3）构建成功的RNA干扰载体应包含patatin和StPPOi序列。研究者使用PCR技术验证RNA干扰载体是否成功构建时，设计的引物要能扩增出patatin和StPPOi序列，所以图2中应选择引物②和③。 （4）图3中转入RNA干扰载体成功的马铃薯的PPO酶活性低于非转基因马铃薯（野生型马铃薯），还应排除P9286质粒对PPO酶活性的影响，保证dsRNA干扰效果只与质粒中目的基因的表达有关，所以B组所用材料为转入P9286空载体的马铃薯。 （5）冷诱导启动子驱动基因表达，会清除两个融合识别位点LF之间的序列，即清除了导入马铃薯的外源基因，可获取符合转基因生物安全的马铃薯，避免外源基因带来转基因食品安全隐患。 6、（2025·四川遂宁·二模）A蛋白是某种激素合成的关键酶。为鉴定该激素合成的部位及生理作用，科研团队利用无缝克隆技术将A蛋白结合蛋白基因（P基因）与葡萄糖苷酸酶基因（GUS基因）融合，构建A蛋白检测探针，通过农杆菌转化法导入拟南芥（一种草本植物）进行实验。相关原理、过程及质粒的结构如图所示。请分析回答： (1)无缝克隆原理图中，过程①中T5核酸外切酶沿 的方向水解DNA，其目的是形成 。过程③所需的酶有 。 (2)与传统的酶切再连法相比，无缝克隆技术可实现多个片段的连接，且操作时间短、成功率高。NEB官方的无缝克隆线上设计软件强制输入片段的长度必须大于75bp，并提示最好不低于110bp。请推测无缝克隆技术不适合连接小于50bp小片段的原因： 。 (3)图中利用无缝克隆技术构建GUS-P融合基因的关键是引物F1与引物 的 端互补。 (4)图中利用双酶切法将融合基因插入Ti质粒，应选用限制酶为 。扩增GUS-P融合基因所需的引物R1序列（5'→3'）的设计依据为 （填序号：①同源序列②限制酶的识别序列③P基因的部分序列④GUS基因的部分序列）。据图分析，引物R1和F2应分别为下列引物 。 ①5'-TAAGTTGTCT……-3'              ②5'-CTTGGATGAT……-3' ③5'-TCTGTTGAAT……-3'              ④5'-ATTCAACAGA……-3' (5)利用农杆菌转化法将目的基因导入拟南芥细胞后，进行植物组培。用 对组培苗进行筛选。已知葡萄糖苷酸酶可以水解X-Gluc呈蓝色，将转基因拟南芥置于不同培养液中培养一段时间，然后分离不同部位的组织分别加入X-Gluc进行鉴定，结果如下表所示： 部位 根 茎 叶 完全培养液 蓝色 浅蓝 浅蓝 缺磷培养液 深蓝 蓝色 浅蓝 根据上表实验结果分析，该激素最主要的合成部位是 ，该激素的生理作用是 。 【答案】(1) 5'→3' 黏性末端 DNA聚合酶和DNA连接酶 (2)小片段的DNA黏性末端之间容易随机结合，导致连接效率低且错误率高 (3) R2 5' (4) BclI和SmaI ②③ ②③ (5) 草甘膦 根 促进植物对磷元素的吸收 【知识点】PCR扩增的原理与过程、DNA重组技术的基本工具、基因表达载体的构建、目的基因的检测与鉴定 【分析】PCR由变性-退火-延伸三个基本反应步骤构成： 1、模板DNA的变性：模板DNA经加热至93℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备。 2、模板DNA与引物的退火（复性）：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合。 3、延伸：DNA聚合酶由降温时结合上的引物开始沿着DNA链合成互补链。此阶段的温度依赖于DNA聚合酶。该步骤时间依赖于聚合酶以及需要合成的DNA片段长度。 【详解】（1）由图可知，无缝克隆时，过程①中T5核酸外切酶沿5'→3'的方向水解DNA，以形成黏性末端。