项目1 任务1 细菌的检查（3）（教案）-《畜禽疫病防治》（高教版第三版）同步精品课堂

《畜禽疫病防治》（第三版）教案 课 题 细菌的检查（3） 课 型 课 时 授课班级 一年级 授课时间 授课教师 教材分析 本节课内容主要围绕实验室常用仪器的使用方法、沙门菌生化试验及结果判断展开。教材内容详实，涵盖了实验室常见仪器的操作步骤、注意事项，以及细菌标本片的制备、染色方法、常用培养基的制备、细菌的分离培养及形态观察、病料的采集、保存和送检等。通过学习这些内容，学生可以掌握实验室基本操作技能，为后续的病原微生物检测和诊断打下坚实基础。 学情分析 教学对象 本课程的教学对象为畜牧兽医专业的学生，他们已经学习了基础的微生物学、生物化学等相关课程，具备一定的理论基础。 知识基础 学生已经掌握了一些微生物学的基本知识，如细菌的基本结构、生长条件等，但可能对具体的实验操作和仪器使用不够熟悉。 技能短板 学生在实际操作方面存在不足，如仪器使用不熟练、实验操作不规范等，需要通过实践操作来提升。 学习特点 学生具有好奇心强、动手能力较好，但需要教师的正确引导和规范操作示范。 学习目标 知识目标 掌握实验室常用仪器的使用方法。 了解沙门菌生化试验及结果判断。 熟悉细菌标本片的制备和染色方法。 知道常用培养基的制备方法。 了解细菌的分离培养及形态观察。 掌握病料的采集、保存和送检方法。 技能目标 能够独立完成实验室常用仪器的操作。 能够制备细菌标本片并进行染色。 能够制备常用培养基。 能够进行细菌的分离培养并观察形态。 能够采集、保存和送检病料。 学习重难点 教学重点 实验室常用仪器的正确使用方法。 细菌标本片的制备及染色方法。 常用培养基的制备。 细菌的分离培养及形态观察。 教学难点 沙门菌生化试验及结果判断。 实验操作中的无菌操作技术。 培养基的配制及灭菌技术。 教学方法 讲授法：讲解实验室常用仪器的使用方法、细菌标本片的制备及染色方法、常用培养基的制备等。 案例分析法：通过具体的案例，分析沙门菌生化试验及结果判断。 小组讨论法：分组讨论实验操作中的问题，培养团队合作精神。 .实践演示法：教师演示操作，学生动手实践。 课前准备 教师准备： 教案、PPT课件、板书设计。 准备好所有实验仪器：电热恒温培养箱、电热干燥箱、高压蒸汽灭菌器（手提式）、电冰箱、电动离心机、电热恒温水浴箱、酒精灯、接种环、载玻片、吸水纸、显微镜、香柏油、乙醇乙醚、擦镜纸、烧杯、量筒、天平、培养皿、试管、三角烧瓶、玻棒、漏斗、滤纸、高压蒸汽灭菌锅、电炉等。 准备好所有实验材料：生理盐水、美蓝染色液、革兰染色液（草酸铵结晶紫、卢戈碘液、石炭酸复红稀释液）、瑞氏染色液、细菌培养物（如大肠杆菌、葡萄球菌）、细菌病料（如肝、脾组织）、营养琼脂粉、蒸馏水、无菌水、无菌棉签、无菌镊子、剪刀、保存液（30%甘油生理盐水、50%甘油缓冲盐水）、来苏尔、脱脂棉、载玻片、盖玻片、动物尸体（或模拟组织块）、病理材料送检单等。 提前调试好所有仪器，确保运行正常。 准备好分组名单，明确组长职责。 准备好实验报告纸。 学生准备： 预习教材相关内容，了解仪器名称、用途和基本操作步骤。 穿戴好实验服、口罩、手套等个人防护用品。 准备好笔记本和笔，记录要点和疑问。 教学媒体 教学过程 教学环节 教师活动设计 学生活动设计 设计意图 活动一： 创设情境 生成问题 提问：“同学们，如果一头牛突然死亡，我们怀疑是某种细菌感染，但肉眼无法直接看到细菌，我们该如何确定具体是哪种细菌，并判断是否具有传染性？” 简述兽医临床诊断中实验室检验的重要性，引出本次课内容——实验室常用仪器使用及细菌检验基础操作。 展示几幅不同细菌的显微图片或培养菌落图片，激发学生兴趣。 提出问题：“要完成细菌的鉴定，我们需要哪些工具？需要经历哪些步骤？”引导学生思考，引出仪器、标本制备、染色、培养等概念。 思考教师提出的问题，尝试回答。 观察图片，了解细菌形态多样性。 根据已有知识或直觉，思考细菌检验可能需要的步骤和工具。 从实际问题出发，激发学生学习兴趣和求知欲。 帮助学生建立理论知识与实际应用的联系。 引导学生初步思考细菌检验的流程，为后续学习做好铺垫。 