第10章 第61课时 基因工程的基本工具和基本操作程序(教用Word)-【金榜题名】2026年高考生物一轮总复习

第61课时　基因工程的基本工具和基本操作程序 高考目标定位 1.概述基因工程是在微生物学、生物化学和分子生物学等学科基础上发展起来的。2.阐明重组DNA技术的三种基本工具。3.阐明基因工程的基本操作程序。 考点一　基因工程的基本工具 1．基因工程的概念 2．基因工程的诞生和发展 (1)肺炎链球菌转化实验不仅证明了DNA是遗传物质，还证明了DNA可在同种生物不同个体之间转移。 (2)DNA双螺旋结构的提出和半保留复制的证明。 (3)中心法则的确立。 (4)遗传密码的破译。 (5)基因转移载体的发现。限制酶、DNA连接酶和逆转录酶的发现为DNA的切割、连接以及功能基因的获得创造了条件。 (6)DNA体外重组的实现。 (7)重组DNA表达实验的成功。 (8)DNA测序和合成技术的发明。 (9)PCR技术的发明。 (10)基因组编辑技术可以实现对特定基因的定点插入、敲除或替换。 3．重组DNA技术的基本工具 (1)限制性内切核酸酶(简称“限制酶”) 【提醒】　①限制酶的识别序列一般由6个核苷酸组成，少数由4个、8个或其他数量的核苷酸组成。 ②限制酶作用的化学键只能是磷酸二酯键。 ③在切割含目的基因的DNA分子时，需用限制酶切割两次此DNA分子，产生4个末端。只有这样才能使目的基因的两端都有可连接的黏性末端或平末端。 (2)DNA连接酶 (3)载体 判断正误 　(1)基因工程是人工操作导致的染色体变异，变异是不定向的(　×　) 提示　基因工程是人工操作导致的基因重组，变异是定向的。 (2)DNA连接酶可以连接目的基因与载体的氢键，形成重组DNA(　×　) 提示　DNA连接酶可以将双链DNA片段“缝合”起来，恢复被限制酶切开的磷酸二酯键。 (3)限制性内切核酸酶、DNA连接酶和质粒是基因工程中常用的三种工具酶(　×　) 提示　限制性内切核酸酶、DNA连接酶和质粒是基因工程中常用的三种工具，前两者属于工具酶，质粒属于载体。 (4)质粒通常采用抗生素合成基因作为标记基因(　×　) 提示　质粒上的抗生素抗性基因常作为标记基因，便于重组DNA分子的筛选。 　将从苏云金杆菌中获取的Bt基因转入棉花细胞内培育转基因抗虫棉的过程中，需借助多种分子工具且经历多个操作步骤。实验人员使用限制酶EcoR Ⅰ和Nhe Ⅰ切割质粒。如图表示常用的限制酶识别序列和切割位点以及质粒上的限制酶切割位点。请思考以下问题： (1)请用图示法写出限制酶EcoR Ⅰ和Nhe Ⅰ切割后形成黏性末端的过程。 提示　限制酶EcoR Ⅰ： 限制酶Nhe Ⅰ： (2)切割图示中的目的基因应选用哪类限制酶？请说明理由。 提示　用限制酶Mun Ⅰ和Spe Ⅰ切割目的基因。限制酶Mun Ⅰ和EcoR Ⅰ切割后形成的黏性末端相同，限制酶Nhe Ⅰ和Spe Ⅰ切割后形成的黏性末端相同，实验人员使用限制酶EcoR Ⅰ和Nhe Ⅰ切割质粒，应选用Mun Ⅰ和Spe Ⅰ切割目的基因。 【归纳总结】　限制酶的选择 (1)不破坏目的基因原则：如图甲中可选择PstⅠ，而不选择SmaⅠ。 (2)保留标记基因、启动子、终止子、复制原点原则：质粒作为载体必须具备标记基因，所选择的限制酶尽量不要破坏这些结构，如图乙中不选择SmaⅠ。若载体上有两个及以上的标记基因，则可合理对其中一些标记基因进行酶切破坏，从而达到比一个标记基因更高的筛选成功率，防止只有一个标记基因时出现的“假阳性”(即未成功导入目的基因的载体也能正常表达标记基因，造成无效筛选)。 (3)善用“双酶切”，注意方向性：目的基因所在序列和载体上存在多种酶切位点时，一般需要选择在目的基因所在序列和载体上都存在切割位点的两种不同的限制酶，对目的基因所在序列和载体进行剪切，即“双酶切法”。