专题08 发酵工程和细胞工程（浙江专用）-【好题汇编】2025年高考生物二模试题分类汇编（浙江专用）

专题08 发酵工程和细胞工程 发酵工程考点01 1．（2025·浙江金华·二模）2011年我国首次利用转基因和体细胞核移植技术成功培育了高产赖氨酸转基因克隆奶牛，其乳汁中含有较高含量的赖氨酸。其基本流程为：构建乳腺专一表达载体→表达载体导入牛胚胎成纤维细胞（BEF）→核移植→重组细胞的体外培养及胚胎移植→检测。下列叙述错误的是（　　） A．表达载体导入的牛胚胎成纤维细胞（BEF）为供体细胞 B．需将重组细胞体外培养至桑椹胚或囊胚再进行胚胎移植 C．高产赖氨酸转基因克隆奶牛的性别与胚胎受体母牛无关 D．检测时可选取克隆奶牛牛耳组织细胞检测目的基因的表达情况 【答案】D 【分析】基因工程的基本原理是让人们感兴趣的基因（即目的基因）在宿主细胞中稳定高效地表达。为了实现基因工程的目标，通常要有多种工具酶、目的基因、载体和宿主细胞等基本要素，并按照一定的程序进行操作，它包括目的基因的获得、重组DNA的形成，重组DNA导入受体细胞也称（宿主）细胞、筛选含有目的基因的受体细胞和目的基因的表达等几个方面。 【详解】A、根据题意可知，表达载体导入的牛胚胎成纤维细胞（BEF）在核移植过程中提供细胞核，因此为供体细胞，A正确； B、胚胎移植时需将重组细胞体外培养至桑椹胚或囊胚再进行胚胎移植，B正确； C、胚胎受体母牛只负责孕育个体，不影响克隆牛的遗传物质，因此高产赖氨酸转基因克隆奶牛的性别与胚胎受体母牛无关，该克隆牛的性别由提供细胞核的个体的性别决定，C正确； D、由于导入的基因只在乳腺细胞内表达，因此检测目的基因的表达情况不能选用克隆奶牛牛耳组织细胞，D错误。 故选D。 2．（2025·浙江金华·二模）研究人员以白菜细胞（2n=20）与甘蓝细胞（2n=18）进行植物体细胞杂交得到杂种植株。通过PCR对杂种植株和亲本植株的物种特异性DNA进行扩增，电泳结果如下图所示。下列说法错误的是（　　） A．据图推测杂种植株的染色体数小于38条 B．叶绿体密度与液泡颜色等差异可做为区分杂交细胞类型的依据 C．通过凝胶电泳结果可知，杂种植株兼具有白菜和甘蓝的某些遗传特性 D．植物体细胞杂交的优点是可以克服远缘杂交不亲合，并保持双亲优良性状 【答案】D 【分析】植物体细胞杂交，是指将植物不同种、属，甚至科间的原生质体通过人工方法诱导融合，然后进行离体培养，使其再生杂种植株的技术。过程为将植物细胞A与植物细胞B用纤维素酶和果胶酶处理，得到不含细胞壁的原生质体A和原生质体B，运用物理方法（离心或电融合法）或是化学方法诱导融合，形成杂种细胞，再利用植物细胞培养技术将杂种细胞培养成杂种植物体。 【详解】A、由图可知，杂种植株只包含部分白菜和甘蓝的DNA，因此可推测杂种植株的染色体数小于38条，A正确； B、利用叶绿体密度、液泡颜色等细胞学差异来鉴定不同杂交类型是体细胞融合实验的常用方法，B正确； C、由图可知，杂种植株兼具有白菜和甘蓝的部分遗传物质，故具有白菜和甘蓝的某些遗传特性，C正确； D、植物体细胞杂交的优点是可以克服远缘杂交不亲合，但不一定能保持双亲优良性状，D错误。 故选D。 3．（2025·浙江金华·二模）哺乳动物红细胞的部分生命历程如下图所示，图中除成熟红细胞外，其余细胞中均有核基因转录的RNA．下列叙述错误的是（　　） A．网织红细胞仍然能够表达出某些核基因编码的蛋白质 B．成熟红细胞细胞仍能进行细胞呼吸 C．成熟红细胞经脱分化后可转变为造血干细胞 D．造血干细胞中血红蛋白基因突变仍能分化出幼红细胞 【答案】C 【分析】1、细胞凋亡是由基因决定的细胞编程序死亡的过程。细胞凋亡是生物体正常发育的基础、能维持组织细胞数目的相对稳定、是机体的一种自我保护机制。在成熟的生物体内，细胞的自然更新、被病原体感染的细胞的清除，是通过细胞凋亡完成的。2、细胞分化：在个体发育中，相同细胞的后代，在形态、结构和生理功能上发生稳定性差异的过程。细胞分化过程遗传物质不变，只是基因选择性表达的结果。 【详解】A、网织红细胞中含有和细胞转录形成的mRNA和核糖体，仍然能够合成核基因编码的蛋白质，A正确； B、成熟的红细胞无线粒体，只能进行无氧呼吸，产物为乳酸，不产生二氧化碳，B正确； C、成熟红细胞无细胞核，无法发生脱分化，C错误； D、造血干细胞中分裂、分化不是由血红蛋白基因决定的，血红蛋白基因突变仍能分化出幼红细胞，D正确。 故选C。 4．（2025·浙江杭州·二模）紫草素是一种重要的化工产品，可从天然紫草中获取，但来源有限。科学家先利用紫草叶片培育出紫草愈伤组织，再通过培养基中的各类成分诱导愈伤组织合成紫草素，实现紫草素的大规模生产。下列叙述错误的是（　　） A．上述过程体现了植物细胞具有全能性 B．上述过程中紫草细胞经历了脱分化 C．培育紫草愈伤组织的过程需控制植物激素配比 D．可利用基因工程和发酵工程大量合成紫草素 【答案】A 【分析】植物组织培养技术的关键：（1）条件：离体，一定营养物质，激素等。（2）培养基状态：固体培养基，主要成分：无机营养成分、有机营养成分、激素、琼脂。（3）细胞学基础：细胞全能性。 【详解】A、植物细胞全能性是指具有某种生物全部遗传信息的任何一个细胞，都具有发育成完整生物体的潜能。 题干中只是利用紫草叶片培育出愈伤组织，再诱导愈伤组织合成紫草素，并没有发育成完整的植物体，所以没有体现植物细胞的全能性，A错误； B、从紫草叶片培育出紫草愈伤组织，这一过程是让已经分化的细胞，经过诱导后，失去其特有的结构和功能而转变成未分化细胞的过程，即脱分化过程，B正确； C、在植物组织培养中，培育愈伤组织时，植物激素的配比会影响细胞的分裂和分化，所以需要控制植物激素配比，C正确； D、基因工程可以将相关基因导入受体细胞，使其大量合成紫草素；发酵工程可以利用微生物等进行发酵生产紫草素，所以可利用基因工程和发酵工程大量合成紫草素，D正确。 故选A。 （2025·浙江·二模）阅读下列材料，完成下面小题。 CAR-T细胞治疗常用于血液系统恶性疾病的治疗。该疗法通过基因工程技术对从患者采集的外周血T细胞进行加工，使其表达CAR（嵌合抗原受体—一种人工构建的细胞表面受体），大量增殖后回输到受者体内，以非MHC依赖方式（依赖于CAR）识别抗原对肿瘤细胞进行杀伤，达到治疗疾病的目的。 5．下列关于CAR蛋白质的叙述，错误的是（    ） A．该蛋白质由附着在内质网上的核糖体合成 B．高尔基体上脱落形成的囊泡膜上不可能含有该蛋白 C．该蛋白质包含脂溶性部分和水溶性部分 D．该蛋白质的存在说明了细胞膜具有信息交流的功能 6．CAR-T细胞对肿瘤细胞起到杀伤作用，下列叙述正确的是（    ） A．在该过程中主要是体液免疫发挥了作用 B．一种CAR-T细胞可以用于治疗各种肿瘤 C．CAR-T细胞对肿瘤细胞杀伤致死属于细胞坏死 D．常规细胞毒性T细胞需要识别肿瘤细胞表面的抗原-MHC 7．该技术涉及到患者外周血的采集、T细胞与CAR-T细胞的培养。下列叙述错误的是（    ） A．采集到的组织无需胰酶处理即可得到分散的细胞 B．采集用具在使用前需进行灭菌和消毒处理 C．CAR-T细胞的培养需在固体培养基中进行 D．往往需在培养基中加入细胞因子以促进CAR-T细胞增殖 8．TCR由能识别肿瘤抗原的胞外单链抗体可变区（基因片段A控制合成）和胞内信号传导区域（基因片段B控制合成）组成，现欲通过3次PCR将两部分基因融合在一起形成下图结构（数字表示相应的引物），与载体连接后形成重组DNA分子。下列叙述正确的是（    ） A．首先需用引物②、④与引物⑤、⑦扩增两个基因片段 B．引物①与引物⑧的5'端需各添加一个启动子以促进转录 C．引物③与引物⑥需同时使用以加快PCR进程 D．第3次PCR无需加入引物即可获得图示完整片段 【答案】5．B 6．D 7．C 8．D 【分析】动物细胞培养的条件： （1）无菌、无毒的环境：①消毒、灭菌；②添加一定量的抗生素；③定期更换培养液，以清除代谢废物。 （2）营养物质：糖、氨基酸、促生长因子、无机盐、微量元素等，还需加入血清、血浆等天然物质。 （3）温度和pH。 （4）气体环境：95%空气（细胞代谢必需的）和5%的CO2（维持培养液的pH）。 5．A、CAR蛋白是细胞表面受体，属于分泌蛋白，分泌蛋白由附着在内质网上的核糖体合成，A正确； B、CAR蛋白是细胞膜上的受体，其合成和运输过程中，高尔基体对其进行加工后，高尔基体上脱落形成的囊泡膜会与细胞膜融合，将CAR蛋白运输到细胞膜上，所以囊泡膜上可能含有该蛋白，B错误； C、细胞膜上的蛋白质既包含脂溶性部分（与磷脂双分子层相互作用），也包含水溶性部分（暴露在膜的内外表面），CAR蛋白作为细胞膜表面受体也不例外，C正确； D、CAR蛋白作为细胞表面受体，能识别抗原，这体现了细胞膜具有信息交流的功能，D正确。 故选B。 6．A、CAR-T细胞对肿瘤细胞的杀伤是通过细胞免疫实现的，不是体液免疫，体液免疫主要靠抗体发挥作用，A错误； B、一种CAR-T细胞只能识别特定的肿瘤抗原，不能用于治疗各种肿瘤，B错误； C、CAR-T细胞对肿瘤细胞杀伤致死是免疫系统清除异常细胞的过程，属于细胞凋亡，不是细胞坏死，细胞坏死是病理性的被动死亡，C错误； D、常规细胞毒性T细胞需要识别肿瘤细胞表面的抗原 - MHC复合体，才能对肿瘤细胞进行攻击，D正确。 故选D。 7．