2026届高三生物学一轮复习讲义微专题16：CRISPRCas9基因编辑、融合基因与融合蛋白、 单酶切导致的正、反接的电泳检测和PCR检测

微专题16　CRISPR/Cas9基因编辑、融合基因与融合蛋白、 单酶切导致的正、反接的电泳检测和PCR检测 考情速览 热点 考情 CRISPR/Cas9基因编辑 2024·新课标卷，35；2023·海南卷，20；2021·海南卷，25 单酶切导致的正、反接的电泳检测和PCR检测 2024·黑吉辽卷，17、25；2024·全国甲卷，38；2024·河北卷，24；2024·湖南卷，15；2024·江西卷，12；2024·浙江6月选考，19、20；2023·山东卷，25；2022·福建卷，13 融合基因与融合蛋白 2023·浙江6月选考，19；2023·辽宁卷，8；2023·江苏卷，22；2023·天津卷，17 热点1　CRISPR/Cas9基因编辑 【剖析真题】 (2021·海南卷，25)CRISPR/Cas9是一种高效的基因编辑技术，Cas9基因表达的Cas9蛋白像一把“分子剪刀”，在单链向导RNA(sgRNA)引导下，切割DNA双链以敲除目标基因或插入新的基因。CRISPR/Cas9基因编辑技术的工作原理如图所示。 回答下列问题。 (1)过程①中，为构建CRISPR/Cas9重组质粒，需对含有特定sgRNA编码序列的DNA进行酶切处理，然后将其插入到经相同酶切处理过的质粒上，插入时所需要的酶是________。 (2)过程②中，将重组质粒导入大肠杆菌细胞的方法是_______________________________________________________________。 (3)过程③～⑤中，sgRNA与Cas9蛋白形成复合体，该复合体中的sgRNA可识别并与目标DNA序列特异性结合，二者结合所遵循的原则是________。随后，Cas9蛋白可切割____________序列。 (4)利用CRISPR/Cas9基因编辑技术敲除一个长度为1 200 bp的基因，在DNA水平上判断基因敲除是否成功所采用的方法是________，基因敲除成功的判断依据是_______________________________________________________________。 (5)某种蛋白酶可高效降解羽毛中的角蛋白。科研人员将该蛋白酶基因插入到CRISPR/Cas9质粒中获得重组质粒，随后将其导入到大肠杆菌细胞，通过基因编辑把该蛋白酶基因插入到基因组DNA中，构建得到能大量分泌该蛋白酶的工程菌。据图简述CRISPR/Cas9重组质粒在受体细胞内，将该蛋白酶基因插入到基因组DNA的编辑过程：________________________________________________ _______________________________________________________________ _______________________________________________________________。 【梳理知识】 CRISPR/Cas9是细菌体内的用来对抗侵略细菌的外源DNA或噬菌体的基因编辑系统。CRISPR 是成簇的、规律间隔的、短回文重复DNA序列。Cas9蛋白是一种RNA引导的DNA内切核酸酶，当细菌受到噬菌体的侵染时，它的某段DNA序列被Cas内切核酸酶剪切后整合到CRISPR的间隔序列区域，当相同种类的噬菌体再次侵染细菌时，转录的crRNA可以引导Cas9蛋白找到并切断噬菌体(形成平末端)释放到细菌体内的DNA，从而阻止噬菌体在细菌体内繁殖。其作用机制大体可以分为三个步骤： (1)Cas内切核酸酶(Cas酶)切割噬菌体获取新的间隔序列。 (2)将其引入原间隔序列并转录出crRNA。 (3)crRNA和Cas9蛋白形成复合物精准切割与新间隔序列相同的基因。