其优点和作用是：①防止目的基因环化；②避免目的基因与载体反向连接，即用DNA连接酶连接后形成的重组DNA分子上，目的基因和载体启动子的方向(或描述为“RNA聚合酶的移动方向”)必须是相同的，否则目的基因导入后无法正常表达。如图甲、乙也可选择Pst Ⅰ和EcoR Ⅰ两种限制酶。 (4)巧用“同尾酶”：同尾酶指来源不同，但能产生相同黏性末端的限制酶。当不适合选择某种限制酶时，可用其同尾酶替换，以获得相同的黏性末端。 考向一　辨析基因工程的基本工具 【例1】　(2024·湖南高考)某同学将质粒DNA进行限制酶酶切时，发现DNA完全没有被酶切，分析可能的原因并提出解决方法。下列叙述错误的是(　　 ) A．限制酶失活，更换新的限制酶 B．酶切条件不合适，调整反应条件如温度和酶的用量等 C．质粒DNA突变导致酶识别位点缺失，更换正常质粒DNA D．酶切位点被甲基化修饰，换用对DNA甲基化不敏感的限制酶 【答案】　B 【解析】　A、限制酶失活会使DNA完全不被酶切，此时应更换新的限制酶，A正确； B、酶切条件不合适通常会使切割效果下降，调整反应条件如温度和PH等，调整酶的用量没有作用，B错误； C、质粒DNA突变会导致限制酶识别位点缺失，进而造成限制酶无法进行切割，此时应更换为正常质粒，C正确； D、质粒DNA上酶切位点被甲基化修饰，会导致对DNA甲基化敏感的限制酶无法进行酶切，此时应换用对DNA甲基化不敏感的限制酶，D正确。 故选B。 【例2】　CRISPR－Cas9基因编辑技术，是对靶向基因进行特定DNA修饰的技术。利用CRISPR－Cas9技术可以使红眼基因B突变获得果蝇突变体，如图为技术原理图。下列相关叙述正确的是(　　 ) A．细胞内的Cas9酶在配对区域定点剪切，引起果蝇发生染色体结构变异 B．该过程中，sgRNA和Cas9酶共同剪切DNA的作用类似于限制酶的作用 C．敲除后需要DNA聚合酶对DNA上的切口进行修复 D．sgRNA与红眼基因B的部分序列配对，不会出现的碱基互补配对方式是A－T 【答案】　B 【解析】　A、细胞内的Cas9酶在配对区域定点剪切，引起果蝇发生基因突变，A错误； B、该过程中，sgRNA和Cas9酶共同剪切DNA，sgRNA和Cas9酶类似于限制酶的作用，B正确； C、敲除后需要DNA连接酶对DNA上的切口进行修复，C错误； D、sgRNA与红眼基因B的部分序列配对，碱基互补配对方式中A—T可能会出现，D错误。 故选B。 考点二　基因工程的基本操作程序 1．目的基因的筛选与获取 (1)目的基因：在基因工程的设计和操作中，用于改变受体细胞性状或获得预期表达产物等的基因。 (2)筛选合适的目的基因 ①从相关的已知结构和功能清晰的基因中进行筛选是较为有效的方法之一。 ②利用序列数据库和序列比对工具进行筛选。 (3)目的基因的获取 ①人工合成目的基因。 ②PCR获取和扩增目的基因 a．PCR(聚合酶链式反应)：是一项根据DNA半保留复制的原理，在体外提供参与DNA复制的各种组分与反应条件，对目的基因的核苷酸序列进行大量复制的技术。 b.PCR反应的条件：一定的缓冲溶液、DNA模板、2种引物、4种脱氧核苷酸、耐高温的DNA聚合酶，以及能自动调控温度的仪器。 c．PCR扩增的过程 d．PCR产物的鉴定：常采用琼脂糖凝胶电泳来鉴定。 ③通过构建基因文库来获取目的基因。 2．基因表达载体的构建——基因工程的核心 (1)目的：使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且遗传给下一代，同时，使目的基因能够表达和发挥作用。 (2)基因表达载体的组成及作用 (3)构建过程 【提醒】　启动子、终止子、起始密码子、终止密码子对比 项目 启动子 终止子 起始密 码子 终止密 码子 本质 DNA DNA mRNA mRNA 位置 目的基 因上游 目的基 因下游 mRNA 首端 mRNA 尾端 功能 RNA聚合酶识别和结合的部位，驱动基因转录出mRNA 使转录在所需要的地方停下来 翻译的起始信号(编码氨基酸) 翻译的结束信号(正常情况下，不编码氨基酸) 3.