过程③缺口处DNA链的补齐，可以看作DNA分子的复制过程，所需的酶有DNA 聚合酶（DNA聚合酶将脱氧单核苷酸加到子链3′-OH末端）和DNA连接酶（将两个DNA片段进行连接）。 （2）无缝克隆技术不适合连接小于50bp的小片段，原因可能是小片段的DNA黏性末端之间容易随机结合，导致连接效率低且错误率高。此外，小片段的DNA在操作过程中也更容易丢失或损坏，进一步降低了连接的成功率。因此，NEB官方的无缝克隆线上设计软件会强制输入片段的长度必须大于75bp，并提示最好不低于110bp，以确保连接的效率和准确性。 （3）DNA的两条链是反向平行的，用无缝克隆技术构建GUS-P融合基因的关键是引物F1的3'端序列与R2引物的5'端序列互补。 （4）利用双酶切法将GUS-P融合基因插入Ti质粒的T-DNA区，如果使用BamHI，会破坏抗性基因Tet'和抗性基因Amp，故选择BclI和SmaI。扩增GUS−P融合基因所需的引物R1序列的设计需要依据P基因的部分序列和限制酶的识别序列，故选②③。根据融合基因的放大图可知，扩增时以DNA的两条链分别作模板，扩增融合基因所需的引物R1和F2应选用下列引物组合为3'端序列可以与③5'-…TCTGTTGAAT-3'配对，5'端序列的互补链可以与②5'-…CTTGGATGAT-3'配对，因此选用的引物组合为②③。 （5）利用农杆菌转化法将融合基因导入农杆菌、拟南芥细胞的过程中，需要筛选两次，这两次筛选分别是先筛选出能在含四环素培养基上生长而不能在含氨苄青霉素培养基上生长的农杆菌，再用含草甘膦的培养基筛选出导入融合基因的拟南芥细胞。葡萄糖苷酸酶可以水解X-Gluc呈蓝色，根据表格可知，在完全培养液中，只有根呈现蓝色，说明该激素最主要的合成部位是根，与完全培养液相比，在缺磷培养液中，根的颜色变为深蓝，而在含磷的完全培养液中出现蓝色，说明该激素的生理作用是促进植物对磷元素的吸收，促进葡萄糖苷酸酶合成，水解X-Gluc呈蓝色。 试卷第1页，共3页 1 / 2 学科网（北京）股份有限公司 学科网（北京）股份有限公司 学科网（北京）股份有限公司 学科网（北京）股份有限公司 $$ 专题11基因工程 考点概览 考点01基因工程的基本工具和操作程序 考点02基因工程综合 基因工程的基本工具和操作程序考点01 1、（2025·四川德阳·二模）科研人员利用TALEN基因编辑技术构建RPE65基因编辑的家犬，建立RPE65基因突变动物模型，TALEN编辑体系主要由特异性的DNA识别域和非特异性的FokI内切核酸酶构成，DNA识别域由多个TALE蛋白连接而成。该系统能对DNA靶序列进行剪切，造成DNA双链断裂，诱导DNA产生修复，从而达到对基因序列进行改造的目的。下列说法错误的是（    ） A．TALE能识别DNA特异位点，发挥靶向作用 B．FokI内切核酸酶作用于DNA的磷酸二酯键 C．可用显微注射的方式将目的基因导入家犬的受精卵 D．受精卵通过有丝分裂形成体积增大的桑葚胚 2、（2025·四川雅安·二模）科学的方法及正确的操作是生物学实验成功的关键，下列说法正确的是（　　） A．在淀粉和淀粉酶反应体系中加入蛋白酶可加速淀粉水解 B．用模型建构的方法研究DNA的结构和种群数量变化规律 C．可采用五点取样法选取样方调查城市街道上树木的种群密度 D．鉴定DNA时，在溶有DNA的酒精溶液中加入二苯胺试剂后并沸水浴加热 3、（2025·四川宜宾·二模）如图是将目的基因导入大肠杆菌内制备“基因工程菌”的示意图，其中引物1-4在含有目的基因的DNA上的结合位置如甲图所示，限制酶BamHI、EcoRI、HindIII在质粒上的识别位点如乙图所示。以下叙述错误的是（    ）    A．PCR过程完成4轮循环，理论上至少需加入引物30个 B．过程①中不能同时使用限制酶EcoRI和BamHI切割质粒 C．在氨苄青霉素培养基上生长的大肠杆菌就是此过程制备的工程菌 D．