具体过程如图所示。 命题要点提醒： (1)质粒构建：在一个载体上包含目标DNA片段的特定区域和Cas9内切核酸酶基因。 (2)基因编辑用途：定点基因编辑，构建一个质粒即可，基因(部分)切除，需要构建两个质粒，两个质粒转录出的sgRNA分别与基因的两侧碱基配对。 (3)脱靶问题：即对基因组非特异性切割。有效解决方法：适当增加sgRNA的长度，设计出特异性较强的sgRNA。 【巩固训练】 1.(经典高考)近年诞生的具有划时代意义的CRISPR/Cas9基因编辑技术可简单、准确地进行基因定点编辑。其原理是由一条单链向导RNA引导内切核酸酶Cas9到一个特定的基因位点进行切割。通过设计向导RNA中20个碱基的识别序列，可人为选择DNA上的目标位点进行切割(如图)。下列相关叙述错误的是(　　) A.Cas9蛋白由相应基因指导在核糖体中合成 B.向导RNA中的双链区遵循碱基配对原则 C.向导RNA可在逆转录酶催化下合成 D.若α链剪切点附近序列为……TCCACAATC……则相应的识别序列为……UCCACAAUC…… 2.(2024·九省联考广西卷，21)PCR可用于扩增并检测DNA，但存在交叉污染或偏差等问题，而新研发的基于CRISPR/Cas12a系统的检测方法，可在低浓度样本中更灵敏、快速识别靶标DNA。该系统利用gRNA介导Cas12a蛋白能准确切割靶标DNA。同时切割荧光底物使其发出荧光，通过检测荧光强度确定靶标DNA含量，利用Cas12a检测靶标DNA的过程如图所示。回答： (1)根据图中信息可推测Cas12a作用于靶标DNA时，具有类似________酶和________酶的功能；gRNA识别靶标DNA，遵循的是__________原则。 (2)在构建表达Cas12a蛋白的载体时，通常是将Cas12a基因插入到LacZ基因内，使LacZ基因失活，从而失去催化无色底物显色的能力，AmpR为氨苄青霉素抗性基因。理论上通过含氨苄青霉素且不含无色底物的对应培养基培养，不能筛选到含有Cas12a基因表达载体的工程菌，判断的依据是_______________________________________________________________ _______________________________________________________________。 (3)荧光检测时，60分钟后三组荧光信号强度达到一致，原因是_______________________________________________________________。 (4)实验研究时，增加NTC组作对照的作用是_______________________________________________________________ _______________________________________________________________； g－3＋g－7组可更快检测出靶标DNA，原因是_____________________________ _______________________________________________________________。 热点2　融合基因与融合蛋白 【剖析真题】 (2023·江苏卷，22)为了将某纳米抗体和绿色荧光蛋白基因融合表达，运用重组酶技术构建质粒，如图1所示。请回答下列问题： (1)分别进行PCR扩增片段F1与片段F2时，配制的两个反应体系中不同的有________，扩增程序中最主要的不同是________。 (2)有关基因序列如图2。引物F2－F、F1－R应在下列选项中选用________。 