将目的基因导入受体细胞 生物 种类 植物 动物 微生物 常用 方法 农杆菌转化法、花粉管通道法 显微注射法 Ca2+处理法 受体 细胞 体细胞或受精卵 受精卵 原核细胞 续表 生物 种类 植物 动物 微生物 转化 过程 将目的基因插入Ti质粒的T－DNA中→农杆菌→导入植物细胞→整合到受体细胞的染色体DNA上→表达 将含有目的基因的表达载体提纯→取卵(受精卵)→显微注射→受精卵发育→获得具有新性状的动物 Ca2+处理细胞→细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态→基因表达载体导入 【辨析】　(1)转化：目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程。此处“转化”与肺炎链球菌转化实验中的“转化”含义相同，实质都是基因重组。 (2)农杆菌转化法中的两次拼接和两次导入 第一次拼接是将目的基因拼接到Ti质粒的T－DNA上，第二次拼接(非人工操作)是指插入目的基因的T－DNA拼接到受体细胞的染色体DNA上；第一次导入是将含目的基因的Ti质粒导入农杆菌，第二次导入(非人工操作)是指含目的基因的T－DNA导入受体细胞。 4．目的基因的检测与鉴定 判断正误 　(1)目的基因一定是编码蛋白质的基因(　×　) 提示　目的基因主要是指编码蛋白质的基因，也可以是一些具有调控作用的因子。 (2)真核细胞和细菌的DNA聚合酶都需要Mg2+激活。因此，PCR反应缓冲溶液中一般要添加Mg2+(　√　) (3)基因表达载体中的启动子和终止子决定着翻译的开始与结束(　×　) 提示　启动子和终止子决定着转录的开始与结束。 (4)Ti质粒上的T－DNA可与植物受体细胞的染色体DNA整合在一起(　√　) (5)为培育抗除草剂的作物新品种，导入抗除草剂基因时只能以受精卵为受体(　×　) 提示　为培育抗除草剂的作物新品种，导入抗除草剂基因时能以受精卵为受体，也能以体细胞为受体。 (6)检测目的基因是否导入受体细胞可用抗原—抗体杂交技术(　×　) 提示　检测目的基因是否导入受体细胞的方法是PCR等技术。 1．Bt抗虫蛋白基因(简称Bt基因)是培育转基因抗虫棉较为合适的目的基因，筛选Bt基因后可以利用PCR技术对其进行大量扩增。回答下列问题： (1)什么是引物？DNA复制时为什么需要引物？ 提示　引物是指一小段能与DNA母链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸。在DNA扩增时，DNA聚合酶不能从头开始合成DNA，只能从引物的3′端延伸DNA链，因此复制DNA时应加入两种引物。 (2)PCR扩增Bt基因需要知道Bt基因的全部核苷酸序列吗？ 提示　不需要，只要知道Bt基因两端的部分核苷酸序列即可(以便根据这部分序列合成两种引物)。 (3)为检测Bt基因在转基因抗虫棉细胞中是否转录，科研人员提取棉花细胞中的总RNA，经逆转录过程获得总cDNA，通过PCR技术可在总cDNA中专一性地扩增出Bt基因的cDNA，原因是什么？ 提示　引物是依据Bt毒蛋白基因的一段已知序列设计合成的(或引物能与Bt基因的cDNA特异性结合)。 (4)PCR扩增过程中的循环图示与规律如图所示，若一个Bt毒蛋白基因在PCR中经过n轮循环，理论上得到多少个DNA分子？含引物的DNA分子多少个？含其中一种引物的DNA分子多少个？同时含两种引物的DNA分子多少个？共需要消耗多少个引物？含不等长脱氧核苷酸链的DNA分子多少个？含等长脱氧核苷酸链的DNA分子多少个？ 提示　经过n轮循环，得到2n个DNA分子，含引物的DNA分子2n个，含其中一种引物的DNA分子数(2n－1)个，同时含两种引物的DNA分子(2n－2)个，共需要消耗(2n+1－2)个引物。