专题15 基因工程-【好题汇编】2025年高考生物三模试题分类汇编（新高考通用）

专题15 基因工程 考点概览 考点01 重组DNA技术的基本工具 考点02 基因工程的基本操作程序和应用 考点03 蛋白质工程 重组DNA技术的基本工具考点01 一、单选题 1．（2025·山西·三模）某研学小组实验时出现了异常现象，他们对实验进行了改进。下列改进措施错误的是（　　） 异常现象 改进措施 ① 用质量浓度为0.5g/mL的蔗糖溶液观察不到洋葱质壁分离复原现象 将质量浓度为0.5g/mL的蔗糖溶液更换成质量浓度为0.3g/mL的蔗糖溶液 ② 用95%的酒精、二氧化硅和碳酸钙提取新鲜菠菜绿叶中的色素时提取液颜色偏浅 在95%的酒精中加适量无水碳酸钠 ③ 用2mol/L的NaCl溶液提取新鲜洋葱DNA并用二苯胺试剂检测时蓝色偏淡 将2mol/LNaCl溶液更换成1mol/L ④ 用光学显微镜观察蝗虫卵巢看不到减数分裂各时期细胞 换用蝗虫精巢为实验材料重复实验 A．① B．② C．③ D．④ 2．（2025·山东泰安·三模）关于“DNA的粗提取与鉴定”、“DNA片段的扩增及电泳鉴定”实验，下列说法正确的是（    ） A．将过滤的洋葱研磨液低温放置几分钟，取沉淀物备用 B．在白色丝状物中加入二苯胺试剂即可出现蓝色 C．根据待分离DNA片段的大小，用扩增缓冲液配制成琼脂糖溶液 D．加样孔要留出一个孔加入指示分子大小的标准参照物 3．（2025·甘肃白银·三模）下列有关“DNA粗提取与鉴定”“DNA片段的扩增及电泳鉴定”实验的叙述，错误的是（    ） A．将洋葱研磨液离心后保留上清液并加入冷酒精静置后，可收集到DNA B．电泳鉴定DNA利用了DNA在电场中会向着与它所带电荷相反的电极移动的原理 C．电泳鉴定DNA时，将电泳缓冲液加入电泳槽中，电泳缓冲液不能没过凝胶 D．待指示剂前沿迁移接近凝胶边缘时需停止电泳，并取出凝胶置于紫外灯下观察和照相 4．（2025·山西晋城·三模）几种限制酶的识别序列和切割位点如表所示。下列相关叙述正确的是（　　） 限制酶 识别序列和切割位点 BamHI 5'-G↓GATCC-3' Sau3AI 5'-↓GATC-3' Acc65I 5'-G↓GTACC-3′ A．3种限制酶切割形成的末端中，既有黏性末端又有平末端 B．经Acc65I酶切后得到的黏性末端序列为5'-GTAC-3′ C．能用Sau3AI酶切的DNA序列亦可被BamHI酶切 D．目的基因和质粒分别用BamHI和Sau3AI酶切后，用DNA连接酶连接形成的重组质粒可被BamHI酶切 5．（2025·辽宁·三模）限制酶来源于细菌的“限制-修饰”系统（R-M系统）。典型的R-M系统由限制酶和甲基化酶构成，通常成对出现，一般具有相同的DNA识别位点。如图为细菌利用“限制-修饰”系统抵御噬菌体入侵的示意图，下列相关叙述错误的是（　　）    注：REase表示限制酶，MTase代表甲基化酶。 A．REase能识别双链DNA上的特定碱基序列并切割特定部位的磷酸二酯键 B．DNA分子经限制酶切割产生的片段末端通常有两种形式 C．MTase作用时可阻止噬菌体的限制酶破坏细菌的DNA分子 D．R-M系统中限制酶和甲基化酶成对出现是细菌在进化中形成的防御机制 6．（2025·福建泉州·三模）基因工程的诞生和发展，离不开科学发现和技术发展的支持。下列有关叙述错误的是（　　） A．质粒的发现为基因工程提供了基因转移的“分子运输车” B．DNA合成仪的问世为目的基因的检测与鉴定提供了方便 C．PCR为获取目的基因提供了有效手段 D．基因组编辑技术的发明为目的基因的定向变异提供新途径 二、解答题 7．（2025·广东惠州·三模）桃源黑猪是我国地方猪种的典型代表，具有瘦肉率低的缺陷。MSNT（肌肉生长抑制素）是控制动物“双肌性状”的基因，其功能为可抑制动物骨骼肌增生，增加脂肪沉积。研究人员利用sgMSNT/Cas9复合物敲除MSNT基因获得了桃源黑猪新品种。图1中的sgMSNT/Cas9复合物中，sgMSNT是能准确识别MSNT基因序列的RNA，并引导Cas9蛋白对DNA进行切割。图2为利用该技术成功敲除MSNT基因后，通过胚胎工程获得桃源黑猪新品种的操作步骤。回答下列问题： (1)Cas9蛋白相当于 酶，可催化 键断裂，若图1中复合物所识别的DNA序列为5′-CCATC-3′，则sgMSNT的序列为 。 (2)图1所示技术可弥补桃源黑猪瘦肉率低的缺陷的原因是 。 (3)图2中形成重构胚后可通过 法（写1种）激活，为获得更多胚胎，可在胚胎发育到 期时进行 。 8．（2025·浙江·三模）生物某种性状缺失的原因有多种，如基因突变、染色体畸变、DNA甲基化等。为确定某易感锈病小麦的易感性状是否为基因突变导致的，对该易感锈病小麦的DNA进行了相关检测。回答下列问题： (1)DNA鉴定时，先利用 技术扩增DNA，再经 后电泳分离，根据电泳条带情况判断是否为基因突变引发。更精确的方法是对易感锈病小麦进行DNA ，并将结果与基因数据库中小麦基因组序列进行 ，判断是否发生突变以及突变的 。 (2)提取DNA时，需对样本进行冷冻研磨。研磨前进行冷冻的目的是 ，研磨时加入的研磨液中含有十二烷基硫酸钠（SDS）和乙二胺四乙酸二钠（EDTA），其中EDTA的作用是 。 (3)PCR时，向离心管中加入PCR扩增缓冲液、模板DNA、F1-R1、F2-R2和F3-R3三对引物、无菌水，还有 ，离心后进行PCR，PCR条件程序为预变性10min→循环（变性1min→退火1min→延伸1min）35轮→延伸10min，其中预变性10min的目的主要是 。 (4)电泳时，将样品加到靠近电源 的加样孔内，电泳缓冲液中含有少许溴酚蓝，溴酚蓝在琼脂糖凝胶中的迁移速率比DNA ，因此可根据溴酚蓝的所在位置确定 时间。凝胶中含有荧光染料，便于在 光下观察DNA条带位置。 基因工程的基本操作程序和应用考点02 一、单选题 1．（2025·贵州遵义·三模）骨质疏松症是一种以骨量减少、骨组织变薄为特征的系统性骨病。研究者将人BMP-2基因、CXCR4基因与双歧杆菌ClyA基因拼接后，导入双歧杆菌，用于治疗模型鼠骨质疏松症。其过程及作用机制如图所示。下列相关叙述错误的是（　　）    注：ClyA为双歧杆菌的一种细胞膜蛋白；BMP-2为骨形态发生蛋白2；CXCR4可以将基质细胞迁移到骨质疏松处 A．重组质粒上应含有双歧杆菌ClyA基因的特异性启动子 B．BMP-2基因和CXCR4基因需要拼接到ClyA基因下游 C．培养重组双歧杆菌的培养基中应加入抗生素防止杂菌污染 D．胞外囊泡可能诱导基质细胞迁移到骨质疏松处并分化为成骨细胞 2．（2025·江苏·三模）琼脂糖凝胶电泳通常用于PCR产物的鉴定，相关叙述正确的是（    ） A．DNA分子所带电荷越多，在凝胶中的迁移速率越快 B．用微量移液器将PCR产物与核酸染料的混合物缓慢注入凝胶的加样孔内 C．电场强度增大，DNA在凝胶中的迁移速率加快，电泳时的电压一般为1~5V D．PCR非特异性扩增产物电泳、样品上样量过多电泳均会导致电泳条带模糊 3．（2025·湖北·三模）科学家将金鱼草的橙色花青素合成基因导入水稻，培育出“黄金大米”。为确保其安全性，需特别检测（    ） A．花青素合成基因是否整合到水稻基因组 B．转基因大米中维生素A前体含量是否稳定 C．花青素合成酶是否会引起人体过敏反应 D．转基因水稻花粉是否会导致邻近杂草变异 4．（2025·江西景德镇·三模）转基因抗草甘膦作物，如转基因的匍匐剪股颖（存在抗草甘膦的EPSPS基因）的大面积种植可以给我们带来巨大的经济效益，伴随而来的生态风险也引起了人们广泛关注。研究人员将一高尔夫球场作为控制区，种入转基因甘膦匍匐剪股颖，在控制区外不同位点（如图所示）种植了若干株非转基因的匍匐剪股颖和亲缘物种作为哨兵植物。为确定转基因作物向其同种或亲缘物种转移EPSPS基因的情况，一段时间后需将用于监测的哨兵植物的种子收集并培育成幼苗。下列叙述错误的是（    ） A．检测EPSPS基因流入幼苗的方法为提取幼苗叶片中的DNA为模板，利用针对EPSPS基因设计的特定引物进行PCR并电泳 B．推测哨兵植物主要放置在顺风向的原因是花粉可以随风传播到较远的距离，从而造成基因流动 C．可以通过设置隔离带来防止转基因花粉传播到其他植物 D．可将圆锥花序直接浸没在含农杆菌的溶液中一段时间，然后培养植株即可获得转基因匍匐剪股颖 5．（2025·福建三明·三模）关于DNA片段的扩增及电泳鉴定实验，下列叙述正确的是（    ） A．PCR扩增缓冲液中，一般要添加Ca2+以激活TaqDNA聚合酶 B．电泳缓冲液中加入琼脂糖及核酸染料后，沸水浴至琼脂糖融化 C．将电泳缓冲液加入电泳槽后，再将凝固的凝胶放入电泳槽内 D．将含指示剂的凝胶载样缓冲液与PCR产物混合液缓慢注入加样孔内 6．（2025·贵州遵义·三模）为确定某目的基因是否导入大肠杆菌，可利用PCR扩增受体菌的DNA，并通过琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物。下列相关叙述错误的是（　　） A．筛选导入目的基因的大肠杆菌需要选择培养基 B．大肠杆菌培养和PCR扩增均需要进行无菌操作 C．PCR所需引物应分别与目的基因模板链的5'端互补 D．通过凝胶电泳条带可初步判断PCR扩增是否成功 7．（2025·甘肃白银·三模）从苏云金杆菌中提取出来的抗虫蛋白基因是基因工程中常用的抗虫基因。利用引物对某转基因抗虫植物中的抗虫蛋白基因进行PCR扩增，并进行琼脂糖凝胶电泳，发现电泳槽中出现了非特异性扩增条带。其原因不可能是（　　） A．未加入模板 B．引物特异性差 C．DNA聚合酶质量不好 D．PCR循环次数过多 8．（2025·河南开封·三模）某科研团队拟利用CRISPR/Cas9技术对病毒复制酶基因进行定向编辑并导入怀地黄细胞中，结合植物组织培养技术，培育出脱毒且抗病毒的怀地黄新品种。下列叙述正确的是（    ） A．用茎尖进行植物组织培养获得脱毒苗是因为病毒无法进入茎尖细胞 B．CRISPR/Cas9基因编辑技术可以使病毒复制酶基因发生随机突变 C．进行植物组织培养时需要在培养基中添加干扰素以防止细菌的污染 D．需要对培育出的再生植株进行病毒接种实验以验证其抗病毒能力 9．（2025·陕西安康·三模）PCR技术可实现基因的定点突变。研究人员设计了与蛋白A基因结合的两对引物（引物B和C中都替换了一个碱基）如图1所示。研究人员按照如图2所示的方式进行4次PCR扩增，以获得定点突变的新的蛋白A基因。下列相关叙述错误的是（    ）    A．PCR1体系和PCR2体系必须分开进行 B．PCR3体系中应该加入引物B和C C．PCR4体系中应该加入引物A和D D．DNA聚合酶能够从引物的3'端开始连接脱氧核苷酸 10．（2025·江西·三模）细胞核定位信号（NLS）能够促进蛋白转移到细胞核中，科学家将 NLS 序列与绿色荧光蛋白（GFP）基因融合插入到载体pRI101中,获得pRI101-NLS-GFP 表达载体,利用农杆菌转化法在烟草中表达。载体pRI101-NLS-GFP的构建图谱见下图，下列有关描述正确的是（    ） A．对融合基因PCR 时需在引物的3'端分别添加限制酶 Nde I和 Sma I的识别序列 B．推测农杆菌细胞的解旋酶基因前端含有 NLS 核定位信号 C．融合基因插入到T-DNA 中确保其能整合到烟草的质 DNA 中 D．含该重组质粒的农杆菌侵染烟草，一段时间后观察发现荧光仅存在细胞核 11．（2025·陕西宝鸡·三模）新冠疫情防控的一个重要技术手段是荧光定量PCR。该技术原理如图，在PCR反应体系中加入引物的同时，加入与某条模板链互补的TaqMan荧光探针，当耐高温的DNA聚合酶催化子链延伸至探针处时会水解探针，使荧光基团R分离下来，发出荧光。通过反应体系的荧光达到指定强度时的扩增轮数，即CT值，来判断待测样品中目标核酸的含量。下列叙述不正确的是（　　） A．新冠病毒采集的样品需先进行逆转录再进行荧光定量PCR B．CT值越高，采集样品中的新冠病毒含量也越高 C．TaqMan探针的设计应主要依据新冠病毒RNA内部的一段序列 D．如果没有检测到荧光信号，初步推测样本中不含有新冠病毒 12．（2025·河北秦皇岛·三模）科学家利用PCR技术扩增人乳头瘤病毒HPV—16L1基因，构建了含HPV—16L1基因的表达载体pBI——L1，经根瘤农杆菌介导转化，获得了转基因烟草植株。该技术利用转基因烟草作为生物反应器，生产出了纯度较高的HPV——16Ll蛋白。下列叙述正确的是（    ） A．构建表达载体pBI——L1时可使用两种不同限制酶以确保正确连接 B．