第61课时 基因工程的基本工具和基本操作程序-【金榜题名】2026年高考生物一轮总复习

【例4】C[A、体外诱导食景猴胚胎千细跑，形成了类似囊胚的： 【例2】B[A、细胞内的Ca9酶在配对区战定点剪切，引起果蝇 结构（类囊胚），证实了食蟹猴胚胎千细胞具有分化潜能，A正 发生基因突变，A错误：B、该过程中，sgRNA和C=9酶共同剪切 确：B、实验过程中使用的培养基需含有糖类，糖类可为细胞培养 DNA,SERNA和Cas9酶类似于限制醉的作用，B正确：C、敲除后 提供能源物质，B正确：C、类囊胚的获得利用了动物细胞培养技 需要DNA连接醉对DNA上的切口进行修复，C错误：D、SERNA 术，并没有近行核移植，C错误：D、可借助胚胎移植技术将类囊 与红眼基因B的部分序列配对，碱基互补配对方式中A一T可 能会出现，D错误。故送B门 胚移植到相应的雌性受体中继续胚胎发育，从而可以用来研究 类囊胚的后续发有，D正确，故选C。门 考点二 知识储备 1.(1)性状表达产物(2)①结构和功能清晰序列数据库 教材查漏补缺 (3)②获取a.DNA半保留复制组分大量复制b.缓冲蹈 1.将通过体外受精及其他方式得到的胚胎，移植到同种的、生理状 液引物脱缄核苷酸耐高温的温度心，90℃单链 态相同的雌性动物体内，使之继续发育为新个体的技术 50℃引物72耐高温的DNA聚合酶d琼脂糖凝胶电泳 2.供体是遗传性状优良、生产能力强的个体，受体是有健康的体质 ③基因文库 和正常繁殖能力的个体，且二者必须是同一物种 2.(1)在受体细胞中稳定存在，并且遗传给下一代(2)启动子 3.早期胚胎在相同生理环境条件下空间位置的转移 标记基因 4.可以充分发挥雌性优良个体的繁殖潜力 3.花粉管通道法Ca+体细胞或受精卵受精卵 5,桑甚胚或囊胚 判断正误 提示目的基因主要是指编码蛋白质的基周，也可以是 6.(1)促性腺藏素超数排卵使其具有与卵细胞受精的能力 (1)× 一些具有调控作用的因子。 (2)两个极体、雌、雄原核(3)囊胚滋养层性别胚胎分 (2)/ 割将内细胞团均等分制 (3)× 提示启动子和终止子决定着转录的开始与结来： 7,(1)刚排出的精子必须在堆性动物的生殖道内发生相应生理变 (4) 化后才能受精肝索或Ca3+载体MⅡ期(2)对受体母羊进 (5)×提示为培育抗除草剂的作物新品种，导入抗除草剂基 行同期发情处理，将保存的囊胚进行胚脂胎移植，对受体母羊进行 因时能以受精卵为受体，也能以体翻胞为受体 是否妊振的检查，一段时回后受体母羊产下具有该公羊优良性 (6)×提示检测目的基因是否导入受体细胞的方法是PCR 状的后代 等技术 关键考能 第61课时基因工程的基本工具和基本操作程序 1,(1)提示引物是指一小段能与DNA母链的一段碱基序列互补 配对的短单链核酸。在DNA扩增时，DNA聚合酶不能从头开 考点一知识储备 始合成DNA,只能从引物的3'端延仲DNA链，因此复制DNA 1.DNA分子转基因遗传特性生物类型基因重组 时应加入两种引物。 2.(1)转移(2)半保留复制(4)遗传密码(5)限制酶，DNA连 (2)提示不需要，只要知道B1基因两端的郎分核苷酸序列即 接醇和逆转录醇(6)DNA(9)PCR(10)基因组编辑 可（以便根据这部分序列合成两种引物） 3,(1)原核生物。数千特定核苷酸序列磷酸二酯键磷酸二 (3)提示引物是依据B1毒蛋白基图的一段已知序列设计合成 酯键(2)磷酸二酯键大肠杆菌酷性末端黏性末端 的（或引物能与B1基因的cDNA特异性结合）。 (3)环状双链DNA分子噬菌体有一个至多个自我复制 (4)提示经过#轮循环，得到2个DNA分子，含引物的DNA 受体DNA标记 分子2"个，含其中一种引物的DNA分子数(2"一1)个，同时含 判断正误 两种引物的DNA分子(2"一2)个，共需要消耗(2+1一2)个引 (1)X提示基周工程是人工操作导致的基因重组，变异是定 物，含不等长脱氧核苷酸链的DNA分子2个，含等长脱氧核 向的 苷酸链的DNA分子(2一2m)个 (2)×提示DNA连接酶可以将双链DNA片段“缝合”起来， (5)提示不需要解旋酶，因为PCR过程中，DNA双链在高温下 恢复被很制酶切开的碎酸二酯键。 即可完成解旋。由于(CR过程温度较高，故所需要的DNA聚 合酶应具有时高温的特点。 (3)×提示限制性内初核酸醉，DNA连接酶和质粒是基图 2.(1)B1基因Ti质粒 工程中常用的三种工具，前两者属于工具酶，质粒属于载体。 (2)提示为了避免目的基因和载体的自身环化和反向连接。 (4)×提示质粒上的抗生素抗性基周常作为标记基因，便于 (3)提示目的基国应插入启动子与终止子之间。 重组DNA分子的琉选 (4)农杆菌转化法 关键考能 提示由于Ti质粒上的T一DNA可转移到受体细胞且能整合 (1)提示限制醉EwRI: 到受体细胞的臻色体DNA上，而目的基因又插入T一DNA,所 以目的基因可以整合到受体细胞的染色体DNA上： (5)提示一般不能。如果仅把目的基因整合到线粒体DNA残 GAATTC 一G AATTC- L→-CTTAA + 叶绿体DNA上，由于细胞分裂可能导数目的基因丢失，无法稳 -CTTAAG- G 定遗传 (6)提示 抗原一抗体泰交、用棉叶饲喂棉龄虫 跟制醉Nhe I: 典型例题 【例3】【答案】(1)蔗糖参与蔗糖分解代谢，将蔗糖分解生成 -GCTAGC一 -G CTAGC- 葡萄糖单位时间内葡萄糖的生成量（或蔗糖的减少量等） -CGATCG- -CGATC + G (2)NV基因大于TDNA插人导致NV基因增加部分碱基 序列 (2)提示用限制酶MnI和SpeI切割目的基图。限制酶 (3)突变体便于筛选出成功导人NV基因的细胞 MunI和EoRI切制后形成的站性末端相同，限制酶NheI 【解析】(1)根据表格，野生型菌林加入燕糖就会合成NV醉，不 和SpI切制后形成的黏性未端相同，实验人萸使用限制酶 加就不会合成，推测蔗糖语导了NV基因表达。分析表可知有 EcoR I和Nhe1切割质粒，应选用MunL和SpeI切制目的 NV酶，苗林就能将蔗糖分解出萄萄糖，因此NV酶可能参与蔗 排的分解代谢过程，将蔗糖分解生成葡萄檐。检测NV酶活性 基因。 时，可以测定单位时间内萄萄糖的生成量或蔗排的减少量等。 典型例题 (2)从题目中可知，突变体是通过TDNA随杭插入野生型菌株 【例I】B[A、限制酶失活会使DNA完全不被酶切，此时应更换 基图组DNA筛选获得的。在进行PCR扩增时，使用的引物需 斯的限制酶，A正确：B、酶切条件不合透通常会使切割效果下 要与特定的DNA序列配对结合，才能启动DNA的扩增。野生 降，调整反应条件如温度和PH等，调整酶的用量没有作用，B错 型苗株的基周组DNA中没有TDNA的插入，所以用与NV基 误：C、质粒DNA突变会导数限制醉识别位点缺失，进而造成限 因配对的引物进行扩增时，可以扩增出完整的V基因片段。 而哭变体由于TDNA的随机插入，导致NV基因中增加部分序 制醉无法进行切割，此时应更换为正常质粒，C正确：D、质翘 列。这样一来，使用同样的引物进行扩增时，扩增片段的长度就 DNA上酶切位点被甲基化修饰，会导致对DNA甲基化敏感的 会大于野生型扩增片段的长度。因此若突变体扩增片段长度> 限制酶无法进行醉切，此时应换用对DNA甲基化不敏感的限制 野生型扩增片段长度，则表明突变体构建成功。从基因序列分析 酶，D正确。故选B。门 其原因是T-DNA插入导致NV基国增加部分序列 637 (3)为进一步脸证NV基图的功能，表中的转基图菌林是将NV 类型三 基因导入突变体细胞获得的。突变体由于NV基因发生突变， 【典例突破】 无法正常表达NV酶，导致相关生理功能缺失或异常。通过将 3.【答案】(1)改造基因（或基因定点突变）(2)T-A或C一G 正常的NV基因导入突变体胞，如果能够恢复原本在突变体 A或G(3)3引物2和3中存在互补配对片段，置于同一反应 中缺失或异常的生理功能，就可以有力地证明NV基因确实具 系统时会结合而失去作用(4)M,M中的一种引物与N1,N 有特定的功能。在构建NV基周表达载体时，禽要添加新的标记 中的一种引物必须具有互补配对的片段 基因，原国是便于席迭出成功导入NV基因的细胞。 【解析】(2)若拟突变位点的碱基对为A一T,则需要让其突变 【例4】【答案】(1)只有能利用骏甲基纤维素钠的微生物才能生 为T-A或C一G,对应的密码子由AAU变成AAA或由AAC 长繁殖菌落产：生的纤维茶酶的活性和量有关 变成AAG,可使天冬酰胺替换为赖氨酸。