A、从外周血中采集的T细胞本身就是单个细胞，无需胰酶处理来分散细胞，A正确； B、采集用具若不进行灭菌和消毒处理，会引入杂菌等污染，影响细胞培养，所以采集用具在使用前需进行灭菌和消毒处理，B正确； C、动物细胞培养一般使用液体培养基，而不是固体培养基，CAR-T 细胞属于动物细胞，C错误； D、在动物细胞培养中，往往需要在培养基中加入细胞因子，如白细胞介素等，以促进细胞的增殖，D正确。 故选C。 8．A、要将基因片段A和基因片段B融合在一起，首先需用引物①③扩增基因片段A，用引物⑥⑧扩增基因片段B，这样可以使两个基因片段一端具有互补序列，便于后续限制酶的切割和基因融合，保持基因结构的完整，有利于与载体连接后形成重组DNA分子，A错误； B、启动子是位于基因首端的一段特殊DNA序列，是RNA聚合酶识别和结合的部位，用于驱动基因转录，而转录时不可能从基因的两个方向都进行，所以只需要在一边引物的5'端添加一个启动子，B错误； C、引物③与引物⑥在第二次PCR时使用，将两个基因片段连接起来，它们不是同时使用来加快PCR进程的，C错误； D、前两次PCR分别扩增出带有互补黏性末端的基因片段A和基因片段B，第三次PCR时，以这两个片段为模板，由于它们的黏性末端互补，在DNA聚合酶的作用下可直接延伸形成完整的片段，无需加入引物，D正确。 故选D。 9．（2025·浙江温州·二模）动物细胞培养技术在生物制药、疾病治疗等领域中发挥着重要作用。关于动物细胞培养技术的应用，下列叙述错误的是（    ） A．培养哺乳动物受精卵至原肠胚阶段，用于胚胎移植 B．培养干细胞并诱导分化，用于治疗细胞损伤或病变 C．培养正常细胞并观察药物对其的影响，评估药物的疗效和安全性 D．培养杂交瘤细胞制备单克隆抗体，用于癌症及免疫性疾病的治疗 【答案】A 【分析】动物细胞培养技术的应用：(1)生产有重要价值的生物制品，如病毒疫苗、干扰素、单克隆抗体等。(2)基因工程中受体细胞的培养。(3)用于检测有毒物质，判断某种物质的毒性。(4)科学家培养正常或各种病变的细胞，用于生理、病理、药理等方面的研究.如用于筛选抗癌药物等，为治疗和预防癌症及其他疾病提供理论依据。 【详解】A、哺乳动物胚胎移植，一般是将培养到桑椹胚或囊胚阶段的胚胎进行移植，而不是培养到原肠胚阶段，因为原肠胚细胞已经出现明显分化，此时进行胚胎移植不利于胚胎的进一步发育和着床，A错误； B、干细胞具有分裂和分化能力，培养干细胞并诱导其分化，可用于治疗因细胞损伤或病变导致的疾病，如用造血干细胞治疗白血病等，B正确； C、通过培养正常细胞，观察药物对这些细胞的影响，能够评估药物的有效性和安全性，这是药物研发过程中的重要环节，C正确； D、杂交瘤细胞既能无限增殖，又能产生特异性抗体，培养杂交瘤细胞可制备单克隆抗体，单克隆抗体可用于癌症及免疫相关疾病的诊断、治疗等，D正确。 故选A。 10．（2025·浙江宁波·二模）胚胎工程中的体外受精技术，须将采集到的卵母细胞进行体外培养至成熟。下列叙述正确的是（　　） A．培养卵母细胞要在充满CO₂的培养箱中进行 B．培养基中添加灭菌的血清有利于卵母细胞的培养 C．初次培养的卵母细胞经传代培养可得到大量细胞 D．卵母细胞经培养至完成减数分裂后才可用于受精 【答案】B 【分析】精子的准备：精子获能，刚刚排出的精子，不能立即与卵子受精，必须在雌性动物生殖道发生相应的生理变化后，才能获得受精能力； 卵子的准备：动物排出的可能是初级卵母细胞也可能是次级卵母细胞，都要在输卵管内进一步成熟，达到减数第二次分裂中期时，才具备与精子受精的能力； 对大型动物是借助超声波探测仪、腹腔镜等直接从活体动物的卵巢中吸取卵母细胞，在体外经人工培养成熟后，才能与获能的精子受精（或从刚屠宰母畜的卵巢中采集卵母细胞）。 【详解】A、培养动物细胞（包括卵母细胞）通常是在含有 95% 空气和 5% CO2的混合气体的培养箱中进行，A错误； B、血清中含有丰富的营养物质和一些生长因子等，在培养基中添加灭菌的血清有利于卵母细胞的培养，B正确； C、卵母细胞是高度分化的细胞，一般不能进行传代培养，C错误； D、卵母细胞培养至减数第二次分裂中期就可用于受精，而不是完成减数分裂后，D错误。 故选B。 11．（2025·浙江金华·二模）水稻白叶枯病是由水稻白叶枯病原菌引起的病害，对水稻危害严重，较难进行化学防治，为此科研人员通过转基因技术将白叶枯病抗性基因Xa2l转入水稻品种C418.T-DNA两端有左边界（LB）和右边界（RB），边界间序列进入植物细胞。回答下列问题： (1)制备得到含目的基因（Xa2l）的双右边界T-DNA重组质粒，如下图1所示。 据图可知，制备重组质粒时使用的限制酶为 。重组质粒中含有ColE Ori的意义是 。利用含该重组质粒的农杆菌侵染植物愈伤组织，转移进入植物细胞的T-DNA片段可能含有的基因是 或 。 (2)将含有重组质粒的大肠杆菌接种至 培养基中扩大培养后，提取其中的DNA并通过电泳将重组质粒 。切割含相应条带的凝胶回收重组质粒后，将其与处于感受态的农杆菌混合培养一段时间，再转移至含壮观霉素的培养基中一段时间，筛选得到含重组质粒的农杆菌。影响重组质粒转化农杆菌效率的因素有 （答出2点即可）。 (3)将含重组质粒的农杆菌菌液滴加在愈伤组织表面后一段时间，利用加入含头孢霉素的无菌水冲洗愈伤组织以 。而后将愈伤组织转移至含潮霉素的MS培养基中进行 培养以获得更多的愈伤组织，从功能角度分析，该培养基属于 培养基。将愈伤组织培养至完整植株，在叶片上施用水稻白叶枯病原细菌，目的是检验 。 (4)现获得了同时转入两种类型T-DNA各1个并成功整合到染色体上的一株亲代转基因水稻，请在下图2（竖线表示染色体）中标出T-DNA上基因（可用短横线表示基因）整合在染色体上的可能性 。 【答案】(1) KpnI 使重组质粒在大肠杆菌中复制与扩增 Xa2l Xa2l与hpt (2) LB液体 分离 农杆菌状态，培养液温度，重组质粒的含量等 (3) 除去农杆菌 继代 选择 转基因是否成功/目的基因是否已经成功表达/水稻是否具有白叶枯病抗性 (4) 【分析】基因工程的基本操作步骤主要包括四步：①目的基因的获取；②基因表达载体的构建；③将目的基因导入受体细胞；④目的基因的检测与表达。其中，基因表达载体的构建是基因工程的核心。 【详解】（1）制备得到含目的基因（Xa2l）的双右边界T-DNA重组质粒，如下图1所示，该酶在LB、RB2两边都有，制备重组质粒时使用的限制酶为KpnI，即用KpnI对目的基因和质粒进行切割，以得到相同的黏性末端，再连接得到重组质粒如图1；ColE Ori为大肠杆菌复制起点，使重组质粒在大肠杆菌中复制与扩增；Xa2l是目的基因，需要整合到植物细胞的染色体上，因此必须位于T-DNA中，hpt为潮霉素抗性基因，有利于筛选含目的基因的植物细胞，因此进入植物细胞的T-DNA片段可能含有的基因是Xa2l或Xa2l与hpt。 （2）液体培养基能对微生物进行扩大培养；不同的DNA在电泳中形成的条带不同，电泳能对重组质粒（DNA）进行分离；农杆菌状态，培养液温度，重组质粒的含量等都会影响重组质粒转化农杆菌效率。 （3）头孢是抗生素，可以杀灭细菌，利用加入含头孢霉素的无菌水冲洗愈伤组织以除去农杆菌；将愈伤组织转移至含潮霉素的MS培养基中进行继代培养，以获得更多的愈伤组织；由于加了潮霉素能筛选出抗潮霉素的植物细胞，因此该培养基属于选择培养基；将愈伤组织培养至完整植株，在叶片上施用水稻白叶枯病原细菌，是为了检验转基因是否成功/目的基因是否已经成功表达/水稻是否具有白叶枯病抗性。 （4）现获得了同时转入两种类型T-DNA（只含Xa2l、含Xa2l与hpt）各1个并成功整合到染色体上的一株亲代转基因水稻，可能的位置为。 12．（2025·浙江宁波·二模）苏云金杆菌产生的Bt毒素蛋白具有杀虫能力，科研人员利用由Bt毒素蛋白基因（Bt基因）改造而来的目的基因，成功培育出转基因抗虫棉。目的基因改造过程如图所示（数字表示基因序列中对应的核苷酸序号），其中穿梭质粒载体含T-DNA但不含Vir基因（可辅助T-DNA转移），由天然Ti质粒改造而来。 注：F1-F3，R1-R3表示引物；T-DNA-LB表示左边界；T-DNA-RB表示右边界；Ori表示复制原点；KanR表示卡那霉素抗性基因；HygBR表示潮霉素B抗性基因。 回答下列问题： (1)从苏云金杆菌中提取DNA操作中，加入的酒精所起作用是 和沉淀DNA。以提取的DNA作模板，选用图中的引物 进行PCR，可扩增Bt基因。 (2)改造目的基因时，一方面利用特定酶断开 键，去除与毒性无关的部分序列，以减小分子量，便于将重组DNA导入受体细胞；另一方面，由于细菌和棉花对密码子的偏好有所不同，还需人工合成部分基因序列，以进一步得到不一样的 序列，从而提高基因表达中 过程的效率。 (3)与直接导入同时含有T-DNA和Vir基因的Ti质粒相比，将穿梭质粒和辅助质粒（含Vir基因但不含T-DNA）分别导入农杆菌的优点是 。导入农杆菌的辅助质粒上的vir基因可表达产生 ，用于切割穿梭质粒上的T-DNA。 (4)将转化的农杆菌与棉花叶圆片共培养一段时间后，培养基中加入 可初步筛选得到转化的棉花愈伤组织。若选择培养基中抗生素浓度 ，通常会出现较多假阳性植株。为检测目的基因是否成功导入植株，可提取总DNA作模板进行PCR，则选用的引物应是 。在诱导愈伤组织分化出芽和根的过程中，应注意调整培养基中关键激素的 。 (5)本研究中，用1-1362合成基因序列和1363-1848天然基因序列获得改造的抗虫蛋白，体现了基因工程和 工程的应用。 