实验4，微生物的实验室培养。实验目的，学习并了解无菌技术的操作和微生物的实验室培养。实验器材，电子天平称量指。钥匙、烧杯、三角瓶、量筒、滴管、酒精灯、培养皿、接种环、徒步器、玻璃棒、一液气灭过菌的枪头、镊子、带螺口的试管、试管架、石棉网、电炉、高压灭菌锅、恒温培养箱、超净工作台、实验试剂，牛肉膏、蛋白胨、氯化钠琼脂粉质量分数为5%，氢氧化钠质量分数为5%盐酸蒸馏水体积分数为70%酒精棉PH试纸、大肠杆菌菌液方法步骤一、制备培养基用电子天平称取牛肉膏0.5克。将牛肉膏连同称量纸放入烧杯中，再依次加入称量好的蛋白冻一克。氯化钠0.5克，琼脂粉两克，最后加入100毫升蒸馏水溶解。将烧杯放入垫有石棉网的电炉上加热搅拌，待牛肉膏和琼脂粉完全溶解后，用玻璃棒挑出称量纸，关闭电炉。补足水分至100毫升。用5%氢氧化钠或5%盐酸将培养基调制到PH为7.0至7.2之间，将溶解好的固体培养基倒入三角瓶内。在瓶口加上封口膜封好。将配置好的培养基以及包好的培养皿分别和盛有九毫升蒸馏水的六支试管一起放入灭菌锅内，加盖封好灭菌锅。接通电源进行加热，待排出锅内冷空气后，关闭排气阀，加压到100千帕即121摄氏度，维持20分钟。灭菌完成后关闭电源，待压力降至为零时，打开排气阀。然后再打开灭菌盖，借用灭菌锅的余热烘干锅内物体表面的水汽。取出物体并放入超净工作台，用酒精棉球擦拭超净工作台。和实验者的双手。带三角瓶的培养基冷却至50摄氏度左右，点燃酒精灯。在火焰旁取下封口膜。用手托起三角瓶瓶底，将瓶口放置酒精灯上稍加灼热。左手拿起培养皿，在培养皿内倒入20毫升左右培养基，在超净台上轻轻摇匀冷却。待培养基凝固后将培养皿倒置待用。2、纯化大肠杆菌平板划线法。酒精棉球擦拭超净工作台和实验者的双手。点燃酒精灯，将接种环放在酒精灯火焰上进行灼烧，待接种环冷却后，吸取大肠杆菌培养液。在火焰旁打开培养皿，在培养基一边做第一次平行划线3至4条，然后转动培养皿约70度角，再一次灼烧。接种环放置在培养皿内，稍稍冷却后，沿第一次划线的后端交叉划线，如此重复四次。划线过程中要注意轻轻滑动接种环，不要把培养基划破。将画好的培养皿和一个未划线的对照培养皿倒置放入培养箱内，保持37摄氏度培养一夜。第二天取出培养皿，可以看到划线培养皿中已分离出单菌落，而空白对照中无菌落生长。3、纯化大肠杆菌，稀释涂布平板法。取配置好的牛肉膏蛋白冻培养基平板，分别用记号笔标明10的4次方分之一、十的5次方分之一、十的6次方分之一。六支灭过菌的盛有9毫升蒸馏水的试管，分别做好1至6号标记。用酒精棉球擦拭超净工作台和实验者的双手。在酒精灯旁用一液器吸取一毫升大肠杆菌菌液加入到一号试管中，震荡摇匀，再用移液器吸取一毫升一号试管中菌液加入二号试管中。按上述方法将大肠杆菌菌液分别稀释为10分之1至10的6次方分之一。用移液器吸取100微升稀释度为10的4次方分之一的大肠杆菌稀释液，接入对应编号的平板中将用酒精浸泡过的徒步器放在酒精灯上灼烧，然后放置在平板盖处冷却后。将军悬液沿同心圆方向徒步，均匀转动平板一个角度重复操作一次，使菌液分布均匀，重复上述操作，分别涂布稀释度为十的负5次方，十的负6次方，大肠杆菌均需试验。室温下静置5至10分钟，将涂布的平板和一个空白对照一起倒置。放入培养箱内保持37摄氏度培养一夜，第二天取出培养皿，可以看到涂布的平板中已分离出单菌落，并随稀释度的增加而菌落减少，而空白对照中无菌落生长。注意事项，对培养基进行高压蒸汽灭菌时，先加热至水沸腾并放出锅内的空气，然后继续加热至100千帕121摄氏度，灭菌15至30分钟，这样锅内充满能力强、热量大的水蒸气。2、接种时打开菌液试管时，应入夜在酒精灯火焰旁的无菌区域进行管口在酒精灯火焰上灼烧灭菌，接种环直接灼烧灭菌，培养皿只能打开一条缝隙进行接种，以防杂菌进入。三到平板后的培养基应在适宜条件下放置一段时间，观察其表面是否有菌落出现，从而判断灭菌是否彻底。只能在无菌落出现的培养基上进行接种纯化大肠杆菌的操作。4、平板划线法接种大肠杆菌时，平行间不能出现相连现象，以保证随着划线的进行，大肠杆菌的浓度越来越低。5、实验结束后，各种器材、药品都应进行严格灭菌，以防杂菌污染环境，对人员造成伤害。