(3)若两个反应系统均 (2)耐高温的DNA聚合酶 进行一次复制，则会产生3种不同的DNA分子，因为引物1和4 (3)基因表达载体的构建限制酶，DNA连接酶 (4)繁殖能力强、生理结构和遗传物质简单，对环境因素敏感，容 产生的DNA分子是一样的。(4)重叠至补引物的设计是重叠延 易进行遗传操作等能吸收周围环境中DNA分子 仲PR技术成功的关键。拼接基因M和N时，设计引物时需要 (5)降解时的温度不同、降解时的pH不同 注意的是，需要我到两种基因的重叠部分，即M、M,中的一种 【解析】(1)选择培养基是指一类根据特定微生物的特珠营养 引物与、1、八中的一种引物必须具有互补配对的片段。 要求或其对某理化周素抗性的原理而设计的培养基。具有只允 类型四 许特定的微生物生长，而同时抑制我阻止其他绶生物生长的功 【典例突破】 能。在以羧甲基纤雄素钠为唯一碳源的选择培养基中，只有能 4,【答案】(1)限制性内切核酸（或限制）核苷酸序列(2)磷酸 利用骏甲基纤锥素钠的微生物才能生长繁殖。 二酯键 DNA单链以DNA为模板的DNA链的延伸 刚果红能与培养基中的纤维素形成红色复合物，使得含有纤维 (3)②① 素的培养基呈现红色。当纤雏素被纤维素酶分解时，刚果红与 【解析】(3)PCR过程中，根据已知的DNA序列合成两个引物 纤锥素的复合物无法形成，培养基中就会出现以纤雏素分解苗 要注意模板链和引物的方向是相反的，引物的核苷酸序列要能 为中心的透明圈。这个透明图的大小直接反映了纤维素分解萄 够和相应模板的核苷酸序列发生碱基互补配对，环状DNA图中 分解针雏素的能力。透明圈越大，说明纤维素分解苗分解纤维 显示PCR过程是从已知DNA序列的两端分别向相反方向形成 素的能力越强，即菌落产生的纤维素醉的活性强、量多， 子链，一个引物是与已知DNA序列的第一条链的左端互补站 (2)扩增目的基因片段在PCR仪中进行，因此需要耐高温的 合，向右侧方向延伸形成子链，该引物是④，另一个引物是与已 DNA聚合醉 知DNA序列的第二条链的右端互补结合，而左侧方向延种形成 (3)根据图示中醉基因与质粒栽体经过过程⑤构成重组质粒，推 子链，孩引物是②。 导出过程⑤为基因表达载体的构建，孩过程需要限制酶和DNA 类型五 连接醉 【典例突破】 (4)大肠杆菌作为受体细胞的优点繁殖能力强、生理结构和遗传 5.【答案】(1)逆转录(2)①碱基互补配对 ②正相关 物质简单，对环境固素敏感、家易进行遗传操作等。 (3)①Tag DNA聚合酶活性下降、引物浓度下降，原料dNTP浓 先用Ca+处理细胞，使其成为感受态翻胞，使其处于一种能吸 度下降②越小③阳性(4)abc 收周国环境中DNA分子的生理状态。将重组质粒加于援冲液 【解析】(1)由病毒RNA生成cDNA的过程属于遂转录，需要 中与感受态细胞混合，在一定的温度下促进感受态细胞吸收 逆转录醉的催化。(2)①当样本中有目的基因时，引物和探针与 DNA分子，完成转化过程。 (5)不同酶的最适温度、最适pH不同，当温度和pH改变时，酶 目的基因复性时，通过碱基互补配对彩成氢健而特异性结合 促反应速率也会受到影响。 ②在P(CR猫环的廷仲阶段，Tag DNA聚合酶催化子链的合成并 教材查漏补缺 水解探针，根据题千信息“荧光信号的累积与PCR产物数量完 1.转基因遗传特性生物类型和生物产品 全同步”可知，检测到的荧光强度与反应体系中DNA分子数里 2.双链DNA分子的特定核苷酸序列 正相关关系。(3)①与描数增长期相比，线性增长期目的基因数 3.重组DNA分子的籍选 量的增长率下降，有可能是底物浓度降低导致的，也有可能是酶 4.DNA模板2种引物脱氧核苷酸DNA聚合南 的活性缓授下降导致的。②祥本中初始模板越多时，达到设定 5.DNA聚合酶能与DNA母链的一段碱基序列互补配对的短单 的荧光网值时所经历的护增循环数就越少，C值就越小 链核酸使DNA聚合博能够从引物的3端开始连接脱氧核 ③C1≤37判定为和性，Ct>40或无C1值判定为阴性。图2中荧 苷酸 光闵值大概是36，猴雅病毒核酸检测结果产判定为阳性。(4)阴 6.在受体细胞中稳定存在，并且遗传给下一代表达和发挥作用 性结果也不能排除猴推病毒感染，可能产生假阴性的因素有取 标记基因RNA聚合醇转录出mRNA蛋白质 样太早，样本中病毒量少，达不到实验时荧光PCR检测闲值：样 7.