EGFP基因序列：5′ATGGTGAGCAAGGGC－GACGAGCTGTACAAG3′ AnB1基因序列：5′CATGTCCAGCTGCAG－CCAAAACCACAACCA3′ 图2 A.ATGGTG——CAACCA B.TGGTTG——CACCAT C.GACGAG——CTGCAG D.CTGCAG——CTCGTC (3)将PCR产物片段与线性质粒载体混合后，在重组酶作用下可形成环化质粒，直接用于转化细菌。这一过程与传统重组质粒构建过程相比，无需使用的酶主要有_______________________________________________________________。 (4)转化后的大肠杆菌需采用含有抗生素的培养基筛选，下列叙述错误的有________。 A.稀释涂布平板需控制每个平板30～300个菌落 B.抗性平板上未长出菌落的原因一般是培养基温度太高 C.抗性平板上常常会出现大量杂菌形成的菌落 D.抗性平板上长出的单菌落无需进一步划线纯化 (5) 为了验证平板上菌落中的质粒是否符合设计，用不同菌落的质粒为模板，用引物F1－F和F2－R进行了PCR扩增，质粒P1～P4的扩增产物电泳结果如图3。根据图中结果判断，可以舍弃的质粒有________。 (6)对于PCR产物电泳结果符合预期的质粒，通常需进一步通过基因测序确认，原因是_______________________________________________________________ _______________________________________________________________。 【梳理知识】 1.融合基因与融合蛋白 (1)融合基因：是指将两个或多个基因的编码区首尾相连，置于同一套启动子和终止子内部构成的嵌合基因。 启动子 基因1 基因2 基因3 终止子 (2)融合蛋白：是指融合基因的表达产物。 (3)启动子及其类型 启动子是一段具有特殊序列结构的DNA片段，是RNA聚合酶识别和结合的部位，驱动基因转录出mRNA。主要包括以下三种类型： ①组成型启动子：能够调控基因表达，使其基本恒定在一定程度上，从而使基因在不同部位或组织中的表达水平不存在明显差异。这类启动子一般来自管家基因，可连续不断地启动基因的表达。 ②组织特异性启动子：其调控作用使得基因往往只在某些特定器官或组织中表达，且表现出发育调节的特性。如构建乳腺生物反应器时所用的在乳腺中特异表达的基因的启动子。 ③诱导型启动子：即在某些特定的物理或化学信号刺激后，使目的基因的转录水平有所提高。 2.获得融合基因的方法一——以重叠延伸PCR技术为例 以融合基因M和基因N为例，步骤是： (1)设计4种引物：引物1和引物4为普通引物。引物2的3′端含有基因M的序列，5′端含有基因N的序列；引物3的3′端含有基因N的序列，5′端含有基因M的序列；引物2和引物3完全互补配对。 (2)PCR扩增：利用引物1和引物2扩增基因M，2轮循环可得到M′型DNA分子；利用引物3和引物4扩增基因N，2轮循环可得到N′型DNA分子。 (3)获得融合基因M＋N：将M′型DNA分子和N′型DNA分子放在同一个PCR管里，变性、复性、延伸后，就得到了拼接好的融合基因M＋N。 3.获得融合基因的方法二——无缝克隆技术 In－Fusion技术，即无缝克隆和组装技术，是一种新型的、快速、简洁的克隆方法，可以在质粒的任何位点进行一个或多个目标DNA片段的插入。 具体原理是：在载体末端和目的基因两端应具有15～25个同源碱基，而目的基因两端的同源序列往往是通过引物设计实现的，In－Fusion酶能够识别具有相同末端序列的线性DNA分子并使其形成黏性末端，DNA连接酶再将两条DNA单链黏合起来。 命题要点： (1)质粒构建过程：①采用酶切或者PCR扩增方法将载体线性化；②使用设计好的引物进行目的DNA片段的PCR扩增；③反应体系内形成重组质粒。 (2)与传统酶切、酶连相比的优势：①位点选择灵活，在载体任意位置进行基因克隆；②快速简便；③克隆效率高，阳性克隆高达90%以上；④可同时克隆两个或多个DNA片段。 【巩固训练】 1.