可以用DNA分子杂交法检测再生植株是否表达出HPV-16L1蛋白 C．利用PCR扩增HPV—16L1基因的不需要已知该基因的一段碱基序列 D．必须选用烟草的受精卵作为受体细胞才能保证每个细胞中含有目的基因 13．（2025·四川达州·三模）将抗除草剂基因转入油菜中，得到转基因油菜，在转基因油菜种植多年后，调查发现在公路边的野生油菜有70%含有抗除草剂基因。下列叙述错误的是（    ） A．野生油菜体内的抗除草剂基因主要源自转基因油菜的花粉 B．70%的野生油菜体内出现抗除草剂基因可能是基因重组的结果 C．将抗除草剂基因转入油菜细胞后即可培育出新物种 D．大量使用单一除草剂会导致环境污染，降低生物多样性 二、多选题 14．（2025·江苏常州·三模）如图表示花粉管通道法介导植物基因转移。下列说法正确的是（　　） A．花粉管通道法可适用获得转基因抗虫棉花 B．相比于农杆菌转化法，花粉管通道法避免了植物组织培养这一操作 C．必须在雌蕊成熟时才能进行图中所示的处理方法 D．外源DNA不需要构建基因表达载体，就能借助花粉管通道进入受体细胞并表达 15．（2025·江西景德镇·三模）CRISPR/Cas9基因编辑技术根据靶基因序列设计向导sgRNA，精确引导核酸酶Cas9切割与sgRNA配对的DNA，相关酶在修复断裂DNA的过程中会改变连接部位的碱基序列。科研人员通过删除编码PD-1蛋白基因的2、3、4片段造成蛋白质的功能缺失，制作PD-1基因敲除鼠的流程如图1所示。已知P1和P2是PCR的引物，下列相关分析正确的是（    ） A．核酸酶Cas9敲除2、3、4片段作用在磷酸二酯键，引起的变异属于基因重组 B．如果想让某个基因失去功能，也可以利用基因编辑来破坏目的基因 C．欲将基因的2、3、4共3个片段切除，敲除前需要设计2个向导sgRNA D．sgRNA会因错误结合而出现“脱靶”现象，一般sgRNA序列越短，脱靶率越低 16．（2025·湖南郴州·三模）蛋白A是动物细胞分泌的一种优质蛋白，为使得大肠杆菌具备合成蛋白A的能力，研究人员进行了如图1所示的操作，图2表示3种限制酶的切割位点。下列叙述正确的是（　　） A．利用PCR技术扩增基因A应选择的一对引物是引物2和引物3 B．为使得扩增出的目的基因带有限制酶的切割序列，上游引物序列为5'……GGATCCATTACGGATCG……3' C．抗生素M应为氯霉素，在该平板上能生长的菌落就是含有重组质粒的大肠杆菌 D．从动物细胞提取DNA扩增获得的基因A正确导人大肠杆菌后能正常表达出蛋白质A 17．（2025·吉林·三模）春季是感冒多发季，很多人感染甲流或细菌性感冒，出现高烧、咳嗽、乏力、呕吐等症状，为确诊病原体是否为甲流病毒（遗传物质为单链RNA），通常采用PCR和琼脂糖凝胶电泳技术鉴定，以下分析正确的是（    ） A．呼吸道取样，提取RNA，先逆转录成cDNA，再进行PCR扩增 B．PCR扩增时，引物越短，特异性越强，鉴定时只出现特异性条带 C．电泳原理是利用DNA的带电粒子向与它所带电荷相反的电极移动 D．若确诊患者感染甲流病毒，可通过注射抗生素进行治疗 三、实验题 18．（2025·山西晋中·三模）聚乙烯（PE）塑料因结构稳定难以降解，易造成“白色污染”。某研究团队拟通过基因工程改造大肠杆菌，使其分泌PE降解酶，并通过发酵工程规模化生产该工程菌。请回答下列问题： (1)基因表达载体的构建过程中常采用两种不同的酶进行切割，使用双酶切的优点是 。 (2)尽管目的基因成功导入大肠杆菌，大肠杆菌也未必能成功产生PE降解酶，可能的原因有 （答出1点）。 (3)为检验工程菌对PE的降解效果，科研人员设计了对照实验，对照组为含PE薄膜的培养基+普通大肠杆菌，实验组的处理是 ，其他条件相同且适宜，培养一段时间后，可观察的指标包括 （答出2项）。 (4)若在实际应用中发现用发酵工程产生的发酵液处理PE，PE被降解的效率较低，则可能的原因是 （答出2点）。 (5)科学家在工程菌中引入“自杀基因”，使其在特定环境信号（如光照、特定化学物质缺乏）下启动自毁程序。科学家这样设计的意义是 。 19．（2025·四川乐山·三模）我国科学家将抗虫基因A、抗冻基因B导入番茄，获得了抗虫、耐寒的转基因番茄。所选用的抗虫基因A、抗冻基因B及质粒的限制酶切割位点如图所示。 (1)将抗虫基因A和质粒连接的过程需要用到的酶有 （填图中限制酶）和DNA连接酶。将抗虫基因A与质粒连接后，再将抗冻基因B连接到重组质粒上所用的限制酶是 。 (2)构建好的基因表达载体需要通过一定的方式才能进入受体细胞。我国科学家采用了他们独创的一种方法 ，将目的基因导入番茄细胞。除此之外，将目的基因导入植物细胞常用的方法还有农杆菌转化法。 (3)农杆菌细胞内含有Ti质粒，当它侵染植物细胞后，能将Ti质粒上的T-DNA转移到 ，并且将其整合到 上。 (4)抗虫基因A导入番茄细胞后，若要检测抗虫基因A是否插入番茄染色体中，需要从番茄细胞中提取 进行DNA分子杂交，DNA分子杂交时应使用的探针是 。 (5)若要通过实验检测抗虫基因A在番茄细胞中是否表达为抗虫蛋白，请简要写出实验思路 。 20．（2025·安徽·三模）流感病毒分为甲、乙、丙三型，根据H抗原和N抗原不同，甲型流感病毒又分为许多亚型，其中H3N2主要感染人类，H5亚型毒株不仅对禽类危害大，还能感染人类。某科研团队基于人一禽流感共预防的设想，尝试了共表达DNA疫苗—p—H5/H3质粒的策略。回答下列问题： (1)获取H3病毒和H5病毒的RNA，通过 过程得到它们的DNA，并进一步获取H3基因和H5基因。 (2)利用p质粒和H3基因、H5基因构建p—H5/H3的设计思路如下图；其中限制酶XhoI、NheI、ClaI识别序列和切割位点分别是：5′-C↓TCGAG-3'、5′-G↓CTAGC-3'、5′-AT↓CGAT—3'。 ①任选限制酶XhoI、NheI和ClaI中的一种，写出经其切割产生的DNA片段的末端 。 ②据图判断，过程Ⅱ中处理p—H5质粒的限制酶是 ；参照图中H3基因上限制酶切割位点的标识方法，标出H5基因上限制酶的切割位点 。 (3)结果检测：实验组小鼠分别注射p—H5/H3、p—H5、p—H3，对照组注射质粒p，在完成三次免疫的10天后从脾脏中分离淋巴细胞，分别加入H5或H3流感亚型病毒，进行特异性刺激，48h后进行淋巴细胞增殖检测；检测结果表明，p—H5/H3可以针对相关亚型流感病毒形成有效保护。 ①从脾脏中分离淋巴细胞，是因为 。 ②进行淋巴细胞增殖检测时，悬浮细胞用离心法收集，贴壁细胞的收集方法是 。 21．（2025·河南开封·三模）河南省伏牛山地区分布着多种耐旱植物，柽柳是其中重要的生态修复物种。研究发现，柽柳基因的表达产物可显著增强植物对干旱和高盐胁迫的耐受性。某科研团队利用下图所示质粒构建基因表达载体，然后通过农杆菌转化法将基因导入伏牛山濒危植物太行花中，以提高其抗逆性。回答下列问题。 (1)启动子①应与基因链的 (填“3'”或“5'”)端相连。 (2)为验证转化后的农杆菌是否携带重组质粒，该科研团队采用多重技术(一种在单次反应中通过多对引物同时扩增多个目标序列的技术)进行检测。具体方法为：将下表所示的3对引物加入同一体系中，对转化后的农杆菌进行扩增，扩增产物通过琼脂糖凝胶电泳进行分离检测。 引物 扩增片段 扩增基因 扩增基因 扩增基因 转化成功的农杆菌电泳结果应显示 个条带；如果用同样的方法检测转化成功的太行花植株，结果仅显示2个条带，原因是 。 (3)已知组成型启动子可以持续、高效地启动基因的表达，干旱诱导型启动子仅在干旱胁迫下启动基因表达。若将启动子①设计为干旱诱导型启动子，则启动子②应设计为 (填“组成”或“干旱诱导”)型启动子，这样导入太行花组织细胞的结果是 。 (4)科研团队对转基因太行花进行 水平验证，结果显示转基因太行花的抗逆性并未达到预期。为提升蛋白的生物活性，科研团队计划通过蛋白质工程对其进行改造。以下是相关步骤(含2个干扰项)，请按正确顺序排列： 。 ①通过射线衍射技术分析原始蛋白的盐碱敏感区域空间结构 ②利用计算机优化原始蛋白三维构象 ③采用定点突变技术修改基因的脱氧核苷酸序列 ④通过技术随机诱变基因序列 ⑤推导出耐盐碱功能所需的关键氨基酸替换位点 ⑥将改造后的基因导入受体细胞并检测其耐盐碱能力 ⑦推测出序列并人工合成新的氨基酸链 22．（2025·陕西咸阳·三模）水稻在生长过程中容易感染病虫害，从而引起作物减产。C蛋白和V蛋白分别对水稻螟蛾科害虫和夜蛾科害虫有较强的杀伤效果，科研人员构建了C—V抗虫融合基因（简称C—V基因）表达载体，通过农杆菌转化法将C—V基因表达载体导入水稻叶肉细胞，使其表达出C—V联合蛋白，从而培育出转基因抗虫水稻新品种，过程如图1。所示。回答下列问题：    (1)科研人员进行PCR1和PCR2时，扩增体系中需要分别加入C基因和V基因，其作用均是 。 (2)据图分析，PCR扩增时需要设计引物，为了使C基因和V基因能够正确相连，设计引物2和引物3时，引物序列除了能与模板DNA结合，还需要遵循的原则是 ，因此PCR1和PCR2需要在 （填“同一个”。或“不同”）PCR反应体系中进行。同时，为了使连接后的C—V基因能够正确插入载体中，需要在引物1和引物4的5端插入相关 酶的识别序列。 (3)进行PCR3时，不需要额外添加引物，此反应体系中具有引物效果的是 。 (4)用抗C蛋白抗体和抗V蛋白抗体检测转基因抗虫水稻中的蛋白质，结果如图2所示，1～7为被检测的转基因抗虫水稻，WT表示野生型水稻。    ①转基因抗虫水稻6体内未检测到C蛋白和V蛋白，其原因可能是 （答两点）。 ②为评价转基因抗虫水稻的抗虫效果，探究思路是向非转基因水稻和转基因抗虫水稻 （填序号）接种等量的 ，观察其抗虫效果。 23．（2025·湖南永州·三模）在应对全球粮食危机和气候变化的双重挑战下，中国科学家团队研发了人工淀粉合成途径（ASAP），利用10余种酶将CO2和H2O高效转化为淀粉。现需构建重组大肠杆菌来合成其中的三种关键酶：酶a（基因A，1.5kb）、酶b（基因B，2.0kb）和酶c（基因C，2.5kb），科研人员选择质粒pET28a（5.3kb）为载体。将从甲植物中扩增出的基因A、B、C依次插入到多克隆位点（MCS，约含30个碱基对），如下图所示。回答下列有关问题： 注：①F1~F3、R1~R3为引物；P1~P5为启动子；KanR为卡那霉素抗性基因；ori为复制原点。②限制酶SalⅠ与XhoⅠ的识别序列不同，但酶切后产生的粘性末端相同。 (1)启动子决定了基因的转录位置和方向，从转录角度分析图中P1、P3与P2的相对方向不同的原因是 。在构建基因表达载体时，为了使来自甲植物的基因A、B、C在受体菌中高效表达，其上游的启动子P4应选择 （填“甲植物”或“大肠杆菌”）的启动子。 (2)pET28a中只有一个SalⅠ和NotⅠ酶切位点，且无酶XhoⅠ的识别序列。为了使基因A、B、C依次正向插入pET28a的MCS中，在PCR扩增基因A、B、C时需在引物 的5'端添加限制酶XhoⅠ的识别序列，其它引物的5'端添加限制酶 的识别序列。 (3)初步检验重组质粒pET28a-ABC是否构建成功：获取部分重组质粒，用限制酶SalⅠ、NotⅠ、XhoⅠ充分处理，电泳分离酶切产物。从泳道中的条带数量和大小分析（过小的DNA片段无法通过电泳有效检测出来），当电泳结果为 时，表明成功构建了pET28a-ABC。 (4)将重组质粒导入大肠杆菌前，需先用钙离子处理大肠杆菌，作用是 。最后利用 工程对纯化的转基因大肠杆菌大规模培养生产酶。 (5)与植物光合作用合成淀粉不同，“人工合成淀粉途径”实现了在实验室中从CO2到淀粉分子的全合成。该研究成果尚处于实验室阶段，若未来能够大面积推广应用，可解决当前人类面临的哪些生态环境问题： （至少答出两点）。 24．（2025·河南·三模）IKK激酶山IKKα、IKKβ和IKKγ三种亚基组成，该酶参与动物体内免疫细胞的分化。临床上发现某重症联合免疫缺陷（SCID）患儿的IKKβ基因编码区第1183位碱基T突变为C。为研究该患儿发病机制，研究人员应用大引物PCR定点诱变技术获得突变基因，并培育出SCID模型小鼠。图1为定点诱变获得突变基因的过程。 (1)在定点诱变获取突变基因时，PCR1中使用的引物有 ，PCR2中使用的引物有 。PCR1和PCR2不能在同一个反应体系中进行，原因是 。 (2)PCR在第一个循环之前通常将DNA样品加热至95℃数分钟进行预变性处理，其目的是 。由于大引物较长，含C与G的碱基较多，为减少非目标基因的获得，在PCR2复性过程中应采取的措施是 。 (3)培育模型鼠的过程中，需用限制酶SacⅠ、HindⅢ对突变基因和载体进行双酶切，双酶切的优点是 。