专题突破10 综合PCR的基因工程问题-【金榜题名】2026年高考生物一轮总复习

第10章生物技术与工程 专题突破10 综合PCR的基因工程问题 高考目 阐述常规PCR、重叠延伸PCR、荧光定量PCR等的过程与原理，举例说明不同的PCR技术 标定位 有着不同的应用。 类型一利用PCR技术获取目的基因 类型二利用PCR技术鉴定目的基因的 【基本模型】 连接方式 获取目的基因是基因工程操作的第一步。 【基本模型】 获取目的基因的方法有多种，现在常用PCR 检测目的基因在受体细胞内是否稳定存在 特异性地快速扩增目的基因。PCR是聚合 是基因工程操作的重要步骤，可以借助载体 酶链式反应的缩写。它是一项根据DNA半 上的标记基因、PCR技术和核酸分子杂交技 保留复制的原理，在体外提供参与DNA复 术等方法鉴定受体细胞中是否转入了目的 制的各种组分与反应条件，对目的基因的核 基因。在实际操作中，PCR技术不仅可以精 苷酸序列进行大量复制的技术。该技术由 准地鉴定受体细胞是否转入目的基因，还可 穆里斯等人于1985年发明，为此，穆里斯于 以通过引物的巧妙设计鉴定目的基因的连 1993年获得了诺贝尔化学奖。 接方式。 【典例突破】 【典例突破】 1.“X基因”是DNA分子上一个有遗传效应的 2.(2019·江苏，33节选)为鉴定筛选出的菌落 片段，若要用PCR技术特异性地拷贝“X基 中是否含有正确插入目的基因的重组质粒， 因”，需在PCR反应中加入两种引物，两种 拟设计引物进行PCR鉴定。图示为甲、乙、 引物及其与模板链的结合位置如图1所示。 丙3条引物在正确重组质粒中的相应位置， 下列叙述错误的是 PCR鉴定时应选择的一对引物是 某学生尝试用图中另外一对引物从某一菌 引物1引物2 落的质粒中扩增出了400bp片段，原因是 5 X基因 图1 5 2 dq ooI 类型三 利用PCR技术引导基因定点 图2 突变 A.第一轮复制得到2个DNA分子，即①② 【基本模型】 各一个 重叠延伸PCR技术是指在PCR技术的基 B.第二轮复制得到4个DNA分子，即①② 础上，采用具有互补末端的引物，使PCR产 ③④各一个 物形成了重叠链，通过重叠链的延伸，将不 C.第四轮复制得到16个DNA分子，其中有 同来源的片段重叠拼接起来的一项新技术。 4个X基因 该技术在基因的定点突变、长片段基因的合 D.经五轮循环后产物中有五种不同的DNA 成、基因敲除以及目的基因的扩增等方面有 分子 着独特的应用。 337 金榜题名创新高考总复习生物 【典例突破】 类型四 利用PCR技术扩增未知基因 3.水蛭素是一种蛋白质，可用于预防和治疗血 序列 栓。某科研团队运用重叠延伸P℃R技术在 【基本模型】 水蛭素基因中的特定位点引入特定突变，使 利用PCR技术进行基因扩增时，为了便于 水蛭素第47位的天冬酰胺（密码子为 设计引物，要求目的基因两侧的序列是已知 AAC、AAU)替换为赖氨酸（密码子为 AAA、AAG),从而提高水蛭素的抗凝血活 的。当DNA的某些序列已知，而需要扩增 性。原理如图。 已知序列两端的未知序列时，可采用反向 拟突变位点 PCR技术 【典例突破】 引物2 引物4 3 第 4.(2020·江苏，33节选)如果已知一小段 3 3 -5 15 使用引物1和 5' 3 引物3 DNA的序列，可采用PCR的方法，简捷地 段引物1 使用引物3和 ,2进行PCR 4进行PCR 3 分析出已知序列两侧的序列，具体流程如图 5 ④ 3 51 (以EcoR I酶切为例)： 混合、变性后，杂交 -31 染色体DNA 段 3 -5 首先使用DNA聚合酶延伸， 然后使用引物1和4进行PCR 1酵切ER1 5 3 混合的DNA片段 突变后的基因 未知序列巴知序列末知序列片段F 注：图中的引物2和3的突起处代表与模板 Ⅱ连接！DNA连接酶 已知序列 链不能互补的突变位点。 (1)由以上事例可知，要对蛋白质的结构进 PCR引物 环状DNA EcoR I 行改造，需要通过 来 完成。 