3.2基因工程的基本操作程序第2课时课件-2024-2025学年高二下学期生物人教版选择性必修3

目的基因的筛选与获取 基因表达载体的构建 将目的基因导入受体细胞 第一步 第二步 第三步 第四步 目的基因的检测与鉴定 基因工程的基本操作程序 第3章 基因工程 第2节 基因工程的基本操作程序 （第2课时） 本节聚焦 1、基因工程的基本操作程序主要包括哪几个步骤？ 2、基因工程操作的每一步涉及的技术和方法有哪些？ 阅读教材P81-82，思考并回答下列问题： 自主探究（思） 1、将目的基因导入植物的方法有哪些？如何操作？ 2、农杆菌有何特点？农杆菌转化法的原理、过程是什么？ 3、目的基因导入动物细胞的受体细胞、方法？ 4、目的基因导入微生物细胞的方法？微生物作为受体的优点？ 5、分子水平上检测包括哪些方面？方法是什么？个体生物学水平如何检测？ 由于不同转基因产品所需要的目的基因不同，受体细胞又有植物、动物、微生物之分，因此基因表达载体的构建方法不是千篇一律的,将目的基因导入受体细胞的方法也不是完全相同的。 第三步：将目的基因导入受体细胞 （1）花粉管通道法（我国科学家独创） 方法2：在植物受粉后的一定时间内，剪去柱头，将DNA溶液滴加在花柱切面上，使目的基因借助花粉管通道进入胚囊。 方法1：用微量注射器将含目的基因的DNA溶液直接注入子房中。 目的基因 目的基因 适用生物：开花植物 1.目的基因导入植物细胞 将Bt基因导入棉花细胞的方法。 操作方式： 将目的基因导入植物的方法有哪些？如何操作？ 第三步：将目的基因导入受体细胞 1.目的基因导入植物细胞 （2）农杆菌转化法 目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程。实质是基因重组。 （可转移的DNA） 关于农杆菌 ①农杆菌特点 农杆菌细胞内含有Ti质粒，当它侵染植物细胞后，能将Ti质粒上的T-DNA（可转移的DNA）转移到被侵染的细胞、并且将其整合到该细胞的染色体DNA上。 农杆菌是一种在土壤中生活的微生物，能在自然条件下侵染双子叶植物和裸子植物，而对大多数单子叶植物没有侵染能力。 ②原理 农杆菌有何特点？农杆菌转化法的原理、过程是什么？ 转化： 第三步：将目的基因导入受体细胞 1.目的基因导入植物细胞 （2）农杆菌转化法 目的基因 Ti质粒 表达 载体 农杆菌 植物细胞 植物细胞 染色体DNA 新性状植株 构建 转入 导入 插入 表达 ③过程： ①两次拼接: 第1次---目的基因拼接到Ti质粒的T-DNA上。 第2次---被插入目的基因的T-DNA拼接到受体细胞染色体的DNA上。 ②两次导入： 第1次---将含有目的基因的重组Ti质粒导入农杆菌。 第2次---含目的基因的T-DNA导入受体细胞。 含目的基因 含重组Ti质粒的农杆菌 植物细胞 表现出新性状的植株 2.将目的基因导入动物细胞 （1）常用方法： （2）受体细胞: 显微注射法 受精卵 （3) 过程： 构建基因表达载体并提纯 利用显微注射将基因表达载体注入动物的受精卵中 早期胚胎培养 胚胎移植 获得具有新性状的动物 为什么常选用受精卵作为受体细胞呢？ 第三步：将目的基因导入受体细胞 ①体积大，易操作。 ②全能性高，易培养成完整个体。 目的基因导入动物细胞的受体细胞、方法？ 知识拓展:病毒介导法（主要用于导入动物细胞） 科学家也用病毒DNA与目的基因一起构建的载体，去感染受体动物细胞，也能使目的基因导入动物细胞内。如用腺病毒载体，搭载新冠病毒S基因，进入人体内，使人体产生对S蛋白的免疫记忆。 第三步：将目的基因导入受体细胞 （1）常用方法： Ca2+（CaCl2）处理 原核细胞（常选择大肠杆菌） 可使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态。 （2）受体细胞： 繁殖快，多为单细胞，遗传物质相对较少，易于培养。 