活动二： 调动思维 探究新知 一 、实验室常用仪器的使用 沙门菌生化试 验及结果判断 ( 一 )材料准备 电热恒温培养箱、电热干燥箱、高压蒸汽灭菌器、电冰箱、电动离心机、电热恒温水浴箱等。 (二)人员组织 将学生分组，每组5～10人并选出组长，在各实验中组员轮流担任组长，负责操作分工，各 组分别练习使用仪器。 (三)操作步骤 1. 电热恒温培养箱 电热恒温培养箱又称温箱，主要由箱体、电热丝、温度调节器等组成。温箱主要用于细菌 的培养、某些血清学试验及有关器皿的干燥等(图1-1-17)。 使用方法 插上电源插头，开启电源开关，绿色指示灯明亮，表明电源接通。然后把温控 仪上的调节旋钮旋至所需温度刻度处，此时红灯亮，箱内开始升温，待红绿指示灯交替发亮时， 工作室内温度达到设定状态，进入正常工作。(应注意，近几年销售的温箱有的红灯亮表示通 电及恒温，绿灯亮表示升温。) 2. 电热干燥箱 电热干燥箱又称干热灭菌箱，其构造和使用方法与温箱相似，但所用温度较高。主要用于玻 璃器皿和金属制品的干热灭菌。灭菌时箱内放置物品要留空隙，保持热空气流动，以利于彻底灭 菌。常用灭菌温度160℃,维持2 h。灭菌时，关门加热应开启箱顶上的活塞通气孔，使冷空气排 出，待升至60℃时，将活塞关闭，为了避免玻璃器皿炸裂，灭菌后箱内温度降至60℃时，才能开 启箱门取物品。若仅需达到干燥目的，可一直开启活塞通气孔，温度只需60 ℃左右即可。 3. 高压蒸汽灭菌器 高压蒸汽灭菌器是应用最广、效率最高的灭菌器，有手提式(图1-1-18)、立式、横卧式三种，其构造和工作原理基本相同。 高压蒸汽灭菌器为一锅炉状的双层金属圆筒，外筒盛水，内筒有一活动金属隔板，隔板有 许多小孔，使蒸汽流通。灭菌器上方或前方有金属厚盖，盖上有压力表、安全阀和放气阀。盖 的边缘附有螺旋，借以紧闭灭菌器，使蒸汽不能外溢。 在标准大气压下，水的沸点是100 ℃,这个温度能杀死一般细菌的繁殖体，要杀死芽孢则 需要很长时间。如果加大压力，则水的沸点升高。因高压蒸汽灭菌器是一个密闭的容器，加热 时蒸汽不能外溢，所以锅内压力不断增大，使水的沸点超过121℃。 使用方法 (1)加适量水于灭菌器外筒内，使水面略低于支架，将灭菌物品包扎好放入内筒筛板上。 (2)器盖盖上时，必须将器盖腹侧的放气软管插入消毒内筒的管架中，然后对称扭紧六个 螺栓，检查安全阀、放气阀，并使安全阀呈关闭状态，放气阀呈打开状态。通电后，待水蒸气从 放气阀均匀冒出时，表示锅内冷空气已排尽，然后关闭放气阀继续加热，待灭菌器内压力升至约 1×10⁵Pa(121.3℃), 开始计时，维持20～30min(通过控制电源维持),即可达到灭菌的目的。灭 菌时，锅内空气应完全排净，灭菌锅内留有不同分量空气时，压力与温度的关系见表1-1-3。 表1-1-3 灭菌锅留有不同分量空气时，压力与温度的关系 压力数 全部空气排出 时的温度/℃ 2/3空气排出 时的温度/℃ 1/2空气排出 时的温度/℃ 1/3空气排出时 的温度/℃ 空气全不排出 时的温度/℃ MPa kg/cm² 1b/in² 0.03 0.35 5 108.8 100 94 90 72 0.07 0.70 10 115.6 109 105 100 90 0.10 1.05 15 121.3 115 112 109 100 0.14 1.40 20 126.2 121 118 115 109 0.17 1.70 25 130.0 126 124 121 115 0.21 2.10 30 134.6 130 128 126 121 (3)灭菌完毕，停止加热，待压力自动降至零时才能开盖取物。 (4)手提式高压蒸汽灭菌器灭菌之后，可放出器内的水，并擦干净。 4. 电冰箱 电冰箱主要由箱体、制冷系统、自动控制系统和附件四大部分构成。实验室中常用以保存 培养基、药敏片、病料以及菌种、疫苗、诊断液等生物制品。 使用方法 (1)电冰箱电源的电压 一般为220 V, 如不符合，须另装稳压器稳压。 (2)通电检查箱内照明灯是否明亮，机器是否运转。 (3)使用时将温度调节器调至一定刻度(冷冻室0℃以下，冷藏室温度4～10 ℃)。调节 温度时不可一次调得过低，以免冻坏箱内物品，应作第二次、第三次调整。 5. 电动离心机 实验室常用电动离心机沉淀细菌、血细胞、虫卵和分离血清等，较多使用低速离心机，转速 可达4000r/min 。 常用倾角电动离心机，其中管孔有一定倾斜角度，使沉淀物迅速下沉。上口 有盖，确保安全，前下方装有电源开关和速度调节器，可以调节转速。 使用方法 (1)先将盛有材料的两个离心管及套管放天平上配平，然后对称放入离心机中，若分离材 料为一管，则对侧离心管放入等量的其他液体。 (2)将盖盖好，接通电路，慢慢旋转速度调节器到所需刻度，保持一定的速度，达到所需的 时间( 一般转速2000 r/min, 维持3～20 min), 将调节器慢慢旋回“0”处，停止转动后方可揭盖 取出离心管。 6. 电热恒温水浴箱 电热恒温水浴箱为镀镍的铜或不锈钢制成的水浴箱，加热快、耗电少，箱前有“电源”和 “加热”指示灯(一红一绿),并装有温度调节器，自37～100 ℃可以调节定温，箱侧有一水龙 头，供放水用。水浴箱主要用于蒸馏、干燥、浓缩、温渍化学药品及血清学试验。 使用方法 使用时必须先加水于箱内，通电后绿灯亮，再顺时针方向旋转温度调节器，绿灯灭，使加热 指示灯(红灯)亮，即接通内部电热丝，使之加温。如水温达到所需温度，再逆时针方向微调温 度调节器，使红绿指示灯忽亮忽灭，经30～60 min 观察，水温恒定不变即达到定温。如下次使 用需要同样温度，可不必旋转调节旋钮，或记下所需刻度，以作下次转向之用。 (四)注意事项 1. 电热恒温培养箱 (1)电热恒温培养箱必须放置于干燥、平稳处。 (2)使用时，随时注意温度计的指示温度是否与所需温度相同。 (3)除了取放培养物开启箱门外，尽量减少开启次数，以免影响恒温。 (4)工作室内隔板放置试验材料不宜过重、过密，以防影响热空气对流。底板为散热板 其上切勿放置物品。 (5)温箱内禁止放入易挥发性物品，以免发生爆炸。 2. 电热干燥箱 (1)灭菌时箱内放置物品要留空隙，保持热空气流动，以利于彻底灭菌。 (2)灭菌过程中如遇温度突然升高，箱内冒烟，应立即切断电源，关闭排气小孔，箱门四周 用湿毛巾堵塞，杜绝氧气进入，火则自熄。 3. 高压蒸汽灭菌器 (1)螺栓必须对称均匀旋紧，以免漏气。 (2)内简中的灭菌物品，不可堆压过紧，以免妨碍蒸汽流通，影响灭菌效果。 (3)灭菌时间和压力必须准确可靠，操作人员不能擅自离开。 (4)注意安全，在高压灭菌密封液体时，如果压力骤降，可能造成物品内外压力不平衡而 炸裂或液体喷出。 4. 电冰箱 (1)电冰箱应放置在干燥通风处，避免日光照射，远离热源，离墙10 cm 以上，以保证对 流，利于散热。 (2)冷冻室冰霜较厚时，按化霜按钮或切断电路，进行化霜，霜融化后清洁整理。 (3)箱内存放物品不宜过挤，以利于冷空气对流，使箱内温度均匀。 (4)箱内保持清洁干燥，如有霉菌生长，断电后取出物品，经消毒后，方可使用。 5. 电动离心机 (1)离心前，离心管需加上套管放天平上配平，然后对称放入离心机中。 (2)离心时如有杂音或离心机震动，立即停止使用，进行检查。 6. 电热恒温水浴箱 (1)使用时必须先向箱内加水。 (2)不可加水过多，以浸过加热容器为宜。 (3)使用完毕，待水冷却后，必须放水擦干。 二 、细菌标本片的制备及染色方法 (一)材料准备 酒精灯、接种环、载玻片、吸水纸、生理盐水、美蓝染色液、革兰染色液、瑞氏染色液、染色 缸、染色架、洗瓶、显微镜、香柏油、乙醇乙醚、擦镜纸、细菌培养物(大肠杆菌、葡萄球菌等)、细 菌病料、无菌镊子和剪刀、玻璃铅笔等。 (二)人员组织 将学生分组，每组5～8人，组员轮流担任组长，负责本组操作分工。 (三)操作步骤 1. 细菌标本片的制作 (1)涂片标本的制作 细菌涂片标本的制作如图1-1-19。 ① 涂片 取清洁载玻片一块(若不洁要 用酒精棉球擦净，置火焰上通过数次),用吸管 取生理盐水1滴置于玻片中央，再将接种环在 火焰上灭菌，待冷后从固体培养基上挑取少许 菌落，置于玻片上的生理盐水中混匀，并在玻片 上涂成直径约为1 cm 的涂面，要求薄而均匀 (以透过涂面能看见手上的指纹为度)。