Ⅲ扩增，Taq DNA聚合酶 PCR产物 (2)若拟突变位点的碱基对为A一T,则需要 V测序、分析， 片段F的 让其突变为 才能达到目的。 3'完整序列 引物2的突变位点（突起处）应设计为 请据图回答问题： (假设引物为单链DNA)。 (1)步骤I用的EcoR I是一种 (3)在第一阶段获得2种具有重叠片段 酶，它通过识别特定的 DNA的过程中，引物1、引物2组成的反应 切割特定位点。 系统和引物3、引物4组成的反应系统中均 (2)步骤Ⅱ用的DNA连接酶催化相邻核苷 进行一次复制，共产生 种DNA分子。 酸之间的3'一羟基与5'一磷酸间形成 该阶段必须将引物1、2和引物3、4置于不 ;PCR循环中，升温到95℃是 同反应系统中，这是因为 为了获得 :Tag DNA聚合酶 的作用是催化 (4)利用重叠延伸PCR技术还可以将两个 不同来源的DNA片段拼接起来。有人想利 用该技术把基因M和N拼接在一起，设计 基因M的引物M1、M2,基因N的引物N1、 (3)若如表所列为已知的DNA序列和设计 N2。在设计这4种引物时，特别要注意的问 的一些PCR引物，步骤Ⅲ选用的PCR引物 题是 必须是 (从引物①②③④中选择， 填编号)。 338 第10章生物技术与工程 DNA序列（虚线处省略了部分核苷酸序列） ①当样本中有目的基因时，引物和探针与目 的基因复性时，通过 原则 已知 5-AACTATGCGCTCATGA ---GCAATGCGTAGCCTCT-3 而特异性结合。 序列 ￥TTGATACGCGAGTACT ----CGTTACGCATCGGAGA-5' ②在PCR循环的延伸阶段，Tag DNA聚合 D5'-AACTATGCGCTCATGA-3 酶催化子链的合成并水解探针。检测到的 PCR 25'-GCAATGCGTAGCCTCT-3' 荧光强度与反应体系中DNA分子数呈 引物 5-AGAGGCTACGCATTGC-3' 5'-TCATGAGCGCATAGTT-3' (填“正相关”或“负相关”)关系。 (3)通过实时荧光PCR检测猴痘病毒感染 类型五 利用PCR技术快速检测病原体 时，检测到的荧光强度变化如图2所示。 【基本模型】 病原体检测是诊断和控制传染病的重要手 1荧光强度 平台期 段，为迅速而准确地确定病原体的存在和种 0.5 类，发展了许多快速检测方法。PCR技术是 线性增长期 Ct值 荧光阈值 一种基于DNA扩增原理的快速病原体检测 指数增长期！ 方法，它能够在几小时内扩增和检测极小量 10203040 的病原体DNA,并且具备高度的特异性和 循环数 图2 敏感性。 【典例突破】 ①与指数增长期相比，线性增长期日的基因 5.猴痘是由猴痘病毒（一种RNA病毒）感染所 数量的增长率下降，原因可能有 致的一种病毒性人畜共患病，临床上表现为 发热、皮疹、淋巴结肿大等。猴痘病毒感染的 ②Ct值的含义：在PCR扩增过程中，每个反 常规检测方法是通过实时荧光PCR鉴定。 应管内的荧光信号达到设定的荧光阈值时 (1)首先，从样本中提取病毒RNA,经 酶作用生成cDNA;然后以cDNA为模板进行 所经历的扩增循环数。因此，当样本中初始 实时荧光PCR扩增，测定样品中病毒核酸量。 模板越多时，Ct值就 (2)通过实时荧光PCR扩增目的基因，需额 ③某新猴痘病毒核酸检测说明书标明，Ct≤ 外添加荧光标记探针（一小段单链DNA,可 37判定为阳性，Ct>40或无C值判定为阴 与目的基因中部序列特异性结合)。当探针 性。图2所示猴痘病毒核酸检测结果应判 完整时，不产生荧光。在PCR过程中，与目 的基因结合的探针被Tag DNA聚合酶水 定为 解，R与Q分离后，R发出的荧光可被检测 (4)(多选)阴性结果也不能排除猴痘病毒感 到（如图1）。 染，可能产生假阴性的因素有 ®探针⊙ a.取样太早，样本中病毒量少，达不到实时 m ⑧性o 荧光PCR检测阈值 ⑨ b.