含不等长脱氧核苷酸链的DNA分子2n个，含等长脱氧核苷酸链的DNA分子(2n－2n)个。 (5)PCR扩增Bt基因的过程中需要解旋酶吗？并说明理由。所需要的DNA聚合酶应具有什么特点？ 提示　不需要解旋酶，因为PCR过程中，DNA双链在高温下即可完成解旋。由于PCR过程温度较高，故所需要的DNA聚合酶应具有耐高温的特点。 2．据图分析抗虫棉的培育过程。 (1)该过程中的目的基因是Bt基因，载体是Ti质粒。 (2)基因工程中，往往使用两种限制酶切割目的基因，这样做的原因是什么？ 提示　为了避免目的基因和载体的自身环化和反向连接。 (3)为了保证目的基因在受体细胞中能正确表达，对目的基因在质粒中的插入位点有什么要求？ 提示　目的基因应插入启动子与终止子之间。 (4)该实例中，导入目的基因的方法是农杆菌转化法。为什么目的基因可以整合到染色体的DNA上？ 提示　由于Ti质粒上的T－DNA可转移到受体细胞且能整合到受体细胞的染色体DNA上，而目的基因又插入T－DNA，所以目的基因可以整合到受体细胞的染色体DNA上。 (5)将目的基因导入受体细胞时，能否仅把目的基因整合到线粒体DNA或叶绿体DNA上？为什么？ 提示　一般不能。如果仅把目的基因整合到线粒体DNA或叶绿体DNA上，由于细胞分裂可能导致目的基因丢失，无法稳定遗传。 (6)该实例中，检测目的基因是否成功表达的常见方法有哪些？ 提示　抗原—抗体杂交、用棉叶饲喂棉铃虫。 考向二　辨析基因工程的基本操作程序 【例3】　(2024·贵州高考)研究者用以蔗糖为唯一碳源的液体培养基，培养真菌A的野生型(含NV基因)、突变体(NV基因突变)和转基因菌株(转入NV基因)，检测三种菌株NV酶的生成与培养液中的葡萄糖含量，结果如表所示(表中“＋”表示有，“—”表示无)。 检测用菌株 蔗糖 NV酶 葡萄糖(培养液中) 野生型 ＋ ＋ ＋ 野生型 — — — 突变体 ＋ — — 转基因菌株 ＋ ＋ ＋ 回答下列问题。 (1)据表可推测___________诱导了NV基因表达。NV酶的作用是______________________。检测NV酶活性时，需测定的指标是________________________________(答出一点即可)。 (2)表中突变体由T­DNA随机插入野生型菌株基因组DNA筛选获得。从野生型与突变体中分别提取基因组DNA作为模板，用与________(选填“T­DNA”或“NV基因”)配对的引物进行PCR扩增。若突变体扩增片段长度___________(选填“>”“＝”或“<”)野生型扩增片段长度，则表明突变体构建成功，从基因序列分析其原因是______________________________。 (3)为进一步验证NV基因的功能，表中的转基因菌株是将NV基因导入___________细胞获得的。在构建NV基因表达载体时，需要添加新的标记基因，原因是_____________________________________________________。 【答案】　(1)蔗糖　参与蔗糖分解代谢，将蔗糖分解生成葡萄糖　单位时间内葡萄糖的生成量(或蔗糖的减少量等) (2)NV 基因　大于　T­DNA 插入导致 NV 基因增加部分碱基序列 (3)突变体　便于筛选出成功导入 NV 基因的细胞 【解析】　(1)根据表格，野生型菌株加入蔗糖就会合成NV酶，不加就不会合成，推测蔗糖诱导了NV基因表达。 分析表可知有NV酶，菌株就能将蔗糖分解出葡萄糖，因此NV酶可能参与蔗糖的分解代谢过程，将蔗糖分解生成葡萄糖。 检测NV酶活性时，可以测定单位时间内葡萄糖的生成量或蔗糖的减少量等。 (2)从题目中可知，突变体是通过T­DNA 随机插入野生型菌株基因组DNA筛选获得的。在进行PCR扩增时，使用的引物需要与特定的DNA序列配对结合，才能启动DNA的扩增。