若采用 液体培养物作涂片，可直接取菌液涂片。接种 环置火焰上灭菌后插入试管架。 ② 干燥涂片 在室温下自然干燥，必要时 将涂面向上，置火焰上方来回微烤使其干燥。 ③ 固定涂片 干燥后，将涂面向上，在火 焰上快速来回通过2～3 次，其温度以手背接 触玻片底面感觉微烫手为宜。组织触片、血片 用吉姆萨染液染色时要用甲醇固定。固定的目的是使细菌的蛋白质凝固，形态固定，染色时不变形，易于着色，水洗时不易被冲掉。 (2)血液推片和组织抹片的制作 ① 血液推片的制作 取一张边缘整齐的载玻片，用其一端蘸取少许血液，在另一张干 净无油脂的载玻片上，以45°角均匀地推成一薄层血涂片，以红细胞不重叠为宜，然后干燥 固 定 。 ② 组织抹片的制作 用经火焰灭菌的镊子夹起组织(如肝、肾、淋巴结),用灭菌剪刀剪 下小块组织，将组织切面在载玻片上等距离轻压几下，使其留有组织切面的压迹，然后干燥 固 定 。 2. 常 用 的 细 菌 染 色 方 法 细菌染色的一般步骤如图1-1-19。常用的细菌染色方法如下 (1)美蓝染色法 在已固定好的抹片上，滴加适量美蓝染色液覆盖涂面，染色2～3 min, 水洗，吸水纸轻压吸干后镜检，结果菌体呈蓝色。 (2)革兰染色法 ① 在固定好的抹片上，滴加草酸铵结晶紫染色液，作用1～3 min,水洗。 ② 加革兰碘液，作用1～2 min,水洗。 ③ 加95%酒精脱色30 s 至 1 min,水洗。 ④ 加稀释石炭酸复红，复染30s 左右，水洗，用吸水纸吸干后镜检。 结果：革兰阳性菌呈蓝紫色，革兰阴性菌呈红色。 (3)瑞氏染色法 细菌抹片自然干燥后，滴加瑞氏染色液于涂片上，固定标本1～3 min 后，再滴加与染色液等量的磷酸缓冲液或中性蒸馏水于玻片上，轻轻摇晃使其与染色液混合均 匀，静置5 min 左右水洗，吸水纸吸干后镜检，结果菌体呈蓝色，组织细胞的胞浆一般呈红色 细胞核呈蓝色。 3. 常用染色液的配制 (1)碱性美蓝染色液 甲液：美蓝0.3 g、95%酒精30 mL;乙液：0.01%氢氧化钾溶液 100 mL。 先配甲液，将美蓝放入研钵中，徐徐加入酒精研磨均匀后，把甲、乙两液混合，过夜后用滤 纸过滤即成。新鲜配制的美蓝液染色效果不好，陈旧的染色效果好。 (2)革兰染色液 ① 草酸铵结晶紫溶液 甲液：结晶紫2 g、95%酒精20 mL; 乙液：草酸铵0.8 g、蒸馏水 80 mL。 将结晶紫放入研钵中，加酒精研磨均匀制成甲液，然后将完全溶解的乙液与甲液混合 即成。 ② 卢戈碘液 碘 1 g、碘化钾2 g、蒸馏水300mL。 将碘化钾放入研钵中，加入少量蒸馏 水，使其溶解，再放入已磨散的碘片，徐徐加水，同时充分磨匀，待碘片完全溶解后，把余下的蒸 馏水倒入，再装入瓶中。 ③ 石炭酸复红稀释液 取碱性复红酒精饱和溶液(碱性复红10g 溶于95%酒精100 mL 中)1 mL和5%石炭酸水溶液9mL混合，即为石炭酸复红原液。再取原液10 mL和90 mL 蒸 馏水混合，即成石炭复红稀释液。 (3)瑞氏染色液 取瑞氏染料0.1 g, 纯中性甘油1 mL, 在研钵中混合研磨，再加入甲醇 60mL, 使其溶解，装入中性瓶中过夜，次日过滤，盛入棕色瓶中，保存于暗处。保存越久，染色 效果越好。 (4)吉姆萨染色液 取吉姆萨染料0.6g, 加入甘油50mL, 置于55～60 ℃水浴箱中，2 h 后加入甲醇50 mL,静置1 d 以上，过滤后即可使用。 (四)注意事项 (1)根据所检材料不同，选择合适的标本片制备方法。 (2)细菌染色时，严格控制所加试剂与样品的作用时间。 (3)水洗时水流不能直接冲洗样品涂面。 (4)严格遵守病原微生物实验室的生物安全要求。 三 、常用培养基的制备 病原微生物 实验室的生 物安全要求 (一)材料准备 高压蒸汽灭菌器、电热干燥箱、电炉、天平、量筒、漏斗、试管、培养皿、烧杯、三角烧瓶、营养琼 脂培养基(或伊红美蓝琼脂培养基、三糖铁琼脂培养基、SS琼脂培养基、麦康凯琼脂培养基)等。 (二)人员组织 将学生分组，每组5～8人，组员轮流担任组长，负责本组操作分工。 (三)操作步骤 1. 营养琼脂培养基 以营养琼脂培养基的制备过程为代表说明固体培养基的制备过程，其他固体培养与之 相似。 基本程序：计算→称量→溶化→倒平板或倒试管分装→灭菌→无菌检验→保存备用。 (1)计算 根据营养琼脂培养基说明书了解营养琼脂粉与水的比例， 一般是1000 mL蒸 馏水中应加营养琼脂粉31.3 g, 再根据培养基的需要量确定营养琼脂粉的用量(图1-1-20)。 营养琼脂粉的量=31.3×15×n/1000(g) 其中：15 代表一个平板需要营养琼脂培养基约15 mL; n 代表要做的平板的数量。 (2)称量 用普通天平准确称量出营养琼脂粉的量，用量筒量出相应的蒸馏水的量，要尽 量准确(图1-1-21、图1-1-22)。 (3)溶化 将营养琼脂粉和蒸馏水倒入搪瓷缸中，于电炉上加热溶化，边加热边搅拌，沸 腾时立即从电炉上拿下，等泡沫消失后再放在电炉上加热，注意不能让营养琼脂溢出，煮沸 2～3次(图1- 1-23)。 (4)倒平板或倒试管分装 若做平板培养基应倒于培养皿中，每板约15 mL, 以刚好覆盖 平皿底为宜(图1-1-24)。若做斜面培养基应倒入试管中，量为试管的1/3。 (5)灭菌 将平板培养基整齐地平放入高压灭菌器的内筒中，将试管口盖上棉塞或橡胶 塞，用纸包扎好，直立放入内筒中，在121.3℃灭菌20～30 min(图1-1-25)。灭菌完毕，将平 板培养基拿出平放于桌面，凝固前勿动；将试管培养基摆成斜面，凝固前勿动。 (6)无菌检验 随机抽取几个平皿或试管于温箱中培养24 h, 若无菌生长则为合格。 (7)保存备用 将合格的平板培养基和试管培养基放 入冰箱，在0～4 ℃中保存备用(图1-1-26)。 注意：SS 琼脂培养基不需要灭菌。 2. 血液琼脂培养基 将灭菌的营养琼脂冷却至45～50 ℃,以无菌操作，加 入5%～10%的无菌血液(或脱纤维血),然后倾注于平皿或分装于试管制成斜面。 3. 肉汤培养基 (1)成分 牛肉膏3～5 g, 蛋白胨10 g, 氯化钠5 g, 蒸馏水1000 mL。 (2)制法 将牛肉膏、蛋白胨、氯化钠加蒸馏水后，加热溶解。矫正pH 至7.4～7.6,过滤 分装。置高压蒸汽灭菌器内，121.3 ℃灭菌20 min 即成。 (3)用途 可供一般细菌生长，同时也是制作一般培养基的基础原料；供营养要求较高的 细菌分离培养，亦可供溶血性细菌的观察和保存菌种。 4. 半固体培养基 由肉汤培养基中加入0.3%～0.5%琼脂粉制成，用于菌种的保存或观察细菌的运动性。 (四)注意事项 (1)正确量取营养琼脂粉和蒸馏水。 (2)加热溶化时，注意边加热边搅拌，沸腾时不能让营养琼脂溢出，防止烫伤。 (3)固体培养基灭菌完毕，将平板或试管拿出放于桌面，凝固前不要移动。 四 、细菌的分离培养及形态观察 ( 一)材料准备 电热恒温培养箱、病料、实验用菌种、营养琼脂培养基、肉渣汤(庖肉)培养基、接种环、酒 精灯、烙刀、镊子、剪子等。 (二)人员组织 将学生分组，每组5～8人，组员轮流担任组长，负责本组操作分工。 (三)操作步骤 1. 细菌的分离培养 (1)平板划线分离法 是通过将被检材料连续划线而获得独立的单个菌落，因而划线愈长，获得单个菌落机会也愈多。具体步骤如下 ① 右手持接种环于酒精灯上烧灼灭菌，冷却。 ② 无菌操作取病料，若为液体病料，可直接用灭菌的接种环取病料一环；若 为固体病料，首先将烙刀在酒精灯上灭菌，并立即用其在病料表面烧烙灭菌，在烧 烙面的中央做一切口，然后用灭菌接种环从切口插入组织中缓缓转动接种环，取 少量组织或液体。 ③ 左手持平皿，用拇指、食指及中指将皿盖打开一侧(如图1-1-27A 所示，角度大小以能 顺利划线为宜，但以角度小为佳，以免空气中细菌污染培养基)。 ④ 将已取被检材料的接种环伸人平皿，并涂于培养基一侧，然后自涂抹处以腕力在平板 表面轻轻地分区划线(图1-1-27B)。 ⑤ 划线完毕，烧灼接种环，将培养皿盖好，用记号笔在培养皿底部注明被检材料及日期， 倒置放于37℃温箱中，培养18～24 h 观察结果。