研究人员经鉴定、筛选获得一只转基因杂合鼠HE，让HE与野生鼠杂交得F1，F1雌雄鼠随机交配得F2。对F2中纯合野生鼠WT、纯合突变鼠HO、杂合鼠HE三种小鼠胸腺淋巴细胞中组成IKK激酶的三种亚基进行提纯和电泳，结果如图2。据此结果推测SCID患者免疫缺陷产生的机制是 。 25．（2025·江西景德镇·三模）已知酿酒酵母菌不能吸收纤维素，科研人员利用基因工程技术将EG基因等基因分多步导入酿酒酵母菌，获取可以直接利用纤维素发酵的酿酒酵母工程菌。 (1)构建基因表达载体是基因工程的核心步骤，科研人员采用以下两种方法构建含有EG基因的表达载体。 ①双酶切法：如上图标注了载体、EG基因的限制酶切点、EG基因两端的部分序列，已知酿酒酵母菌不能合成尿嘧啶，图中的标记基因为尿嘧啶合成基因。 结合图中信息分析，在扩增EG基因时应在引物的 （填“5'”或“3'”）端添加 限制酶的识别序列，设计的引物序列为 。（从5'端书写，写出前12个碱基序列即可） ②同源重组法：是指发生在两个DNA分子的同源序列（DNA序列相同或近似）之间直接进行交换的一种重组形式。利用同源重组的方法可以将目的基因插入到表达载体上，如右图所示。该操作可通过PCR技术在任一位点实现质粒的线性化，只要将目的基因两端带有与线性化质粒两端同源的DNA序列，在重组酶的作用下即可实现质粒上的同源重组，被称为体外同源重组。真核生物有性生殖过程中发生在 之间的基因重组，为体外同源重组提供了依据。与双酶切法相比，同源重组法构建基因表达载体的突出优点是 。 (2)导入上述重组质粒的酿酒酵母菌应在 的培养基上筛选培养。将筛选得到的菌株接种到液体培养基中培养一段时间，通过检测 ，以确定其发酵效果。 26．（2025·内蒙古通辽·三模）组织型纤溶酶原激活剂（t-PA）是一种血栓溶解剂，难以从天然组织中提取或人工合成。科研人员从人胎盘染色体基因库中筛选出t-PA基因，将其与质粒结合，导入人黑色素瘤细胞中构建工程细胞，以生产t-PA。回答下列问题： (1)用PCR技术扩增t-PA基因时的步骤及设定的参数如图1所示。引物在步骤 中与模板链结合，步骤丁的目的是 。步骤戊应设定跳转到步骤 。 (2)PCR需要设计两种引物，如图2所示。图示中可作为引物的是 （填序号），原因是 。 (3)t-PA基因及构建表达载体的过程如图3所示。为保证t-PA基因与质粒高效连接，应选用图3中的限制酶 进行切割。 (4)与使用大肠杆菌为受体工程细胞相比，用人黑色素瘤细胞的优点是 。 27．（2025·广西柳州·三模）IL—2（白细胞介素—2）是一种具有抗肿瘤作用的细胞因子，B7是诱导特异性免疫的共刺激分子。研究通过在肿瘤细胞中表达IL—2或联合表达IL—2、B7，诱导机体产生抗肿瘤免疫应答，为IL—2基因治疗进入临床提供依据。回答下列问题： (1)重组逆转录病毒的构建（部分过程见图1、图2）：根据图11-1进行分析，对逆转录病毒载体及IL-2基因片段都使用 （填序号）酶处理（A．EcoRI  B．HindIII  C．HpaI  D．BamHI），并在 酶的作用下连接获得IL-2重组载体。先用 处理大肠杆菌细胞，再将重组载体导入，扩增后提取大肠杆菌DNA鉴定目的基因。利用上述限制酶进行酶切，由图2可知，IL-2基因已定向插入载体内，基因长度约为 bp。将IL-2重组载体转染至CRIP细胞（某种能被逆转录病毒感染的宿主细胞），在多孔细胞板进行 培养并筛选阳性细胞，收集含有IL—2病毒的上清液。 (2)IL-2基因导入肿瘤细胞及表达检测：取病毒上清液感染小鼠胰腺癌细胞，提取肿瘤细胞内 ，构建RT—PCR（逆转录聚合酶链式反应）体系，分析确定肿瘤细胞内IL-2基因是否正常插入到染色体DNA。 (3)B7基因导入肿瘤细胞及表达检测：再将B7基因导入上述转基因肿瘤细胞，培养后提取蛋白质，加入带有荧光染料的单克隆抗体，利用 技术检测B7基因的表达水平。 (4)体内致瘤性实验：将同品系小鼠分成3组，背部皮下注射 肿瘤细胞的小鼠作为对照组，皮下注射已导入IL-2基因的肿瘤细胞的小鼠以及已导入IL-2和B7双基因的肿瘤细胞的小鼠作为实验组，观察小鼠肿瘤的生长情况，根据下图可以得出结论： ① ；② 。 (5)分析与讨论：IL—2是重要的免疫调节细胞因子，能诱导T淋巴细胞的增殖。转基因肿瘤细胞通过细胞因子的分泌调节激活了小鼠体内的 免疫，使机体产生抗肿瘤免疫效应。 四、解答题 28．（2025·山西·三模）某研究者用基因工程技术获得目的基因高效表达的大肠杆菌，构建重组质粒时，用EcoRI和KpnI两种限制酶同时切割质粒。图甲为两种质粒，其中lacZ基因编码产生的β-半乳糖苷酶可以分解X-gal产生蓝色物质，使菌落呈现蓝色，否则菌落为白色。图乙为目的基因（呈现出两端的部分碱基序列）。图丙为限制酶识别序列及切割位点。请回答下列问题： (1)不选用图甲中质粒B的原因是 。 (2)为保证目的基因能与质粒A正确连接，科研人员需利用PCR技术修饰并扩增目的基因，所设计的一对引物的碱基序列分别为5'- -3'、5'- -3'（只写出前10个碱基）。 (3)为筛选出导入重组质粒的大肠杆菌，排除未导入质粒的大肠杆菌和导入质粒而非重组质粒的大肠杆菌的干扰，使用了添加 等成分的培养基进行培养。若菌落呈现 ，则为所选大肠杆菌。 29．（2025·甘肃天水·三模）与普通玉米相比，甜玉米细胞中可溶性糖向淀粉的转化较慢，导致可溶性糖含量高，汁多质脆。为提高甜玉米的商品价值，科研人员培育出了超量表达G蛋白的转基因甜玉米新品种。在超量表达G基因载体的构建中，所用DNA片段和Ti质粒的酶切位点如图1、2所示。回答下列问题： (1)为培育出超量表达G蛋白的转基因甜玉米，应将G基因插入Ti质粒的T-DNA中。为使DNA片段能定向插入T-DNA中，可用PCR技术在DNA片段的两端添加限制酶识别序列，M、N端添加的序列所对应的限制酶分别是 。 (2)已知在单子叶植物的伤口处涂抹酚类化合物，则可以用农杆菌侵染玉米等单子叶植物。用于构建基因表达载体的质粒用限制酶切割后，可通过 的方法检测质粒是否被切开。构建好基因表达载体后，依次在含 的培养基上培养，筛选出可能含有目的基因的农杆菌，再用 法将重组质粒导入到植物体中。 (3)若某次实验电泳结果发现：实验组和对照组都没有任何条带，从PCR操作过程角度解释可能的原因是 （至少答出2点）。 30．（2025·陕西咸阳·三模）科研人员将蛋白A基因和蛋白B基因插入质粒上构建重组表达质粒，导入酵母菌获得融合蛋白AB，其制备过程如图所示，其中相关识别序列如表。回答下列问题： 限制酶 BamH1 EcoR I Mbo I HaeIII 识别序列和切割位点（5-3） G↓GATCC G↓AATTC ↓GATC GG↓CC (1)PCR1和PCR2是在两个不同反应体系中进行的，两个反应体系中加入的不同物质是 ，PCR1和PCR2的目的是 。从而有利于基因A和基因B融合。过程②时不需要加入的引物是 。 (2)为了将融合基因与质粒进行正向连接，选择其中的两种限制酶切割质粒，不选另外两种限制酶的理由是 。为了使融合基因与质粒用相同的限制酶处理后能够产生相同的末端（便于连接），应在设计的引物P1的5端加上限制酶 的识别序列。 (3)确保重组质粒能在大肠杆菌中扩增的元件是 过程③将重组质粒导入大肠杆菌时要用 处理大肠杆菌，目的是 。 31．（2025·甘肃白银·三模）全球工业化使环境雌激素（EEs）污染日益加剧，开发灵敏、简便的环境监测方法成为一项紧迫任务。研究发现，在EEs诱导下，斑马鱼幼鱼能够从无到有地表达卵黄蛋白原，且表达水平与水体中EEs浓度呈正相关。斑马鱼幼鱼通体透明，成功转入荧光蛋白基因后容易观察到其体内的荧光情况。回答下列问题： (1)根据斑马鱼幼鱼的特征，如果先给无启动子的荧光蛋白基因加上 基因的特异性启动子，就可利用基因工程构建能够监测水体中EEs污染情况的转基因斑马鱼，科研人员可以通过 （写出一种方法）获取该特异性启动子。 (2)pEGFP-1是一种无启动子的EGFP（一种绿色荧光蛋白）基因载体。下图为pEGFP-1质粒简化图谱，最好选择 酶将所选的特异性启动子序列正确地插入pEGFP-1质粒中，然后将构建成功的基因表达载体通过 法注入斑马鱼受精卵，最终获得转基因斑马鱼。 注：ori为复制起点；为卡那霉素抗性基因；MCS为外源DNA的插入部位；SV40poly（A）为转录终止信号 (3)检查转基因斑马鱼是否培育成功也是基因工程的重要环节。请利用EGFP，从个体生物学水平描述转基因斑马鱼的鉴定方法： 。 (4)经过个体生物学水平筛选成功的转基因斑马鱼能否投入实际生产使用，并说明理由： （合理即可）。 32．（2025·山东泰安·三模）科研人员尝试利用鸡新城疫病毒（HB1）基因和传染性支气管炎病毒（H120）基因，采用基因工程技术培育转基因工程菌，以制备二联体疫苗，所需要的限制酶的识别序列和切割位点如表所示，培育流程如图所示。 限制酶 BclI PvitⅡ XbaI Sau3AI 识别序列和切割位点（5′-3'） T↓GATCA CAG↓CTG T↓CTAGA ↓GATC (1)根据图示信息，应选用限制酶 切割质粒，不选用其他限制酶的原因是 。 (2)为保证融合基因与质粒的正向连接，在设计PCR引物时，应在b链对应引物的 （填“3'”或“5′”）端添加限制酶 （填种类）的识别序列。根据图表信息，写出该引物的12个碱基序列5′- -3′。 (3)为筛选出导入了基因表达载体的大肠杆菌，培养基甲中应添加 （填“四环素”或“青霉素”）,培养基乙中应添加 （填“四环素”或“青霉素”）,菌落 （填图中数字）中的大肠杆菌可用来制备疫苗。 33．（2025·湖南湘西·三模）某真菌W基因编码的纤维素酶含有一段疏水信号肽，可在内质网加工后分泌至胞外。已知W基因转录产物序列如下（部分）：5'-UGAAC-GCUA…（中间序列）…GUCGACUCG-3'。现需将其转入大肠杆菌表达，所用质粒如图1。 限制酶 BamHI EcoRI MfeI KpnI HindIII 识别序列和切割位点 G↓GATCC G↓AATTC C↓AATTG GGTAC↓C A↓AGCTT 图3 (1)若需在细菌中表达可分泌的成熟酶，应选择 和 进行双酶切（从上述酶中选择），其科学依据是 ； (2)若直接将含信号肽的W基因转入大肠杆菌，预测表达产物无法分泌的原因： 。 (3)Ca2+处理可使大肠杆菌细胞膜形成短暂通透性孔道，此时细胞处于 态。若改用Mg2+处理，转化效率显著下降，其分子机制是 。 (4)扩增W基因编码链时，与其模板链结合区序列为 （从转录产物推导至少4碱基）。 34．（2025·山西临汾·三模）某科研团队从某细菌中提取抗盐基因，将该基因转入烟草培育成抗盐烟草。下图是转基因抗盐烟草的培育过程，外源DNA片段和Ti质粒上都有4种限制酶的切割位点，虚线箭头表示转录的方向。请分析回答下列问题。 (1)用图中的Ti质粒和抗盐基因构建重组质粒时，为防止自身环化和反向连接，最好选择图中的限制酶 ，对抗盐基因进行扩增常用 技术。 (2)将重组质粒A导入到农杆菌的方法常用 法。将抗盐基因导入植物细胞除了图中的方法外还可以用 法（写出一点）。 (3)筛选成功导入抗盐基因的烟草细胞 （填“可以”或“不可以”）用含有M抗生素的培养基进行筛选，原因是 。 (4)对转基因烟草进行个体水平的检测方法是 。 35．（2025·宁夏银川·二模）胶原蛋白在维持器官、组织、细胞等方面发挥着关键性作用。科学家将合成胶原蛋白的基因kit导入大肠杆菌构建基因工程菌，过程如图所示。请据图回答下列问题： (1)目的基因与质粒连接后可以导入到不同物种细胞中表达出同种蛋白质，其原理是 。 (2)已知kit基因的部分序列见下，采用PCR技术进行扩增时，选用的引物为 （填字母）。为使基因与质粒成功连接，适宜的方法是在引物的 端添加 两种限制酶识别序列。 5'—CGGGATCCA………………AGAATTCCG—3' 3'—GCCCTAGGT………………TCTTAAGGC—5' A．5'—GCCCTAGGT—3'  B．5'—CGGAATTCT—3' C．5'—CGGGATCCA—3'  D．5'—GCCTTAAGA—3' (3)酶切kit基因，并与质粒中长度为170bp的片段进行置换，构建重组质粒pET-28a（+）-kit，用HindⅢ酶分别酶切pET-28a（+）和pET-28a（+）-kit，获得如下表所示片段。 质粒类型 pET-28a（+） pET-28a（+）-kit HindIII酶切片段 1000bp，2550bp 1000bp、2000bp、700bp 则kit基因长度为 ，由此判定kit基因上有 个HindⅢ酶切位点，原因是 。 36．（2025·安徽合肥·三模）低温是早春和晚秋作物生长的重要环境胁迫因子，可导致植物的叶出现脱水萎蔫。