若已经合成了图甲所示4种引物，应选择引物1和4扩增目的基因 4、（2025·四川成都石室中学·二模）将马铃薯胰蛋白酶抑制剂基因Pin-Ⅱ导入杨树细胞，培育抗虫杨树。如图表示利用含目的基因的DNA分子和Ti质粒构建基因表达载体的过程，图中表示氨苄青霉素抗性基因，表示新霉素抗性基因，箭头表示限制酶的酶切位点，相关酶的识别序列如表所示。下列叙述正确的是（    ） A．利用PCR扩增目的基因时，应该选择引物2和引物3并在引物3'端添加相应酶切位点 B．为使目的基因与质粒高效重组，选用KpnⅠ和HindⅢ比选用KpnⅠ和SmaⅠ效果更好 C．为将表达载体导入农杆菌，可以使用离心法或PEG融合法处理受体细胞 D．成功导入目的基因的杨树细胞既具有氨苄青霉素抗性，又有新霉素抗性 5、（四川省宜宾市第三中学·二模）红细胞生成素（EPO）是体内促进红细胞生成的一种激素物质，是当今最成功的基因工程药物，可用于治疗肾衰性贫血等疾病。由于天然EPO来源极为有限，目前临床使用的红细胞生成素主要来自基因工程技术生产的重组人红细胞生成素（rhEPO）。其简要生产流程如图，下列相关叙述正确的是（    ） A．过程①用到的工具酶有DNA聚合酶、限制酶和DNA连接酶 B．构建的重组表达载体中终止子的作用是终止翻译过程 C．检测重组细胞是否转录出EPO的mRNA常用分子杂交技术 D．用乳腺生物反应器生产EPO可将人EPO基因导入哺乳动物体细胞获得 6、（四川省乐山第一中学 二模）实验结果产物能成功检出用阳性（+）表示，无法检出用阴性（一）表示。假阳性是指检查结果是阳性，但实际是阴性；假阴性则与之相反。某流感患者进行甲型病毒检测，下列可导致假阳性结果的是（    ） A．抗原检测—单克隆抗体保存温度过高 B．抗体检测—患者半年内接种过甲流疫苗 C．核酸检测—PCR扩增时变性温度设置过低 D．核酸检测—病毒发生变异与RCR引物不匹配 7、（2025·四川达州·二模）为了提升猪瘟病毒疫苗的效果，科研人员构建了猪瘟病毒p30蛋白基因（p30）与白喉毒素无毒突变基因（CRM197A）的融合基因表达质粒，以生产融合蛋白疫苗。图1为质粒构建、疫苗生产以及效果测试示意图。请回答下列问题： (1)完成图1的过程②需要向反应体系中加入 酶。利用PCR技术扩增p30-CRM197A融合基因时，需要向反应体系中添加的引物是 （选填图中的F1~F4）。 (2)选用大肠杆菌作为受体细胞时，一般先用 处理大肠杆菌，使其处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态。图1中培养导入重组质粒的大肠杆菌时，采用的接种方法是 。 (3)筛选时，科研人员挑选了5个菌落，提取质粒后加入BamHI、HindⅢ酶切、电泳，结果如图2： ①可初步判断 号菌落的质粒中含有p30-CRM197A融合基因。 ②p30基因和CRM197A基因 （填“含”或“不含”）BamHI和HindⅢ酶切位点，理由是 。 (4)科研人员在检测上述菌落时发现某个菌落同时含有空载质粒和融合基因表达质粒，出现此现象的可能原因有： ①有些大肠杆菌同时导入了空载质粒和融合基因表达质粒： ②导入空载质粒的大肠杆菌和导入触合基因表达质粒的大肠杆菌在接种时未分散开，导致 。 (5)为检测融合蛋白疫苗的效果，科研人员将p30蛋白、p30-CRM197A融合蛋白分别注入小鼠体内，一段时间后检测抗体含量，结果如图3所示。据此可判定融合蛋白疫苗效果更好，依据是 。 8、（2025·四川广安·二模）干旱胁迫是限制作物产量和品质的一个重要影响因素。科研人员通过转基因技术将大肠杆菌的耐旱基因（mtlD）整合进玉米基因组，增强了玉米的抗旱性。据图回答问题。 限制酶 识别序列及切割位点（5'→3'） BamHI G↓GATCC BclI T↓GATCA SmaI CCC↓GGG (1)可采用PCR技术扩增目的基因，PCR扩增的原理是 。