3.目的基因导入微生物细胞 Ca2+ 感受态细胞 吸收 Ca2+处理细胞 感受态细胞 表达载体与感受态细胞混合 感受态细胞吸收DNA分子 重组DNA分子 目的： 优点： 种类 项目 植物细胞 动物细胞 微生物细胞 常用方法       受体细胞       转化 过程 农杆菌转化法；花粉管通道法 显微注射法 Ca2＋处理法 体细胞或受精卵 受精卵 原核细胞 将目的基因导入受体细胞小结 目的基因插入Ti质粒的T­DNA上构建表达载体→转入农杆菌→导入植物细胞→插入植物细胞的染色体DNA中→表现出新性状的植株 构建基因表达载体并提纯→利用显微注射将基因表达载体注入动物的受精卵中→早期胚胎培养→胚胎移植→获得具有新性状的动物 Ca2＋处理细胞→感受态细胞→表达载体与感受态细胞混合→感受态细胞吸收DNA分子 下面为利用农杆菌转化法制备转基因植物的过程图，据图回答下列问题： ①重组Ti质粒的构建需要哪些酶的作用？ 限制酶、DNA连接酶。 ②将基因表达载体导入农杆菌细胞时，应怎样处理农杆菌细胞？ 要用Ca2＋处理农杆菌细胞，使其处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态。 ③学以致用：如何制备能生产人胰岛素的大肠杆菌？ 胰腺 提取筛选 胰岛mRNA 胰岛素cDNA 逆转录 重组 质粒 质粒 导入 大肠杆菌 mRNA 胰岛素原 加工 成熟胰岛素 A.图中Ⅰ是质粒，步骤①需要用到限制酶和DNA连接酶 B.图中Ⅱ是含目的基因的重组质粒，步骤②是将重组质粒导入棉花细胞 C.图中Ⅲ 是农杆菌，通过步骤③将目的基因导入植物细胞 D.剔除培育成功的抗虫棉体内的四环素抗性基因不会影响抗虫基因的表达 3.如图为科学家通过基因工程培育抗虫棉时，从苏云金杆菌中提取抗虫基因“放入”棉花细胞中，与棉花的DNA分子“结合起来”而发挥作用的过程示意图。以下相关说法不正确的是( ) 2.如图表示转基因动、植物的培育过程。下列有关叙述错误的是( ) A.受体细胞A只能是绵羊的体细胞 B.②过程中需要进行胚胎移植操作 C.可采用花粉管通道法将目的基因导入受体细胞B D.③过程中一般需要生长素和细胞分裂素 1.我国科学家独创的花粉管通道法，可以使目的基因借助花粉管通道进入受体细胞，是一种十分简便经济的方法，对此认识正确的是( ) A.不必构建表达载体就可以直接导入 B.此方法可用于转基因动物 C.受体细胞只能是植物的卵细胞 D.有时可以取代农杆菌转化法 D A B 课后练习（检） Bt基因 mRNA Bt抗虫蛋白 抗虫棉 第四步：目的基因的检测与鉴定 目的基因检测与鉴定的目的和内容是什么？ PCR等技术 抗原—抗体杂交 分子 水平 抗虫、抗病鉴定 个体水平 受体细胞的染色体DNA上是否插入了目的基因 目的基因是否转录出了mRNA 目的基因是否翻译成蛋白质 个体是否具有相应性状 检测目的基因进入受体细胞后，是否稳定维持和表达其遗传特性。 目的： 内容： 第四步：目的基因的检测与鉴定 （1）检测目的基因是否插入 转基因生物 提取DNA DNA作为模板 PCR操作 是否扩增出目的基因 电泳操作 1.分子水平的检测 PCR琼脂糖凝胶电泳检测结果 ——通过PCR等技术检测 如检测棉花的染色体 DNA 上是否插入了 Bt 基因。 M：marker 1-6：转基因棉花 7：非转基因棉花 8：阴性对照 1. 分子水平的检测 （2）检测目的基因是否转录 —— 通过 PCR 等技术检测 如检测 Bt 基因是否转录出 mRNA。 Bt M3 C0 T-9 T-2 T-51 T-5 T-23 T-11 T-20 T-21 T-34 T-10 10个 PCR 阳性棉花植株中，有四株 Bt 基因发生转录。 第四步：目的基因的检测与鉴定 对扩增产物进行电泳检测 转基因生物 PCR操作 是否扩增出目的基因 逆转录 cDNA 提取mRNA mRNA作为模板 1. 