凡是分离菌应在划线上生长，否则为污染菌 (图1- 1-27C)。 (2)倾注分离法 取3支熔化后冷至50 ℃左右的琼脂管，用灭菌的接种环取一环培养物 (或被检材料)移至第一管中，随即用掌心搓转均匀，再由第一管取一环至第二管，搓转均匀 后，再由第二管取一环至第三管，搓转均匀。将三管接种后的培养基分别倒入三个灭菌培养皿 中，待凝固后，倒置于37 ℃温箱中培养24 h 观察结果，其结果如图1-1-28 所示。 2. 厌氧菌的分离培养 厌氧菌的分离培养常用肉渣汤(庖肉培养基)培养法。先将试管倾斜，使培养基表面露出 一点，然后接种被检材料或菌种，接种后将试管直立，即封闭液面。最后置37 ℃温箱中培养 24～48 h。 3. 细菌基本形态的观察 (1)纯培养物标本片 如葡萄球菌、链球菌、大肠杆菌、炭疽杆菌(图1-1-29)。 (2)血片或组织触片 如丹毒杆菌、炭疽杆菌、巴氏杆菌(图1-1-30 至图1-1-33)。 标本片准备两种， 一是纯培养的细菌涂片，二是血片或组织触片。先认识纯培养细菌的形 态、大小和排列，然后学会观察血片或组织触片中的细菌，为将来细菌病的实验室诊断打下 基础。 (四)注意事项 (1)接种环使用前后要及时灭菌。 (2)以腕力在平板表面轻轻地分区划线，不能用力过大，以防划破培养基。 (3)划线完毕，用记号笔做好标记，倒置于37 ℃温箱中培养。 五 、病料的采集、保存、送检 ( 一)材料准备 煮沸消毒器、外科刀、外科剪、镊子、试管、平皿、广口瓶、包装容器、注射器、采血针头、脱脂 棉、载玻片、酒精灯、火柴、保存液、来苏尔、新鲜动物尸体等。 (二)人员组织 将学生分组，每组5～8人，组员轮流担任组长，负责本组操作分工。 (三)操作步骤 1. 病料的采集 (1)采集病料的时间 最好在动物死后立即采取，以不超过6h 为宜。 (2)采集病料器械的消毒 刀、剪、镊子、注射器和针头等可煮沸消毒30 min; 玻璃器皿等 可高压灭菌或干热灭菌；软木塞和橡皮塞于0.5%石炭酸水溶液中煮沸10～15 min; 载玻片在 1%～2%碳酸氢钠水溶液中煮沸10～15 min,水洗后用清洁纱布擦干，将其保存于酒精与乙醚 等份液中备用。 (3)各种组织脏器病料的采集 采集病料应无菌操作。采集病料的种类，应根据不同的 疫病，相应地采集脏器及内容物。在无法估计是某种疫病时，应进行全面采集。各脏器及内容 物的采集方法如下： ① 淋巴结及内脏 将淋巴结、肺、肝、脾、肾等有病变的部位各采集1～2cm³ 的小方块，分 别置于灭菌试管、平皿或小瓶中。 ② 脓汁及渗出液 用注射器或吸管抽取，置于灭菌试管中。若为开放性病灶或鼻腔等 可用无菌棉签浸蘸后放在试管中。 ③ 血液 心血通常在右心房采取，先用烧红的铁片或刀片烧烙心肌表面，然后用灭菌的 注射器自烧烙处扎入吸出血液，盛于灭菌试管或小瓶中。血清的采集，以无菌操作采集血液 10 mL,置于灭菌的试管中，待血液凝固析出血清后，以灭菌滴管吸出血清置于另一灭菌试管 内。供血清学检查时，可于每毫升血清中加入3%～5%石炭酸溶液1～2滴。全血的采集，在 注射器中先吸入5%柠檬酸1 mL, 再以无菌操作采集全血至10 mL, 注入灭菌的试管或小 瓶中。 ④ 乳汁 乳房和挤乳者的手用新洁尔灭等消毒，弃去最初所挤的3～4股乳汁，再采集 10mL 左右的乳汁于灭菌的试管中。若仅供镜检，则可于其中加入0.5%的福尔马林液。 ⑤ 胆汁 采集方法同心血烧烙采取法。 ⑥ 肠 用线扎紧一段肠道(5～10 cm) 两端，然后将两端切断，置于灭菌器皿中。亦可用 烧烙采集法采集肠道黏膜或其内容物。 ⑦ 皮肤 取大小约10cm×10cm 的皮肤一块，保存于30%甘油缓冲溶液或10%饱和盐 水溶液或10%福尔马林溶液中。 ⑧ 胎儿、禽和小动物 将整个尸体包入不透水的塑料薄膜、油布或数层油纸中，装入箱内送检。 ⑨ 脑、脊髓、管骨 可将脑、脊髓浸入50%甘油盐水中，或将整个头割下，或将整个管骨包 入浸过0.1%升汞溶液的纱布或油布中，装箱送检。 供镜检的涂片制作：先将脓汁、血、黏液等病料置于玻片上，再用一灭菌棉签均匀涂抹，或 用另一玻片抹之。