野生型菌株的基因组DNA中没有T­DNA的插入，所以用与NV基因配对的引物进行扩增时，可以扩增出完整的NV基因片段。而突变体由于T­DNA的随机插入，导致NV基因中增加部分序列。这样一来，使用同样的引物进行扩增时，扩增片段的长度就会大于野生型扩增片段的长度。因此若突变体扩增片段长度>野生型扩增片段长度，则表明突变体构建成功。 从基因序列分析其原因是T­DNA插入导致NV基因增加部分序列。 (3)为进一步验证NV基因的功能，表中的转基因菌株是将NV基因导入突变体细胞获得的。突变体由于NV基因发生突变，无法正常表达NV酶，导致相关生理功能缺失或异常。通过将正常的NV基因导入突变体细胞，如果能够恢复原本在突变体中缺失或异常的生理功能，就可以有力地证明NV基因确实具有特定的功能。 在构建NV基因表达载体时，需要添加新的标记基因，原因是便于筛选出成功导入NV基因的细胞。 【例4】　(2024·甘肃高考)源于细菌的纤维素酶是一种复合酶，能降解纤维素。为了提高纤维素酶的降解效率，某课题组通过筛选高产纤维素酶菌株，克隆表达降解纤维素的三种酶(如下图)，研究了三种酶混合的协同降解作用，以提高生物资源的利用效率。回答下列问题。 (1)过程①②采用以羧甲基纤维素钠为唯一碳源的培养基筛选菌株X，能起到筛选作用的原因是_______________________________________________________。高产纤维素酶菌株筛选时，刚果红培养基上的菌落周围透明圈大小反映了________________________________。 (2)过程④扩增不同目的基因片段需要的关键酶是_________________________。 (3)过程⑤在基因工程中称为__________________________，该过程需要的主要酶有____________________。 (4)过程⑥大肠杆菌作为受体细胞的优点有_____________________________。该过程用Ca2+处理细胞，使其处于一种______________________________的生理状态。 (5)课题组用三种酶及酶混合物对不同生物质原料进行降解处理，结果如下表。表中协同系数存在差异的原因是________________________________________________(答出两点)。 生物质 原料 降解率(%) 协同系数 酶A 酶B 酶C 混1 混2 混1 混2 小麦秸秆 7.08 6.03 8.19 8.61 26.98 74.33 114.64 玉米秸秆 2.62 1.48 3.76 3.92 9.88 24.98 77.02 玉米芯 0.62 0.48 0.86 0.98 6.79 1.82 11.34 注：混1和混2表示三种酶的混合物 【答案】　(1)只有能利用羧甲基纤维素钠的微生物才能生长繁殖　菌落产生的纤维素酶的活性和量有关 (2)耐高温的DNA聚合酶 (3)基因表达载体的构建　限制酶、DNA连接酶 (4)繁殖能力强、生理结构和遗传物质简单、对环境因素敏感、容易进行遗传操作等　能吸收周围环境中DNA分子 (5)降解时的温度不同、降解时的pH不同 【解析】　(1)选择培养基是指一类根据特定微生物的特殊营养要求或其对某理化因素抗性的原理而设计的培养基。具有只允许特定的微生物生长，而同时抑制或阻止其他微生物生长的功能。在以羧甲基纤维素钠为唯一碳源的选择培养基中，只有能利用羧甲基纤维素钠的微生物才能生长繁殖。 刚果红能与培养基中的纤维素形成红色复合物，使得含有纤维素的培养基呈现红色。当纤维素被纤维素酶分解时，刚果红与纤维素的复合物无法形成，培养基中就会出现以纤维素分解菌为中心的透明圈。这个透明圈的大小直接反映了纤维素分解菌分解纤维素的能力。透明圈越大，说明纤维素分解菌分解纤维素的能力越强，即菌落产生的纤维素酶的活性强、量多。 (2)扩增目的基因片段在PCR仪中进行，因此需要耐高温的DNA聚合酶。 (3)根据图示中酶基因与质粒载体经过过程⑤构成重组质粒，推导出过程⑤为基因表达载体的构建，该过程需要限制酶和DNA连接酶。 (4)大肠杆菌作为受体细胞的优点繁殖能力强、生理结构和遗传物质简单、对环境因素敏感、容易进行遗传操作等。 先用Ca2+ 处理细胞，使其成为感受态细胞，使其处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态。将重组质粒加于缓冲液中与感受态细胞混合，在一定的温度下促进感受态细胞吸收DNA分子，完成转化过程。 (5)不同酶的最适温度、最适pH不同，当温度和pH改变时，酶促反应速率也会受到影响。 1．(选择性必修3 P67)基因工程：按照人们的愿望，通过转基因等技术，赋予生物新的遗传特性，创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。 2．(选择性必修3 P71)限制酶能够识别双链DNA分子的特定核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的磷酸二酯键断开。 3．(选择性必修3 P72)载体上有特殊的标记基因，便于重组DNA分子的筛选。 4．(选择性必修3 P77)PCR反应需要在一定的缓冲溶液中才能进行，需提供DNA模板、2种引物、4种脱氧核苷酸和耐高温的DNA聚合酶。 5．(选择性必修3 P77)真核细胞和细菌的DNA聚合酶都需要Mg2+激活。因此，PCR反应缓冲液中一般要添加Mg2+。引物是一小段能与DNA母链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸，引物的作用是使DNA聚合酶能够从引物的3′端开始连接脱氧核苷酸。 6．(选择性必修3 P80)基因表达载体的构建的目的：使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且遗传给下一代，同时，使目的基因能够表达和发挥作用。基因表达载体是载体的一种，除目的基因、标记基因外，还必须含有启动子、终止子等。启动子是RNA聚合酶识别和结合的部位，有了它才能驱动基因转录出mRNA，最终表达出人类需要的蛋白质。 7．(选择性必修3 P81)转化：目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程。 8．(选择性必修3 P81～82)将目的基因导入植物细胞的方法是农杆菌转化法、花粉管通道法；导入动物细胞的方法是显微注射法；导入微生物细胞的方法是Ca2+处理法。 9．(选择性必修3 P82)目的基因的检测与鉴定：首先是分子水平的检测，包括通过PCR等技术检测棉花的染色体DNA上是否插入了Bt基因或检测Bt基因是否转录出了mRNA；从转基因棉花中提取蛋白质，用相应的抗体进行抗原—抗体杂交，检测Bt基因是否翻译成Bt抗虫蛋白等。其次，还需要进行个体生物学水平的鉴定。例如，通过采摘抗虫棉的叶片饲喂棉铃虫来确定Bt基因是否赋予了棉花抗虫特性以及抗性的程度。 10．如图为所用载体图谱示意图，图中限制酶的识别序列及切割位点为：Hind Ⅲ(A↓AGCTT)、PvitⅡ(CAG↓CTG)、KpnⅠ(G↓GTACC)、EcoRⅠ(G↓AATTC)、PstⅠ(CTGCA↓G)、BamH Ⅰ(G↓GATCC)。为使phb2基因(该基因序列不含图中限制酶的识别序列)与载体正确连接，在扩增的phb2基因两端分别引入Pvit_Ⅱ和EcoR_Ⅰ两种不同限制酶的识别序列。将经过这两种酶酶切的phb2基因和载体进行连接时，可选用T4_DNA连接酶(填“E.coli DNA连接酶”或“T4 DNA连接酶”)。 学科网（北京）股份有限公司 $$