(2023·浙江6月选考，19)某研究小组利用转基因技术，将绿色荧光蛋白基因(GFP)整合到野生型小鼠Gata3基因一端，如图甲所示。实验得到能正常表达两种蛋白质的杂合子雌雄小鼠各1只，交配以期获得Gata3－GFP基因纯合子小鼠。为了鉴定交配获得的4只新生小鼠的基因型，设计了引物1和引物2用于PCR扩增，PCR产物电泳结果如图乙所示。 下列叙述正确的是(　　) A.Gata3基因的启动子无法控制GFP基因的表达 B.翻译时先合成Gata3蛋白，再合成GFP蛋白 C.2号条带的小鼠是野生型，4号条带的小鼠是Gata3－GFP基因纯合子 D.若用引物1和引物3进行PCR，能更好地区分杂合子和纯合子 2.(2023·天津卷，17)构建可利用纤维素产乙醇的转基因酿酒酵母菌株是解决能源危机的手段之一，为此设计表达载体，思路如下。 (1)外源基因的选择　纤维素常见生物降解途径如下。 纤维素Ⅰ寡糖纤维二糖葡萄糖 酿酒酵母通常无法吸收纤维素、寡糖和纤维二糖，应向酿酒酵母转入上图中三种酶的基因，并使其表达产物在细胞________(填“内”或“外”)发挥作用。 (2)外源基因的插入方法　同源重组是碱基序列基本相同的DNA区段通过配对、链断裂和再连接而产生片段交换的过程。通过同源重组将外源基因插入染色体的特定位点可获得遗传稳定的工程菌株，如甲图所示。 酿酒酵母基因组有多个AB短序列。为通过同源重组将外源基因插入AB之间，在设计表达载体时，可采用PCR技术在外源基因两端分别引入A和B，获得乙图所示长片段。PCR时应选用的一对引物为________(从P1～P6中选)。 (3)标记基因的选择　URA3是尿嘧啶合成关键酶基因，常被用作标记基因。另外，URA3编码的蛋白可将外源5－氟乳清酸转化为有毒物质，导致细胞死亡。 ①为得到成功插入酶Ⅰ基因的菌株1，需将酶Ⅰ基因同URA3一起插入URA3缺陷型酿酒酵母基因组AB之间，并利用________的培养基筛选存活菌株。 ②在后续插入酶Ⅱ基因时，为继续利用URA3作为筛选标记，需切除菌株1的URA3。为此设计表达载体时，还应向URA3两端引入酿酒酵母基因组中不存在的同源区段C和C′，并以下图方式________排列才能通过同源重组达到上述目的。 此后，需要将菌株1在________的培养基上培养，存活菌株即为URA3被成功切除的菌株1′。 (4)表达载体的构建　综上，将三种酶基因依次插入酿酒酵母基因组中，在构建表达载体时，A、B、C、C′、URA3和酶基因应采用下图________的排布方式。 热点3　单酶切导致的正、反接的电泳检测和PCR检测 【剖析真题】 (2024·江西卷，12)γ－氨基丁酸在医药等领域有重要的应用价值。利用L－谷氨酸脱羧酶(GadB)催化L－谷氨酸脱羧是高效生产γ－氨基丁酸的重要途径之一。研究人员采用如下图方法将酿酒酵母S的L－谷氨酸脱羧酶基因(gadB)导入生产菌株E.coliA，构建了以L－谷氨酸钠为底物高效生产γ－氨基丁酸的菌株E.coliB。下列叙述正确的是(　　) A.图中表明，可以从酿酒酵母S中分离得到目的基因gadB B.E.coliB发酵生产γ－氨基丁酸时，L－谷氨酸钠的作用是供能 C.E.coliA和E.coliB都能高效降解γ－氨基丁酸 D.可以用其他酶替代NcoⅠ和KpnⅠ构建重组质粒 【梳理知识】 1.利用单酶切法和双酶切法构建基因表达载体 2.单酶切法中正向连接与反向连接的检测 (1)利用PCR进行检测 方法：用特定的引物对正向连接和反向连接的重组质粒进行PCR扩增，二者得到的扩增产物长度不同。如图3中，选用引物a、b可扩增出1 100 bp长度的产物，用引物a、c无法扩增出产物，则为正向连接；如图4，选用引物a、b无法扩增出产物，用引物a、c可扩增出1 000 bp长度的产物，则为反向连接。 (2)利用电泳进行检测 方法：用特定的限制酶对正向连接和反向连接的重组质粒进行切割，对产物进行电泳，二者得到的条带存在差异。