组织块、致密结节及脓汁等，亦可夹在两张玻片之间，然后沿水平面向两端 推移，制成推压片。用组织块作触片时，持小镊子将组织块的游离面在玻片上轻轻涂抹即可。 每份病料制片不少于2～4张。制成后的涂片自然干燥，彼此中间垫以小木棍或纸片，重叠后 用线缠往，用纸包好。每片应注明号码，并附说明。 2. 病料的保存 送检病料应保持新鲜状态，以免病料送达实验室时失去原来的状态，影响正确诊断。常用 的保存剂及其配制方法如下： (1)各材料常用的保存剂 病毒检验材料： 一般用灭菌的50%甘油缓冲盐水。 细菌检验材料： 一般用灭菌的液体石蜡，30%甘油缓冲盐水或饱和氯化钠溶液。 血清学检验材料：固体材料(小块肠、耳、脾、肝、肾及皮肤等)可用硼酸或氯化钠处理。液 体材料如血清可在每毫升中加入3%～5%石炭酸溶液1～2滴。 病理组织材料：用10%福尔马林液。 (2)几种保存剂的配制方法 ① 30%甘油生理盐水溶液 纯中性甘油 30.0 mL 0 .02%酚红 1.5 g 氯化钠 0.5 g 中性蒸馏水加至 100.0 mL 碱性磷酸钠 1.0 g 混合后置高压灭菌器中灭菌30 min。 ② 50%甘油缓冲盐水溶液 中性纯甘油 150.0 mL 酸性磷酸钠 0.46 g 中性蒸馏水 150.0mL 碱性磷酸钠 10.74 g 氯化钠 2.5 g 将酸性磷酸钠、碱性磷酸钠和氯化钠溶于100 mL 中性蒸馏水中，然后与150 mL 中性纯甘 油和50 mL中性蒸馏水混合。混合后分装，于高压灭菌器内灭菌30 min。 ③ 饱和氯化钠溶液 取一定量的蒸馏水加入纯氯化钠，不断搅拌至不能溶解为止(一般 为8%～39%),然后用滤纸过滤，即可得饱和氯化钠溶液。 3. 病料的包装和送检方法 (1)病理材料送检单 病料送检应附动物病理材料送检单，该单需复写三份，其中一份留 为存根，两份寄往检验室，待检查完毕后，退回一份。送检单格式见表1-1-4。 (2)病料的包装和送检 液体病料(如黏液、渗出液、尿及胆汁)最好收集在灭菌玻璃管 中，管口用火焰封闭，封闭时注意勿使管内病料受热。将封闭的玻璃管用棉花纸包裹，装入较 大的试管中，再装盒运送。用棉签蘸取的鼻液及脓汁等物，可置于灭菌试管内，剪除多余的棉 签，严密加塞，用蜡密封管口，再装盒送寄。 装盛组织或脏器的玻璃容器，包装时力求细致而结实，最好用双重容器或广口瓶。将盛材 料的器皿和塞，用蜡封口后，置于内容器中，内容器中需填充棉花或废纸。气候温暖时须加冰 块，但避免病料与冰块直接接触，以免冻结。外容器内垫以废纸、木屑、石灰粉等，装入内容器 后封好，外容器上需注明上下方向，最好以箭头注明，并写明“病理材料”“小心玻璃”等标记。 疑似危险传染病(炭疽、口蹄疫等)病料应将盛病料的器皿置于金属匣内，将病匣焊封加印后 装入木盒寄送。 病料装于容器内至送到检验部门的时间应越短越好。运送途中应避免病料 炭疽公共卫生 接触高温及日光，以免材料腐败或病原微生物死亡。 (四)注意事项 (1)采集病料前需作尸体检查，怀疑是炭疽时，不可解剖，应先由末梢血管采血涂片镜检。 操作时应特别注意，勿使血液污染它处。排除炭疽后方可采集有病变的组织器官。 (2)采集病料应无菌操作， 一套器械与容器，只能采集或容装一种病料，不可用其再采其 他病料或容纳其他脏器材料。 (3)病料保存时注意配备并使用合适的保存剂。 学生认真听讲，记录笔记，并积极提问。 学生分组讨论，总结每种仪器的操作要点和注意事项。 学生分组实践操作，在教师指导下完成细菌标本片的制备、染色、培养基的制备、细菌的分离培养及形态观察、病料的采集、保存和送检。 通过教师的讲解和学生的实践操作，让学生全面掌握教材内容，为后续的学习和实验操作奠定基础。 活动三： 调动思维 探究新知 教师活动设计： 将学生分成5-8人小组，每组选出组长，明确组长职责（组织分工、检查操作、汇报等）。 提出探究性问题： “高压灭菌时为什么要排尽冷空气？如果没排尽会有什么后果？” “革兰染色中，酒精脱色这一步为什么如此关键？它决定了什么？” “平板划线时，为什么每次划线都要从上次末端开始，且角度要小？” “采集不同病料（如血液、脓汁、组织）时，具体操作有何不同？