日的基因进人受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达 本被污来，RNA醉将病毒RNA降解，从而导致样本中病毒量 的过程 少：病毒发生变异，检测不出来，从而出现假阴性 8.农杆菌转化法花粉管通道法显微注射法 第62课时基因工程的应用、蛋白质工程、 9.PCR蛋白质抗体抗原一抗体杂交采摘抗虫棉的叶片问 喂棉铃虫 DNA的两个重要实验 1O.PrⅡEcoR I T4DNA连接醇 考点一知识储备 专题突破10综合PCR的基因工程问题 1,抗虫功能的基因抗病基因降解或抵抗蛋白质编码基因 花青素代谢相关的外源生长激素肠乳糖牌基因乳汁 类型 2,基因改造 乳腺中特异表达显微注射抗原决定基因克隆 【典例突破】 免疫接 1.C[据图分析可知，第一轮复制形成2个DNA分子，即①②各 3.工程菌牛凝乳酶的基因基因工程南 一个，A正确：第二轮复制得到22一4（个）DNA分子，即①复制 判断正误 得①和、②复制得②和①，即得到①②③①各一个，B正确：第 (1)X提示转基因抗玉米螟玉米能够热抗玉米螟，但不一定 四轮复制得到16个DNA分子，其中有8个⑤(X基因)，C错误： 能热抗其他害虫。 经五轮循环后共形成32个DNA分子，其中①②各一个，③④各 (2)×提示乳腺生物反应器是将药用蛋白基因导入情乳动 四个，22个⑤，故产物中有五种不同的DNA分子，D正确。门 类型二 物的受精卵中，但该基图在乳腺细胞中表达 (3)、/ 【典例突破】 2.【答案】乙、丙目的基因反向连接 ()×提示大肠杆菌细胞中没有内质网，高尔基体等细跑 【解析】分析题国可知，理论上可以选择的引物组合有甲和丙，乙 器，获得人的干扰素后要经过进一步的加工和修饰才具有生物 和丙两种情况。如果选禄甲和丙这对引物，则无论目的基因是否 活性。 正确插入，扩增的片段都是50十300十100一450(bp),不符合要求 关键考能 如果选择乙和两这对引物，正向连接和反向连接后所得站果不同 1.(1)提示不能。抗虫恭因具有专一性。 所以应瑰择乙和两这对引物进行PCR鉴定。如果目的基固和质 (2)提示减少了化学农药的使用量，降低了环境污来」 粒反向连接，则引物乙会出现在重组质粒的外侧，此时若加入引物 (3)提示会。害虫会因遗传物质发生改变产生对转基因抗虫 甲和乙，则可以扩增出300十100-400(bp)的片段。 棉的抗性 638金榜题名 创新高考总复习 生物 卵 7.(2022·全国甲，38节选)某牧场引进一只产 雌性① 鉴定 肉性能优异的良种公羊，为了在短时间内获 杜泊羊 胞 性别 体外 得具有该公羊优良性状的大量后代，该牧场 二分胚 受粘 受精卵 当地 利用胚胎工程技术进行了相关操作。回答 雄性 普通 杜泊羊 下列问题： 绵羊 (1)在体外受精前要对精子进行获能处理， 多只 其原因是 杜泊羊 (1)为了获得更多的卵母细胞，需用 精子体外获能可采用化学诱导法，诱导精子 对雌性杜泊羊进行 处理， 获能的药物是 (答出 过程②中产生的精子需进行获能处理，目的 一点即可)。利用该公羊的精子进行体外受 是 精需要发育到一定时期的卵母细胞，因为卵 (2)在实际胚胎工程操作中，常以观察到 母细胞达到 时才具备与精子受精 或 作为受精的标志。 的能力。 (3)图中移植的胚胎处于 期。为获得 (2)请以保存的囊胚和相应数量的非繁殖期 雌性杜泊羊，胚胎移植前需取 鉴定 受体母羊为材料进行操作，以获得具有该公 为提高胚胎的利用率，尽快获得数 羊优良性状的后代。主要的操作步骤是 量较多的子代杜泊羊，图中过程⑤使用 技术对胚胎进行处理，处理时要注意 请完成课时提分集训60 第61课时 基因工程的基本工具和基本操作程序 高考目 1.概述基因工程是在微生物学、生物化学和分子生物学等学科基础上发展起来的。2.阐明 标定位 重组DNA技术的三种基本工具。3.阐明基因工程的基本操作程序。 核心考点奥破 考点一 基因工程的基本工具 (2)DNA双螺旋结构的提出和 知识储备·夯基 的证明。 1.基因工程的概念 (3)中心法则的确立。 挨作环境 (4) 的破译。 生物体外 挨作水平 (5)基因转移载体的发现。 水平 士要技术 的发现为DNA的切割、 基因工程 等技术 连接以及功能基因的获得创造了条件。 