在反应体系中除加入模板、dNTP、含Mg2+的缓冲液外，还需要加入 。 (2)为了保证mtlD基因正确连接到质粒中以构建重组质粒，在设计mtlD基因的引物时，应在两种引物的5'端分别添加 限制酶的识别序列，请据此设计转录模板链的引物5'- -3'（含12个碱基序列）。酶切后的目的基因片段和质粒通过 （填“EcoliDNA连接酶”、“T4DNA连接酶”或“E-coliDNA连接酶或T4DNA连接酶”）进行连接。 (3)为检测mtlD基因是否成功插入质粒中，研究人员从受体菌中提取质粒，使用SmaI和 进行双酶切，通过电泳检测酶切结果，若电泳结果出现 个条带，则说明插入成功。 (4)从个体水平上检测耐旱基因是否在玉米体内正常表达，请写出鉴定方法 。 9、（2025·四川成都·二模）相分离是蛋白质具有的一种物理特性，是驱动细胞内各类无膜凝聚体形成的重要机制。研究人员将未知蛋白与不具有相分离特性的Cry2蛋白相连，如果未知蛋白具有相分离特性，则在蓝光照射下会发生凝聚，从而开发出检测蛋白是否有相分离特性的工具。FUS蛋白作为经典的相分离蛋白，经常用作实验对照。为了探究X蛋白是否具备相分离特性，科学家需要构建能同时表达Cry2蛋白和X蛋白的重组质粒，质粒中LacZ基因编码产生的β—半乳糖苷酶可以分解X—gal产生蓝色物质，使菌落呈现蓝色，否则菌落为白色。图1表示质粒的结构，图2表示含有目的基因的DNA片段，其中P1、P2、P3表示引物，其余箭头处表示相关限制酶的识别位点。回答下列问题：    (1)构建重组质粒的过程中需要用到E．coli DNA连接酶，该酶的作用是将具有 的DNA片段连接起来。据图1分析，应选用四种限制酶中的 和 切割质粒，以保证目的基因插入后能够正常表达出Cry2蛋白和X蛋白。 (2)已知X蛋白基因转录得到的mRNA前三个碱基为起始密码子AUG。研究发现在紧邻起始密码子AUG之前加入序列，会显著提高基因的表达效率。利用PCR技术获取X蛋白基因时，为保证X蛋白基因能正确插入载体并高效表达，除选择引物P1外，还需要选择引物 （填“P2”或“P3”），并在该引物5端增加碱基序列5´- -3´ (3)通过琼脂糖凝胶电泳可将不同的DNA片段区分开来，该技术所依据的原理是 。对PCR产物进行电泳检测，结果显示除X蛋白基因条带外，还有多条非特异性条带（引物和模板不完全配对导致）。为减少非特异性条带的产生，可适当 （填“提高”或“降低”）PCR中复性过程的温度。 (4)为筛选出成功导入重组质粒的目标菌，需要将重组质粒与经处理的大肠杆菌混匀，再将大肠杆菌接种到含有四环素和X-gal的培养基上。培养一段时间后，培养基中颜色为 的菌落为目标菌落，原因是 。 (5)为了确认X蛋白的相分离特性，还可以构建两种重组质粒作为对照，对照组质粒与实验组质粒相比，所含基因的差异分别是 、 。 10、（2025·四川雅安·二模）CRISPR-Cas9是一种源自细菌抵御噬菌体的基因组编辑技术。CRISPR是细菌基因组中的一段特殊DNA序列，Cas9是一种能够切割DNA双链的核酸内切酶。在基因编辑过程中，通过引导RNA（sgRNA）将Cas9引导到目标DNA序列位置，然后Cas9对目标DNA进行切割。为研究AtTPST基因在拟南芥中的功能及其对植株发育的影响，科研人员利用CRISPR-Cas9基因组编辑技术构建敲除载体，通过农杆菌转化法将敲除载体转入拟南芥中，获得靶基因敲除的株系。 (1)利用CRISPR-Cas9技术敲除AtTPST基因的核心工作是 ，该过程需要用到的工具酶有 。 (2)CRISPR-Cas9基因组编辑技术中，科研人员是依据 的部分序列来设计sgRNA。现已知某sgRNA的局部序列为5'-UCCAGAAUC-3'，则其识别序列为 。 (3)科研人员将Cas9基因和sgRNA基因插入到Ti质粒的 区域，目的是 。 (4)CRISPR-Cas9基因组编辑技术在定点编辑基因时存在一个大的弊端，有很大概率会造成一些非目的基因序列的错误剪接和编辑，请分析其原因可能是 。 (5)结合Cas9的蛋白结构，科学家们通过一系列的点突变实验，发现同时突变Cas9的第10位和第840位氨基酸，可以完全破坏Cas9的核酸酶功能不影响Cas9识别sgRNA-DNA复合体的功能，这个cas9被称为dCas9。据图分析，当dCas9—sgRNA复合物结合到DNA的目标位点后，会使转录被阻断的原因是 。    11、（2025届四川省攀枝花三中 二模）PCR技术是一种用于放大扩增特定的DNA片段的分子生物学技术，其最大的特点是能将微量的DNA大幅增加。 I.如果已知一小段DNA的序列，可采用PCR的方法，简捷地分析出已知序列两侧的序列，具体流程如图1（以EcoRI酶切为例）所示。 (1)步骤Ⅱ中所用的DNA连接酶的作用是催化形成 ，从而形成环状DNA。 (2)步骤Ⅲ中的复性温度设定是成败的关键，温度过高会破坏 的碱基配对。 (3)若下表所列为已知的DNA序列和设计的一些PCR引物，步骤Ⅲ选用的PCR引物必须是 （填数字“①、②、③、④”）。 DNA序列（虚线处省略了部分核苷酸序列） 已知序列 PCR引物 ①5′-AACTATGCGCTCATGA-3′  ②5′-AGAGGCTACGCATTGC-3′ ③5′-GCAATGCGTAGCCTCT-3′  ④5′-TCATGAGCGCATAGTT-3′ (4)新冠病毒核酸定性检测原理：先以病毒RNA为模板利用 酶合成cDNA，再通过PCR技术扩增相应的DNA片段，然后在扩增产物中加入特异的核酸探针。如果检测到特异的杂交分子则核酸检测为阳性。此方法为RT-PCR技术。 (5)如果探针是带有荧光标记的，即为“实时荧光RT-PCR技术”。在PCR反应体系中，加入的荧光探针与模板DNA的某条链互补结合，探针完整时，报告荧光基团发射的荧光信号被淬灭荧光基团吸收。当子链延伸至探针处，探针被TaqDNA聚合酶降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而发出荧光（如图2所示）。即每扩增1个DNA分子，就有1个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。 ①若最初该反应体系中只有1个DNA分子模板，进行第4次循环时，需要消耗荧光探针 个。 ②检测时，荧光强度一般要达到或超过阈值才能确诊。若检测出现假阴性，推测可能的一个原因 。 基因工程综合考点02 1、（2025·四川德阳·二模）为了培育既抗除草剂（草甘膦），又抗冻的烟草植株，科学家将抗草甘膦基因（Aro基因，存在EcoRI酶切位点）和抗冻基因（Cor基因，存在Bell酶切位点）采用融合PCR技术（原理如下图所示）连接起来构建为Aro-Cor融合基因并进行了扩增，再将融合基因导入烟草细胞培育既抗除草剂又抗冻的转基因烟草，过程如下。请分析回答：    (1)在将Aro基因和Cor基因融合的过程中，起到搭桥作用的引物2和引物3的碱基序列 （填“相同”或“不相同”），变性后形成的杂交分子在补齐为双链等长的融合基因时的延伸过程，不需要添加引物，其原因是 。为保证构建的Aro-Cor融合基因能正确插入载体中，应该分别在引物1和引物4侧连接 的限制酶识别序列。 (2)上述培育转基因烟草过程中将目的基因导入烟草细胞采用的方法是 ，将农杆菌和烟草细胞按比例充分混匀，3天后转入含有潮霉素而不是四环素抗性基因的选择培养基筛选抗性愈伤组织，原因是 。 (3)植物激素是植物体内产生，能从产生部位运送到作用部位，对植物的 的微量有机物。在培育转基因烟草植株的过程中，培养基中添加的生长素和细胞分裂素会影响植物细胞的发育方向，据此分析，在初次进行实验时，可以尝试调整生长素和细胞分裂素的 来观察其对细胞发育的影响。 