为什么？” 巡视各小组讨论情况，参与引导，鼓励学生从原理上思考。 各小组派代表分享讨论结果，教师点评总结，补充完善。 小组内围绕教师提出的问题进行讨论，结合教材内容和自己理解进行分析。 小组成员分工合作，查阅资料或请教教师。 记录讨论结果，推选代表准备发言。 认真听取其他小组的分享，进行比较和思考。 通过小组讨论和问题探究，激发学生主动思考，加深对操作原理的理解。 培养学生的团队协作能力和分析解决问题的能力。 查漏补缺，确保学生不仅知其然，更知其所以然。 活动四： 巩固练习 素质提升 巩固练习设计 学生分组进行沙门菌生化试验操作，并观察结果。 学生分组制备细菌标本片并进行染色，观察细菌形态。 学生分组制备常用培养基，并进行细菌的分离培养及形态观察。 学生分组采集、保存和送检病料。 分组进行实践练习，记录实验结果。 分析实验结果，进行讨论和总结。 通过巩固练习，让学生进一步熟悉实验操作，提升实验技能，培养学生的团队协作和问题解决能力。 课堂小结 作业布置 课堂小结 教师带领学生回顾本节课的主要内容，包括常用仪器的使用、标本制备与染色、培养基制备、细菌分离培养、病料采集保存等关键知识点和操作要点。 强调无菌操作原则在微生物学检验中的重要性。 鼓励学生在课后继续练习，并思考如何将这些技能应用于未来的兽医实践。 课堂作业布置 完成本次实验报告，详细记录操作步骤、观察结果（包括革兰染色结果、菌落特征等）和遇到的问题及解决方法。 思考题：比较美蓝染色和革兰染色的优缺点及适用范围。高压蒸汽灭菌和干热灭菌各有什么优缺点？适用于哪些物品？ 预习下次课内容。 板书设计 实验室常用仪器使用及细菌检验基础 一、 实验室常用仪器 1. 电热恒温培养箱（温箱） - 构造：箱体、电热丝、温控器 - 用途：细菌培养、血清试验、器皿干燥 - 使用方法：电源→调温→观察指示灯→正常工作 - 注意事项：（略） 2. 电热干燥箱（干热灭菌箱） - 用途：玻璃、金属器皿灭菌 - 使用方法：留空隙→高温（160℃，2h）→冷却后开箱 - 注意事项：（略） 3. 高压蒸汽灭菌器 - 构造：外筒、内筒、盖、压力表、安全阀、放气阀 - 原理：加压→沸点升高（>121℃） - 使用方法：加水→放物品→盖盖→排冷空气→升压→计时→降压→开盖 - 注意事项：（略） 4. 电冰箱 - 用途：保存培养基、菌种、疫苗等 - 使用方法：调温（4℃左右） - 注意事项：（略） 5. 电动离心机 - 用途：沉淀细菌、血细胞等 - 使用方法：配平→对称放入→盖盖→调速→计时→停转→开盖 - 注意事项：（略） 6. 电热恒温水浴箱 - 用途：恒温加热 - 使用方法：加水→调温→观察指示灯 - 注意事项：（略） 二、 细菌标本片制备及染色 1. 标本片制备：涂片、推片、抹片 - 涂片：生理盐水+菌→涂布→干燥→固定 2. 常用染色法 - 美蓝染色：菌体蓝色 - 革兰染色： - 原理：细胞壁结构差异 - 步骤：结晶紫→碘液→酒精脱色→复染 - 结果：G+蓝紫，G-红色 - 瑞氏染色：组织细胞染色 三、 常用培养基制备 1. 营养琼脂培养基：计算→称量→溶化→分装→灭菌→检验 2. 其他：血液琼脂、肉汤、半固体 四、 细菌分离培养 1. 平板划线分离法：分区划线→单个菌落 2. 倾注分离法 五、 病料采集、保存、送检 1. 采集：无菌操作、不同病料方法 2. 保存：选择合适保存剂 3. 送检：包装、送检单 教学反思 本节课内容较多，理论讲解与实践操作结合紧密。从教学效果来看，通过情境创设能有效激发学生兴趣，但理论讲解部分仍需注意控制节奏，避免信息过载。小组讨论环节能活跃气氛，促进思考，但需加强对讨论方向的引导。实践操作环节是重点，学生参与度高，但部分学生操作不够熟练，无菌观念仍需加强培养。对于高压蒸汽灭菌器等复杂仪器，演示效果较好，但学生实际操作机会有限，未来可考虑增加模拟操作或增加分组。总体而言，本节课达到了预期的教学目标，但也暴露出部分学生基础薄弱、动手能力不足的问题，需要在后续教学中持续关注和加强训练。 原创精品资源学科网独家享有版权，侵权必究！ 学科网（北京）股份有限公司 $$