科研人员以一种农杆菌 Ti质粒为载体，将由低温诱导启动子RD29A控制的拟南芥耐寒基因 AtCOR15a导入番茄基因组，以期改良番茄的耐寒性，为培育耐寒性番茄新品种奠定基础。回答下列问题。 (1)低温诱导启动子 RD29A的作用是 。请在图中标明重组后拟南芥耐寒基因 AtCOR15a 和低温诱导启动子RD29A 的位置 。 (2)将含有基因 AtCOR15a的重组 Ti质粒转入农杆菌，再用农杆菌侵染番茄无菌苗子叶，使用抗生素 筛选出具有该抗生素抗性的幼苗后，还需提取抗性幼苗的染色体DNA 进行PCR 鉴定, 目的是 。 (3)通过对番茄幼苗的总 RNA 进行测定，获得基因 AtCOR15a相对表达量最高的3个株系A1、A33、A37。为进一步从个体水平对这些株系幼苗的耐寒性进行评估，简要写出实验设计思路 。 37．（2025·安徽六安·三模）A蛋白是某种激素合成的关键酶。为鉴定该激素合成的部位及生理作用，科研团队利用无缝克隆技术将A蛋白结合蛋白基因（P基因）与葡萄糖苷酸酶基因（GUS基因）融合，构建A蛋白检测探针，通过农杆菌转化法导入拟南芥进行实验。相关原理、过程及质粒的结构如下图所示。 注：①bar为抗草甘膦（一种除草剂）基因；Tetr为四环素抗性基因；Ampr为氨苄青霉素抗性基因②F1、F2、R1、R2为引物③BamH I、Sma I、Bcl I为限制酶 (1)无缝克隆时所需的酶除T5核酸外切酶外还有 和 。用无缝克隆技术构建GUS-P融合基因的关键是R2引物 端序列与 互补。 (2)利用双酶切法将融合基因插入Ti质粒，选用的限制酶为 。扩增融合基因所需的引物R1和F2应选用下列引物组合为 。 ①5'-…CTTGGATGAT-3'②5'-…TAAGTTGTCT-3'③5'-…ATTCAACAGA-3' ④5'-…TCTGTTGAAT-3' 38．（2025·宁夏石嘴山·三模）番茄红素具有一定的抗癌效果。普通番茄合成的番茄红素易在番茄红素环化酶的催化下转化为胡萝卜素。科学家利用基因工程设计的重组DNA（质粒三）能表达出双链RNA（发卡），番茄细胞可识别双链RNA并将该双链RNA和具有相同序列的单链RNA一起降解，从而阻止番茄红素的转化，提高番茄红素的产量。下图为利用质粒一和目的基因构建重组质粒三的过程示意图。回答下列问题：    (1)质粒通常用作基因进入受体细胞的载体，它能供外源DNA片段（基因）插入的原因是 。 (2)对质粒二开环需用到的限制酶是 。为了防止其自身环化，需进行去磷酸化，即去除开环的质粒两端的 个磷酸基团。 (3)构建质粒三时，最好在A、B两端分别加 、 的识别序列，目的是 。 (4)质粒三导入受体细胞并表达后，形成双链RNA（发卡）的原因是 。“发卡”在受体 进行PCR扩增。 39．（2025·湖南长沙·三模）t-PA蛋白能降解血栓，是脑血栓患者的特效药，但其促进血栓溶解的特异性不高。若将t-PA蛋白第84位的氨基酸替换成丝氨酸（密码子是UCU），获得改良的t-PA蛋白，其溶解血栓的效率明显提升。图1和图2为改造t-PA蛋白基因及构建表达载体的过程。请回答下列问题： (1)在PCR技术中高温变性的目的是 。PCR的产物一般通过 来鉴定。若PCR扩增没有获得扩增产物，下列解释合理的有 。 ①复性温度过高②复性温度过低③缓冲液中缺少镁离子④引物之间形成二聚体 (2)图1中黑点表示突变位点的碱基，若要得到改良t-PA蛋白，则引物b中该位点的碱基是5' 3'（写3个碱基）。重叠延伸得到的改良t-PA蛋白基因非模板链序列为5'-TGAAACGCT…（中间序列）…GTCGGCTCG-3'。为了便于将扩增后的基因和质粒pCLY11成功构建成重组质粒，需在引物的5'端添加限制酶酶切序列，请写出PCR3扩增中引物a的碱基序列5'- -3'（要求：写出15个碱基）。 (3)运用乳房生物反应器可以从转基因牛的乳汁中获得t-PA改良蛋白，请完善以下流程： ①将t-PA改良基因与乳腺特异性启动子连接，构建表达载体； ② ； ③ ，移植到代孕母牛子宫； ④筛选转基因牛，从乳汁中提取t-PA蛋白。 (4)对乳汁t-PA进行活性检测，应以t-PA溶液为阳性对照，以 为阴性对照。 40．（2025·甘肃白银·三模）拟南芥是科学研究中的模式植物。某科研人员将黄粉虫细胞内的抗冻蛋白基因TmAFP与Ti质粒连接形成基因表达载体导入拟南芥细胞中，以获得耐低温拟南芥，过程所用的基因、Ti质粒、限制酶的识别序列及切割位点如图1所示。请回答下列问题： (1)对TmAFP基因进行PCR扩增，在PCR反应体系中加入的缓冲液中含有Mg2+，Mg2+的作用是 。利用PCR的方法扩增TmAFP基因时需要引物，引物的作用是 。 (2)为了使TmAFP基因插入Ti质粒，设计引物时需要在A端引物的5'端和B端引物的5'端分别添加 （填限制酶）的识别序列。结合目的基因的部分碱基序列，请设计引物的碱基序列。 引物1（A端的引物）：5′— —3'； 引物2（B端的引物）：5'— —3'。 (3)为了筛选出成功导入含抗冻蛋白基因TmAFP的重组质粒的农杆菌，一般可进行如下步骤。 第一步：让农杆菌在含 的培养基上培养，得到如图2所示的菌落。 第二步：再将灭菌绒布按到培养基上，使绒布面沾上菌落，然后将绒布按到含 的培养基上培养，得到如图3所示的结果（空圈表示与图2对照无菌落的位置）。 第三步：选出图2培养皿中的某些菌落进行培养，即可得到含重组质粒的农杆菌。其中图2中的菌落 （填数字）表示含重组质粒的农杆菌。 41．（2025·浙江·三模）番茄细菌性斑疹病是番茄种植产业中较严重的病害，具有发病迅速、防治难等特点，主要由丁香假单胞杆菌感染引起。研究发现：植物体内芦丁等类黄酮类次生代谢产物含量增多时可增强植物对细菌或真菌病害的抗性。而经拟南芥AtMYB11或AtMYB12基因（简称A基因）转化的烟草、番茄等植株可提高芦丁等物质的合成量。现欲向番茄植株内转入A基因进而选育出高抗病番茄品系。 抗生素 功能作用 潮霉素、卡那霉素、庆大霉素、链霉素 通过抑制核糖体功能达到杀死细菌、动物、植物细胞的效果。 羧苄青霉素 通过抑制细菌细胞壁的形成达到杀死细菌的效果； 可分解生成生长素类物质，刺激植物愈伤组织的形成与增殖。 (1)目的基因的获取。一般情况下目的基因片段越小，重组效率和导入效率均越高。从拟南芥提取的A基因长度约为3000bp，若要提高目的基因与质粒重组效率，可以 获取A基因。 (2)目的基因的扩增与重组质粒的构建。若获取的A基因无上述限制性内切核酸酶识别序列，PCR扩增A基因时，需在两种引物的 端（填“5′”或“3′”）添加相应的识别序列。为成功选育出高抗病番茄品系，构建重组质粒应选择 酶对图示质粒进行切割。 (3)重组质粒的导入。将农杆菌放入低温、低浓度的 溶液中处理以改变细胞膜的通透性，使之成为感受态细胞。再在低温条件下与重组质粒混合，以低温条件处理的作用是 ，然后进行短暂的热刺激处理，使外源重组质粒转入农杆菌细胞。将转化后的农杆菌置于摇床慢速培养一段时间，其目的是使农杆菌从感受态恢复正常状态，从而 。因此，在培养基中加入 ，才能初步选出导入重组质粒的大量农杆菌。 (4)农杆菌与番茄细胞共培养与筛选。根据表格信息，将农杆菌与番茄细胞共培养一段时间后，番茄外植体培养基要加入 （抗生素）以杀灭农杆菌。之后培养过程中培养基中加入 以筛选出含有A基因的番茄细胞。 (5)转基因植株的扩增。为了获得更多的A基因番茄植株，对脱分化形成愈伤组织进行继代培养，影响继代培养物生成再生植株的因素除培养条件（温度、光照等）、培养基中营养物质和植物生长调节剂的浓度和配比外，还有 （写出2点）。 42．（2025·河南·三模）GRF是一种在植物中广泛存在的特异性转录因子，在植物的生长发育和胁迫响应过程中发挥着重要作用。BpGRF4为白桦GRF基因家族成员，科研人员通过农杆菌转化法获得了白桦过表达BpGRF4株系，用以探究BpGRF4在白桦植株生长发育过程中的作用。 (1)科研人员首先提取野生型白桦的根、茎、叶的总RNA，通过 获得cDNA；然后以获得的cDNA为模板通过PCR获得BpGRF4基因，利用PCR扩增BpGRF4基因时，每次循环需要经过三步，依次是 ；以根、茎、叶的总RNA为模板，说明在这三个器官中BpGRF4的表达量 （填“高”或“低”）。 (2)利用PCR扩增该基因时，加入的一个引物序列是ATGGATTTTGGGGTAGTGGGTT，根据该序列 （填“能”或“不能”）推测出另一个引物的序列，原因是 。 (3)科研人员使用T4 DNA连接酶将获得的BpGRF4基因片段连接到A载体限制酶NocI的酶切位点上，构建过表达载体，可推测获得的BpGRF4基因两端有 个限制酶NocI的酶切位点。将构建的过表达载体导入农杆菌中，需先用Ca2+处理农杆菌，其目的是 。 (4)利用农杆菌转化法得到过表达BpGRF4的白桦转基因株系OE-3，科研人员统计了1树龄的野生型白桦植株（WT）和1树龄的OE-3的表型，结果如图所示，说明BpGRF4是通过 来促进白桦植株的生长发育的。将WT与OE-3杂交，能否预测子一代的株高？请说明理由： 。 43．（2025·浙江温州·三模）LfcinB是一种阳性离子抗菌肽，其正电荷数决定其抗菌能力。因其分子量较小而易被分解，导致其产量低、较难获取。现利用基因工程技术制备LfcinB，以期获得更高效率的生产应用。回答下列问题：    (1)LfcinB易导致原核宿主裂解死亡，因此往往需要带负电的蛋白（APBSP）与LfcinB相连接形成融合蛋白，以防止这一现象的发生，原因是 。 (2)APBSP-LfcinB基因片段的合成和扩增。利用PCR技术获取APBSP-LfcinB融合基因（获取过程如图1）并扩增，PCR时，引物可以 （A．为Taq DNA聚合酶提供结合位点 B．决定扩增产物大小 C．决定反应的特异性 D．决定变性时间）。以融合基因表达获得的融合蛋白，为方便除去APBSP蛋白而仅获得LfcinB，需在融合蛋白连接处引入甲酸裂解位点（对应的mRNA序列为5'GACCCA-3'）。因此在PCR扩增APBSP基因时，需在 （填“引物1”或“引物2”）的5'端引入甲酸裂解位点的对应序列，其在引物中对应的序列为5'- -3'。 (3)重组载体的构建与克隆。所用表达载体（图2）可将M和N之间的片段整合到酵母菌的染色体上，其中M是甲醇诱导型启动子、Q是终止子。将酶切的质粒与融合基因连接构建重组质粒，并导入大肠杆菌。将大肠杆菌接种至含 的LB培养基中培养和筛选。 (4)重组质粒导入酵母菌。利用图中的限制酶 处理重组质粒，使其线性化，线性化处理的目的可能是 。在低温条件下，将线性化重组质粒与一种毕赤酵母（甲醇营养型酵母菌，且是组氨酸缺失突变体）混合，在50%聚乙二醇溶液中进行短暂的 处理，实现对毕赤酵母的转化。然后将其接种于不含 的培养基，筛选出导入重组质粒的毕赤酵母， (5)融合蛋白的诱导表达。将所选菌株在液体培养基中连续培养若干天，每隔24小时在培养基中加入甲醇，其目的是 。 (6)LfcinB的分离纯化和检测。将含有融合蛋白的上清液收集至离心管中，加入等体积的甲酸处理一定时间，收集固形物并用适量溶液溶解后，用 方法对产物进行分离纯化，再进行检测与鉴定。 44．（2025·江苏·三模）病毒诱导的基因沉默技术（VIGS）是利用病毒载体携带目的基因侵染植物细胞，在植物细胞中复制产生dsRNA（双链RNA），激活植物自身的基因沉默机制，降解植物目标mRNA的技术。叶用莴苣生长到一定时期极易抽薹（茎迅速生长），从而导致莴苣减质减产。研究表明LsMET1基因（甲基转移酶1基因）促进叶用莴苣抽薹，研究人员利用VIGS尝试使LsMET1基因沉默来验证该观点，主要操作如图。请回答下列问题。 (1)过程①反应体系中加入的物质除引物、原料、模板外，还有 ，下列四种引物中用于过程①的是 。 A．5'GAATTCATGA………………………3'    B．5'CTTAAGTTAC………………………3' C．5'CTGCAGTAGA………………………3'    D．5'GACGTCATCT………………………3' (2)过程②将环状DNA扩增为线性DNA的目的是 。 (3)在TRV1、TRV2质粒中插入双启动子目的是 。过程④将TRV1质粒和重组质粒导入农杆菌后，在培养基中应加入 进行筛选。 (4)导入植物细胞的CP-LsMET1-RZ基因转录后在 催化下，被剪切为CPRNA、LsMET1 RNA、RZRNA。LsMET1 RNA诱导内源LsMET1基因沉默的机制如图2，AGO1蛋白选择性降解3'端稳定性较低的一条链。据图分析，向农杆菌中导入TRV1质粒的目的是 ，激活的RISC有的能诱导LsMET1 mRNA降解，有的不能诱导LsMET1 mRNA降解，其原因是 。 (5)研究人员测定了LsMET1表达量和抽墓（茎生长）状况，结果如图3。该实验结果与预期是否一致，并说明理由。 。 45．（2025·河南·三模）科研人员利用农杆菌介导的喷花法（即将农杆菌悬浮液用微型喷壶均匀喷洒于棉花柱头和花药等器官上）将海岛棉中控制纤维发育良好的目的基因GbHCT与草铵麟除草剂抗性基因导入陆地棉Y1169中（如图），研究棉花株高、有效铃数等农艺性状的改变与目的基因GbHCT插入的关系。回答下列相关问题： (1)GbHCT基因包括GbHCT13、GbHCTI5两种，首先用PCR技术对基因分别扩增，扩增两基因时均需要引物，引物的作用是 ，该过程中为激活参与反应的酶需在缓冲液中添加 。 (2)利用BglⅡ与BstEⅡ对pCAMBIA3301载体进行双酶切的优点是 。用PCR技术扩增GbHCT基因时，对目的基因的引物的操作是 。 (3)研究人员将带有pCAMBIA3301－GbHCT重组载体的农杆菌菌液通过喷花法转化到棉花中，其原理是 。在幼苗期对每株植株的同一叶片涂抹大田适用的草铵麟除草剂，该操作的目的是 ，此时草铵膦除草剂抗性基因属于 。 (4)下表为两个转基因棉花品系农艺性状与非转基因陆地棉Y1169对照组之间的比较。 品系 株高 有效果枝数 有效铃数 转GbHCT13 85.10 11.10 14.96 转GbHCT15 83.35 12.78 17.14 Y1169 79.70 9.30 9.20 据此得出的实验结论是 。 46．（2025·四川内江·三模）2-苯乙醇（2-PE）具有令人愉悦的玫瑰香气，常作为添加剂而广泛地应用于食品、化妆品和医药领域。酿酒酵母生产2-PE过程中，支路基因ARO8的表达会损耗中间代谢物而导致2-PE产量不高。科研人员欲使用CRISPR/Cas9基因编辑技术（CRISPR/Cas9系统编码的sgRNA可引导Cas9蛋白切割目的基因）对尿嘧啶营养缺陷型酿酒酵母进行编辑处理，以降低由ARO8基因导致的中间产物损耗来提高2-PE产量。生产过程如图1： 注：1.BclⅠ识别序列5'-TGATA-3'，SmiⅠ识别序列为5'- TTTAAA-3'，EcoRⅠ识别序列为5'- GAATTC-3'； 2.URA3基因表达产物可指导合成尿嘧啶，但当培养基中含有5-氟乳清酸（5-FOA）时，尿嘧啶可将5-FOA转化为有毒的5-氟尿嘧啶而抑制细胞生长。 回答下列问题： (1)构建基因表达载体。人工合成sgRNA对应的DNA片段时，应根据 基因的部分已知碱基序列等设计。据图分析可知，为保证sgRNA对应的DNA片段正确插入质粒1中，在进行PCR扩增时需在该DNA片段上下游分别添加 限制酶的识别序列，再用 连接。基因表达载体除了图示组成外，还需要有 。 (2)基因表达载体的扩增。在含有 的培养基上筛选培养导入重组质粒的大肠杆菌，提取质粒。 (3)导入受体细胞。用质粒2转化尿嘧啶营养缺陷型酿酒酵母，在 的平板上筛选成功导入质粒的酿酒酵母。Cas9蛋白在sgRNA引导下切割ARO8基因实现对ARO8基因的敲除。实现敲除后，为避免质粒残留带来后续影响，研究人员将获得的单菌落多次传代，随后稀释涂布在含有 的平板上，筛选并获得不再含有质粒2的菌落。 (4)表达水平检测。为验证ARO8基因的缺失对2-PE合成的影响，研究人员对2-PE发酵产量进行了检测，结果如图2.实验结果说明 。 47．（2025·青海西宁·三模）北京大学贾桂芳课题组、美国芝加哥大学何川课题组、贵州大学宋宝安课题组将水稻转入肥胖基因（FTO基因），单株产量提高了三倍。科研人员构建含肥胖基因的重组质粒，主要技术流程如图所示。图中HindⅢ、BamHI、PstI、XhoI和EcoRI表示限制酶，NptⅡ为卡那霉素抗性基因。请回答下列问题： (1)获取FTO基因时，需要先从细胞中提取 ，再通过逆转录过程获得cDNA，进而通过PCR扩增FTO基因；引物的作用是 。 (2)PCR的产物可通过电泳鉴定，如果待测FTO基因片段的泳道出现杂带，原因可能是复性时温度偏 （填“高”或“低”），导致 。 (3)构建重组质粒时，先将Bt基因替换为FTO基因。扩增FTO基因前，要在两种引物的5'端加入图示限制酶 的识别序列。过程②构建重组质粒选用的酶是 。 (4)常用 法将FTO基因导入水稻细胞，转化后的细胞在培养基上培养。配制培养基时，除了营养物质和激素外，还需要的物质是 。 48．（2025·河南郑州·三模）2，3一丁二醇是一种在食品工业、医药行业等诸多领域具有广泛应用价值的化合物，常用产气肠杆菌进行生产。产气肠杆菌发酵产生2，3—丁二醇的同时，也会生成乳酸、甲酸、乙酸等多种副产物，影响产量。回答下列问题。 (1)对产气肠杆菌进行纯培养时，下列接种过程的正确排序是 。培养过后，若在培养基中观察到不同形态的菌落，原因可能是 。    (2)已知P基因（位于拟核DNA分子中）与产气肠杆菌发酵过程中副产物的生成有关。研究人员拟用如下图所示的流程构建重组质粒，随后将其转入产气肠杆菌体内用以敲除P基因（敲除后的P基因将被有关的酶降解），请完善相关步骤。    ①要得到步骤③所示的重组质粒，应采用引物 和 对上述片段进行PCR扩增。 ②用限制酶 处理PCR产物，并用XholⅠ对质粒进行酶切。 ③将酶切后的PCR产物和质粒进行连接后得到如下重组质粒。    ④组成该质粒的结构还必须包括 （答出2点即可）等。 (3)将经上述流程获得的重组质粒导入产气肠杆菌并进行筛选，随后采用不同引物组合对筛选后的菌株进行PCR扩增，电泳检测结果如下图所示。其中，P基因已被敲除的有 。为检测该基因工程是否取得成功，最终应进行的操作为 。    49．（2025·福建三明·三模）我国是世界上最大的水稻生产国，水稻的栽培历史源远流长。在水稻育种方面，转基因技术已成为新品种培育的一条崭新途径，研究人员运用基因工程技术进行转基因水稻的研究。图1是研究人员利用T-DNA将目的基因导入水稻的一条染色体DNA局部示意图。    注：①图中灰色部分为带有目的基因的T-DNA片段。 ②酶切位点及引物2-5位于T-DNA末端区域。 回答下列问题： (1)由于该T-DNA长度过长，PCR无法扩增完整序列，为检测植株是否含有目的基因，应选取的引物是 （从引物2~引物5中选择），进行PCR及电泳检测，得到结果，如图2。其中，1和2分别为野生型和已知转基因植株作为对照， 为转基因植株。    (2)反向PCR技术是一种用于扩增已知序列侧翼未知DNA序列的技术。为进一步确定含目的基因的T-DNA插入染色体的具体位置，研究人员利用图2转基因植株2的染色体DNA检测，流程如图3。    通过过程Ⅰ、Ⅱ获得环状DNA后，过程Ⅲ应选取图1中的引物 扩增。为了验证T-DNA的定位，根据过程Ⅳ测序结果设计引物6，选取引物3和6，以植株2的染色体DNA为模板，进行PCR扩增，电泳结果获得扩增产物，说明植株2的T-DNA整合在 区域。利用引物3和6检测其他转基因植物，电泳结果显示仅部分转基因植物有PCR扩增产物，则说明 。 (3)对植株2自交所得子代植株DNA进行PCR检测，得到结果如图4。结合图1推测：子代PCR时除了使用了引物2和6组合外，还使用了引物 组合，根据PCR结果可以确定 为所需纯合转基因植株。    50．（2025·重庆·三模）甲硫氨酸作为必需氨基酸之一，是动物饲料中必不可少的添加剂。某科研小组以蜡样芽孢杆菌EN34为材料生产甲硫氨酸，但是产量不高。已知metI基因、metK基因与甲硫氨酸的合成和分解有关，metI基因指导合成的酶R可催化M转化为甲硫氨酸，metK基因指导合成的SAM合成酶可催化甲硫氨酸转化为S-腺苷甲硫氨酸（SAM）。回答下列问题： (1)甲硫氨酸是蜡样芽孢杆菌EN34的 （填“初生”或“次生”）代谢物。若要提高蜡样芽孢杆菌 EN34生产甲硫氨酸的产量，从调控metI基因与metK 基因表达的角度分析，应该进行的操作是 。 (2)该小组构建了含有某种强启动子（P43）和metI基因的基因表达载体，相关过程如图1所示。该过程需要用到的工具酶除图中的 HindⅢ和EcoRⅠ外，还有 。metI 基因表达时，以 （填“a”或“b”）链为转录的模板。科研中常用 （填离子）处理蜡样芽孢杆菌 EN34，有利于将 pEB03-P43-metI表达载体导入其中。 (3)该小组利用基因敲除技术（通过一定的途径使机体特定的基因失活或缺失）敲除蜡样芽孢杆菌 EN34 的metK基因后，将其相关DNA片段及野生型菌株的相关片段用PCR技术扩增，再进行电泳处理，结果如图2所示。分子在电泳过程中的迁移速率与 答出2点）等有关，据图2推测，该过程敲除基因的原理是 。 51．（2025·甘肃白银·三模）玉米又称棒子、苞米、苞谷等，是我国重要的粮食作物之一。研究玉米的光合作用速率和培育玉米新品种均具有重要的意义。玉米在早期光合作用的过程中会产生大量可溶性糖，可溶性糖在淀粉合成酶的作用下转化为淀粉，使玉米籽粒呈糯性。研究发现，与野生型相比，玉米的CST1基因缺失突变体光合作用速率下降。回答下列问题： (1)科研人员对玉米叶片的气孔开放程度进行检测，结果如图1所示，    据图分析，突变型玉米光合作用速率下降的原因可能是 。 (2)科研人员培育出超量表达P蛋白的转基因玉米，以提高玉米的营养价值。利用Ti质粒构建的基因表达载体如图2所示，其中强启动子能驱动基因的持续转录。将萌发的玉米种子的胚芽尖端割伤，有利于种子吸收酚类化合物。    ①在构建基因表达载体时，图2中切割目的基因的DNA片段应选用的限制酶是 。同时用农杆菌侵染玉米叶片外植体，其目的是 ，但科研人员在实验中发现，玉米等单子叶植物无法分泌酚类化合物，导致农杆菌难以感染，为了提高转化的成功率，可将萌发的玉米种子的胚芽尖端割伤，然后在伤口处 ，最后再置于农杆菌液中进行浸泡。 ②为了检测P蛋白基因是否整合到玉米细胞的染色体DNA上，初步检测时最好在培养基中加入 。 52．（2025·甘肃甘南·三模）shRNA表达载体产生的shRNA会形成发卡结构，其中单链结构由loop序列区编码后产生环形，而双链结构被RNaseⅢ类似酶Dicer剪切成为siRNA，siRNA可与靶基因表达产生的mRNA结合，导致mRNA被降解从而诱导靶基因沉默。利用该技术同时干扰植物甲KatB基因和KatC基因的表达，研究人员设计了shRNA表达载体，KatB和KatC转录模板链部分序列和shRNA表达载体的示意图如图1、2所示。回答下列问题:    (1)表达载体的RB和LB分别是T - DNA的右边界和左边界，其中表示终止子的序列是 。目的基因用限制酶XhoⅠ和SpeⅠ处理后可定向插入6×UAS的下游，原因是两者切割DNA产生的 不同。 (2)HPT表达的酶使细胞对抗生素——潮霉素B具有抗性。重组质粒转入受体菌后，培养液中添加一定量的潮霉素B，目的是 、 。 (3)为达到更高的干扰效率，目的基因①的序列与KatB和KatC基因 （填图中的区域）的序列一致。①的编码链5'～3'序列与②的 序列相同，理由是 。 (4)导入重组质粒的植物甲进行转化并用DEX诱导目的基因表达，检测基因的表达情况结果如图所示。植株M和N的表达情况不同，其原因可能是 。    53．（2025·江西·三模）海洋中含有丰富的几丁质，科研工作者从红树林虾场土壤中筛选到一株能够分解几丁质的放线菌橙黄小单孢菌，通过设计特异性引物F（含限制酶 MfeⅠ的酶切位点）和R（含限制酶HindⅢ的酶切位点），以橙黄小单孢菌的基因组DNA 为模板进行PCR，克隆得到一个几丁质酶基因Machi3，并成功在大肠杆菌中表达。请回答下列有关问题： (1)进行PCR时，除了特异性引物和模板外，还要添加 （至少填2项），PCR产物通过琼脂糖凝胶电泳验证后，再对目的片段进行回收。 (2)将测序正确的Machi3和pET-28a质粒（见图1）用 进行酶切,回收目的基因片段和酶切质粒，用 连接构建重组表达质粒，并转化至大肠杆菌细胞中，对重组菌体进行培养，分离提纯重组几丁质酶。 (3)将重组几丁质酶液分别与α-几丁质、胶体几丁质、虾壳粉、淀粉、纤维素、不同脱乙酰度的壳聚糖（脱乙酰度50%、70%、80%、85%、90%、95%）进行反应,在最适反应温度和pH条件下,测定重组几丁质酶的酶活力（结果如图2），根据结果分析，其中 是重组几丁质酶的最适底物，推测壳聚糖脱乙酰度与重组几丁质酶水解效率的关系是 。 54．（2025·黑龙江齐齐哈尔·三模）烟草是喜温植物，对温度较敏感，不同温度对烟草品质和产量的影响不同。温度低于13℃，烟草无法生长，所以在烟草植株生长的前期和中期，如遇低温天气，则会造成烟草减产。