分子水平的检测 第四步：目的基因的检测与鉴定 （3）目的基因是否翻译 抗原-抗体杂交技术 提取 Bt毒蛋白 注射小鼠体内 标记抗体 提取蛋白 电泳分离 抗原 抗体 杂交 苏云金杆菌 如检测Bt基因是否翻译出Bt 抗虫蛋白。 抗体 标记抗体 如果出现杂交带，说明目的基因成功翻译出蛋白质。 原理：抗原与抗体的特异性结合。 转基因棉花 方法2：分子杂交技术 利用基因探针来检测目的基因是否导入或者转录出了mRNA。 不同大小的核酸分子 具体步骤： a.提取受体细胞的DNA（RNA）进行酶切后，进行琼脂糖凝胶电泳； b.对分离后定位在凝胶上的DNA（RNA）进行处理，并将凝胶中变性的DNA转移至硝酸纤维素膜上固定； c.用相应的带有标记的探针进行杂交，出现杂交带（即形成双链），经放射自显影，就可鉴别出目的基因或RNA。 基因探针是一段带有荧光标记或同位素标记，且序列已知，能与目的基因进行碱基互补配对的核酸序列（DNA单链或RNA单链），应是单链，若为双链，必须先行变性处理成单链。 转基因生物 鉴定方法 成功标志 抗虫植物 抗病毒（菌）植物 抗盐植物 抗除草剂植物 获取目的基因产物的转基因生物 饲喂害虫（抗虫接种实验） 害虫死亡 病毒（菌）接种实验 未染病 盐水浇灌 正常生长 喷洒除草剂 正常生长 提取细胞产物与天然产品进行功能活性比较 功能、活性正常 第四步：目的基因的检测与鉴定 2.个体生物学水平鉴定 抗性检测： 功能活性比较： 抗虫、抗病接种实验，以确定是否具有抗性以及抗性程度； 基因工程产品与天然产品的功能活性比较，以确定功能活性是否相同。 ——检测是否具有抗性以及抗性强度等 如：胰岛素注射到糖尿病模型小鼠。 合作探究（议） 1.若无法获得该蛋白，原因可能是什么？ 2.以上情况如何解决？ 3.若可以获得该蛋白，但是蛋白质无活性，原因可能是？ 4.以上情况如何解决？ 真核生物的基因有内含子，原核生物没有真核生物所具有的切除内含子对应的RNA序列的机制，其初始转录产物中与内含子对应的RNA序列不能被切除，因此无法表达出该蛋白。 使用cDNA作为目的基因或使用酵母菌等真核生物作为受体细胞 原核生物缺少高尔基体和内质网等细胞器，无法对真核生物的蛋白质进行正确的加工。 人工体外再加工或使用酵母菌等真核生物作为受体细胞 当真核生物的基因以原核生物作为受体细胞时： 目的基因的筛选与获取 基因表达载体的构建 将目的基因导入受体细胞 第一步 第二步 第三步 第四步 目的基因的检测与鉴定 基因工程的基本操作程序 前提 核心 关键 保证 利用PCR获取和扩增 目的基因、 启动子、 终止子、 标记基因 农杆菌转化法(植物)、显微注射法(动物) 、 感受态细胞法(微生物); 分子检测：是否插入、转录、翻译 个体水平：是否具有抗性以及抗性强度等。 有了目的基因，我们才能赋予一种生物以另一种生物的遗传特性。 使目的基因在受体细胞中稳定存在，并可进行遗传、表达和发挥作用。 载体进入受体细胞稳定表达，才能实现一种生物的基因在另一种生物中的转化。 才能确定目的基因是否真正在受体细胞中稳定遗传和正确表达。 1.人血白蛋白在临床上被广泛应用。我国科学家通过生物工程技术在水稻胚乳中提取到人血白蛋白，其流程如下图所示。下列叙述正确的是（　　） A．PCR扩增时需要DNA模板、引物、耐高温的RNA聚合酶等条件 B．过程①需用农杆菌转化法将人血白蛋白基因直接导入水稻胚乳细胞中 C．过程①需将目的基因与胚乳中特异性表达基因的启动子等调控元件重组 D．过程②改变生长素和细胞分裂素的浓度及比例不影响细胞的脱分化过程 C 2.除草剂的有效成分草甘膦能够专一性抑制EPSP合成酶的作用，从而使植物多种代谢途径受影响而导致植物死亡。草甘膦没有选择性，除掉杂草的同时作物也会受损。培育抗草甘膦作物是解决办法之一，下列关于转入外源EPSP合成酶基因使矮牵牛抗草甘膦流程的叙述正确的是（　　） A．