样本被污染，RNA酶将病毒RNA降解 游⑨ c.病毒发生变异 请完成专题突破集训10 图1 339(3)为进一步脸证NV基图的功能，表中的转基图菌林是将NV 类型三 基因导入突变体细胞获得的。突变体由于NV基因发生突变， 【典例突破】 无法正常表达NV酶，导致相关生理功能缺失或异常。通过将 3.【答案】(1)改造基因（或基因定点突变）(2)T-A或C一G 正常的NV基因导入突变体胞，如果能够恢复原本在突变体 A或G(3)3引物2和3中存在互补配对片段，置于同一反应 中缺失或异常的生理功能，就可以有力地证明NV基因确实具 系统时会结合而失去作用(4)M,M中的一种引物与N1,N 有特定的功能。在构建NV基周表达载体时，禽要添加新的标记 中的一种引物必须具有互补配对的片段 基因，原国是便于席迭出成功导入NV基因的细胞。 【解析】(2)若拟突变位点的碱基对为A一T,则需要让其突变 【例4】【答案】(1)只有能利用骏甲基纤维素钠的微生物才能生 为T-A或C一G,对应的密码子由AAU变成AAA或由AAC 长繁殖菌落产：生的纤维茶酶的活性和量有关 变成AAG,可使天冬酰胺替换为赖氨酸。(3)若两个反应系统均 (2)耐高温的DNA聚合酶 进行一次复制，则会产生3种不同的DNA分子，因为引物1和4 (3)基因表达载体的构建限制酶，DNA连接酶 (4)繁殖能力强、生理结构和遗传物质简单，对环境因素敏感，容 产生的DNA分子是一样的。(4)重叠至补引物的设计是重叠延 易进行遗传操作等能吸收周围环境中DNA分子 仲PR技术成功的关键。拼接基因M和N时，设计引物时需要 (5)降解时的温度不同、降解时的pH不同 注意的是，需要我到两种基因的重叠部分，即M、M,中的一种 【解析】(1)选择培养基是指一类根据特定微生物的特珠营养 引物与、1、八中的一种引物必须具有互补配对的片段。 要求或其对某理化周素抗性的原理而设计的培养基。具有只允 类型四 许特定的微生物生长，而同时抑制我阻止其他绶生物生长的功 【典例突破】 能。在以羧甲基纤雄素钠为唯一碳源的选择培养基中，只有能 4,【答案】(1)限制性内切核酸（或限制）核苷酸序列(2)磷酸 利用骏甲基纤锥素钠的微生物才能生长繁殖。 二酯键 DNA单链以DNA为模板的DNA链的延伸 刚果红能与培养基中的纤维素形成红色复合物，使得含有纤维 (3)②① 素的培养基呈现红色。当纤雏素被纤维素酶分解时，刚果红与 【解析】(3)PCR过程中，根据已知的DNA序列合成两个引物 纤锥素的复合物无法形成，培养基中就会出现以纤雏素分解苗 要注意模板链和引物的方向是相反的，引物的核苷酸序列要能 为中心的透明圈。这个透明图的大小直接反映了纤维素分解萄 够和相应模板的核苷酸序列发生碱基互补配对，环状DNA图中 分解针雏素的能力。透明圈越大，说明纤维素分解苗分解纤维 显示PCR过程是从已知DNA序列的两端分别向相反方向形成 素的能力越强，即菌落产生的纤维素醉的活性强、量多， 子链，一个引物是与已知DNA序列的第一条链的左端互补站 (2)扩增目的基因片段在PCR仪中进行，因此需要耐高温的 合，向右侧方向延伸形成子链，该引物是④，另一个引物是与已 DNA聚合醉 知DNA序列的第二条链的右端互补结合，而左侧方向延种形成 (3)根据图示中醉基因与质粒栽体经过过程⑤构成重组质粒，推 子链，孩引物是②。 导出过程⑤为基因表达载体的构建，孩过程需要限制酶和DNA 类型五 连接醉 【典例突破】 (4)大肠杆菌作为受体细胞的优点繁殖能力强、生理结构和遗传 5.【答案】(1)逆转录(2)①碱基互补配对 ②正相关 物质简单，对环境固素敏感、家易进行遗传操作等。 (3)①Tag DNA聚合酶活性下降、引物浓度下降，原料dNTP浓 先用Ca+处理细胞，使其成为感受态翻胞，使其处于一种能吸 度下降②越小③阳性(4)abc 收周国环境中DNA分子的生理状态。将重组质粒加于援冲液 【解析】(1)由病毒RNA生成cDNA的过程属于遂转录，需要 中与感受态细胞混合，在一定的温度下促进感受态细胞吸收 逆转录醉的催化。