科学家将陆地棉抗寒基因（GhSAD2基因）导入烟草，提高烟草的低温防御能力，回答下列问题： （注：ori：复制原点；CaMV35S：启动子；GUS：报告基因，可将X-葡萄糖苷转化成蓝色物质） (1)基因工程中可用PCR技术获取和扩增目的基因，其原理是 ，反应体系中需加入：模板（烟草DNA或cDNA）、引物、原料、 、缓冲液和Mg2+等，Mg2+的作用是 (2)为保证GhSAD2基因正向插入载体，需要在引物1的 端加入限制酶 序列。扩增出的目的基因和pBI121载体经XbaI和SmaI双酶切后得到的片段，可用 连接。 (3)将导入GhSAD2基因和GUS基因的双基因表达载体pBI121-GhSAD2-GUS导入农杆菌，可向培养基中加入 物质，在恒温培养箱中培养直至菌落特征稳定，挑取 色（填“蓝色”或“白色”）菌落，经扩大化培养后侵染烟草。 (4)为检测GhSAD2基因是否成功导入并整合到烟草染色体DNA，提取12株长势较好的转基因烟草植株的叶肉细胞DNA，用引物1和引物2进行PCR扩增并电泳检测，结果如图2.根据电泳结果，含pBI121-GhSAD2-GUS基因表达载体的农杆菌侵染烟草植株的转化率约为 。 （注：M为分子大小参照物；1-12为转GhSAD2基因烟草PCR产物；13为pBI121-GhSAD2-GUS基因表达载体PCR产物；14为野生型烟草PCR产物） (5)低温对植物的伤害首先发生在细胞膜上，会破坏细胞膜的流动性，导致电解质渗出，影响外界溶液的电导率。为检测转基因烟草是否表现出抗寒性状，将野生型烟草和转GhSAD2基因烟草分别置于4℃环境中，48h后测定其导电率，结果如图3.结果显示转基因烟草具有抗寒性状，理由是 。 （注：CK为野生型植株；T1、T2为转GhSAD2基因植株） 55．（2025·陕西安康·三模）某萝卜品种是雌雄同花植物，其储藏根长形（R）对圆形（r）为显性，长形萝卜与圆形萝卜杂交，所得子代全为椭圆形。该萝卜品种在栽培过程中容易感染霜霉病菌，从而影响萝卜的产量和品质。实验人员从某种微生物细胞内提取到抗霜霉病基因T，并将该基因导入椭圆形萝卜中，获得了两种椭圆形抗病萝卜品系P1和P2（每种萝卜品系中只导入了一个抗霜霉病基因T）。为了确认抗霜霉病基因T插入的位置，通过PCR检测P1和P2自交后代F1每株个体的相关基因电泳条带组成，结果如图1、2所示（各种情况均在图中展示）。不考虑基因突变和互换，回答下列问题： (1)从微生物细胞中提取DNA时需要加入蛋白酶，其作用是 。以从微生物细胞中提取的mRNA为模板合成DNA，以DNA为模板进行PCR扩增得到抗霜霉病基因T，以上过程涉及的关键酶是 。 (2)通过PCR扩增基因R、r、T时，需要设计引物，一般来说，设计的引物长度越短，引物特异性越 （填“强”或“弱”）。PCR的缓冲液中一般都要加入Mg2+，目的是 。 (3)根据图1可知，抗病萝卜品系P1中基因T插入的染色体是 ，该品系自交所得F1①②③代表的植株表型及比例为 。 (4)抗病萝卜品系P2自交后代结果表明基因R/r与基因T位于 （填“同源染色体”或“非同源染色体”）上，图2中②代表的植株在F1中所占的比例为 。 56．（2025·安徽·三模）玉米是我国种植面积最大、总产量最高的作物，但在生产上，玉米常因感染禾谷镰孢菌患玉米茎腐病，使得产量大大减少。研究发现植物LOBI基因在响应病原侵染中具有重要作用，为探究玉米中的LOBI基因是否具有相同作用，某研究团队将玉米中的LOBI基因连接到强启动子上，并通过下列途径获得转基因玉米植株，回答下列问题:    (1)步骤③农杆菌转化法的原理是:农杆菌细胞内含有 质粒，当农杆菌侵染植物细胞后，该质粒上的 可以转移到被侵染的细胞，并且 。 (2)步骤①在构建基因表达载体时，应优先选用的限制酶是 和 ，使用双酶切的优点在于 。 (3)步骤④将浸泡过含有农杆菌溶液的玉米愈伤组织进行植物组织培养时，需要用到的植物激素有 ，除此之外培养基中需加入 ，筛选出的愈伤组织经再分化过程形成丛芽，最终获得转基因玉米植株。 57．（2025·重庆·三模）基因工程中的启动子实际包含了基本启动子和增强子两个基因元件，基本启动子本身不足以启动基因表达（图A），只有基本启动子上游或下游存在增强子时，才能开启转录（图B）。科学家想要捕获斑马鱼体内的增强子，制作了“增强子侦察元件”，包含了基本启动子、报告基因和终止子（图A），并把侦察元件转入受精卵，侦察元件会随机插入基因组中。 (1)增强子是 （有/没有）遗传效应的DNA片段。根据图C分析，为了捕获增强子，筛选后代的标准是 。 (2)筛选具有某种特征的后代后，将其基因组随机打断成较大的碎片，并纯化分离。为了将其中具有报告基因的碎片挑选出来，可以采用PCR技术检测，应选用的引物组合（图D中挑选）是 。电泳结果若有条带，则说明电泳结果所对应的DNA碎片含有 。 (3)为了对增强子测序，需要大量的含增强子的DNA序列。将选出的碎片环化处理，并选择引物组合（图D中挑选） 进行PCR。再对扩增产物进一步测序，即可获得增强子DNA序列。 (4)人类已经完成斑马鱼全基因组测序，实验方法可以改进。研究者对图A所示侦察元件进行了改造，期望改造后的元件随机插入基因组后，在“侦察”增强子的同时，也造成该增强子原本所调控的基因发生突变，失去功能。研究者找到能表达报告基因的个体，分析突变基因，对照全基因组序列，即可快速定位增强子位置获取增强子序列。请画图表示改造后的载体，并标出各部分名称 。 58．（2025·河北沧州·三模）作物抗性的提高和产量的提高往往难以兼顾，在不损失作物产量的前提下，提高其抗逆性是一个长期性的挑战。我国科学家利用逆境诱导型启动子OsNAC6调控水稻锌指蛋白在高盐胁迫下的表达，实现了作物在干旱条件下的产量提升。回答下列问题： (1)高盐胁迫下， 才可以与OsNAC6结合，进而合成锌指蛋白。下图为OsNAC6与锌指蛋白基因融合后的结构及相应限制酶切割位点示意图，其转录的模板链为a链，则在体外扩增融合序列时，应选用的引物是 ，1个融合序列在体外扩增n次需要 个引物。 (2)利用图2所示质粒构建基因表达载体，欲通过荧光定量分析锌指蛋白基因的表达情况，则需在图1融合序列上游和下游引物的 （填“3'”或“5'”）端分别添加限制酶 对应的序列，并选用XhoI和MunI切割质粒来得到所需黏性末端，这样做的目的是 （答出2点）。 限制酶 识别序列 XhoI 5'-C↓TCGAG-3' 3'-GAGCT↑C-5' MunI 5'-C↓AATTG-3' 3'-GTTAA↑C-5' SalI 5'-G↓TCGAC-3' 3'-CAGCT↑G-5' EcoRI 5'-G↓AATTC-3' 3'-CTTAA↑G-5' NheI 5'-G↓CTAGC-3' 3'-CGATC↑G-5' (3)将重组质粒导入水稻体细胞常用的方法是 。为检测重组质粒是否导入水稻细胞，研究人员进行了如下实验： 组别 项目 A B C D 细胞类型 非转基因细胞 转基因细胞 非转基因细胞 转基因细胞 培养液 正常培养液 ① 荧光检测 ①的处理应为 。若检测结果为 ，则说明导入成功。 59．（2025·黑龙江大庆·三模）胶原蛋白广泛应用于食品、医疗、美容等领域。利用基因工程生产的胶原蛋白组织相容性极好，对细胞生长及伤口愈合等都有显著效果，是现代生物医药材料的开发重点。科学家将编码胶原蛋白的基因SUMO-hCOL1A 1导入大肠杆菌中构建基因工程菌，过程如图。请回答以下问题： (1)从组织细胞中提取胶原蛋白mRNA，通过 过程获得cDNA，该cDNA中 （填“含有”或“不含有”）终止子。 (2)为了能对基因SUMO-hCOL1A 1与质粒pET21a（+）进行双酶切，以构建重组质粒pET21a（+）-SUMO-hCOLIA 1，采用PCR技术扩增基因SUMO-hCOL1A 1时，应将 （填限制酶）识别序列加在引物的 （填“5'”或“3'”）端。 (3)构建重组质粒pET21a（+）-SUMO-hCOL1A 1时，目的基因会与质粒上长度为150bp的片段发生置换。质粒pET21a（+）和重组质粒pET21a（+）-SUMO-hCOL1A 1在HindⅢ酶切后获得的片段如下表所示（每种片段各1个）： 质粒类型 pET21a（+） pET21a（+）-SUMO-hCOL1A1 酶切获得片段 1800bp、3750bp 550bp、2200bp、4050bp 则基因SUMO-hCOL1A 1上有 个HindⅢ的酶切位点，该基因长度为 bp。 (4)将重组质粒导入先用 处理的大肠杆菌中，并接种在含氨苄青霉素的培养基中培养。 (5)为验证基因工程菌是否构建成功，提取上述基因工程菌质粒，利用（2）中的限制酶对其进行双酶切，产物进行电泳，结果如下图。初步分析可知，基因工程菌的构建 （选填“成功”或“不成功”），理由是 。 60．（2025·青海海东·三模）小白鼠的红眼对黑眼为显性，分别由等位基因R/r控制，其长尾和短尾由另一对等位基因M/m控制。现用一只红眼长尾雄鼠和一只黑眼短尾雌鼠作亲本杂交，F1中红眼长尾：黑眼短尾：红眼短尾：黑眼长尾约为1：1：1：1。不考虑X、Y同源区段，回答下列问题： (1)F1的实验结果能否说明R/r、M/m的遗传遵循自由组合定律？说明理由： 。 (2)若长尾对短尾为显性，则两对等位基因位于染色体中的情况可能为 。 (3)经检测，现已确定短尾对长尾为显性，兴趣小组将F1红眼短尾雌雄鼠相互交配，若子代出现 ，则两对等位基因位于两对常染色体上。 (4)平滑肌细胞（SMC）是哺乳动物血管壁的重要组成部分，其功能产生障碍会导致主动脉瘤的发生。研究人员为开发特异性标记血管SMC的方法，开展了相关研究。为获得血管SMC被特异性标记的工具鼠并用于研究，研究人员进行了下列实验，利用转基因技术分别获得含一个CE基因的转基因A鼠、含一个Stop基因和一个tdT基因的转基因B鼠（CE基因所在染色体和Stop、tdT基因所在染色体为非同源染色体），将A鼠和B鼠杂交，如图所示。 ①A鼠和B鼠杂交后获得同时含有以上三种基因的CE杂合小鼠C，其所占比例为 。 ②在外源药物T的诱导下，定位于细胞质中的雌激素受体进入细胞核中，Cre重组酶能导致loxP位点间的序列丢失。根据题意，用药物T饲喂小鼠C后，可观察到SMC 。 61．（2025·四川成都·三模）酵母细胞中的转录因子GAL4，含有与DNA结合的BD蛋白和激活DNA转录的AD蛋白，二者在空间上接近时，才能激活相关基因的转录。利用该原理(如图甲)，可以研究两种蛋白质(“诱饵”蛋白和“猎物”蛋白)是否具有相互作用。通过构建基因表达载体将“诱饵”蛋白与BD融合、“猎物”蛋白与AD融合，如果“猎物”蛋白与“诱饵”蛋白能相互作用，在酵母菌细胞中形成“诱饵蛋白—猎物蛋白”复合物时，AD与BD在空间上接近，就可以激活相关基因(这个被激活的、能显示“诱饵”和“猎物”相互作用的基因称之为“报告基因”)的转录。为了探究植物细胞中钙调蛋白(CaM)是否与激酶(CDPK1)相互作用，科研人员利用图乙所示的质粒和目的基因构建基因表达载体，图乙中限制酶的识别序列依次为Ⅲ、Ⅰ、Ⅰ、Ⅴ。回答下列问题： (1)研究人员采用PCR扩增CaM基因，PCR是根据DNA 的原理在体外大量扩增目的基因的技术。为了使扩增后的CaM基因经相关限制酶切割后能够准确插入图乙的AD质粒中，所用引物的5'端需要分别添加序列为5' - - 3'和5' - - 3'。 (2)该研究除了构建CaM - AD重组质粒外，还需要构建另一种重组质粒(简称X重组质粒)，该重组质粒需要保证插入的 基因与BD质粒中的 基因能正确表达出所需要的融合蛋白。两种重组质粒构建好后，需要将它们导入 (填“1”或“2”)个酵母菌细胞中进行表达。 (3)组氨酸、色氨酸、亮氨酸、腺嘌呤是酵母菌生存必需的营养物质，该实验用的酵母菌由于基因异常不能合成上述营养物质。研究人员将AD质粒、BD质粒、CaM - AD重组质粒、X重组质粒按照不同组合导入这种缺陷酵母菌(“＋”代表“导入”“－”代表“未导入”)，再接种到相应的平板上培养，一段时间后观察到的菌落情况如图丙所示。 已知BD质粒中含有控制亮氨酸合成的基因，根据图丙中菌落情况推测，报告基因为控制营养物质 合成的基因。实验结果显示CaM与CDPK1 (填“能”或“不能”)相互作用，理由是 。该实验设置第二组和第三组的作用是 。 62．（2025·湖北·三模）磷脂酸（PA）是调节植物生长发育和逆境响应的重要信使物质。为了解植物细胞中PA的动态变化，研究人员用无缝克隆技术将高度专一的PA结合蛋白（PABD）基因与绿色荧光蛋白（GFP）基因融合，构建有效监测细胞PA变化的荧光探针，并测定拟南芥细胞内PA含量。无缝克隆技术连接DNA片段的机理和构建荧光探针表达载体的过程如图所示，请回答下列问题。 注：bar为草胺膦抗性基因；Kanr为卡那霉素抗性基因。 (1)无缝克隆时，T5核酸外切酶沿 （填“5′→3′或“3′→5′”）的方向水解DNA形成黏性末端。 (2)过程②两个片段复性后存在一段“缺口”的原因是过程①形成的黏性末端 （填“大于”“等于”或“小于”）互补配对的区段（同源序列），过程③所需的酶有 。 (3)与传统的酶切再连法相比无缝克隆技术构建重组质粒的优点有____。 A．不受限制酶酶切位点的限制 B．不会引入多余碱基，不会出现移码突变 C．操作相对简单，成功率高 D．不需要使用PCR技术扩增目的基因 (4)PCR扩增PABD基因时需依据 的核苷酸序列设计引物R1。据图分析扩增目的片段的所用的引物F1和R2可对应下表中的 （填序号）。 ① 5′-TCCGGACTCAGATCTCGAGC-3′ ② 5′-AGCTATAGTTCTAGATCTAGATTAACTAGTCTTAGTGGCGTC-3′ ③ 5′-TATCGATGGCGCCAGCTGAGGATGGTGAGCAAGGGCGA-3′ ④ 5′-GCTCGAGATCTGAGTCCGGACTTGTACAGCTCGTCCA-3′ (5)利用农杆菌花序侵染法转化拟南芥，将获得的种子进行表面消毒，均匀铺在含有 的MS培养基上进行筛选和鉴定，将筛选得到的种子种植可得到转基因拟南芥，通过观测转基因拟南芥根尖细胞中 ，了解PA的分布和含量。 63．（2025·江苏常州·三模）水稻是全球最重要的粮食作物之一，提高其光合作用效率对于保障粮食安全具有重要意义。近年来，科学家们通过基因工程技术将蓝藻中的相关基因导入水稻，以提高其光合效率和产量。回答下列问题： (1)扩增目的基因。研究人员需要根据 序列设计引物；在PCR反应前，在微量离心管中加入原料、酶等成分后离心，其目的是 ；适当提高退火温度可以提高PCR扩增的特异性，原因是 。 (2)构建并鉴定重组质粒。表达载体与含目的基因的DNA片段如图1所示，据图分析，用一种限制酶与DNA连接酶构建重组质粒时，应选择的限制酶是 。完成构建后，取样、鉴定质粒时，选用限制酶 （填“E”或“B”或“H”或“X”）进行完全酶切并电泳，电泳时需要根据 的移动掌控电泳进程，电泳结果如图2所示：图2中出现结果Ⅰ的原因是 ，出现结果Ⅱ、Ⅲ的原因是 。最后，根据电泳结果，筛选出正确的重组质粒。 64．（2025·江苏盐城·三模）持续和大量施用有机磷化合物会严重威胁人畜健康及生态环境，科研人员从邻单胞菌中发现甲基对硫磷水解酶基因mpd，其表达产物MPD能够高效水解无色的甲基对硫磷并且生成亮黄色的对硝基苯酚。将mpd导入枯草芽孢杆菌制备优质菌种，构建表达载体的主要过程如下图所示，请回答下列问题: (1)过程①采用重叠延伸PCR的方法获得启动子PytkA与信号肽SPnprB的融合基因，除了图示的条件外，扩增PytkA时还需要的条件还有 ，设计引物R2的依据有 。P2、R1对应于下面的4个引物中的 。最终要获得大量PytkA＋SPnprB融合片段，需要用图中引物 进行PCR。 a.5′GCGGGATCCTTTTTTGTGACG—3′ b.5′－GAAAGGTGATGGCATGCGCAACTTGACCAAG－3′ c.5′－CTTGGTCAAGTTGCGCATGCCATCACCCTTTC－3′ d.5′－GCGCTGCAGCTGAGGCCATG－3′ (2)过程③构建表达载体时，需要用 酶切PytkA＋SPnprB＋mpd融合片段与载体1，再用DNA连接酶连接，将重组表达载体导入处于感受态的大肠杆菌，接种于含有 的培养基中37℃培养。 (3)提取构建成功的表达载体，导入枯草芽孢杆菌，需要接种于含有 的培养基，出现 ，说明得到能成功表达的细胞。 (4)研究人员进一步用A、B两种不同的启动子构建表达载体，探究它们对菌体增殖和mpd基因表达的影响，结果如图2，实际生产中应采用 ，理由是 。 65．（2025·陕西安康·三模）疫霉菌感染会造成辣椒严重减产，水杨酸（SA）可以抵御疫霉菌感染。科研人员测定了辣椒叶片中的SA含量，结果如图1所示。P酶催化合成SA，H蛋白能促进P基因表达P酶。回答下列问题： (1)红光可作为一种 作用于光敏色素，进而调控植物的生长发育。据图5分析，两种不同光处理后，辣椒感染程度低的是 （填“白光”或“红光”）处理组，理由是 。 (2)科研人员推测H蛋白通过特异性结合P基因的启动子来促进P基因表达，为验证上述推测，科研人员开展相关研究，实验组部分过程如图2所示。结果显示，与对照组相比，实验组转基因植株荧光强度更高。质粒1上的甲、质粒2上的乙分别是 （填“H”或“P”）基因的启动子、 （填“H”或“P”）基因。 (3)结合以上研究，请提出一种减少疫霉菌感染造成的减产的措施： 。 66．（2025·甘肃白银·三模）抗菌肽（AMPs）作为抗生素替代物，具有广谱抗菌活性及不易使细菌产生耐药性等优点。研究者欲利用改造后的大肠杆菌（工程菌）生产AMPs。回答下列问题： (1)用PCR扩增目的基因M时，设计的特异性引物有 种。 (2)AMPs也会抑制大肠杆菌，造成组成型表达（持续表达）目的基因M的大肠杆菌最大种群数量偏低，限制了AMPs产量。研究者在大肠杆菌基因组DNA中插入N和C基因，使质粒上目的基因M的表达受到红光控制。红光调控目的基因M表达的原理如图所示。 N和C基因表达应为 （填“组成型表达”或“红光诱导型表达”）。据图阐述红光调控目的基因M的表达过程： 。 (3)为避免工程菌泄漏污染环境，研究者利用阻遏蛋白基因和调控元件，使工程菌在红光和蓝光同时照射时，激活致死基因G表达，从而诱导工程菌死亡。完善工程菌生产AMPs步骤。 ①在黑暗条件下培养工程菌至种群数量达到最适值（K值）。 ② 照射至AMPs浓度在培养液中达到适宜浓度（生产需求量）。 ③ ，避免工程菌泄漏。 67．（2025·四川成都·三模）“生物钢”是一种蛛丝蛋白，其强度是钢的45倍，且有蚕丝般的柔软和光泽，在纺织、医疗等多领域具有广阔的应用前景。科学家从蜘蛛中获取蛛丝蛋白基因并将其植入山羊体内，使得羊奶中含有蛛丝蛋白，再利用特殊的纺丝技术，将羊奶中的蛛丝蛋白纺成丝。回答以下问题：    注：①图1为蛛丝蛋白基因DNA片段结构示意图；②图2是基因工程中所使用的载体示意图，图中KpnⅠ、XbaⅠ、EcoRⅠ均表示相应限制酶识别位点；③蛛丝蛋白基因转录的模板链位于b链（图3中标识b链碱基序列）。 (1)为使目的基因与载体正确连接，利用PCR技术获取和扩增蛛丝蛋白基因时所需要的两种引物的序列分别为 、 （注意标明端和端）。 (2)若要构建A山羊乳腺生物反应器，则受体细胞常选择 ，同时结合基因表达载体结构组成分析，载体中P应为 ，其功能是 。 (3)研究人员发现，若将蛛丝蛋白31号位的色氨酸替换为酪氨酸（注：色氨酸的密码子为UGG：酪氨酸的密码子为UAC和UAU）；蛛丝韧性可提高50%。研究人员欲利用大引物PCR技术对蛛丝蛋白基因进行定点诱变（过程见图3），则拟突变位点对应的基因结构为 （标明端和端）。第一次PCR的产物DNA中碱基序列与b链 （填“相同”或“互补”）的链作为第二次PCR所用的引物。与X射线诱变相比，该突变技术的优点是 （答出一点即可）。 (4)培育转基因山羊涉及的生物工程技术包括 （答出两种），为检测转基因山羊是否成功表达蛛丝蛋白基因，请写出检测思路： 。 68．（2025·陕西·三模）同源重组基因敲除技术是将同源DNA 片段导入受体细胞，利用同源 DNA 片段的互换，用其他DNA 片段在原有位置替代靶基因，从而实现基因的敲除。米曲霉产生的曲酸具有抗菌性、抗氧化性等抗逆能力，具有重要的应用价值。为提高米曲霉产曲酸能力，科研人员用同源重组基因敲除技术成功敲除了米曲霉3.042 菌株中的msn2基因，获得高产的g-5菌株。其部分机理如图1所示（bp表示碱基对）。 (1)构建基因敲除框需要的工具酶有 ，将基因敲除框导入米曲霉细胞常用的方法是 。 (2)科研人员选取进行基因敲除操作后的3个菌落，分别提取其DNA，选择图中引物 进行PCR扩增，电泳结果如图2 所示。根据1号菌落电泳结果可得出的结论是 。为进一步验证3号菌落为目的菌落，需要选择图中引物 重复上述操作。 (3)米曲霉的曲酸产量与其对逆境的敏感性有关，tpsⅠ基因表达产物可以降低米曲霉对逆境的敏感性。推测tpsⅠ基因表达产物与曲酸合成的关系是 。为验证该推测，可采用的实验方法是 ，预期实验结果是 。 69．（2025·辽宁·三模）蛋白酶抑制剂基因转化是作物抗虫育种的新途径。某研究小组拟将胰凝乳蛋白酶抑制剂（StPinlA）的基因插入胰蛋白酶抑制剂（NaPI）基因的表达载体中，并对棉花进行共同转化，使其在棉花细胞中表达NaPI-StPinlA融合蛋白，从而获得转基因植株，过程如图1所示。回答下列问题： 限制酶 识别序列及切割位点 BamHI 5'-G↓GATCC-3' EcoRI 5'-G↓AATTC-3' HindIII 5'-A↓AGCTT-3' DraIII 5'-CAC↓GTG-3' StuI 5'-AGG↑CCT-3' (1)扩增StPinlA基因时，可选择图1中的一对引物是 ，StPinlA基因上无限制酶的识别序列，为了使扩增后的StPinlA基因能够与Ti质粒上的NaPI基因正确连接，用PCR技术扩增StPinlA基因时，需要设计合适的加端引物，依据图1及表的信息推测，引物E-F包含的碱基序列为5'- （写出12个碱基序列）-3'。 (2)为了使连接后的重组基因NaPI-StPinlA能够表达出融合蛋白，设计时应考虑剔除NaPI基因中的终止子序列、 及NaPI基因中终止密码子对应的碱基序列，剔除NaPI基因中终止密码子对应的碱基序列的目的是 。 (3)将构建好的重组Ti质粒导入农杆菌中进行转化，并将农杆菌涂布在含有 的固体培养基上，从而选择出生长正常的菌落中的农杆菌与棉花的叶肉细胞共培养。在愈伤组织阶段取部分细胞提取总DNA进行PCR和凝胶电泳，此操作的目的是 ，取细胞A、 B、C、D中的DNA扩增后的电泳结果如图2所示，其中成功导入重组基因NaPI-StPinlA的细胞是 。 70．（2025·四川南充·三模）乙偶姻是一种天然存在于多种食品中的化合物，常被用作食品添加剂和防腐剂。当前，生物法制备乙偶姻主要以糖类为底物，从微生物发酵液中提取乙偶姻，其代谢途径如图1。 为了得到高产乙偶姻的菌株，科学家构建了budC基因敲除的枯草芽孢杆菌，构建流程如图2。 注：1）F1、F2、R1、R2表示引物，Ampr为氨苄青霉素抗性基因，Kanr为卡那霉素抗性基因，Tetr为四环素抗性基因。2）同源重组是指两个DNA分子的相同区域之间发生的交换和重组。 (1)PCR过程中，每次循环可分为 三步，扩增budC基因下游片段时引物中需分别添加 的酶切位点。 (2)为筛选出目的菌株（即含有完整重组质粒的枯草芽孢杆菌），请完善以下内容： 序 步骤内容 结果及结论 1 将经图中③处理的枯草芽孢杆菌接种到含氨苄青霉素的培养基上培养，一段时间后，培养基上出现单菌落。 ，说明该单菌落的菌株即为目的菌株。 2 将 培养一段时间，观察培养基上是否有菌落生长。 (3)为检测枯草芽孢杆菌budC基因敲除是否成功，研究人员提取（2）小题筛选出的枯草芽孢杆菌的5个菌株的基因组，然后用引物F1和R2进行扩增并电泳，结果如图3。根据电泳结果能判断budC基因敲除成功，原因是 。 (4)将budC基因敲除成功的枯草芽孢杆菌经过优化后投入到工厂中进行乙偶姻的生产，请在图4中补充发酵产乙偶姻的基本步骤 、 。 71．（2025·浙江嘉兴·三模）在水稻品种改良中，CRISPR-Cas9基因编辑技术具有重要价值。技术路线主要步骤是：选择目标基因→设计sgRNA→构建sgRNA-Cas9复合体→转移到水稻细胞内。在sgRNA的引导下，对目标基因进行编辑。已知：野生型水稻易感病（基因型为aaBB）；基因A使水稻抗稻瘟病；基因B介导感病反应信号途径；A/a、B/b两对基因独立遗传。回答下列问题： (1)获得抗稻瘟病水稻的方法之一是导入A基因，以期获得基因型为 的纯合水稻。也可以通过 基因B介导的感病反应途径来获得抗稻瘟病水稻。 (2)科研人员首先设计一段与 互补的sgRNA，构建sgRNA-Cas9复合体，对野生型水稻进行基因敲除，将获得的水稻（P）种植，表现为易感稻瘟病。让其自交，F1中大部分易感稻瘟病，少部分抗稻瘟病。亲本（P）的基因型是 （注：原有基因被敲除后，在原有基因字母右上方写上“-”表示，如a-、B-）。 (3)利用基因编辑技术敲除水稻相关基因，该过程会导致水稻的遗传多样性 。从进化的角度讲，这种变异为生物进化提供了 。在基因编辑过程中，可能会出现对非目标基因进行了编辑，最可能的原因是 。 (4)基因编辑产物可能会通过杂交转移到其他植物，这种现象属于 （填“遗传漂变”或“基因漂移”），这种基因污染可能导致生物多样性降低，因此我们必须在创新与 之间寻求平衡。 