操作结果赋予生物新的 创造史符合 人需要的新的 和尘物产品 (6) 体外重组的实现。 变异原埋 (7)重组DNA表达实验的成功。 2.基因工程的诞生和发展 (8)DNA测序和合成技术的发明。 (1)肺炎链球菌转化实验不仅证明了DNA (9) 技术的发明。 是遗传物质，还证明了DNA可在同种生物 (10) 技术可以实现对特定基 不同个体之间 因的定点插人、敲除或替换。 330 第10章生物技术与工程 3.重组DNA技术的基本工具 判断正误 (1)限制性内切核酸酶（简称“限制酶”） (1)基因工程是人工操作导致的染色体变异， 士要来源 变异是不定向的 ( 种类·分离的限制醇有种 (2)DNA连接酶可以连接目的基因与载体的 氢键，形成重组DNA () 特点 识别双链DNA分子的 (专性使每一条链中特定部位的 (3)限制性内切核酸酶、DNA连接酶和质粒是 限 断开 基因工程中常用的三种工具酶 ( ) 作拥一断开两个核苷酸之间的 (4)质粒通常采用抗生素合成基因作为标记 切制位省：识别序列的中心轴线两侧 基因 EcoR I 补性 (在G与 5'GAA TTC3'G AATTC 末瑞 关键考能·提升 A之间 3'CTTAAG5'CTTAA G 结果 切制) 中轴线 将从苏云金杆菌中获取的B基因转入棉花 切割位置：识别序列的中心轴线处 细胞内培育转基因抗虫棉的过程中，需借助 Sma I 平 (在G与 5'CCC GGG3'CCC GGG 多种分子工具且经历多个操作步骤。实验 木端 C之问 3'GGG CCC5'GGG CCC 人员使用限制酶EcoR I和NheI切割质 切制) 中轴线 粒。如图表示常用的限制酶识别序列和切 割位点以及质粒上的限制酶切割位点。请 【提醒】 ①限制酶的识别序列一般由6个 核苷酸组成，少数由4个、8个或其他数量的 思考以下问题： 核苷酸组成。 限制，识别序列及切制位点： 启动 ②限制酶作用的化学键只能是磷酸二酯键。 EcoR I Nhe 1 GCTAGC ③在切割含目的基因的DNA分子时，需用 Min I CAATTG Xba I:TCTAGA 限制酶切割两次此DNA分子，产生4个末 EcoR I:GAATTC 端。只有这样才能使目的基因的两端都有 质粒 Spe I:ACTAGT 可连接的黏性末端或平末端。 B:基因 (2)DNA连接酶 Mun I Xba I SpeI 作用将双链DNA片段“缝合”起来，恢复被限制 酶切开的 (1)请用图示法写出限制酶EcoR I和 DNA 米源 NheI切割后形成黏性末端的过程。 E.coli DNA 连接酶 类型 功能“缝合”互补的 T4 DNA 米源，T4噬菌体 连接脚 功能.“缝合”互补的 和平木端 (3)载体 种类厂质粒（常川载体）： 动植物病毒等 限制酶切制位点 携带外源DNA片段的质粒进入受体细 (2)切割图示中的目的基因应选用哪类限制 特点 胞后，能在细胞中进行 ·或整 合到 上，随受体DNA同步复制 酶？请说明理由。 常有特殊的 其因，使于重组DNA 分子的筛选 作州 携带外源DNA片段进入受休细胞 331 金榜题名创新高考总复习生物 【归纳总结】 限制酶的选择 Pst I Sma I Pst 1 标记基因 PstI 典型例题·研磨 EcoRI Smal 抗病 考向一 辨析基因工程的基本工具 EcoR I Sma 基因 【例1】(2024·湖南高考)某同学将质粒 甲 DNA进行限制酶酶切时，发现DNA完全没 (1)不破坏目的基因原则：如图甲中可选择Ps1 有被酶切，分析可能的原因并提出解决方 I,而不选择SmaI。 法。下列叙述错误的是 ( ) (2)保留标记基因、启动子、终止子、复制原点 A.限制酶失活，更换新的限制酶 原则：质粒作为载体必须具备标记基因，所选 B.酶切条件不合适，调整反应条件如温度和 择的限制酶尽量不要破坏这些结构，如图乙中 酶的用量等 不选择SmaI。若载体上有两个及以上的标 C.质粒DNA突变导致酶识别位点缺失，更 记基因，则可合理对其中一些标记基因进行酶 换正常质粒DNA 切破坏，从而达到比一个标记基因更高的筛选 D.酶切位点被甲基化修饰，换用对DNA甲 成功率，防止只有一个标记基因时出现的“假 基化不敏感的限制酶 阳性”（即未成功导入目的基因的载体也能正 【例2】CRISPR-Cas9基因编辑技术，是对 常表达标记基因，造成无效筛选)。 