【答案】(1) 溶解某些蛋白质 F1和R3 (2) 磷酸二酯 mRNA/密码子 翻译 (3) 质粒小，转化成功率高 限制性内切核酸酶 (4) 潮霉素B 过低 F3和R2 浓度和比例/浓度和配比 (5)蛋白质 【分析】基因工程技术的基本步骤：（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。（4）目的基因的检测与鉴定。 【详解】（1）在从苏云金杆菌中提取 DNA 操作中，加入酒精的作用是溶解蛋白质（因为 DNA 不溶于酒精，而某些蛋白质等杂质可溶于酒精）和沉淀 DNA。要扩增 Bt 基因，根据 PCR 引物的设计原则（引物要与目的基因两端的序列互补配对），从图中可知应选用引物 F1和R3进行 PCR。 （2）改造目的基因时，一方面利用特定限制酶切开磷酸二酯键（限制酶能够识别特定的核苷酸序列，并在特定的位点切割 DNA 分子，作用的是磷酸二酯键），去除与毒性无关的部分序列，以减小分子量，便于将重组 DNA 导入受体细胞；另一方面，由于细菌和桃花对密码子的偏好有所不同，还需人工合成部分碱基序列，以进一步得到不一样的密码子序列，从而提高基因表达中翻译过程的效率（不同生物对密码子的偏好不同，优化密码子可以使目的基因在受体细胞中更高效地进行翻译合成蛋白质）。 （3）与直接导入同时含有T-DNA和Vir基因的Ti质粒相比，将穿梭质粒和辅助质粒（含Vir基因但不含T-DNA）分别导入农杆菌的优点是质粒小，转化成功率高（如果使用含有 T - DNA 和 Vir 基因的 Ti 质粒，其自身的 T - DNA 可能会随机整合到受体细胞基因组中，影响实验结果，而分开导入可以更精确地控制 T - DNA 的来源）。根据限制酶的作用可知导入农杆菌的辅助质粒上的 Vir 基因可表达产生限制性内切核酸酶，用于切割穿梭质粒上的 T - DNA。 （4）结合基因表达载体的示意图，根据图中穿梭质粒上的KanR和HygBR两个标记基因的位置，用HygBR基因对应的抗生素初步筛选转化的棉花愈伤组织。若选择培养基中抗生素浓度过低，通常会出现较多假阳性植株（因为抗生素浓度低不能有效抑制未转化的细胞生长，一些未成功导入重组质粒的细胞也可能存活下来）。PCR扩增目的基因（由图可知，该目的基因是人工合成的1-1362基因序列与1363-1848基因序列拼接成的）时，引物应在目的基因的两端，所以为检测棉花植株是否导入目的基因，应选用的引物是F3、R2。在诱导愈伤组织分化出芽和根的过程中，应注意调整培养基中关键激素（生长素和细胞分裂素）的浓度比例（不同的浓度比例会影响愈伤组织分化的方向，生长素与细胞分裂素比值高时，有利于根的分化；比值低时，有利于芽的分化）。 （5）本研究中，用 1 - 1362 合成基因序列和 1363 - 1848 天然基因序列获得改造的抗虫蛋白，体现了基因工程和蛋白质工程的应用（蛋白质工程是通过基因修饰或基因合成，对现有蛋白质进行改造，或制造一种新的蛋白质，这里对天然的抗虫蛋白基因进行改造获得新的抗虫蛋白，涉及蛋白质工程，同时将改造后的基因导入植物细胞涉及基因工程）。 13．（2025·浙江温州·二模）帕金森病是常见的中枢神经系统疾病。酪氨酸羟化酶在帕金森病中起着关键作用，其表达水平的下降与帕金森病的病理过程密切相关。当前研究发现由干细胞分泌的外泌体对该病有一定的治疗作用，回答下列问题。    (1)如图所示，外泌体是一类包含有复杂成分的小膜泡，干细胞分泌外泌体的方式为 ，这种方式体现了细胞膜具有 的结构特点。外泌体与其他细胞膜上的 结合后，将信息传递给靶细胞，发挥调节作用。 (2)为验证干细胞分泌的外泌体对帕金森病有一定的治疗作用，根据以下材料和用具，完善实验思路，设计实验记录表。 材料和用具：正常小鼠若干只，生理盐水配制的MPTP溶液（腹腔注射，用于制备急性帕金森小鼠模型），缓冲液配制的外泌体溶液（静脉注射），生理盐水，缓冲液等。 （要求与说明：实验中涉及的剂量不作具体要求。旋转试验可用于评估小鼠神经系统的功能，其结果可用转圈数进行表示。） ①完善实验思路： 将45只正常小鼠随机分为A、B、C三组，每组15只，其中B、C两组 ，制备成急性帕金森病小鼠模型； A组、B组 ，C组 。 将小鼠置于相同且适宜的条件下饲养，并在T1、T2、T3天， 。 进行数据的统计与分析。 ②设计一张表格，用于记录实验数据。 。 ③实验结果表明，使用外泌体治疗后，在一定时间范围内帕金森病小鼠转圈数明显减少，说明外泌体对帕金森病有一定的治疗作用。请结合信息预测A、B、C三组小鼠体内酪氨酸羟化酶的表达量大小： 。结合上述研究，除注射外泌体外，请再提出1种可能的治疗帕金森病的思路： 。 【答案】(1) 胞吐 一定的流动性 受体 (2) 腹腔注射MPTP溶液 腹腔注射生理盐水 静脉注射外泌体溶液 对每组小鼠进行旋转实验，记录转圈数 A组 > C组 > B组 通过基因治疗提高酪氨酸羟化酶基因的表达量 【分析】一些大分子的物质可以通过胞吞、胞吐的方式进出细胞，体现了细胞膜的流动性。 【详解】（1）外泌体是一类包含有复杂成分的小膜泡，外泌体通过胞吐释放，体现细胞膜具有一定的流动性；外泌体通过膜表面配体与靶细胞受体结合传递信息，发挥调节作用。 （2）①根据题意信息可知，为了验证干细胞分泌的外泌体对帕金森病有一定的治疗作用，可以将45只正常小鼠随机分为A、B、C三组，每组15只，其中B、C两组腹腔注射MPTP溶液，制备成急性帕金森病小鼠模型。 ②A组腹腔注射生理盐水（正常对照），B组腹腔注射生理盐水（模型对照），C组腹腔注射缓冲液配制的外泌体溶液（治疗组）。将小鼠置于相同且适宜条件下饲养，并在T1、T2、T3天进行旋转试验，记录各组小鼠的转圈数。由此设计表格可以记录实验数据， 。 ③因为帕金森模型（B组）酶表达下降，外泌体治疗（C组）部分恢复，正常组（A组）最高。所以预测酪氨酸羟化酶表达量为A组 > C组 > B组 。通过基因治疗提高酪氨酸羟化酶基因的表达量可治疗帕金森病。 细胞工程考点02 1．（2025·浙江金华·二模）2011年我国首次利用转基因和体细胞核移植技术成功培育了高产赖氨酸转基因克隆奶牛，其乳汁中含有较高含量的赖氨酸。其基本流程为：构建乳腺专一表达载体→表达载体导入牛胚胎成纤维细胞（BEF）→核移植→重组细胞的体外培养及胚胎移植→检测。下列叙述错误的是（　　） A．表达载体导入的牛胚胎成纤维细胞（BEF）为供体细胞 B．需将重组细胞体外培养至桑椹胚或囊胚再进行胚胎移植 C．高产赖氨酸转基因克隆奶牛的性别与胚胎受体母牛无关 D．检测时可选取克隆奶牛牛耳组织细胞检测目的基因的表达情况 【答案】D 【分析】基因工程的基本原理是让人们感兴趣的基因（即目的基因）在宿主细胞中稳定高效地表达。为了实现基因工程的目标，通常要有多种工具酶、目的基因、载体和宿主细胞等基本要素，并按照一定的程序进行操作，它包括目的基因的获得、重组DNA的形成，重组DNA导入受体细胞也称（宿主）细胞、筛选含有目的基因的受体细胞和目的基因的表达等几个方面。 【详解】A、根据题意可知，表达载体导入的牛胚胎成纤维细胞（BEF）在核移植过程中提供细胞核，因此为供体细胞，A正确； B、胚胎移植时需将重组细胞体外培养至桑椹胚或囊胚再进行胚胎移植，B正确； C、胚胎受体母牛只负责孕育个体，不影响克隆牛的遗传物质，因此高产赖氨酸转基因克隆奶牛的性别与胚胎受体母牛无关，该克隆牛的性别由提供细胞核的个体的性别决定，C正确； D、由于导入的基因只在乳腺细胞内表达，因此检测目的基因的表达情况不能选用克隆奶牛牛耳组织细胞，D错误。 故选D。 2．（2025·浙江杭州·二模）同尾酶指识别位点不同但能切出相同黏性末端的限制酶；同裂酶指具有相同识别序列的限制酶(切割位点相同或不同均可)。几种基因工程中常用的限制酶如表所示。下列叙述错误的是（　　） 限制酶的名称 识别和切割位点 HinPⅡ 5-G↓CGC-3' GlaⅠ 5-GC↓GC-3' HhaⅠ 5-GCG↓C-3' HpaⅡ 5'-C↓CGG-3' NarⅠ 5'-GG↓CGCC-3' A．HinPⅡ和HhaI为同裂酶，切出的黏性末端不同 B．HinPⅡ和HpaII切割的产物连接后，其序列不能被GlaI切割 C．HinPⅡ和NarI为同尾酶，它们切割的产物连接后的序列不能被GlaI切割 D．某质粒仅含1个GlaI的识别位点，则该质粒能被NarI切割的概率为1/16 【答案】C 【分析】限制酶能够识别双链DNA分子的某种特定核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断裂，形成黏性末端或平末端。 【详解】A、同裂酶是指具有相同识别序列的限制酶。HinPⅡ识别和切割位点是5'-G↓CGC-3'，HhaⅠ识别和切割位点是5'-GCG↓C-3'，二者识别序列均为GCGC，所以HinPⅡ和HhaⅠ为同裂酶。 黏性末端是指凸出的单链部分，HinPⅡ酶切后产生的黏性末端为5'CG3'，，HhaⅠ酶切后产生的黏性末端为3'GC5'，这两个黏性末端是不同的，前者凸出来的部位是5'端，后者是3'端，即使字母相同，A正确； B、HinPⅡ识别和切割位点是5'-G↓CGC-3'，HpaⅡ识别和切割位点是5'-C↓CGG-3'，二者切割产物连接后的序列为 -GCGG- 。GlaⅠ识别和切割位点是5'-GC↓GC-3'，连接后的 -GCGG- 序列不能被GlaⅠ识别和切割，B正确； C、同尾酶是指识别位点不同但能切出相同黏性末端的限制酶。