可以通过mRNA在逆转录酶的作用下构建cDNA文库，从中获取EPSP合成酶基因 B．用限制酶和DNA连接酶处理目的基因和Ti质粒，仅涉及磷酸二酯键的断裂和形成 C．基因表达载体组件中的起始密码子是RNA聚合酶识别和结合的部位，驱动基因转录 D．目的基因插入Ti质粒的T-DNA上，农杆菌的转化能使植物细胞都能培育出转基因植株 A 课后练习（检） 3.科研人员利用农杆菌转化法将抗病毒蛋白基因C 导入番木瓜，培育出转基因抗病番木瓜，所用的 Ti 质粒如图所示。下列叙述正确的是（ ） A．该技术的原理是农杆菌的拟核DNA 与番木瓜基因发生重组 B．构建基因表达载体需要限制酶和耐高温的 DNA 聚合酶 C．可利用 PCR 技术筛选出含有抗病毒蛋白基因C 的受体细胞 D．可利用卡那霉素抗性基因检测是否成功构建抗病毒番木瓜 C 4.如图为转基因抗虫烟草的培育流程，下列叙述正确的是（　　） A．培育过程①需要使用纤维素酶和果胶酶 B．培育过程②将重组Ti质粒导入烟草细胞前需要使用CaCO3处理农杆菌 C．培育过程③④仅通过调节植物激素可诱导愈伤组织再生出新植株 D．可通过观察害虫吞食转基因烟草后的存活情况进行个体水平检测 D 课后练习（检） 5.快速准确的检测对疫情防控起着至关重要的作用。病毒的检测方法有：①用“新冠病毒核酸检测试剂盒”，检测病毒的遗传物质RNA；②特异性抗原蛋白检测，即检测病毒表面的一种糖蛋白；③特异性抗体检测，即检测感染者体内通过免疫反应所产生的某种抗体。下列有关说法不正确的是（　　） A．方法②③都需要用到抗原—抗体杂交的方法 B．方法①②③都需要从患者体内采集病毒样本 C．某人有可能①②为阳性③为阴性，也可能③为阳性①②为阴性 D．由于RNA比DNA稳定性差，核酸检测时往往需将病毒样本的RNA反转录成cDNA，扩增之后进行分段测序 B 6.科学家从某植物中提取乙烯受体基因（Ers1），通过基因工程技术将Ers1基因反向连接到质粒中，筛选出转入反义Ersl基因的该种植物，其果实的储藏期将延长，过程如图所示。下列相关叙述错误的是（ ） A．PCR扩增时，需在Ers1基因左右两端分别添加XhoI、HpaI酶切序列 B．筛选农杆菌的培养基中可加入潮霉素，过程④包括脱分化和再分化 C．转基因植物中反义Ersl基因和Ersl基因分别转录出的mRNA碱基序列能互补 D．若目的基因成功转入植物细胞中，则可检测到Kanr和hyg的表达产物 D 8.科学家将人的生长激素基因与某种细菌(不含抗生素抗性基因)的DNA分子进行重组，并成功地在该细菌中得以表达(如图)。下列相关叙述错误的是（ ） A.过程①合成人生长激素基因的过程 需要用到逆转录酶 B.过程③是将重组质粒溶于缓冲液后 与经Ca2＋处理的细菌B混合 C.成功导入了重组质粒的细菌B在含有 氨苄青霉素的培养基上不能生长 D.可采用抗原—抗体杂交技术检测工 程菌中生长激素基因是否成功表达 C 7.下列哪一种方法不能用于检测目的基因是否成功导入或表达( ) A.在显微镜下直接观察受体细胞中是否含有目的基因 B.通过PCR等技术检测受体细胞的DNA分子上是否含有目的基因 C.提取受体细胞合成的相应蛋白质，利用抗原—抗体特异性反应进行检测 D.抗虫基因导入植物细胞后，检测植物是否具有抗虫特性 A 课后练习（检） 9.NK603是能耐草甘膦(一种除草剂)的转基因玉米，这种玉米因导入了抗草甘膦基因，对草甘膦具有抗药性。请回答下列问题： (1)基因工程的操作程序主要包括四个步骤，其核心步骤是____________________；PCR可以特异性地快速扩增抗草甘膦基因，扩增抗草甘膦基因时，需要用到从嗜热菌中提取出的_____________________________________，还要合成一小段能与抗草甘膦基因碱基互补配对的片段，即________。 