靶向基因进行特定DNA修饰的技术。利用 (3)善用“双酶切”，注意方向性：目的基因所在 序列和载体上存在多种酶切位点时，一般需要 CRISPR一Cs9技术可以使红眼基因B突 选择在目的基因所在序列和载体上都存在切 变获得果蝇突变体，如图为技术原理图。下 割位点的两种不同的限制酶，对目的基因所在 列相关叙述正确的是 序列和载体进行剪切，即“双酶切法”。其优点 Cas9酶 和作用是：①防止目的基因环化；②避免目的 被剪下的DNA片段水解 基因与载体反向连接，即用DNA连接酶连接 敲除前的B基因 敲除后的B基因 后形成的重组DNA分子上，目的基因和载体 A.细胞内的Cas9酶在配对区域定点剪切， 启动子的方向（或描述为“RNA聚合酶的移动 引起果蝇发生染色体结构变异 方向”)必须是相同的，否则目的基因导入后无 法正常表达。如图甲、乙也可选择PstI和 B.该过程中，sgRNA和Cas9酶共同剪切 EcoR I两种限制酶。 DNA的作用类似于限制酶的作用 (4)巧用“同尾酶”：同尾酶指来源不同，但能产 C.敲除后需要DNA聚合酶对DNA上的切 生相同黏性末端的限制酶。当不适合选择某 口进行修复 种限制酶时，可用其同尾酶替换，以获得相同 D.sgRNA与红眼基因B的部分序列配对， 的黏性末端。 不会出现的碱基互补配对方式是A一T 考点二 基因工程的基本操作程序 ②利用 和序列比对工具进行 知识储备·夯基 筛选。 1.目的基因的筛选与获取 (3)日的基因的获取 (1)日的基因：在基因工程的设计和操作中， ①人工合成目的基因。 ②PCR 和扩增目的基因 用于改变受体细胞 或获得预期 a.PCR(聚合酶链式反应)：是一项根据 等的基因。 的原理，在体外提供参与 (2)筛选合适的目的基因 DNA复制的各种 与反应条件，对目 ①从相关的已知 的基因 的基因的核苷酸序列进行 的 中进行筛选是较为有效的方法之一。 技术。 332 第10章生物技术与工程 b.PCR反应的条件：一定的 续表 DNA模板、2种 、4种 项 起始密 终止密 DNA聚合酶，以及能自动调控 启动子 终止子 码子 码子 的仪器。 c.PCR扩增的过程 位置 目的基 目的基 mRNA mRNA 因上游 因下游 首端 尾端 变性 温度超过℃时，双链DNA解聚为 当温度下降到℃左右时，两种通 RNA聚合晦 复性 使转录在 都译的起翻译的结束 过碱基互补配对与两条单链DNA结合 识别和结合 功 所需要的始信号信号（正常情 能 的部位，驱动 当温度上升到℃左右时，溶液中的4种 地方停 (编码氨况下，不编码 脱氧核苷酸在 的作 基因转录 延伸 下来 基酸) 氨基酸) 川下，根据城基互补配对原则合成新的 出mRNA DNA链 d.PCR产物的鉴定：常采用 3.将目的基因导入受体细胞 来鉴定。 生物 植物 动物 微生物 ③通过构建 来获取目的基因。 种类 2.基因表达载体的构建— 基因工程的核心 常用农杆菌转化法 (1)目的：使目的基因 显微注射法 处理法 方法 ,同时，使目 的基因能够表达和发挥作用。 受体 细胞 原核细胞 (2)基因表达载体的组成及作用 日的某因：编码蛋白质的某因或具有调 控作用的因了 将含有目的 将目的基因插入基因的表达 Ca2+处理细 表达载体 :RNA聚合侮识别和结合的部 胞→细胞处于 复制原点 位；能取动基因转录出mRNA Ti质粒的T一 载体提纯→ 一种能吸收周 终止了：起调控作用使转录在所需要 DNA中→农杆取卵（受精 转化 的地方停下来 菌→导入植物细卵)→显微注 围环境中 便」亚组DNA分子的筛选 过程 DNA分子的 胞·整合到受体射→受精卵 生理状态→基 (3)构建过程 细胞的染色体发育→获得 具有新性状 因表达载体 DNA上表达 质粒 外源IDNA片段 导入 的动物 可一种限制或 口的基因 产生相同木端的 限制阵切制 【辨析】(1)转化：目的基因进入受体细胞 一个切口， DNA连接酶 两个切口，获得 内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过 两个黏性末端 口的某因 程。此处“转化”与肺炎链球菌转化实验中 基内表达载体 的“转化”含义相同，实质都是基因重组。 