HinPⅡ识别和切割位点是5'-G↓CGC-3'，NarⅠ识别和切割位点是5'-GG↓CGCC-3'，二者切割后产生的黏性末端均为 -GCG和C- ，所以HinPⅡ和NarⅠ为同尾酶。 分析连接后的序列能否被GlaⅠ切割：HinPⅡ和NarⅠ切割产物连接后的序列为 -GCGC- ，GlaⅠ识别和切割位点是5'-GC↓GC-3'，该序列能被GlaⅠ识别和切割，C错误； D、GlaⅠ识别和切割位点是5'-GC↓GC-3'，NarⅠ识别和切割位点是5'-GG↓CGCC-3'，可以看出NarⅠ识别位点包含了GlaⅠ的识别位点。某质粒仅含1个GlaⅠ的识别位点，由于DNA是双链结构，从概率角度看，随机出现GlaⅠ识别位点（GC↓GC）的概率为 (1/4)  4 =1/256，而NarⅠ识别位点（GG↓CGCC）包含GlaⅠ识别位点，在仅含1个GlaⅠ识别位点的情况下，该质粒能被NarⅠ切割的概率为1/16（因为在GlaⅠ识别位点基础上，前后各增加一个碱基，共16种可能情况，其中有一种是NarⅠ的识别位点），D正确。 故选C。 3．（2025·浙江杭州·二模）HIV通过细胞膜上的A蛋白侵染人体细胞。欧洲人群中存在A基因的一种突变形式(记为a)，其缺失了32个碱基对导致A蛋白异常，aa个体天然免疫HIV。为了快速辨别甲、乙、丙个体的基因型，用引物F和R分别对甲、乙、丙个体的基因组进行PCR，每组PCR产物都分为两份，一份直接电泳，一份用Apol切割后电泳，结果如图所示。下列叙述正确的是（　　） A．甲、丙个体的2号加样孔中的样品被ApoI处理过 B．测序比对3和4号条带可获得a基因缺失的序列 C．乙个体两个加样孔条带一致可能是ApoI失活导致 D．PCR产物直接电泳无法区分AA、Aa和aa个体 【答案】B 【分析】题干信息分析，A基因和a基因碱基对数量不同，电泳形成两种条带，根据图示可知，A基因具有Apol酶切位点，A基因被酶切后经过电泳会形成两个条带，a基因不能被酶切，因此PCR产物直接电泳最多有两个条带，用Apol切割后电泳最多有三个条带，1号加样孔是用Apol切割后电泳结果，2号加样孔是直接电泳的结果。 【详解】A、A基因和a基因碱基对数量不同，电泳形成两种条带，根据图示可知，A基因具有Apol酶切位点，A基因被酶切后经过电泳会形成两个条带，a基因不能被酶切，因此PCR产物直接电泳最多有两个条带，用Apol切割后电泳最多有三个条带，而甲的1号加样孔有三个条带，说明1号加样孔是用Apol切割后电泳结果，2号加样孔是直接电泳的结果，即甲、丙个体的2号加样孔中的样品没有被ApoI处理过，A错误； B、相比A基因，a基因缺失了32个碱基对，因此4是a基因，3是A基因，测序比对3和4号条带可获得a基因缺失的序列，B正确； C、根据乙的1号加样孔可知，该个体的基因型为aa，由于a基因不能被ApoI酶切，因此出现乙个体两个加样孔条带一致的情况，C错误； D、2号加样孔是直接电泳的结果，AA直接电泳的结果是只有条带3，aa直接电泳的结果是只有条带4，Aa直接电泳的结果是同时有条带3和4，因此PCR产物直接电泳可以区分AA、Aa和aa个体，D错误。 故选B。 4．（2025·浙江金华·二模）下图为细胞内某些大分子物质合成过程局部示意图。下列叙述错误的是（　　）    A．若a链为DNA，则b链可能是RNA B．若该过程为转录过程，则b链为编码链 C．若甲为DNA聚合酶，则b链左侧为3'端 D．若甲为RNA聚合酶，则该酶能识别特定碱基序列 【答案】B 【分析】转录是指以DNA的一条链为模板，通过RNA聚合酶合成RNA的过程。 【详解】A、若a链为DNA，则b链可能是RNA，图示在进行逆转录过程，A正确； B、若该过程为转录过程，a链为RNA，则b链为模板链，B错误； C、若甲为DNA聚合酶，图示在进行DNA复制，子链延伸方向为5'→3'端，因此则b链（模板链）左侧为3'端，C正确； D、若甲为RNA聚合酶，图示在进行转录过程，RNA聚合酶可识别启动子并与之结合驱动基因转录，即该酶能识别特定碱基序列，D正确。 故选B。 5．（2025·浙江金华·二模）家猫的长尾与短尾由等位基因（A、a）基因控制，黑色毛与黄色毛分别由B与b基因控制，且黑黄相间的毛色只会在雌猫中出现。为研究两对基因的遗传方式，进行了观察和实验。回答下列问题： (1)现有一只长尾雌猫与一只短尾雄猫生了4只小猫，其2只雌猫中1只长尾，1只短尾，2只雄猫中1只长尾，1只短尾。根据以上现象 （填“能”或“不能”）判断家猫长尾性状中的显性性状。若能，请写出判断理由；若不能，请设计杂交方案并写出预期结果以确定显性性状。 。 经鉴定后确定长尾为显性性状。 (2)选取一群黑色雌猫与一群黄色雄猫进行随机交配，F1雌猫毛色全为黑黄相间，雄猫全为黑色。F1随机交配产生的F2中雌猫1/2为黑黄相间，1/2为黑色，雄猫中1/2为黑色，1/2为黄色。据此分析，B/b基因位于 染色体上，且亲代雌、雄猫的基因型分别为 、 。为了进一步研究B/b基因的遗传方式，科研人员分别提取了F1雌猫毛囊内色素细胞的DNA与mRNA，用基因B与b对应的单链DNA片段制成探针，利用 技术进行检测。发现每个细胞中的DNA对两种探针检测都呈阳性；而对mRNA检测的结果是部分细胞只对B基因探针呈阳性，部分细胞只对b基因探针呈阳性。出现以上结果的原因可能是 。 (3)科研人员还根据B/b基因两个末端设计了特异性引物，对F1雌猫毛囊内色素细胞中的DNA进行PCR后，得到610kb的DNA片段，然后利用限制酶EcoRⅠ切割后，加入琼脂糖凝胶的 处，电泳后得到结果如下图1所示。请在下图2中用“↑”标出PCR产物中EcoRⅠ识别序列位点，并写出相应片段的大小 。 (4)现有1只短尾黑黄相间猫与1只纯合长尾黄色猫杂交得到子代，请用遗传图解表示该过程 。 【答案】(1) 不能 让F1长尾雌雄猫相互交配，短尾雌雄猫相互交配并多次产仔，若长尾猫子代出现性状分离，则长尾为显性性状，若短尾猫子代出现性状分离，则短尾为显性性状 (2) X XBXB XbY 核酸分子杂交 毛囊内色素细胞只能随机表达B、b基因中的一个（或2条X染色体在体细胞中会随机失活一条） (3) 加样孔处 (4) 【分析】已知一只长尾雌猫与一只短尾雄猫生了4只小猫，其2只雌猫中1只长尾，1只短尾，2只雄猫中1只长尾，1只短尾。由于后代数量过少，不能确定各种性状的比例关系，所以​​不能​​判断家猫长尾性状中的显性性状。判断家猫长尾性状中的显性性状，让F1长尾雌雄猫相互交配，短尾雌雄猫相互交配并多次产仔，若长尾猫子代出现性状分离，则长尾为显性性状，若短尾猫子代出现性状分离，则短尾为显性性状 【详解】（1）已知一只长尾雌猫与一只短尾雄猫生了4只小猫，其2只雌猫中1只长尾，1只短尾，2只雄猫中1只长尾，1只短尾。由于后代数量过少，不能确定各种性状的比例关系，所以​​不能​​判断家猫长尾性状中的显性性状。判断家猫长尾性状中的显性性状，让F1长尾雌雄猫相互交配，短尾雌雄猫相互交配并多次产仔，若长尾猫子代出现性状分离，则长尾为显性性状，若短尾猫子代出现性状分离，则短尾为显性性状。 （2）黑色毛与黄色毛分别由B与b基因控制，且黑黄相间的毛色只会在雌猫中出现，选取一群黑色雌猫与一群黄色雄猫进行随机交配，F1雌猫毛色全为黑黄相间，雄猫全为黑色。所以黑对黄为显性性状，F1随机交配产生的F2中雌猫1/2为黑黄相间XB   Xb，1/2为黑色，雄猫中1/2为黑色，1/2为黄色。由此可知，毛色的遗传与性别相关联，所以B/b基因位于X染色体上。因为F1雌猫毛色全为黑黄相间（XBXb ），雄猫全为黑色（XBY），所以亲代雌、雄猫的基因型分别为XBXB   、XbY。为了进一步研究B/b基因的遗传方式，科研人员分别提取了F1雌猫毛囊内色素细胞的DNA与mRNA，用基因B与b对应的单链DNA片段制成探针，利用核酸分子杂交技术进行检测。发现每个细胞中的DNA对两种探针检测都呈阳性；而对mRNA检测的结果是部分细胞只对B基因探针呈阳性，部分细胞只对b基因探针呈阳性，其原因可能是毛囊内色素细胞只能随机表达B、b基因中的一个（或2条X染色体在体细胞中会随机失活一条）。 （3）对F1雌猫毛囊内色素细胞中的DNA进行PCR后，得到610kb的DNA片段，然后利用限制酶EcoRⅠ切割后，加入琼脂糖凝胶的加样孔处； 已知用基因B与b对应的单链DNA片段制成引物，对F1雌猫毛囊内色素细胞中的DNA进行PCR后，得到610kb的DNA片段，然后利用限制酶EcoRⅠ切割后，电泳得到3条带，分别为610kb、403kb、207kb。因为610 = 403 + 207，所以EcoRⅠ识别序列位点在610kb片段的中间位置，将610kb的片段切割成403kb和207kb两个片段，如下图 （4）经鉴定后确定长尾为显性性状，已知短尾黑黄相间猫（aaXBXb  ）与纯合长尾黄色猫（AAXbY）杂交，其遗传图解如下 6．（2025·浙江金华·二模）水稻白叶枯病是由水稻白叶枯病原菌引起的病害，对水稻危害严重，较难进行化学防治，为此科研人员通过转基因技术将白叶枯病抗性基因Xa2l转入水稻品种C418.T-DNA两端有左边界（LB）和右边界（RB），边界间序列进入植物细胞。回答下列问题： (1)制备得到含目的基因（Xa2l）的双右边界T-DNA重组质粒，如下图1所示。 据图可知，制备重组质粒时使用的限制酶为 。重组质粒中含有ColE Ori的意义是 。