基因表达载体的构建　 　 耐高温的DNA聚合酶(Taq DNA聚合酶)　 引物　 (2)为促进农杆菌吸收含抗草甘膦基因的重组Ti质粒，一般先用______________处理农杆菌细胞；当含有重组Ti质粒的农杆菌侵染玉米细胞后，抗草甘膦基因随Ti质粒的________转移到玉米细胞中，并整合到__________DNA上。 (3)培育转基因动物一般是将目的基因注入动物的受精卵，而不是体细胞，原因是__________________________________________________。 (4)在个体水平上鉴定耐草甘膦的转基因玉米培育是否成功的措施是 ________ ________________________________________。 钙离子(Ca2+)　 T－DNA　 染色体　 动物的受精卵具有全能性，动物体细胞不具有全能性　 转基因玉米喷施草甘膦，观察它们抗草甘膦效果 课后练习（检） 10.甘蓝型油菜中，抑制PEP基因的表达可提高油菜籽的含油量。通过基因工程将PEP基因反向连接在启动子后，构建转反义PEP基因油菜是提高油菜籽含油量的常用技术路径。请回答下列问题： (1)为将PEP基因反向连接在启动子后，构建反义PEP基因，需要将限制酶酶切位点设计在引物上，PEP基因的上游引物和下游引物中应分别引入_____________ 酶切位点。 ScaⅠ、HamHⅠ (2)用激光照射油菜愈伤组织时，可在细胞膜上打出一个穿孔，转反义PEP基因表达载体由此小孔进入油菜细胞，几秒钟后小孔封闭，该过程体现了细胞膜具有 。目的基因表达载体进入细胞后，Ti质粒上的 区段可转移到油菜细胞的基因组中。 流动性 T－DNA (3)筛选时，需在油菜愈伤组织培养基中加入 进行初步选择。在激光照射下，存活的细胞一般会发出 。为检测反义PEP基因是否整合到染色体上，研究者通常检测细胞中是否存在ntp基因，而不检测PEP基因。不直接检测PEP基因的原因是_______________________ 。 新霉素 绿色荧光 油菜细胞的基因组中本身有PEP基因 (4)已知PEP基因的转录模板链为A链，则反义PEP基因的转录模板为 。转反义PEP基因油菜中PEP基因的表达受阻，原因是___________________________________ _________________________________________________________。 B链 以B链为模板转录出 的RNA与以A链为模板转录出的RNA配对形成双链，抑制了PEP基因的翻译过程 课后练习（检） 11.图1是某基因工程中构建重组质粒的过程示意图，载体质粒P0具有四环素抗性基因(TetR)和氨苄青霉素抗性基因(AmpR)。请回答下列问题： (1)用Taq DNA聚合酶进行PCR扩增获得的目的基因片段，其两端各自带有一个腺嘌呤脱氧核苷酸。载体P1用酶处理，在两端各添加了一个碱基为______________的脱氧核苷酸，形成P2；P2和目的基因片段在___________酶作用下，形成重组质粒P3。 胸腺嘧啶(T)　 DNA连接　 (2)为鉴定筛选出的菌落中是否含有正确插入目的基因的重组质粒，拟设计引物进行PCR鉴定。图2为甲、乙、丙 3条引物在正常重组质粒中的相应位置，PCR鉴定时应选择的一对引物是__________。某学生尝试用图中另外一对引物从某一菌落的质粒中扩增出了400 bp 片段，原因是____________________。 乙、丙　 图2 目的基因反向连接　 图1 课后练习（检） 探究实践：DNA 片段的扩增及电泳鉴定 1. 实验原理： （1）利用PCR在体外进行DNA 片段的扩增 （2）DNA 片段的电泳鉴定 DNA分子具有可解离的基团，在一定的pH下，这些集团会带上正电荷或负电荷。在电场的作用下，带电分子会向着它所带电荷相反的电极移动，这个过程就是电泳。 