【提醒】 启动子、终止子、起始密码子、终止 (2)农杆菌转化法中的两次拼接和两次导入 密码子对比 第一次拼接是将目的基因拼接到Tⅰ质粒的 T一DNA上，第二次拼接（非人工操作）是指 起始密 终止密 插入目的基因的T一DNA拼接到受体细胞 启动子 终止子 码子 码子 的染色体DNA上；第一次导入是将含目的 基因的Ti质粒导入农杆菌，第二次导入（非 质 DNA DNA mRNA mRNA 人工操作)是指含目的基因的T一DNA导 入受体细胞。 333 金榜题名创新高考总复习 生物 4.目的基因的检测与鉴定 (4)PCR扩增过程中的循环图示与规律如图 日的基因转 所示，若一个B毒蛋白基因在PCR中经过n mRNA 韧 译 蛋白质 个体 是不插入 轮循环，理论上得到多少个DNA分子？含引 1检测 「检测 检测 检测 物的DNA分子多少个？含其中一种引物的 抗原一抗 抗虫、抗病 DNA分子多少个？同时含两种引物的DNA PCR等技术 休杂交 接种实验等 分子多少个？共需要消耗多少个引物？含不 等长脱氧核苷酸链的DNA分子多少个？含 分子水平的检测 个休生物学 水平的鉴定 等长脱氧核苷酸链的DNA分子多少个？ gu吗；3 判断正误 吗5 (1)目的基因一定是编码蛋白质的基因( 吗s/ -31 a5吧 (2)真核细胞和细菌的DNA聚合酶都需要 g.3四彩 5品吗} .m吧 Mg2+激活。因此，PCR反应缓冲溶液中一般 :00mwww 晒； 要添加Mg2 ( ) 3 5安w3 s my sCmm (3)基因表达载体中的启动子和终止子决定着 3 一日标序列 吧53 翻译的开始与结束 ( -·渊罚序列 5纪m吗53 口可引物A 吧 (4)Ti质粒上的T一DNA可与植物受体细胞 口引物B 循环： 环2： 循环3： 变性一复性→延伸 变性·复性一延仲变性一复性+延佛 的染色体DNA整合在一起 ) (5)为培育抗除草剂的作物新品种，导入抗除 草剂基因时只能以受精卵为受体 ( (5)PCR扩增Bt基因的过程中需要解旋酶 (6)检测目的基因是否导入受体细胞可用抗原 吗？并说明理由。所需要的DNA聚合酶应 抗体杂交技术 具有什么特点？ 关键考能·提升 L.B1抗虫蛋白基因（简称Bt基因）是培育转基 2.据图分析抗虫棉的培育过程。 因抗虫棉较为合适的目的基因，筛选Bt基 因后可以利用PCR技术对其进行大量扩 Bt 苏云金 基因 转入 增。回答下列问题： 杆菌 农杆菌 (1)什么是引物？DNA复制时为什么需要 构继基因 引物？ T-DNA 表达载体 感染 T质粒 月的基内 组织 插入染色 培养 体TDNA中 棉株细胞 (2)PCR扩增Bt基因需要知道B1基因的全 抗棉 部核苷酸序列吗？ (1)该过程中的目的基因是 ,载体 是 (2)基因工程中，往往使用两种限制酶切割 目的基因，这样做的原因是什么？ (3)为检测B基因在转基因抗虫棉细胞中 是否转录，科研人员提取棉花细胞中的总 RNA,经逆转录过程获得总cDNA,通过 (3)为了保证目的基因在受体细胞中能正确 PCR技术可在总cDNA中专一性地扩增出 表达，对目的基因在质粒中的插入位点有什 Bt基因的cDNA,原因是什么？ 么要求？ 334 第10章生物技术与工程 (4)该实例中，导入目的基因的方法是 (3)为进一步验证NV基因的功能，表中的 。 为什么目的基因可以整合到 转基因菌株是将NV基因导入 染色体的DNA上？ 细胞获得的。在构建NV基因表达载体时， 需要添加新的标记基因，原因是 (5)将目的基因导入受体细胞时，能否仅把 【例4】(2024·甘肃高考)源于细菌的纤维素 目的基因整合到线粒体DNA或叶绿体 酶是一种复合酶，能降解纤维素。为了提高 DNA上？为什么？ 纤维素酶的降解效率，某课题组通过筛选高 产纤维素酶菌株，克隆表达降解纤维素的三 种酶（如下图），研究了三种酶混合的协同降 解作用，以提高生物资源的利用效率。回答 (6)该实例中，检测目的基因是否成功表达 下列问题。 的常见方法有哪些？ 