如图中，用BglⅡ和Hind Ⅰ进行双酶切，电泳后若出现1 100 bp条带，则为正向连接；电泳后若出现1 000 bp条带，则为反向连接。 【巩固训练】 (2023·山东卷，25)科研人员构建了可表达J－V5融合蛋白的重组质粒并进行了检测，该质粒的部分结构如图甲所示，其中V5编码序列表达标签短肽V5。 (1)与图甲中启动子结合的酶是________。除图甲中标出的结构外，作为载体，质粒还需具备的结构有_________________________________(答出2个结构即可)。 (2)构建重组质粒后，为了确定J基因连接到质粒中且插入方向正确，需进行PCR检测，若仅用一对引物，应选择图甲中的引物________。已知J基因转录的模板链位于b链，由此可知引物F1与图甲中J基因的________(填“a链”或“b链”)相应部分的序列相同。 (3)重组质粒在受体细胞内正确表达后，用抗J蛋白抗体和抗V5抗体分别检测相应蛋白是否表达以及表达水平，结果如图乙所示。其中，出现条带1证明细胞内表达了________，条带2所检出的蛋白________(填“是”或“不是”)由重组质粒上的J基因表达的。 参考答案 热点1 【剖析真题】 (1)DNA连接酶　(2)Ca2＋处理法　(3)碱基互补配对原则　目标DNA特定的核苷酸　(4)DNA分子杂交技术　不出现杂交带　(5)CRISPR/Cas9重组质粒在受体细胞内进行转录和表达，转录的产物是sgRNA，表达的产物是Cas9蛋白，二者形成复合体，该复合体中的sgRNA可识别并与目标DNA序列特异性结合，在特定位点上切割基因组DNA，然后将该蛋白酶基因插入到基因组DNA中 解析　(1)基因工程所需的工具酶有限制酶和DNA连接酶，限制酶负责切割，DNA连接酶负责连接，因此，为构建CRISPR/Cas9重组质粒，需对含有特定sgRNA编码序列的DNA进行酶切处理，然后将其插入到经相同酶切处理过的质粒上，插入时所需要的酶是DNA连接酶。(2)大肠杆菌是原核生物，属于微生物，将目的基因导入微生物细胞的方法是Ca2＋处理法。(3)根据题图可知，在CRISPR/Cas9基因编辑技术中，sgRNA是根据靶基因设计的向导RNA，准确引导Cas9切割与sgRNA配对的靶基因DNA序列。Cas9能借助sgRNA分子与目标DNA进行特异性结合的原因在于sgRNA分子上的碱基序列与目标DNA分子上的碱基序列可以通过碱基互补配对原则实现sgRNA与目标DNA特定序列的特定识别，进而定位；由此可见，Cas9在功能上属于限制酶，可切割目标DNA特定的核苷酸序列。(4)可利用DNA分子杂交技术判断基因敲除是否成功，若未出现杂交带，则说明基因敲除成功。(5)根据图示可知，CRISPR/Cas9重组质粒在受体细胞内进行转录和表达，转录的产物是sgRNA，表达的产物是Cas9蛋白，二者形成复合体，该复合体中的sgRNA可识别并与目标DNA序列特异性结合，在特定位点上切割基因组DNA，然后将该蛋白酶基因插入到基因组DNA中。 【巩固训练】 1.C　[蛋白质由相应基因指导在核糖体中合成，A正确；向导RNA中双链间遵循碱基互补配对原则，B正确；向导RNA可通过转录形成，以RNA为模板合成DNA的过程中需要用到逆转录酶，C错误；由于α链与识别序列的互补序列互补，故两链碱基相同，只是其中T替换为U，D正确。] 2.(1)限制　解旋　碱基互补配对　(2)使用的培养基中不含无色底物，所以在含氨苄青霉素且不含无色底物的对应培养基上长出的菌落，无论Cas12a基因是否成功导入都不会出现显色反应　(3)Cas12a蛋白切割荧光底物使其发出荧光的物质含量相同 (4)排除其他物质介导Cas12a蛋白切割荧光底物使其发出荧光　g－3和g－7在介导Cas12a蛋白切割荧光底物使其发出荧光方面具有协同作用 解析　(1)根据图中信息可推测Cas12a作用于靶标DNA时，可以切割靶标DNA，并能解开靶标DNA，使其与g－3和g－7结合，所以Cas12a具有类似限制酶和解旋酶的功能；gRNA识别靶标DNA，遵循的是碱基互补配对原则。