2、（2025·四川南充·二模）水孔蛋白作为细胞水分跨膜运输的主要通道蛋白，参与植物的生长及逆境适应过程。为研究天山雪莲水孔蛋白基因（S基因）在低温适应过程中的作用机制，研究人员利用基因工程将S基因导入番茄细胞获得转基因番茄。请回答下列问题：    (1)研究人员设计了携带限制酶位点的特异性引物P1和P2。在PCR时，引物P2将与S基因 （填“A链”或“B链”）的3'端结合；若经过5次循环，得到同时含有引物P1和P2的DNA有 个。 (2)构建重组质粒时，不能用限制酶EcoR I切割大肠杆菌质粒，原因是 ；切割后再用DNA连接酶将具有相同 的S基因和质粒切口连接起来。 (3)通过农杆菌转化法将目的基因导入番茄细胞，在愈伤组织阶段取部分细胞提取总DNA进行PCR和凝胶电泳，此操作的目的是 。 (4)研究人员将转基因番茄和野生型番茄分别放置在0℃和25℃的培养箱中处理8h，结束后采样测定抗逆生理指标（结果见下图2）。据此推测S基因表达显著提高番茄抗寒性的机制是 。    注：丙二醛为植物在遭受逆境下发生膜脂过氧化的产物 3、（2025·四川绵阳·二模）CRISPR/Cas9基因编辑技术已被广泛应用于基因治疗等领域。其基本工具sgRNA/Cas9来源于原核细胞，包括具有导向功能的sgRNA和行使DNA双链切割功能的Cas9蛋白，技术原理如图甲所示。回答下列问题： I.某研究团队以人乳腺癌MDA-MB-231细胞、Lenti-CAS9-sgRNA质粒等为材料，进行原位定点敲除乳腺癌细胞中的人源粘着斑蛋白（VCL）基因，以研究该基因在细胞中的作用，为乳腺癌的治疗提供理论支持。 (1)获取目的基因。经过改造的质粒已经插入了Cas9蛋白基因如图乙，故只需要根据 基因的部分序列人工合成sgRNA基因即可。 (2)构建表达载体。人工合成的sgRNA基因如图丙，需要通过 扩增，为了确保酶切后能正确连接到质粒上（相应酶切序列如图丙），需在引物1的5'端加上碱基序列 ，引物2的5'端加上碱基序列 。 (3)导入受体细胞。利用慢病毒将包含SgRNA基因的重组质粒及相应对照质粒（空质粒）分别转入不同的乳腺癌MDA-MB-231细胞。感染后用 筛选稳转细胞系。设计转入空质粒的乳腺癌细胞的目的是 。 (4)检测与鉴定。获得稳转细胞系，培养3d后收集细胞全部蛋白检测VCL，结果如图丁，显示敲除成功。检测特定蛋白质的原理是 。 Ⅱ、其他应用 (5)敲入目的基因与个体化治疗。通过同源重组修复可插入外源目的基因。正确的操作是：导入基因编辑工具表达载体的同时，导入外源目的基因，且在目的基因两端加上与 相同的序列。 (6)对基因或染色体定位跟踪。将Cas9基因改造成Cas9i基因（表达的Cas9i蛋白丧失切割功能），并与绿色荧光蛋白（GFP）基因融合，表达载体构建关键部分为：—启动子—Cas9i基因—GFP基因—终止子—，最终表达成融合蛋白Cas9i-GFP，利用SgRNA/Cas9i-GFP荧光跟踪特定基因在细胞中的分布。改造Cas9基因的技术属于 （填“基因工程”“蛋白质工程”“酶工程”）。 (7)调控基因表达。转录因子M如果结合到基因上游的调控序列，就会招募转录元件聚集以促进下游基因转录。要通过sgRNA/Cas9i工具促进乳腺癌细胞中的X基因表达，表达载体构建关键部分为： 。 4、（2025·四川成都石室中学·二模）有些人由于乳糖酶分泌少，不能完全消化牛奶中的乳糖，饮用牛奶后易出现腹泻等不适症状，这称为乳糖不耐受。为了解决这一问题，科学家将肠乳糖酶基因导入奶牛受精卵，使获得的转基因奶牛分泌的乳汁中，乳糖的含量大大降低，而其他营养成分不受影响。根据如下操作流程回答相关问题：    (1)为了获得更多的卵母细胞，在进行①过程前，需要用 处理奶牛A，从输卵管中采集卵母细胞后，还需要体外培养至 期，才可以进行③过程。通过图中②过程采集的B奶牛精子不能直接使成熟的卵细胞受精，常要用化学诱导法对奶牛的精子进行 处理，即用一定浓度的 处理。 (2)⑤过程表示将重组质粒导入受体细胞，常用的方法是 。 (3)⑥过程在移植胚胎前，可以选择发育良好、形态正常的 进行胚胎分割。 (4)外源基因插入奶牛受精卵中的DNA上后，导致有的受精卵发育成转基因奶牛，有的会死亡。分析导致受精卵死亡的最可能原因是 。⑦过程的检测结果为 时，说明转基因奶牛D是符合要求的优质牛。 5、（2025·四川邛崃市第一中学·二模）马铃薯在加工过程中，颜色会逐渐变成褐色，称为褐变。研究发现，多酚氧化酶（PPO）是导致马铃薯褐变的关键因素，而StPOT32基因是影响PPO合成的重要基因。研究者利用RNA干扰技术和外源基因清除等技术获取符合转基因生物安全，且抗褐化能力强的转基因马铃薯。请分析回答： (1)导致马铃薯褐变的PPO，其合成需要经历相关基因的 阶段。 (2)研究发现，在dsRNA干扰下，马铃薯褐变受到抑制，推测dsRNA能 （选填“促进”或“抑制”）StPOT32基因的表达。为得到dsRNA，研究者以StPOT32基因作为干涉靶点，使用StPOT32基因的片段StPPOi与含有patatin的P9286质粒构建RNA干扰载体，如图1所示，StPPOi上游的patatin的作用是 。    (3)研究者使用PCR技术验证RNA干扰载体是否成功构建时，需要设计相关引物，请在图2的4个引物中选出相关引物 （填图中序号）。    (4)为检验dsRNA干扰效果，研究者对三组马铃薯块茎的PPO活性进行检测，结果如图3所示，其中B组所用的材料为 。    (5)研究者构建RNA干扰载体所用的P9286质粒中含有外源基因清除系统，并用冷诱导启动子驱动。当该系统激活时，会清除两个融合识别位点LF之间的序列，这样操作的意义是 。 6、（2025·四川遂宁·二模）A蛋白是某种激素合成的关键酶。为鉴定该激素合成的部位及生理作用，科研团队利用无缝克隆技术将A蛋白结合蛋白基因（P基因）与葡萄糖苷酸酶基因（GUS基因）融合，构建A蛋白检测探针，通过农杆菌转化法导入拟南芥（一种草本植物）进行实验。相关原理、过程及质粒的结构如图所示。请分析回答： (1)无缝克隆原理图中，过程①中T5核酸外切酶沿 的方向水解DNA，其目的是形成 。过程③所需的酶有 。 (2)与传统的酶切再连法相比，无缝克隆技术可实现多个片段的连接，且操作时间短、成功率高。NEB官方的无缝克隆线上设计软件强制输入片段的长度必须大于75bp，并提示最好不低于110bp。请推测无缝克隆技术不适合连接小于50bp小片段的原因： 。 (3)图中利用无缝克隆技术构建GUS-P融合基因的关键是引物F1与引物 的 端互补。 (4)图中利用双酶切法将融合基因插入Ti质粒，应选用限制酶为 。扩增GUS-P融合基因所需的引物R1序列（5'→3'）的设计依据为 （填序号：①同源序列②限制酶的识别序列③P基因的部分序列④GUS基因的部分序列）。据图分析，引物R1和F2应分别为下列引物 。 ①5'-TAAGTTGTCT……-3'              ②5'-CTTGGATGAT……-3' ③5'-TCTGTTGAAT……-3'              ④5'-ATTCAACAGA……-3' (5)利用农杆菌转化法将目的基因导入拟南芥细胞后，进行植物组培。用 对组培苗进行筛选。已知葡萄糖苷酸酶可以水解X-Gluc呈蓝色，将转基因拟南芥置于不同培养液中培养一段时间，然后分离不同部位的组织分别加入X-Gluc进行鉴定，结果如下表所示： 部位 根 茎 叶 完全培养液 蓝色 浅蓝 浅蓝 缺磷培养液 深蓝 蓝色 浅蓝 根据上表实验结果分析，该激素最主要的合成部位是 ，该激素的生理作用是 。 试卷第1页，共3页 1 / 2 学科网（北京）股份有限公司 学科网（北京）股份有限公司 学科网（北京）股份有限公司 学科网（北京）股份有限公司 $$