PCR产物一般通过琼脂糖凝胶电泳鉴定。在凝胶中DNA分子的迁移速率与凝胶浓度、DNA 分子大小和构象（如链状和环状）等有关。 凝胶中的DNA分子通过染色，可在波长300nm紫外灯下被检测出来。 ①PCR利用了DNA的热变性原理，通过调节温度来控制DNA双链的解聚与结合，PCR仪实质上就是一台能够自动调控温度的仪器。一次PCR一般要经历30次循环。 ②PCR扩增DNA片段还利用了DNA半保留复制的原理。 变性 90˚C 延伸 72˚C 退火 50˚C 2.材料用具 (1)用具 探究实践：DNA 片段的扩增及电泳鉴定 PCR仪 微量离心管 微量移液器 自动控温，实现DNA的扩增 实际上是进行PCR反应的场所 用于向微量离心管转移PCR配方中的液体 一次性吸液枪头 微量移液器吸取一种试剂更换一次枪头 包括电泳仪、电泳槽等 电泳装置 (2)试剂 ①4种脱氧核苷酸等量混合液、2种引物、TaqDNA 聚合酶、模板DNA、扩增缓冲液、无菌水。 ③PCR反应体系的配方(右表) ②电泳缓冲液： 凝胶载样缓冲液： 核酸染料： PCR反应体系的配方 10倍浓缩的扩增缓冲液（含Mg2+） 5uL 20mmol/L的4种脱氧核苷酸的等量混合液（实为dNTP） 1uL 20umol/L的引物I 2.5uL 20umol/L的引物II 2.5uL H2O 28-33uL 1-5U/uL的TaqDNA聚合酶 （即耐高温的DNA聚合酶） 1-2U 模板DNA 5-10uL 总体积 50uL 2.材料用具 探究实践：DNA 片段的扩增及电泳鉴定 注：模板DNA的用量为1pg-1ug。 用来维持pH值，使DNA带负电。 用于指示DNA样品可能位置。 核酸染料在紫外光照射下发荧光。核酸染料可与DNA分子形成染料-DNA复合物，其荧光强度与DNA含量成正比。 琼脂糖等。 Ⅰ.预变性的目的？ Ⅱ.最后一个循环结束后通常还需在72℃维持几分钟，目的是？ 3.实验步骤 用微量移液器按照PCR反应体系配方或PCR试剂盒的说明书，在微量移液管中依次加入各组分。 待所有组分都加入后，盖严离心管的盖子。将微量离心管放入离心机里，离心约10s，使反应液集中在离心管的底部。 参照下表的参数，设置好PCR仪的循环程序。将装有反应液的微量离心管放入PCR仪中进行反应。 移液 离心 扩增 使子链充分延伸,可根据目的片段长度适当调整延伸时间。 使DNA充分变性，以利于引物更好地和模板结合。 探究实践：DNA 片段的扩增及电泳鉴定 (1)DNA片段的扩增 视频：PCR扩增DNA片段 将温热的琼脂糖溶液迅速倒入模具，并插入合适大小的梳子，以形成加样孔。 待凝胶溶液完全凝固，小心拔出梳子，取出凝胶放入电泳槽内。 将电泳缓冲液加入电泳槽中，电泳缓冲液没过凝胶1mm为宜。 扩增得到的PCR产物与凝胶载样缓冲液(内含指示剂)混合，再用微量移液器将混合液缓慢注入凝胶的加样孔内。留一个加样孔加入指示分子大小的标准参照物。 接通电源，根据电泳槽阳极至阴极之间的距离来设定电压，一般为1～5V/cm。待指示剂前沿迁移接近凝胶边缘时，停止电泳。 取出凝胶置于紫外灯下观察和照相。 ①加液： ②加样： ③电泳： 根据待分离DNA片段的大小，用电泳缓冲液配制琼脂糖溶液，一般配制质量分数0.8%～1.2%的琼脂糖溶液。在沸水浴或微波炉内加热至琼脂糖熔化。稍冷却后，加入适量的核酸染料混匀。 观察鉴定 ①融化： ②倒模: ③凝固: 制备凝胶 进行电泳 (2)PCR扩增产物电泳鉴定的具体过程 3.实验步骤 探究实践：DNA 片段的扩增及电泳鉴定 视频：DNA琼脂糖凝胶电泳 4.注意事项 ①为避免外源DNA等因素的污染，PCR实验中使用的微量离心管、枪头和蒸馏水等在使用前必须进行高压灭菌处理。 ②该实验所需材料可以直接从公司购买，缓冲液和酶应分装成小份，并在-20℃储存。使用前，将所需试剂从冰箱拿出，放在冰块上缓慢融化。 ③在向微量离心管中添加反应组分时，每吸取一种试剂后，移液器上的枪头都必须更换。 ④在进行操作时，一定要戴好一次性手套。 ⑤PCR扩增不能随意加大试剂用量。 探究实践：DNA 片段的扩增及电泳鉴定 （1）你是否成功扩增出DNA片段？判断的依据是什么？ 以在紫外灯下直接观察到DNA条带的分布及粗细程度（条带的分布代表扩增产物的类型；条带的粗细代表扩增产物量的多少）来评价扩增的结果。进行电泳鉴定的结果应该是一条条带。 该片段大小约为750bp （3）你进行电泳鉴定的结果是几条条带？如果不止一条条带，请分析产生这个结果的可能原因。 未出现扩增条带可能的原因有： 出现非特异性扩增带可能的原因有： 5.实验结果及分析评价 探究实践：DNA 片段的扩增及电泳鉴定 ①TaqDNA聚合酶失活；②引物出现质量问题；③变性时温度低，变性时间短④Mg2+浓度过低⑤漏加了PCR的反应成分⑥各反应成分的用量不当⑦PCR程序设置不当等。 ①引物设计不合理，它们与非目的序列有同源性或容易形成二聚体；②复性时的温度过低③DNA聚合酶的浓度过高④模板DNA出现污染⑤Mg2+浓度过高 （2）通过电泳条带能否确定扩增产物一定是所需的 DNA 片段？为什么 不能；因为电泳条带仅能显示扩增片段的大致长度，不能显示精准的 DNA 碱基数量，也不能呈现碱基序列。 1、用PCR方法检测转基因植株是否成功导入目的基因时，得到以下电泳图谱，其中1号为DNA标准样液(Marker)，10号为蒸馏水，PCR时加入的模板DNA如图所示。据此作出的分析，不合理的是( ) A.PCR产物的分子大小在250～500 bp之间 B.3号样品为不含目的基因的载体DNA C.9号样品对应植株不是所需的转基因植株 D.10号确定反应体系等对结果没有干扰 B 2、为优化目的基因(700 bp)的PCR条件，研究者设计不同的复性温度进行实验，产物的琼脂糖凝胶电泳结果如下图。据图分析，下列表述错误的是（ ） A.对照组可用无菌蒸馏水代替模板，其他成分相同 B.电泳条带的宽度、亮度与扩增产物大小呈正相关 C.复性温度的高低会影响PCR扩增产物的纯度 D.58 ℃是本实验中扩增该基因的最佳复性温度 B 课后练习（检） 3、在基因工程操作过程中，科研人员利用识别两种不同序列的限制酶(R1和 R2)处理某 DNA，进行凝胶电泳检测，结果如图所示。以下相关叙述中，正确的是( ) A.该 DNA 最可能是线状 DNA 分子 B.两种限制酶在该 DNA 上各有两个酶切位点 C.限制酶 R1与 R2的切点最短相距约 200 bp D.限制酶 R1与 R2的切点最长相距约 800 bp C 4、一种双链DNA分子被三种不同的限制酶切割,切割产物通过电泳分离,用大小已知的DNA片段的电泳结果作为分子质量标记。关于该双链DNA,下列说法错误的是 (　　) A.呈环状结构 B.分子质量大小为10 kb C.有一个NotⅠ和两个EcoRⅠ切点 D.其NotⅠ切点与EcoRⅠ切点的最短距离为2 kb D 课后练习（检） 5、用A和B两种限制酶同时和分别处理同一DNA片段，限制酶对应切点一定能切开。两种酶切位点及酶切产物电泳分离结果如图1和图2所示。下列叙述错误的是（　　） A．用A和B两种限制酶同时处理图中同一DNA片段得到6个游离的磷酸基团 B．图1中X代表的碱基对数为4500，Y是限制酶A的酶切位点 C．电泳凝胶中DNA分子的迁移速率与凝胶的浓度、DNA分子大小和构象等有关 D．设计引物从图1中完整DNA片段中扩增出完整X，至少需要3次PCR A 课后练习（检） 6、γ射线照射大豆，筛选出纯合突变体甲，将其与野生型大豆为亲本，进行正反交获得 F₁，采用特异性引物对双亲及 F₁植株的基因组进行 PCR 扩增，结果如下图。下列分析错误的是（ ） A．γ射线照射可提高大豆基因突变频率 B．杂交成功获得的 F₁ 植株有 3、4、7、9 C．