(2)①当样本中有目的基因时，引物和探针与 DNA分子，完成转化过程。 (5)不同酶的最适温度、最适pH不同，当温度和pH改变时，酶 目的基因复性时，通过碱基互补配对彩成氢健而特异性结合 促反应速率也会受到影响。 ②在P(CR猫环的廷仲阶段，Tag DNA聚合酶催化子链的合成并 教材查漏补缺 水解探针，根据题千信息“荧光信号的累积与PCR产物数量完 1.转基因遗传特性生物类型和生物产品 全同步”可知，检测到的荧光强度与反应体系中DNA分子数里 2.双链DNA分子的特定核苷酸序列 正相关关系。(3)①与描数增长期相比，线性增长期目的基因数 3.重组DNA分子的籍选 量的增长率下降，有可能是底物浓度降低导致的，也有可能是酶 4.DNA模板2种引物脱氧核苷酸DNA聚合南 的活性缓授下降导致的。②祥本中初始模板越多时，达到设定 5.DNA聚合酶能与DNA母链的一段碱基序列互补配对的短单 的荧光网值时所经历的护增循环数就越少，C值就越小 链核酸使DNA聚合博能够从引物的3端开始连接脱氧核 ③C1≤37判定为和性，Ct>40或无C1值判定为阴性。图2中荧 苷酸 光闵值大概是36，猴雅病毒核酸检测结果产判定为阳性。(4)阴 6.在受体细胞中稳定存在，并且遗传给下一代表达和发挥作用 性结果也不能排除猴推病毒感染，可能产生假阴性的因素有取 标记基因RNA聚合醇转录出mRNA蛋白质 样太早，样本中病毒量少，达不到实验时荧光PCR检测闲值：样 7.日的基因进人受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达 本被污来，RNA醉将病毒RNA降解，从而导致样本中病毒量 的过程 少：病毒发生变异，检测不出来，从而出现假阴性 8.农杆菌转化法花粉管通道法显微注射法 第62课时基因工程的应用、蛋白质工程、 9.PCR蛋白质抗体抗原一抗体杂交采摘抗虫棉的叶片问 喂棉铃虫 DNA的两个重要实验 1O.PrⅡEcoR I T4DNA连接醇 考点一知识储备 专题突破10综合PCR的基因工程问题 1,抗虫功能的基因抗病基因降解或抵抗蛋白质编码基因 花青素代谢相关的外源生长激素肠乳糖牌基因乳汁 类型 2,基因改造 乳腺中特异表达显微注射抗原决定基因克隆 【典例突破】 免疫接 1.C[据图分析可知，第一轮复制形成2个DNA分子，即①②各 3.工程菌牛凝乳酶的基因基因工程南 一个，A正确：第二轮复制得到22一4（个）DNA分子，即①复制 判断正误 得①和、②复制得②和①，即得到①②③①各一个，B正确：第 (1)X提示转基因抗玉米螟玉米能够热抗玉米螟，但不一定 四轮复制得到16个DNA分子，其中有8个⑤(X基因)，C错误： 能热抗其他害虫。 经五轮循环后共形成32个DNA分子，其中①②各一个，③④各 (2)×提示乳腺生物反应器是将药用蛋白基因导入情乳动 四个，22个⑤，故产物中有五种不同的DNA分子，D正确。门 类型二 物的受精卵中，但该基图在乳腺细胞中表达 (3)、/ 【典例突破】 2.【答案】乙、丙目的基因反向连接 ()×提示大肠杆菌细胞中没有内质网，高尔基体等细跑 【解析】分析题国可知，理论上可以选择的引物组合有甲和丙，乙 器，获得人的干扰素后要经过进一步的加工和修饰才具有生物 和丙两种情况。如果选禄甲和丙这对引物，则无论目的基因是否 活性。 正确插入，扩增的片段都是50十300十100一450(bp),不符合要求 关键考能 如果选择乙和两这对引物，正向连接和反向连接后所得站果不同 1.(1)提示不能。抗虫恭因具有专一性。 所以应瑰择乙和两这对引物进行PCR鉴定。如果目的基固和质 (2)提示减少了化学农药的使用量，降低了环境污来」 粒反向连接，则引物乙会出现在重组质粒的外侧，此时若加入引物 (3)提示会。害虫会因遗传物质发生改变产生对转基因抗虫 甲和乙，则可以扩增出300十100-400(bp)的片段。 棉的抗性 638