(2)在构建表达Cas12a蛋白的载体时，通常是将Cas12a基因插入LacZ基因内，使LacZ基因失活，从而失去催化无色底物显色的能力，而使用的培养基中不含无色底物，所以在含氨苄青霉素且不含无色底物的对应培养基上长出的菌落，无论Cas12a基因是否成功导入都不会出现显色反应。(3)荧光检测时，60分钟后三组荧光信号强度达到一致，原因是Cas12a蛋白切割荧光底物使其发出荧光的物质含量相同。(4)实验研究时，增加NTC组作对照的作用是排除其他物质介导Cas12a蛋白切割荧光底物使其发出荧光；g－3＋g－7组可更快检测出靶标DNA，原因是g－3和g－7在介导Cas12a蛋白切割荧光底物使其发出荧光方面具有协同作用。 热点2 【剖析真题】 (1)模板、引物　复性温度　(2)CD　(3)限制性内切核酸酶(限制酶)和DNA连接酶　(4)ABC　(5)P3、P4　(6)电泳只能显示扩增片段的大致长度，不能显示精准的DNA碱基数量，也不能呈现DNA碱基序列 解析　(1)PCR反应进行的条件：引物、酶、4种脱氧核苷酸、模板和缓冲液(其中需要Mg2＋)。分别进行PCR扩增片段F1与片段F2时，配制的两个反应体系中不同的有模板(片段F1、片段F2)、引物。扩增程序中恰当地选择复性温度，尽量避免引物与模板的非特异性结合，以保证目的产物的有效扩增。(2)由图1可知，F2－F与F1－R互补，因此选项中A、B一组，C、D一组，再由图1可知，F2－F与F1片段(EGFP基因序列3′端)部分相同，与F2片段(AnB1基因序列5′端)部分互补，即C项“GACGAG”与EGFP基因的“5′GACGAG3′”同，“5′CTGCAG3′”与AnB1基因序列的“5′CTGCAG3′”互补，F1－R与F2片段(AnB1基因序列5′端)部分相同，与F1片段(EGFP基因序列3′端)部分互补，即D项符合。(3)传统重组质粒构建需要使用限制性内切核酸酶(限制酶)切割质粒使其具有与目的基因相同的黏性末端，之后再用DNA连接酶将目的基因和质粒连接成重组质粒。题干将PCR产物片段与线性质粒载体混合后，在重组酶的作用下可形成环化质粒，不需要使用限制性内切核酸酶(限制酶)和DNA连接酶。(4)用稀释涂布平板法培养计数时，为了使结果更准确，应选择有30～300个菌落数的平板，但筛选时不需控制数目，A错误；培养基温度太高将接种的菌落杀死，会导致抗性平板上未长出菌落，属于操作失误，不是一般原因，B错误；转化后的大肠杆菌需采用含有抗生素的培养基筛选，一般含有重组质粒的大肠杆菌才能发展为菌落，故不会出现大量杂菌形成的菌落，C错误；稀释涂布平板法和平板划线法均为分离纯化细菌的方法，用稀释涂布平板法在抗性平板上长出的单菌落无需进一步划线纯化，D正确。(5)EGFP为720 bp，AnB1为390 bp，二者的总大小为720 bp＋390 bp＝1 110(bp)，用引物F1－F和F2－R进行了PCR扩增，其大小接近于P1、P2，根据图3结果判断，可以舍弃的质粒有P3、P4。(6)电泳只能显示扩增片段的大致长度，不能显示精准的DNA碱基数量，也不能呈现DNA碱基序列，因此对于PCR产物电泳结果符合预期的质粒，通常需进一步通过基因测序确认。 【巩固训练】 1.B　[由图甲可知，Gata3基因与GFP基因共用一个启动子，且由题干可知，两基因能正常表达出相关蛋白质，A错误；由于启动子在左侧，基因在右侧，转录基因时，先转录Gata3基因，再转录GFP基因，由于转录和翻译的方向均是沿mRNA的5′端→3′端，因此翻译时先合成Gata3蛋白，再合成GFP蛋白，B正确；由图乙可知，大片段包含GFP基因编码区片段，小片段不包含GFP基因编码区片段，则2号小鼠是Gata3－GFP基因纯合子，4号小鼠是野生型，C错误；若用引物1和引物3进行PCR，杂合子和Gata3－GFP基因纯合子均能扩增出条带，仅有Gata3基因时无法扩增出条带，因此不利于区分杂合子和纯合子，D错误。] 