利用含该重组质粒的农杆菌侵染植物愈伤组织，转移进入植物细胞的T-DNA片段可能含有的基因是 或 。 (2)将含有重组质粒的大肠杆菌接种至 培养基中扩大培养后，提取其中的DNA并通过电泳将重组质粒 。切割含相应条带的凝胶回收重组质粒后，将其与处于感受态的农杆菌混合培养一段时间，再转移至含壮观霉素的培养基中一段时间，筛选得到含重组质粒的农杆菌。影响重组质粒转化农杆菌效率的因素有 （答出2点即可）。 (3)将含重组质粒的农杆菌菌液滴加在愈伤组织表面后一段时间，利用加入含头孢霉素的无菌水冲洗愈伤组织以 。而后将愈伤组织转移至含潮霉素的MS培养基中进行 培养以获得更多的愈伤组织，从功能角度分析，该培养基属于 培养基。将愈伤组织培养至完整植株，在叶片上施用水稻白叶枯病原细菌，目的是检验 。 (4)现获得了同时转入两种类型T-DNA各1个并成功整合到染色体上的一株亲代转基因水稻，请在下图2（竖线表示染色体）中标出T-DNA上基因（可用短横线表示基因）整合在染色体上的可能性 。 【答案】(1) KpnI 使重组质粒在大肠杆菌中复制与扩增 Xa2l Xa2l与hpt (2) LB液体 分离 农杆菌状态，培养液温度，重组质粒的含量等 (3) 除去农杆菌 继代 选择 转基因是否成功/目的基因是否已经成功表达/水稻是否具有白叶枯病抗性 (4) 【分析】基因工程的基本操作步骤主要包括四步：①目的基因的获取；②基因表达载体的构建；③将目的基因导入受体细胞；④目的基因的检测与表达。其中，基因表达载体的构建是基因工程的核心。 【详解】（1）制备得到含目的基因（Xa2l）的双右边界T-DNA重组质粒，如下图1所示，该酶在LB、RB2两边都有，制备重组质粒时使用的限制酶为KpnI，即用KpnI对目的基因和质粒进行切割，以得到相同的黏性末端，再连接得到重组质粒如图1；ColE Ori为大肠杆菌复制起点，使重组质粒在大肠杆菌中复制与扩增；Xa2l是目的基因，需要整合到植物细胞的染色体上，因此必须位于T-DNA中，hpt为潮霉素抗性基因，有利于筛选含目的基因的植物细胞，因此进入植物细胞的T-DNA片段可能含有的基因是Xa2l或Xa2l与hpt。 （2）液体培养基能对微生物进行扩大培养；不同的DNA在电泳中形成的条带不同，电泳能对重组质粒（DNA）进行分离；农杆菌状态，培养液温度，重组质粒的含量等都会影响重组质粒转化农杆菌效率。 （3）头孢是抗生素，可以杀灭细菌，利用加入含头孢霉素的无菌水冲洗愈伤组织以除去农杆菌；将愈伤组织转移至含潮霉素的MS培养基中进行继代培养，以获得更多的愈伤组织；由于加了潮霉素能筛选出抗潮霉素的植物细胞，因此该培养基属于选择培养基；将愈伤组织培养至完整植株，在叶片上施用水稻白叶枯病原细菌，是为了检验转基因是否成功/目的基因是否已经成功表达/水稻是否具有白叶枯病抗性。 （4）现获得了同时转入两种类型T-DNA（只含Xa2l、含Xa2l与hpt）各1个并成功整合到染色体上的一株亲代转基因水稻，可能的位置为。 7．（2025·浙江杭州·二模）科研人员利用pBI质粒将沙冬青的低温诱导基因(Am基因)导入烟草中，以获得抗寒烟草。pBI质粒是一种农杆菌表达载体，其结构如图所示。其中，NPTII是能在植物细胞中表达的卡那霉素抗性基因；Neo是能在细菌细胞中表达的新霉素抗性基因；GUS基因的表达产物会让菌落呈现蓝色，否则菌落呈现白色；GUS基因两侧分别有SacI和XbaI的单一酶切位点。回答下列问题：    (1)构建重组DNA分子。用SacI和XbaI切割质粒，对产物进行 ，然后对结果中的 (填“大”或“小”)片段切胶回收待用。PCR扩增Am基因，有时PCR会出现非特异性产物，非特异性产物出现的可能因素有哪几项? 。(A．引物特异性不强；B．退火温度过低；C．循环次数过少；D．模板数量太少)据图分析，引物2的5'端需添加 的识别序列。用相同的限制酶切割Am基因，连接得到重组DNA分子。DNA连接酶的最适温度为37℃，但在此温度下黏性末端之间互补形成的氢键易断裂从而影响连接效果，故DNA连接酶催化反应的条件一般为 。(A．无需缓冲液，37C1h；B．需要缓冲液，37C1h；C．无需缓冲液，16℃过夜；D．需要缓冲液，16℃过夜) (2)转化农杆菌及检测。用 和低温处理农杆菌，加入重组DNA分子完成转化实验。将完成转化实验的菌液涂布到含新霉素的培养基上，将培养皿 于恒温培养箱中培养，形成 色菌落的是含重组DNA分子的阳性菌。若对阳性菌进行进一步的鉴定，可用引物1、2对阳性菌进行PCR，阳性菌为该PCR反应提供了 (3)转化植物细胞及检测。用重组农杆菌侵染烟草细胞，添加 筛选出成功转化的烟草细胞。诱导阳性烟草细胞脱分化为愈伤组织，进一步得到烟草植株，若 ，则表明该基因工程项目成功。 【答案】(1) 电泳 大 AB SacI D (2) CaCl2(Ca2+) 倒置 白 模板 (3) 卡那霉素 烟草植株抗寒/耐寒/耐低温(意思相近即可) 【分析】基因工程技术的基本步骤： （1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。 （2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。 （3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法。 （4）目的基因的检测与鉴定：分子水平上的检测、个体水平上的鉴定。 【详解】（1）用SacI和XbaI切割质粒后，会得到不同大小的DNA片段，为了分离这些片段，对产物进行电泳。对结果中的大片段切胶回收待用， 因为较大的片段更可能包含完整的基因或重要的功能区域，而较小的片段可能是非特异性产物或不需要的部分。PCR扩增Am基因，有时PCR会出现非特异性产物，非特异性产物出现的可能因素有：A、如果引物设计不合理，可能会与非目标序列结合，导致非特异性扩增。B、退火温度过低会导致引物与非目标序列结合，增加非特异性产物的生成。由于引物2与终止子位置接近，需在其5′端添加SacI的识别序列。黏性末端连接的最佳条件一般选“需要缓冲液，16℃过夜”(即选项D)。 （2） 常用“CaCl2”溶液和低温处理农杆菌，再加入重组DNA分子完成转化。将涂布好菌液的培养皿“倒置”于恒温培养箱中培养。能形成“白”色菌落的是含重组DNA分子的阳性菌(即GUS基因被替换)。对阳性菌用引物1、2进行PCR时，阳性菌提供了模板。 （3）用重组农杆菌侵染烟草细胞后，添加卡那霉素筛选成功转化的烟草细胞。若得到的烟草植株抗寒/耐寒/耐低温的表型，则说明该基因工程成功。 8．（2025·浙江宁波·二模）苏云金杆菌产生的Bt毒素蛋白具有杀虫能力，科研人员利用由Bt毒素蛋白基因（Bt基因）改造而来的目的基因，成功培育出转基因抗虫棉。目的基因改造过程如图所示（数字表示基因序列中对应的核苷酸序号），其中穿梭质粒载体含T-DNA但不含Vir基因（可辅助T-DNA转移），由天然Ti质粒改造而来。 注：F1-F3，R1-R3表示引物；T-DNA-LB表示左边界；T-DNA-RB表示右边界；Ori表示复制原点；KanR表示卡那霉素抗性基因；HygBR表示潮霉素B抗性基因。 回答下列问题： (1)从苏云金杆菌中提取DNA操作中，加入的酒精所起作用是 和沉淀DNA。以提取的DNA作模板，选用图中的引物 进行PCR，可扩增Bt基因。 (2)改造目的基因时，一方面利用特定酶断开 键，去除与毒性无关的部分序列，以减小分子量，便于将重组DNA导入受体细胞；另一方面，由于细菌和棉花对密码子的偏好有所不同，还需人工合成部分基因序列，以进一步得到不一样的 序列，从而提高基因表达中 过程的效率。 (3)与直接导入同时含有T-DNA和Vir基因的Ti质粒相比，将穿梭质粒和辅助质粒（含Vir基因但不含T-DNA）分别导入农杆菌的优点是 。导入农杆菌的辅助质粒上的vir基因可表达产生 ，用于切割穿梭质粒上的T-DNA。 (4)将转化的农杆菌与棉花叶圆片共培养一段时间后，培养基中加入 可初步筛选得到转化的棉花愈伤组织。若选择培养基中抗生素浓度 ，通常会出现较多假阳性植株。为检测目的基因是否成功导入植株，可提取总DNA作模板进行PCR，则选用的引物应是 。在诱导愈伤组织分化出芽和根的过程中，应注意调整培养基中关键激素的 。 (5)本研究中，用1-1362合成基因序列和1363-1848天然基因序列获得改造的抗虫蛋白，体现了基因工程和 工程的应用。 【答案】(1) 溶解某些蛋白质 F1和R3 (2) 磷酸二酯 mRNA/密码子 翻译 (3) 质粒小，转化成功率高 限制性内切核酸酶 (4) 潮霉素B 过低 F3和R2 浓度和比例/浓度和配比 (5)蛋白质 【分析】基因工程技术的基本步骤：（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。（4）目的基因的检测与鉴定。 【详解】（1）在从苏云金杆菌中提取 DNA 操作中，加入酒精的作用是溶解蛋白质（因为 DNA 不溶于酒精，而某些蛋白质等杂质可溶于酒精）和沉淀 DNA。要扩增 Bt 基因，根据 PCR 引物的设计原则（引物要与目的基因两端的序列互补配对），从图中可知应选用引物 F1和R3进行 PCR。 （2）改造目的基因时，一方面利用特定限制酶切开磷酸二酯键（限制酶能够识别特定的核苷酸序列，并在特定的位点切割 DNA 分子，作用的是磷酸二酯键），去除与毒性无关的部分序列，以减小分子量，便于将重组 DNA 导入受体细胞；另一方面，由于细菌和桃花对密码子的偏好有所不同，还需人工合成部分碱基序列，以进一步得到不一样的密码子序列，从而提高基因表达中翻译过程的效率（不同生物对密码子的偏好不同，优化密码子可以使目的基因在受体细胞中更高效地进行翻译合成蛋白质）。 （3）与直接导入同时含有T-DNA和Vir基因的Ti质粒相比，将穿梭质粒和辅助质粒（含Vir基因但不含T-DNA）分别导入农杆菌的优点是质粒小，转化成功率高（如果使用含有 T - DNA 和 Vir 基因的 Ti 质粒，其自身的 T - DNA 可能会随机整合到受体细胞基因组中，影响实验结果，而分开导入可以更精确地控制 T - DNA 的来源）。根据限制酶的作用可知导入农杆菌的辅助质粒上的 Vir 基因可表达产生限制性内切核酸酶，用于切割穿梭质粒上的 T - DNA。 （4）结合基因表达载体的示意图，根据图中穿梭质粒上的KanR和HygBR两个标记基因的位置，用HygBR基因对应的抗生素初步筛选转化的棉花愈伤组织。若选择培养基中抗生素浓度过低，通常会出现较多假阳性植株（因为抗生素浓度低不能有效抑制未转化的细胞生长，一些未成功导入重组质粒的细胞也可能存活下来）。PCR扩增目的基因（由图可知，该目的基因是人工合成的1-1362基因序列与1363-1848基因序列拼接成的）时，引物应在目的基因的两端，所以为检测棉花植株是否导入目的基因，应选用的引物是F3、R2。在诱导愈伤组织分化出芽和根的过程中，应注意调整培养基中关键激素（生长素和细胞分裂素）的浓度比例（不同的浓度比例会影响愈伤组织分化的方向，生长素与细胞分裂素比值高时，有利于根的分化；比值低时，有利于芽的分化）。 （5）本研究中，用 1 - 1362 合成基因序列和 1363 - 1848 天然基因序列获得改造的抗虫蛋白，体现了基因工程和蛋白质工程的应用（蛋白质工程是通过基因修饰或基因合成，对现有蛋白质进行改造，或制造一种新的蛋白质，这里对天然的抗虫蛋白基因进行改造获得新的抗虫蛋白，涉及蛋白质工程，同时将改造后的基因导入植物细胞涉及基因工程）。 9．（2025·浙江·二模）某科研团队为了验证农杆菌转化植物的功能，利用长冠瘿瘤的葡萄植株根据科学史上一系列研究进行了以下实验。请回答下列问题： (1)切下冠瘿瘤的一部分，经 后，取液体部分，稀释后利用 法接种至LB固体培养基中，获得较好分散度的单菌落。 (2)分别取平板上的每个单菌落制成菌悬液后，侵染植物愈伤组织，结果发现只有部分菌落的菌种能致瘤，说明 。接种一段时间后杀死农杆菌，发现冠瘿瘤的生长不再依赖于农杆菌，且冠瘿组织的无限生长不需要外源的植物激素，原因是 。 (3)取其中致瘤的农杆菌菌种，接种至LB液体培养基进行 ，48h后提取其中的DNA并通过 分离纯化得到其中的质粒DNA，发现质粒DNA分子量大于处在相同位置的线性Marker DNA，说明等分子量的 迁移速率更大。 (4)科研团队还研究了质粒中Vir系列基因的作用，发现敲除农杆菌内质粒上的VirC与VirD基因后，无法合成 酶从而无法在农杆菌内切割与复制得到游离的T-DNA。而将农杆菌内质粒上的VirE基因敲除后，侵染愈伤组织发现不再致瘤，且农杆菌胞内会出现被自身核酸酶切割后的不等长T-DNA片段，说明VirE基因表达产物的作用是 。 (5)将农杆菌分为两组，分别将GFP（绿色荧光蛋白）基因连接至甲组农杆菌质粒的T-DNA内部基因启动子下游与乙组农杆菌质粒的T-DNA外部基因启动子下游。侵染愈伤组织后，可在甲组 中检测到绿色荧光，乙组 中检测到绿色荧光，原因是 。 【答案】(1) 研磨（破碎） 与过滤（离心） 稀释涂布平板 (2) 冠瘿瘤表面或内部含有农杆菌与其他微生物 农杆菌中的T-DNA已经转移至植物细胞内 ，且T-DNA中含有相关植物激素合成基因并能在植物细胞内成功表达 (3) 扩大培养 电泳 质粒/环状DNA (4) 限制酶与DNA聚合酶 保护T-DNA，避免被农杆菌自身的核酸酶降解 (5) 愈伤组织/植物细胞 农杆菌细胞 T-DNA内部基因启动子在植物细胞内发挥作用而T-DNA外部基因启动子在农杆菌中发挥作用 【分析】1、微生物接种方法： （1）平板划线接种法：平板划线接种法主要用于分离和纯化微生物，通过划线使微生物在琼脂平板上分散生长，形成单个菌落。  ‌分区划线法‌：将平板分为四个区域，依次划线，每划完一个区域后需烧灼接种环以稀释菌液，最终在第四区获得单个菌落；连续划线法‌：在平板上连续划线，无需分区，适用于菌液浓度较低的情况； （2）稀释涂布平板法：将一定量的菌液滴加在平板上，用无菌涂布耙均匀涂布，使菌液分散至整个平板表面，培养后挑取单个菌落，适用于菌液浓度较低或需要均匀分布的情况； 2、基因表达载体包括目的基因、标记基因、启动子和终止子。标记基因的作用是为了鉴别受体细胞中是否含有目的基因，从而将含有目的基因的细胞筛选出来； 3、土壤农杆菌是一种革兰氏阴性土壤杆菌，感染双子叶植物会产生根瘤，其致瘤特性是由 Ti 质粒介导的。质粒是根癌农杆菌诱发冠瘿瘤的决定因素； 4、天然的质粒不能直接作为表达载体，必须加以改造才能作为载体利用。 【详解】（1）切下冠瘿瘤的一部分后，需要进行研磨（破碎） 与过滤（离心），这样可以使微生物分散在液体中，便于后续操作。要获得较好分散度的单菌落，常用的接种方法是稀释涂布平板法。因为稀释涂布平板法可以将菌液均匀地涂布在固体培养基表面，从而使单个微生物在培养基上形成单菌落； （2）只有部分菌落的菌种能致瘤，这说明冠瘿瘤表面或内部含有农杆菌与其他微生物；接种一段时间后杀死农杆菌，冠瘿瘤的生长不再依赖于农杆菌且不需要外源植物激素，原因是致瘤农杆菌将Ti质粒上的T - DNA整合到了植物细胞的染色体DNA上，T-DNA上含有控制合成植物激素的基因，这些基因在植物细胞中表达，使植物细胞能够自主合成植物激素，从而维持冠瘿组织的无限生长； （3）将致瘤的农杆菌菌种接种至LB液体培养基进行扩大培养（或液体培养），液体培养基可以为微生物提供充足的营养物质，使其大量繁殖；提取DNA后通过电泳分离纯化得到其中的质粒DNA。电泳是根据DNA分子的大小、形状和电荷等特性，在电场作用下使其在凝胶中迁移，从而实现分离；发现质粒DNA分子量大于处在相同位置的线性Marker DNA，说明在相同条件下，质粒（或环状DNA）迁移得更快，也就是等分子量的质粒（或环状DNA）迁移速率更大； （4）由题意可知，敲除农杆菌内质粒上的VirC与VirD基因后无法在农杆菌内切割与复制得到游离的T-DNA，这一过程需要的酶是切割T-DNA的相关酶和DNA复制有关的酶，通常是限制性核酸内切酶（限制酶）和DNA聚合酶；敲除VirE基因后，农杆菌胞内会出现被自身核酸酶切割后的不等长T-DNA片段，且不再致瘤，这说明VirE基因表达产物能够保护T-DNA不被农杆菌自身的核酸酶降解； （5）甲组将GFP基因连接至农杆菌质粒的T-DNA内部基因启动子下游，T-DNA会整合到愈伤组织细胞的染色体DNA上，随着染色体DNA的转录和翻译，可在愈伤组织细胞的细胞核（因为基因转录主要在细胞核进行，且整合到染色体DNA上 ）中检测到绿色荧光；乙组将GFP基因连接至农杆菌质粒的T-DNA外部基因启动子下游，T-DNA不会整合到愈伤组织细胞的染色体DNA上，但是由于启动子能启动转录，所以在农杆菌自身细胞内（因为基因在农杆菌质粒上，在农杆菌内进行转录和翻译 ）可检测到绿色荧光。 原因：只有当GFP基因位于T-DNA内部时，T-DNA才能整合到愈伤组织细胞的染色体DNA上并在细胞内表达，而位于T -DNA外部时，不会整合到愈伤组织细胞染色体DNA上，只能在农杆菌自身细胞内表达。 10．（2025·浙江温州·二模）水稻是全球最重要的粮食作物之一，提高其光合作用效率对于保障粮食安全具有重要意义。近年来，科学家们通过基因工程技术将蓝藻中的相关基因导入水稻，以提高其光合效率和产量。回答下列问题： (1)扩增目的基因。研究人员需要根据 序列设计引物；在PCR反应前，在微量离心管中加入原料、酶等成分后离心，其目的是 ；适当提高退火温度可以提高PCR扩增的特异性，原因是 。 (2)构建并鉴定重组质粒。表达载体与含目的基因的DNA片段如图1所示，据图分析，用一种限制酶与DNA连接酶构建重组质粒时，应选择的限制酶是 。完成构建后，取样、鉴定质粒时，选用限制酶 （填“E”或“B”或“H”或“X”）进行完全酶切并电泳，电泳时需要添加的缓冲液有 （A．磷酸缓冲液  B．Tri-硼酸缓冲液  C．上样缓冲液  D．扩增缓冲液），电泳结果如图2所示：图2中出现结果Ⅰ的原因是 ，出现结果Ⅱ、Ⅲ的原因是 。最后，根据电泳结果，筛选出正确的重组质粒。 (3)导入目的基因。将高效光合基因导入水稻细胞后，培养时在培养基中添加潮霉素（抑制蛋白质合成）的目的是______。 A．促进受体细胞分裂 B．筛选符合要求的水稻细胞 C．抑制未导入质粒的细胞的生长 D．诱导高效光合相关基因表达 (4)检测目的基因的表达。研究团队将蓝藻的高效光合相关基因成功转入水稻细胞，但培养获得的转基因植株中，约30%个体的光合速率未显著提升，可能的原因有 （写出2点）。 【答案】(1) 目的基因(两端) 使反应液集中于微量离心管底部 退火温度越高，引物与模板链的结合越精准，非特异性扩增减少 (2) B E BC 有质粒未接入目的基因 目的基因接入质粒时，有正接与反接两种情况 (3)C (4)导入的基因未正常转录/导入的基因转录后未正常翻译/导入的基因发生了突变/导入的基因不能正常表达 【分析】基因表达载体的构建是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。