落叶覆益的 纤蟹素 高户纤维 面X 酣土 降解细菌 茶蒋菌株X 基因纽IDNA 质粒我体 f组陈A -隆A其因 酶A基因 典型例题·研磨 亚组酵B (体细 粒我休 5 种B基因 避B因 质粒载体 考向二辨析基因工程的基本操作程序 重组酪G 一酶C华因 确C基因 【例3】(2024·贵州高考)研究者用以蔗糖为 (1)过程①②采用以羧甲基纤维素钠为唯 唯一碳源的液体培养基，培养真菌A的野生 碳源的培养基筛选菌株X,能起到筛选作用 型（含NV基因）、突变体(NV基因突变)和 的原因是 转基因菌株（转入NV基因），检测三种菌株 高产纤维 NV酶的生成与培养液中的葡萄糖含量，结果 素酶菌株筛选时，刚果红培养基上的菌落周 如表所示（表中“十”表示有，“一”表示无）。 围透明圈大小反映了 检测用菌株 蔗糖 NV酶 葡萄糖（培养液中） (2)过程④扩增不同目的基因片段需要的关 野生型 键酶是 野生型 (3)过程⑤在基因工程中称为 突变体 ,该过程需要的主要酶有 转基因菌株 + (4)过程⑥大肠杆菌作为受体细胞的优点有 回答下列问题。 。 该过程 (1)据表可推测 诱导了NV基因 用Ca2+处理细胞，使其处于一种 表达。NV酶的作用是 的生理状态。 检测NV酶活性时，需测定的指 (5)课题组用三种酶及酶混合物对不同生物 标是 质原料进行降解处理，结果如下表。表中协 (答出一点即可)。 同系数存在差异的原因是 (2)表中突变体由TDNA随机插入野生型 (答出两点)。 菌株基因组DNA筛选获得。从野生型与突 生物质 降解率(%) 协同系数 变体中分别提取基因组DNA作为模板，用 原料 与 (填“TDNA”或“NV基因”) 酶A 酶B 酶C 混1 混2 混1 混2 配对的引物进行PCR扩增。若突变体扩增 小麦秸秆 7.08 6.03 8.19 8.61 26.9874.33114.6 片段长度 (填“>”“=”或“<”) 玉米秸秆 2.62 1,48 3.76 3.92 9.88 24.98 77.02 野生型扩增片段长度，则表明突变体构建成 功，从基因序列分析其原因是 玉米芯 0.62 0.48 0.86 0.986.79 1.82 11.34 注：混1和混2表示三种酶的混合物 335 金榜题名创新高考总复习生物 教材查漏补缺 ■ 1.(选择性必修3P6?)基因工程：按照人们的 9.(选择性必修3P82)目的基因的检测与鉴 愿望，通过 等技术，赋子生物新的 定：首先是分子水平的检测，包括通过 ,创造出更符合人们需要的新的 等技术检测棉花的染色体DNA上是否 插入了Bt基因或检测Bt基因是否转录出 2.(选择性必修3P1)限制酶能够识别 了mRNA:从转基因棉花中提取 ,并且使每一条 用相应的 进行 链中特定部位的磷酸二酯键断开。 检测Bt基因是否翻译成Bt抗虫蛋白等。 3.(选择性必修3P2)载体上有特殊的标记基 其次，还需要进行个体生物学水平的鉴定。 因，便于 例如，通过 4.(选择性必修3Pz)PCR反应需要在一定的 缓冲溶液中才能进行，需提供 来确定Bt基因是否赋予了棉花抗虫特性以 、4种 和耐高温的 及抗性的程度。 10.如图为所用载体图谱示意图，图中限制酶 5.（选择性必修3P77)真核细胞和细菌的 的识别序列及切割位点为：HidⅢ 都需要Mg2+激活。因此，PCR反 (A'AGCTT)、PvitⅡ(CAG'CTG)、 应缓冲液中一般要添加Mg2+。引物是一小 KpnI(G GTACC),EcoRI(G'AATTC), 段 PstI(CTGCA'G)、BamH I(G'GATCC)。 ,引物的作用是 为使hb2基因（该基因序列不含图中限 制酶的识别序列)与载体正确连接，在扩 6.(选择性必修3P80)基因表达载体的构建的 增的phb2基因两端分别引入 目的：使目的基因 和 两种不同限制酶的识别序 ,同时，使目的基因 列。将经过这两种酶酶切的hb2基因和 能够 基因表达载体是 载体进行连接时，可选用 载体的一种，除目的基因、 外，还 (填“E.coli DNA连接酶”或“T4DNA连 必须含有启动子、终止子等。启动子是 接酶”)。 识别和结合的部位，有了它才能驱 Hind M 动基因 ,最终表达出人类需 PvitI 要的 BamH T 启动子 Kpn I EcoR I 7.(选择性必修3P81)转化： 氨苄青需素 抗性某因终止.了 -Pst I 8.(选择性必修3P81一82)将目的基因导入植物 复制原点 细胞的方法是 Kpn I 导入动物细胞的方法是 ;导入 请完成课时提分集训61 微生物细胞的方法是 处理法。 336