2.(1)外　(2)P1和P6　(3)①不含尿嘧啶　②2　含有5－氟乳清酸和尿嘧啶　(4)4 解析　(1)据题意，酿酒酵母需利用纤维素作为生产乙醇的原料，但酿酒酵母菌株无法直接吸收利用纤维素等糖类，所以酶Ⅰ、酶Ⅱ和酶Ⅲ应为胞外酶，在细胞外催化纤维素分解为葡萄糖后，再被酿酒酵母吸收利用，故应在细胞外发挥作用。(2)同源重组需要在外源基因两端分别引入A和B，可通过PCR方法实现三个片段的连接。引物对P3/P4只能扩增外源基因，引物对中含P2或P5则不能有效扩增。而引物P1(P6)同时包含A(B)和外源基因部分序列，可达到设计要求。故选用的一对引物为P1和P6。(3)①URA3是尿嘧啶合成关键酶基因，可作为标记基因，所以在筛选被转化的受体细胞时，需在培养基中去除尿嘧啶，无URA3(连同目的基因)的酵母细胞将无法存活，因此可筛选出含有目的基因及URA3的受体细胞。②如题图所示，方式1中URA3两侧C、C′是反向同源序列，方式2中URA3两侧C、C′是同向同源序列。在发生同源重组时，方式1只是导致URA3序列倒位，但不会切除URA3；而方式2将导致URA3以环状小分子形式被切除，并在细胞分裂过程中因不能复制而丢失。故选方式2。此后，菌株1′因不含URA3，可在含有5－氟乳清酸和尿嘧啶的培养基上存活，而没有成功切除URA3的菌株，会将5－氟乳清酸转化为有毒物质，导致细胞死亡。(4)在明确了表达载体整体构建思路后，最终的表达载体需要同时满足两个条件：一是需要将URA3标记基因与目的基因(酶基因)一起插入酿酒酵母基因组AB之间，所以A、B应置于标记基因与目的基因最外侧；二是需要利用C、C′片段切除URA3标记基因，同时不能影响酶基因，所以C、C′应紧邻URA3两侧。同时满足上述条件的只有图4。 热点3 【剖析真题】 D　[由题图可知，不能直接从酵母菌S中分离得到目的基因gadB，只能分离得到含有目的基因gadB序列的染色体DNA，若要获得目的基因，需进行PCR，A错误；由题意知，L－谷氨酸钠是生产γ－氨基丁酸的底物，不能用来供能，B错误；将目的基因(gadB)导入菌株E.coliA构建高效生产γ－氨基丁酸的菌株E.coliB，E.coliA和E.coliB均不能高效降解γ－氨基丁酸，C错误；图中质粒显示含多克隆位点，表明质粒上含有多种限制酶识别序列，除此之外，也可用同尾酶替代，D正确。] 【巩固训练】 (1)RNA聚合酶　复制原点、标记基因、限制酶切割位点　(2)F1和R2或者F2和R1　a链　(3)J－V5融合蛋白　不是 解析　(1)与图甲中启动子结合的酶是RNA聚合酶。图甲中有启动子和终止子等，作为载体，质粒还需具备的结构有限制酶切割位点、标记基因、复制原点等。(2)据图甲可知，引物F2与R1或F1与R2结合部位包含J基因的碱基序列，因此推测为了确定J基因连接到质粒中且插入方向正确，进行PCR检测时，若仅用一对引物，应选择图甲中的引物F2和R1或F1和R2。b是模板链，而根据图中启动子和终止子的位置可知，转录方向是图中从左向右，对应的模板链方向应该是3′→5′，非模板链(也就是a链)是5′→3′；考虑到DNA复制的方向是子链的5′→3′，引物基础上延伸的方向肯定是5′→3′，所以引物结合的单链其方向是3′→5′；图中F1是前引物，在左侧，所以其配对的单链是3′→5′的b链，故其序列应该与a链相应部分的序列相同。(3)据图乙可知，只有抗V5抗体时，出现条带1，抗V5抗体能与V5编码序列表达标签短肽V5特异性结合，只有抗J蛋白抗体时，出现条带1和条带2，且条带1较宽，说明该物质能与抗J蛋白抗体特异性结合，因此出现条带1证明细胞内表达了J－V5融合蛋白，而条带2可能是杂质。 学科网（北京）股份有限公司 $$