启动子：启动转录，终止子：终止转录。 【详解】（1）研究人员需要根据目的基因(两端)的核苷酸序列设计引物，因为引物要与目的基因特定区域互补配对，引导DNA聚合酶延伸合成新的DNA链。在PCR反应前，在微量离心管中加入原料、酶等成分后离心，其目的是使反应液集中在离心管底部，提高反应效率。如果反应液不集中，可能会导致反应不均匀，影响PCR扩增效果。适当提高退火温度可以提高PCR扩增的特异性，原因是较高的退火温度使引物与模板结合的特异性增强，减少引物与非目的基因序列的错配结合。 （2）构建并鉴定重组质粒。表达载体与含目的基因的DNA片段如图1所示，据图分析，用一种限制酶与DNA连接酶构建重组质粒时，应选择的限制酶是B，因为在目的基因的两端有限制酶B的识别序列，质粒也有酶B的识别序列，完成构建后，取样、鉴定质粒时，选用限制酶E进行完全酶切并电泳，因为重组质粒目的基因前，启动子后有酶E的识别位点，并且标记基因上有酶E的识别位点，电泳时需要添加的缓冲液有，B、Tri - 硼酸缓冲液一般用于特定的电泳如等电聚焦电泳等；C上样缓冲液主要起增加样品密度、使样品沉入加样孔以及含有指示剂便于观察等作用，使电泳结果更准确；而A、磷酸缓冲液常用于维持电泳体系的pH稳定，该体系未涉及酸碱，不需要使用，D扩增缓冲液是用于PCR扩增反应的，与电泳无关，故选BC。 图2中出现结果Ⅰ的原因是有质粒未接入目的基因，电泳只出现未切割的质粒条带。因为没有导入质粒，就只有原本存在于细胞中的未切割质粒，在电泳中呈现一条条带。 出现结果Ⅱ、Ⅲ的原因是目的基因接入质粒时，有正接与反接两种情况，导致出现大小不同的条带。 （3）ABCD、将高效光合基因导入水稻细胞后，培养时在培养基中添加潮霉素（抑制蛋白质合成）的目的是筛选符合要求的水稻细胞。因为只有导入了含潮霉素抗性基因（一般在表达载体上）的重组质粒的水稻细胞，抑制未导入质粒的细胞的生长，从而筛选出含有目的基因的细胞，C正确，ABD错误。 故选C。 （4）导入的基因未正常转录/导入的基因转录后未正常翻译/导入的基因发生了突变/导入的基因不能正常表达，可能会导致培养获得的转基因植株中，约30%个体的光合速率未显著提升。 试卷第1页，共3页 2 / 2 学科网（北京）股份有限公司 $$ 专题08 发酵工程和细胞工程 发酵工程考点01 （2025·浙江·二模）阅读下列材料，完成下面小题。 以下所示为猕猴桃苹果复合果醋发酵工艺。猕猴桃、苹果→榨汁→混合→酶解→巴氏杀菌→加入酵母菌→酒精发酵→过滤→加入醋酸菌→醋酸发酵→离心→调配→灌装→巴氏杀菌→成品 1．下列关于发酵过程中细胞代谢的叙述，正确的是（    ） A．酵母菌加入到发酵液后只进行厌氧呼吸产生乙醇 B．酵母菌在发酵中持续增殖导致其数量不断增多 C．醋酸菌进行需氧发酵支持生命活动，主要在线粒体内进行 D．氧气能将乙醇氧化成醋酸是醋酸发酵不能密闭的原因之一 2．下列关于复合果醋发酵的叙述，正确的是（    ） A．果汁中加入纤维素酶和果胶酶有利于提高果汁产量 B．发酵后进行巴氏杀菌是为了将发酵液中的微生物完全杀死 C．加入醋酸菌前调整醋酸浓度以避免对醋酸菌造成影响 D．发酵菌种的类型与比例不会影响复合果醋的口感 3．（2025·浙江·二模）为了筛选能平衡肠道菌群和降解胆固醇的乳酸菌，下列叙述正确的是（    ） A．可从酸奶和泡菜中采样分离乳酸菌 B．以胆固醇为唯一N 源的培养基进行筛选 C．平板倒置培养创造无氧环境 D．无需检测目的菌株的抗生素敏感性 4．（2025·浙江金华·二模）某制醋工艺流程如下图所示。酒曲中含有霉菌、酵母菌、乳酸菌等菌种，霉菌能够产生糖化酶将淀粉水解。醋醅含有醋酸菌。下列叙述错误的是（　　） A．该发酵过程属于混菌发酵，可改善成品的风味 B．醋酸发酵过程中经常翻动发酵物，有利于改善通气状况 C．糖化和酒精发酵阶段的温度应高于醋酸发酵阶段的温度 D．装坛的成品中不含有醋酸菌等发酵菌种 5．（2025·浙江温州·二模）泡菜是一类营养丰富且受大众喜爱的食品。下列属于泡菜制作中必需的操作是（    ） A．蔬菜经高压蒸汽灭菌 B．装坛时盐水没过蔬菜 C．发酵前添加陈泡菜汁 D．发酵中定期开盖排气 6．（2025·浙江杭州·二模）连续发酵是指以一定的速度向培养系统内添加新鲜的培养液，同时以相同的速度流出，维持培养系统内培养液量的恒定，使微生物细胞能在近似恒定状态下生长的微生物培养方式。下列叙述正确的是（　　） A．连续发酵有利于及时补充发酵罐中的营养物质 B．连续发酵不利于排出发酵菌产生的有害代谢废物 C．连续发酵过程中无需监控发酵罐内的温度和pH D．连续发酵过程中流出的培养液不含产物故应废弃 7．（2025·浙江宁波·二模）传统泡菜的制作是利用蔬菜表面的微生物来进行发酵。下列叙述错误的是（　　） A．盐水应煮沸冷却后再倒入泡菜坛中 B．用水密封泡菜坛以实现气体只出不进 C．添加陈泡菜水可缩短泡菜制作的时间 D．泡菜制作中的亚硝酸盐含量逐渐降低 8．（2025·浙江·二模）某科研团队为了验证农杆菌转化植物的功能，利用长冠瘿瘤的葡萄植株根据科学史上一系列研究进行了以下实验。请回答下列问题： (1)切下冠瘿瘤的一部分，经 后，取液体部分，稀释后利用 法接种至LB固体培养基中，获得较好分散度的单菌落。 (2)分别取平板上的每个单菌落制成菌悬液后，侵染植物愈伤组织，结果发现只有部分菌落的菌种能致瘤，说明 。接种一段时间后杀死农杆菌，发现冠瘿瘤的生长不再依赖于农杆菌，且冠瘿组织的无限生长不需要外源的植物激素，原因是 。 (3)取其中致瘤的农杆菌菌种，接种至LB液体培养基进行 ，48h后提取其中的DNA并通过 分离纯化得到其中的质粒DNA，发现质粒DNA分子量大于处在相同位置的线性Marker DNA，说明等分子量的 迁移速率更大。 (4)科研团队还研究了质粒中Vir系列基因的作用，发现敲除农杆菌内质粒上的VirC与VirD基因后，无法合成 酶从而无法在农杆菌内切割与复制得到游离的T-DNA。而将农杆菌内质粒上的VirE基因敲除后，侵染愈伤组织发现不再致瘤，且农杆菌胞内会出现被自身核酸酶切割后的不等长T-DNA片段，说明VirE基因表达产物的作用是 。 (5)将农杆菌分为两组，分别将GFP（绿色荧光蛋白）基因连接至甲组农杆菌质粒的T-DNA内部基因启动子下游与乙组农杆菌质粒的T-DNA外部基因启动子下游。侵染愈伤组织后，可在甲组 中检测到绿色荧光，乙组 中检测到绿色荧光，原因是 。 9．（2025·浙江·二模）灵芝是一种药用真菌，它的多糖和三萜类化合物是主要的活性物质，具有抗氧化、抗癌、抗衰老等多种生理功能。科研者通过多种育种方式的结合选育出具有优良性状的菌种，再利用液态深层发酵技术生产功能活性物质。 (1)育种 ①获得原生质体：活化的原始菌种培养4-5天，对发酵液进行 操作，取菌体加入已灭菌的溶壁酶和较高渗透压的甘露醇溶液进行酶解获得原生质体，利用 (填仪器)对其进行显微镜观察计数。 ②人工诱导变异：对原生质体进行化学诱导选育出高产多糖的菌种A和高产三萜类化合物的B，其育种原理是 。相对于整个细胞，诱导原生质体更容易达到目的，原因是 。 ③诱导原生质体融合：对菌种A、B的原生质体加入聚乙二醇和 Ca²⁺辅助诱导剂诱导融合，进一步 出具有同时高产多糖和三萜类化合物的新菌种Y。Ca²⁺辅助诱导剂作用机理可能是 。 (2)深层液体发酵 基本过程：菌种Y→试管斜面培养→摇瓶种子培养→繁殖罐培养→发酵罐培养→发酵产品处理。 ①菌种是发酵工业的关键，用于发酵生产的菌种Y除了高产多糖和三萜类化合物外，还应满足的条件有 A．菌种发酵产物易于分离            B．培养基来源充足且廉价，被转化的效率高 C．菌种遗传特性和生产能力稳定      D．菌种对环境没有明显危害 ②摇瓶培养的目的是 。深层发酵技术相较于传统农业栽培具有 等方面的优势。 ③优化培养条件是发酵生产高效顺利进行的重要措施。科研者以葡萄糖、蛋白胨、pH值三个因素为自变量，以获得较高灵芝浸膏多糖产量，实验结果见表。 试验序号 A．葡萄糖浓度(%) B．蛋白胨(%) C． pH值 灵芝浸膏多糖含量(%) 菌丝干重(g/100mL) 1 1(2%) 1(0.2%) 1(pH5.0) 10.3 14.9 2 1(2%) 2(0.4%) 2(pH6.0) 11.2 16.5 3 1(2%) 3(0.6%) 3(pH7.0) 10.8 15.2 4 2(3%) 1(0.2%) 3(pH7.0) 8.9 10.6 5 2(3%) 2(0.4%) 2(pH6.0) 9.2 12.4 6 2(3%) 3(0.6%) 1(pH5.0) 7.1 9.9 7 3(4%) 1(0.2%) 2(pH6.0) 8.1 10.2 8 3(4%) 2(0.4%) 3(pH7.0) 7.2 8.6 9 3(4%) 3(0.6%) 1(pH5.0) 6.8 8.4 从表中可得，对灵芝浸膏多糖含量影响最重要的因素为 。当培养基组成为 为最优条件组合。 细胞工程考点02 1．（2025·浙江金华·二模）2011年我国首次利用转基因和体细胞核移植技术成功培育了高产赖氨酸转基因克隆奶牛，其乳汁中含有较高含量的赖氨酸。其基本流程为：构建乳腺专一表达载体→表达载体导入牛胚胎成纤维细胞（BEF）→核移植→重组细胞的体外培养及胚胎移植→检测。