突变体甲自交获得的 F₁ 植株有 3 种 D．获得的 F₁ 植株自交，后代基因型频率不变 D 课后练习（检） 7、抗原检测阴性但临床仍然高度怀疑新冠病毒感染的患者，医生会建议做核酸检测。该检测实际采用的技术是 RT-PCR，病毒刺突蛋白编码序列如下图所示，科研人员为该PCR 分 别设计了引物 A ( 5’-CCCTGTATGGGGTTCTAA - 3') 和 引物B(5'-ACG…ACT①TT A②CTGGTGCAG-3'),已知引物 A 中 ATG 对应起始密码子，引物B中 TTA 对应终止密码子，标记基因可以插入刺突蛋白编码序列的首端或末端。下列叙述正确的是（ ） A．获取新冠病毒的遗传物质后直接进行 PCR 扩增以节省出报告时间 B．若标记基因需要插入引物B的①或②位置中，则应选择②位置 C．用琼脂糖凝胶电泳来鉴定 PCR 后的产物，电泳结束后可在凝胶上直接观察到相应条带 D．为避免杂菌污染，PCR 实验过程中使用的微量离心管、枪头和蒸馏水等在使用前必须进行干热灭菌 B 课后练习（检） 8、DNA测序时，先将待测单链DNA模板、引物、有关酶、4种脱氧核苷三磷酸（dNTP，N代表A、T、C、G，能提供能量并作为DNA复制的原料）均加入4个试管中，再分别加入一定量的含放射性同位素标记的ddNTP（ddGTP、ddATP、ddCTP、ddTTP）。不同于dNTP的是，ddNTP的五碳糖的3位不含羟基。在DNA合成时ddNTP随机与dNTP竞争核苷酸链延长位点，并终止DNA的延伸，从而形成不同长度的一系列终止处带有放射性同位素标记的DNA链。下图是DNA测序时得到含放射性标记的子代DNA的电泳图谱。下列相关说法错误的是（　　） A．反应体系中的引物为单链，DNA聚合酶从引物的3'端连接脱氧核苷酸 B．ddNTP终止子链延伸，其原理可能是其五碳糖的3'位不含羟基，无法连接新的脱氧核苷酸 C．图中加入ddCTP的一组中，可以形成3种长度的子链 D．图中子代DNA的碱基序列是5'-GATCCGAAT-3' D D 课后练习（检） 一、概念检测 1.研究人员将一种海鱼的抗冻蛋白基因afp整合到土壤农杆菌的Ti质粒上，然后用它侵染番茄细胞，获得了抗冻的番茄品种。判断下列相关表述是否正确。 （1）afp基因是培育抗冻番茄用到的目的基因。 （ ） （2）构建含有afp基因的Ti质粒需要限制酶、DNA连接酶和核酸酶（ ） （3）只要检测出番茄细胞中含有afp基因，就代表抗冻番茄培育成功（ ） √ × × 2.利用PCR既可以快速扩增特定基因，也可以检测基因的表达。下列有关PCR的叙述错误的是（ ） A. PCR用的DNA聚合酶是一种耐高温酶 B. 变性过程中双链DNA的解开不需要解旋酶 C. 复性过程中引物与模板链的结合遵循碱基互补配对原则 D. 延伸过程中需要DNA聚合酶、ATP和 4种核糖核苷酸 D 练习与应用 二、拓展应用 1. 研究人员在研究转基因烟草中外源卡那霉素抗性基因的遗传稳定性时，发现44株转基因烟草中有4株该基因的遗传不符合孟德尔遗传规律，在它们的自交后代中出现了较多的没有卡那霉素抗性的植株。请查找相关资料，尝试对这个问题作出解释。 外源基因插入基因组中可能为单位点插入，或者同一染色体多位点插入，或者不同染色体多位点插入。大多数情况下，插入的位点难以做到定点插入；插入的拷贝数也是随机的。因此，外源基因在转基因植物中的遗传是很复杂的。例如，科研人员在对转GUS基因(β-葡糖醛酸糖苷酶基因)的烟草进行基因表达分析时，发现部分转基因植株的染色体DNA中整合了多个拷贝的基因，从而导致GUS基因失活。除此之外，外源基因丢失、基因重排等也都可能影响外源基因的稳定性。 练习与应用 Lavf58.46.101 Multimedia Cloud Transcode (cloud.baidu.com) Lavf58.28.100 $$