下列叙述错误的是（　　） A．表达载体导入的牛胚胎成纤维细胞（BEF）为供体细胞 B．需将重组细胞体外培养至桑椹胚或囊胚再进行胚胎移植 C．高产赖氨酸转基因克隆奶牛的性别与胚胎受体母牛无关 D．检测时可选取克隆奶牛牛耳组织细胞检测目的基因的表达情况 2．（2025·浙江金华·二模）研究人员以白菜细胞（2n=20）与甘蓝细胞（2n=18）进行植物体细胞杂交得到杂种植株。通过PCR对杂种植株和亲本植株的物种特异性DNA进行扩增，电泳结果如下图所示。下列说法错误的是（　　） A．据图推测杂种植株的染色体数小于38条 B．叶绿体密度与液泡颜色等差异可做为区分杂交细胞类型的依据 C．通过凝胶电泳结果可知，杂种植株兼具有白菜和甘蓝的某些遗传特性 D．植物体细胞杂交的优点是可以克服远缘杂交不亲合，并保持双亲优良性状 3．（2025·浙江金华·二模）哺乳动物红细胞的部分生命历程如下图所示，图中除成熟红细胞外，其余细胞中均有核基因转录的RNA．下列叙述错误的是（　　） A．网织红细胞仍然能够表达出某些核基因编码的蛋白质 B．成熟红细胞细胞仍能进行细胞呼吸 C．成熟红细胞经脱分化后可转变为造血干细胞 D．造血干细胞中血红蛋白基因突变仍能分化出幼红细胞 4．（2025·浙江杭州·二模）紫草素是一种重要的化工产品，可从天然紫草中获取，但来源有限。科学家先利用紫草叶片培育出紫草愈伤组织，再通过培养基中的各类成分诱导愈伤组织合成紫草素，实现紫草素的大规模生产。下列叙述错误的是（　　） A．上述过程体现了植物细胞具有全能性 B．上述过程中紫草细胞经历了脱分化 C．培育紫草愈伤组织的过程需控制植物激素配比 D．可利用基因工程和发酵工程大量合成紫草素 （2025·浙江·二模）阅读下列材料，完成下面小题。 CAR-T细胞治疗常用于血液系统恶性疾病的治疗。该疗法通过基因工程技术对从患者采集的外周血T细胞进行加工，使其表达CAR（嵌合抗原受体—一种人工构建的细胞表面受体），大量增殖后回输到受者体内，以非MHC依赖方式（依赖于CAR）识别抗原对肿瘤细胞进行杀伤，达到治疗疾病的目的。 5．下列关于CAR蛋白质的叙述，错误的是（    ） A．该蛋白质由附着在内质网上的核糖体合成 B．高尔基体上脱落形成的囊泡膜上不可能含有该蛋白 C．该蛋白质包含脂溶性部分和水溶性部分 D．该蛋白质的存在说明了细胞膜具有信息交流的功能 6．CAR-T细胞对肿瘤细胞起到杀伤作用，下列叙述正确的是（    ） A．在该过程中主要是体液免疫发挥了作用 B．一种CAR-T细胞可以用于治疗各种肿瘤 C．CAR-T细胞对肿瘤细胞杀伤致死属于细胞坏死 D．常规细胞毒性T细胞需要识别肿瘤细胞表面的抗原-MHC 7．该技术涉及到患者外周血的采集、T细胞与CAR-T细胞的培养。下列叙述错误的是（    ） A．采集到的组织无需胰酶处理即可得到分散的细胞 B．采集用具在使用前需进行灭菌和消毒处理 C．CAR-T细胞的培养需在固体培养基中进行 D．往往需在培养基中加入细胞因子以促进CAR-T细胞增殖 8．TCR由能识别肿瘤抗原的胞外单链抗体可变区（基因片段A控制合成）和胞内信号传导区域（基因片段B控制合成）组成，现欲通过3次PCR将两部分基因融合在一起形成下图结构（数字表示相应的引物），与载体连接后形成重组DNA分子。下列叙述正确的是（    ） A．首先需用引物②、④与引物⑤、⑦扩增两个基因片段 B．引物①与引物⑧的5'端需各添加一个启动子以促进转录 C．引物③与引物⑥需同时使用以加快PCR进程 D．第3次PCR无需加入引物即可获得图示完整片段 9．（2025·浙江温州·二模）动物细胞培养技术在生物制药、疾病治疗等领域中发挥着重要作用。关于动物细胞培养技术的应用，下列叙述错误的是（    ） A．培养哺乳动物受精卵至原肠胚阶段，用于胚胎移植 B．培养干细胞并诱导分化，用于治疗细胞损伤或病变 C．培养正常细胞并观察药物对其的影响，评估药物的疗效和安全性 D．培养杂交瘤细胞制备单克隆抗体，用于癌症及免疫性疾病的治疗 10．（2025·浙江宁波·二模）胚胎工程中的体外受精技术，须将采集到的卵母细胞进行体外培养至成熟。下列叙述正确的是（　　） A．培养卵母细胞要在充满CO₂的培养箱中进行 B．培养基中添加灭菌的血清有利于卵母细胞的培养 C．初次培养的卵母细胞经传代培养可得到大量细胞 D．卵母细胞经培养至完成减数分裂后才可用于受精 11．（2025·浙江金华·二模）水稻白叶枯病是由水稻白叶枯病原菌引起的病害，对水稻危害严重，较难进行化学防治，为此科研人员通过转基因技术将白叶枯病抗性基因Xa2l转入水稻品种C418.T-DNA两端有左边界（LB）和右边界（RB），边界间序列进入植物细胞。回答下列问题： (1)制备得到含目的基因（Xa2l）的双右边界T-DNA重组质粒，如下图1所示。 据图可知，制备重组质粒时使用的限制酶为 。重组质粒中含有ColE Ori的意义是 。利用含该重组质粒的农杆菌侵染植物愈伤组织，转移进入植物细胞的T-DNA片段可能含有的基因是 或 。 (2)将含有重组质粒的大肠杆菌接种至 培养基中扩大培养后，提取其中的DNA并通过电泳将重组质粒 。切割含相应条带的凝胶回收重组质粒后，将其与处于感受态的农杆菌混合培养一段时间，再转移至含壮观霉素的培养基中一段时间，筛选得到含重组质粒的农杆菌。影响重组质粒转化农杆菌效率的因素有 （答出2点即可）。 (3)将含重组质粒的农杆菌菌液滴加在愈伤组织表面后一段时间，利用加入含头孢霉素的无菌水冲洗愈伤组织以 。而后将愈伤组织转移至含潮霉素的MS培养基中进行 培养以获得更多的愈伤组织，从功能角度分析，该培养基属于 培养基。将愈伤组织培养至完整植株，在叶片上施用水稻白叶枯病原细菌，目的是检验 。 (4)现获得了同时转入两种类型T-DNA各1个并成功整合到染色体上的一株亲代转基因水稻，请在下图2（竖线表示染色体）中标出T-DNA上基因（可用短横线表示基因）整合在染色体上的可能性 。 12．（2025·浙江宁波·二模）苏云金杆菌产生的Bt毒素蛋白具有杀虫能力，科研人员利用由Bt毒素蛋白基因（Bt基因）改造而来的目的基因，成功培育出转基因抗虫棉。目的基因改造过程如图所示（数字表示基因序列中对应的核苷酸序号），其中穿梭质粒载体含T-DNA但不含Vir基因（可辅助T-DNA转移），由天然Ti质粒改造而来。 注：F1-F3，R1-R3表示引物；T-DNA-LB表示左边界；T-DNA-RB表示右边界；Ori表示复制原点；KanR表示卡那霉素抗性基因；HygBR表示潮霉素B抗性基因。 回答下列问题： (1)从苏云金杆菌中提取DNA操作中，加入的酒精所起作用是 和沉淀DNA。以提取的DNA作模板，选用图中的引物 进行PCR，可扩增Bt基因。 (2)改造目的基因时，一方面利用特定酶断开 键，去除与毒性无关的部分序列，以减小分子量，便于将重组DNA导入受体细胞；另一方面，由于细菌和棉花对密码子的偏好有所不同，还需人工合成部分基因序列，以进一步得到不一样的 序列，从而提高基因表达中 过程的效率。 (3)与直接导入同时含有T-DNA和Vir基因的Ti质粒相比，将穿梭质粒和辅助质粒（含Vir基因但不含T-DNA）分别导入农杆菌的优点是 。导入农杆菌的辅助质粒上的vir基因可表达产生 ，用于切割穿梭质粒上的T-DNA。 (4)将转化的农杆菌与棉花叶圆片共培养一段时间后，培养基中加入 可初步筛选得到转化的棉花愈伤组织。若选择培养基中抗生素浓度 ，通常会出现较多假阳性植株。为检测目的基因是否成功导入植株，可提取总DNA作模板进行PCR，则选用的引物应是 。在诱导愈伤组织分化出芽和根的过程中，应注意调整培养基中关键激素的 。 (5)本研究中，用1-1362合成基因序列和1363-1848天然基因序列获得改造的抗虫蛋白，体现了基因工程和 工程的应用。 13．（2025·浙江温州·二模）帕金森病是常见的中枢神经系统疾病。酪氨酸羟化酶在帕金森病中起着关键作用，其表达水平的下降与帕金森病的病理过程密切相关。当前研究发现由干细胞分泌的外泌体对该病有一定的治疗作用，回答下列问题。    (1)如图所示，外泌体是一类包含有复杂成分的小膜泡，干细胞分泌外泌体的方式为 ，这种方式体现了细胞膜具有 的结构特点。外泌体与其他细胞膜上的 结合后，将信息传递给靶细胞，发挥调节作用。 (2)为验证干细胞分泌的外泌体对帕金森病有一定的治疗作用，根据以下材料和用具，完善实验思路，设计实验记录表。 材料和用具：正常小鼠若干只，生理盐水配制的MPTP溶液（腹腔注射，用于制备急性帕金森小鼠模型），缓冲液配制的外泌体溶液（静脉注射），生理盐水，缓冲液等。 （要求与说明：实验中涉及的剂量不作具体要求。旋转试验可用于评估小鼠神经系统的功能，其结果可用转圈数进行表示。） ①完善实验思路： 将45只正常小鼠随机分为A、B、C三组，每组15只，其中B、C两组 ，制备成急性帕金森病小鼠模型； A组、B组 ，C组 。 将小鼠置于相同且适宜的条件下饲养，并在T1、T2、T3天， 。 进行数据的统计与分析。 ②设计一张表格，用于记录实验数据。 。 ③实验结果表明，使用外泌体治疗后，在一定时间范围内帕金森病小鼠转圈数明显减少，说明外泌体对帕金森病有一定的治疗作用。请结合信息预测A、B、C三组小鼠体内酪氨酸羟化酶的表达量大小： 。结合上述研究，除注射外泌体外，请再提出1种可能的治疗帕金森病的思路： 。 试卷第1页，共3页 2 / 2 学科网（北京）股份有限公司 $$