72．（2025·四川达州·三模）启动子包括不同类型、其中组成型启动子可以高效地启动目的基因在植物各种组织中的表达、但带会阻碍植物的生长发育、诱导型启动子可在特定环境条件下诱导目的基因的表达。沙冬青脱水素基因（AmDHN某因）能使梢株具有较强的抗旱作用。科研人员通过构建AmDHN基因表达载体、以培育耐旱苔药新品种。请分析并回答下列问题： 限制酶 识别序列和切割位点 Bcll T↓GATCA Sac l GAGCT↓C BamH1 G↓GATCC Pst 1 CTGCA↓G Sma 1 CCC↓GGG (1)用如图所示载体1构建含AmDHN目的基因的表达载体，可以成功转化苜蓿，但会出现抑制芽生长和植株生根的现象，推测35S启动子属于 启动子，其基本组成单位是 ，能识别35S启动子的酶是 。 (2)为了弥补这一缺陷，科研人员将载体1中的35S启动子替换成诱导型的Rd29A启动子，得到载体2。载体2除启动子外其他部分均与载体1相同。下图是科研人员用PCR技术扩增AmDHN基因时所设计的引物，根据引物的碱基序列及限制酶的识别序列分析，将AmDHN基因与载体2正确连接应选用的限制酶是 ，酶切后再利用 酶将AmDHN 基因拼接到载体2的切口处。 上游引物P1：5'-GACCCGGGTTTCCAAAGATTTTTTTC-3' 下游引物P2：5'-GAGAGCTCTGGGGTTTTGCTTTTGAATGT-3' (3)拼接好的重组载体应先转入 中，再转化苜蓿。在苜蓿培养基中添加 筛选转化成功的愈伤组织，再通过 过程获得苜蓿植株。 (4)为检测转基因苜蓿中AmDHN基因的转录水平，挑选10株转基因植株幼苗，平均分成2组，分别将幼苗根系用自来水和等量20%PEG溶液处理8h，20%PEG处理的目的是 。8h后利用逆转录PCR和电泳技术检测AmDHN基因和MtActin基因（一种骨架蛋白基因，在各种细胞中表达都相对恒定）的表达水平，结果如下图所示，结果表明 。 蛋白质工程考点03 一、单选题 1．（2025·安徽·三模）蛋白质组指某个时刻，某个组织、器官或个体中所有蛋白质的集合。中国科学家率先倡导并领衔了人类第一个器官（肝脏）国际蛋白质组计划（HLPP），构建了人类第一个器官（肝脏）蛋白质组图谱，有利于揭示肝病的发病机制和病理过程，可发现新型诊断标志物、治疗和创新药物，全面提高疾病防治水平。下列叙述正确的是（　　） A．肝细胞中的核糖体、线粒体均直接参与蛋白质的合成过程 B．特定时间、空间的蛋白质组能够表征人体是否处于某种疾病状态 C．肝脏与其他器官蛋白质组图谱有差异的原因是基因组图谱有差异 D．人体每个器官都拥有一张蛋白质组图谱，且保持终身不变 2．（2025·浙江·三模）人胰岛素分子容易聚合导致药效降低，可采用下图所示的PCR技术改造人胰岛素基因。下列说法错误的是（    ） A．改造前后人胰岛素基因热稳定性基本不变 B．PCR过程经过2轮循环即可得到目标基因 C．图中两条子链的方向不同由引物不同决定 D．通过电泳检测PCR产物不能确定基因是否改造成功 3．（2025·四川成都·三模）某团队为提升猪α干扰素(PoIFN－α)的抗病毒活性，针对其8个关键氨基酸位点进行改造，构建突变体PoIFN－α 8s。测序显示，改造后的DNA非模板链序列第5位点由“TAC”突变为“TGC”，导致编码的氨基酸由酪氨酸变为半胱氨酸，其余位点突变未改变氨基酸种类。下列分析错误的是（    ） A．提升猪α干扰素的抗病毒活性是通过改造基因来完成的 B．密码子AUG、ACG决定的氨基酸依次是酪氨酸、半胱氨酸 C．第5位点突变可能导致猪α干扰素的空间结构发生改变 D．其余位点突变未改变氨基酸种类与密码子的简并性有关 4．（2025·黑龙江大庆·三模）据统计，每年全球约10万人死于蛇毒。眼镜蛇毒液中的三指毒素（3FTxs）本质为蛋白质，可与人体的烟碱乙酰胆碱受体结合，干扰正常的神经传导，迅速引发肌肉瘫痪、呼吸衰竭和组织坏死。2024年诺贝尔化学奖获得者DavidBaker教授研究团队用AI技术结合蛋白质工程获得了热稳定性高的迷你蛋白（S），可与3FTxs的关键区域结合，消除毒性。下列说法错误的是（    ） A．S在高温下仍能保持折叠结构和活性，更利于运输和存储 B．S较普通抗体小，组织渗透性强，可快速起效 C．S与细胞因子、溶菌酶等均属于免疫活性物质 D．S与3FTxs高度亲和，可有效阻止毒素与神经递质受体结合 5．（2025·甘肃白银·三模）为提高玉米品质，研究者将赖氨酸的密码子AAA改造成玉米偏好的密码子AAG，并将富含赖氨酸（AAG）的蛋白质编码基因导入玉米，使原有的蛋白质编码基因被改造，获得了富含赖氨酸的转基因玉米。此过程发生的变化有（    ） A．转基因玉米细胞中基因的表达过程发生改变 B．富含赖氨酸的蛋白质编码基因转录形成的mRNA增多 C．富含赖氨酸的蛋白质编码基因的核苷酸序列发生改变 D．富含赖氨酸的蛋白质的氨基酸排列顺序发生改变 二、解答题 6．（2025·四川德阳·三模）目前用于治疗人类疾病的单克隆抗体大多数是鼠源单抗，人体对鼠源单抗有一定的排斥反应。科研人员根据抗体的结构特点对鼠源单抗进行改造，思路如图甲。获得相关基因后，利用PCR技术进行融合得到目的基因，将其与乳腺细胞表达载体PBCI构建形成重组DNA分子。目的基因，表达载体PBCI的结构如图乙所示。请回答下列问题： 注：P1为山羊乳腺中特异表达的基因启动子，P2为四环素诱导启动子（必须在四环素存在时才能起作用）；限制酶Mbol、Xbal、Scal的识别序列均不相同 (1)图甲所示的抗体改造思路属于 工程的范畴。 (2)构建重组DNA分子时，应选择限制酶 切割目的基因与PBCI载体，以便目的基因正确插入质粒并后续通过荧光检测进行筛选。 (3)通常将重组DNA分子导入小鼠的 （填细胞名称），在培养液中加入 后，发出 色荧光的即为目标细胞，再经过 工程获得大量转基因小鼠。 (4)通过 技术和凝胶电泳技术检测小鼠细胞中的目的基因，再通过 技术检测转基因小鼠乳汁中的改造抗体水平。检测结果发现：目的基因含量正常而相应的mRNA含量很少，改造抗体水平也较低。结合题中信息，原因最可能是 。 7．（2025·河南·三模）T4溶菌酶耐热性差，不利于工业化应用，科研工作者借助PCR定点突变技术（见图1）改造T4溶菌酶基因，并将改造的基因与质粒（见图2）重组后导入大肠杆菌，最终获得耐高温的T4溶菌酶。回答下列问题。 (1)获得耐高温的T4溶菌酶的过程属于 工程范畴。对T4溶菌酶基因的改造离不开PCR技术，该技术的原理是 。图1中，由杂交产物延伸形成全长T4溶菌酶突变基因的过程② （填“需要”或“不需要”）添加引物。 (2)研究发现，Taq酶在PCR反应结束时，往往会自动在产物的3＇末端添加一个核苷酸“A”，如图2所示。先选用特定限制酶对质粒进行酶切，然后使用末端转移酶，在切口处加入一个核苷酸“T”，用DNA连接酶就能将目的基因与质粒连接起来。为了达成目的，现有3种限制酶（酶切位点如图2），应选用 （填酶名称）对质粒进行酶切。但使用该种方法构建重组质粒会遇到插入的目的基因 （“自身环化”或“反向连接”）的问题。 (3)将受体菌接种在含 的培养基上培养，一段时间后，颜色为 色的菌落即为成功导入重组质粒的受体菌。 三、实验题 8．（2025·湖南常德·三模）淀粉经淀粉酶催化水解后的产物是重要的工业原料，但工业化生产常需要在高温条件下进行，而现有的淀粉酶耐热性不强。科研人员发现将淀粉酶（AmyS1）第27位的亮氨酸替换为天冬氨酸后，能产生耐热性高的淀粉酶（AmyS2）。科研人员利用蛋白质工程设计并人工合成了AmyS2基因，将其导入芽孢杆菌，过程如图1所示。最终结果表明，与导入质粒B相比，导入质粒C的芽孢杆菌的培养液中更易获得并提纯AmyS2.回答下列问题： (1)科研人员利用蛋白质工程对淀粉酶（AmyS2）进行了如下改造：预期AmyS2的功能→设计AmyS2的结构→设计AmyS2的 →人工合成AmyS2基因的 序列→将获得的AmyS2基因导入芽孢杆菌生产AmyS2. (2)根据图2分析，利用PCR技术扩增AmyS2基因时，应选择甲、乙、丙、丁四种引物中的 。若将该基因扩增过程中至少经过 次循环，可获得32个符合要求的目的基因。 (3)将AmyS2基因与原始质粒A构建成质粒B，应选择的限制酶是 ；将质粒B与信号肽基因构建成质粒C，应选择的限制酶是 。在工业生产中，使用导入质粒C的工程菌生产α-淀粉酶时，更容易从培养液中获取并提纯目标蛋白质，据此推测，信号肽的功能可能是 。 (4)芽孢杆菌细胞内的bp基因会表达出一种胞外蛋白酶，导致胞外α淀粉酶被降解。科研人员利用基因编辑技术敲除芽孢杆菌的bp基因，构建能高效表达α淀粉酶的工程菌。利用PCR技术可以检测bp基因是否被成功敲除，请简述实验设计思路： 。 9．（2025·四川眉山·三模）t-PA 蛋白能高效降解血栓，是心梗和脑血栓的急救药。然而，为心梗患者注射大剂量的 t-PA会诱发颅内出血。研究证实，将 t-PA 蛋白第 84 位的氨基酸替换后，能显著降低出血副作用。请回答下列问题： (1)获得能显著降低出血副作用的t-PA 改良蛋白的正确顺序是 （选择正确的编号并进行排序）。 ①t-PA蛋白功能分析和结构设计 ②借助易错 PCR 技术对t-PA 基因进行随机突变 ③借助定点突变改造t-PA 基因序列 ④检验t-PA 蛋白的结构和功能 ⑤设计t-PA 蛋白氨基酸序列和基因序列 ⑥利用工程菌发酵合成t-PA 蛋白 (2)改造t-PA 基因序列可以利用如图 1 、2 所示的基因定点突变技术。图 1 表示重叠延伸 PCR 技术，其中第 1 对引物是指 ，两对引物参与的 PCR过程不能在同一反应系统中进行，原因是 。不选择产物 A 进一步延伸的原因是 。 (3)图 2 表示 CBE 单碱基编辑系统，该系统由三个元件构成，其中“dCas9 蛋白+胞苷脱氨酶”在 sgRNA的引导下，对结合区域第 4-8 位点的碱基 C 脱氨反应变成 U ，最终实现 C→T 的不可逆编辑。过程② （发生/未发生）磷酸二酯键的断裂和形成。CBE 单碱基编辑系统将靶位点胞嘧啶脱氨基后，细胞复制 次，子代 DNA 中靶位点碱基对由C-G 彻底替换成 A-T ，实现单碱基编辑。 (4)图 3 分别表示通过基因定点突变技术获得并酶切后的t-PA 改良基因、质粒 pCLY11与一些限制酶的识别序列和酶切位点。要想将t-PA 改良基因与质粒 pCLY11 高效连接，需用限制酶 切割质粒。 (5)LacZ 基因编码产生的半乳糖苷酶可以分解 X-gal 产生蓝色物质，使菌落呈蓝色，否则菌落为白色。将转化后的大肠杆菌接种在含有 的培养基上进行筛选，含重组质粒的大肠杆菌应具有的菌落特征是 。 试卷第1页，共3页 2 / 2 学科网（北京）股份有限公司 学科网（北京）股份有限公司 学科网（北京）股份有限公司 学科网（北京）股份有限公司 $$ 专题15 基因工程 考点概览 考点01 重组DNA技术的基本工具 考点02 基因工程的基本操作程序和应用 考点03 蛋白质工程 重组DNA技术的基本工具考点01 一、单选题 1．（2025·山西·三模）某研学小组实验时出现了异常现象，他们对实验进行了改进。下列改进措施错误的是（　　） 异常现象 改进措施 ① 用质量浓度为0.5g/mL的蔗糖溶液观察不到洋葱质壁分离复原现象 将质量浓度为0.5g/mL的蔗糖溶液更换成质量浓度为0.3g/mL的蔗糖溶液 ② 用95%的酒精、二氧化硅和碳酸钙提取新鲜菠菜绿叶中的色素时提取液颜色偏浅 在95%的酒精中加适量无水碳酸钠 ③ 用2mol/L的NaCl溶液提取新鲜洋葱DNA并用二苯胺试剂检测时蓝色偏淡 将2mol/LNaCl溶液更换成1mol/L ④ 用光学显微镜观察蝗虫卵巢看不到减数分裂各时期细胞 换用蝗虫精巢为实验材料重复实验 A．① B．② C．③ D．④ 【答案】C 【分析】一般来说，雄性个体产生的精子数量远远多于雌性个体产生的卵子数量，因此在选择观察减数分裂的材料时，要选择分裂旺盛的雄性个体生殖器官，如动物卵巢，植物花药。在动物卵巢内的减数分裂没有进行彻底，排卵时仅仅是次级卵母细胞，只有和精子相遇后，在镜子的刺激下，才继续完成减数分裂Ⅱ，所以要完整观察减数分裂各时期的图像，特别是减Ⅱ分裂图像，一般不选择雌性个体的生殖器官。 【详解】A、用质量浓度为0.5g/mL的蔗糖溶液观察不到洋葱质壁分离复原现象的原因是蔗糖溶液浓度过高使细胞失水过多而死亡，将质量浓度为0.5g/mL的蔗糖溶液更换成质量浓度为0.3g/mL的蔗糖溶液，可避免细胞失水过多而死亡，A正确； B、用95%的酒精、二氧化硅和碳酸钙提取新鲜菠菜绿叶中的色素时，提取液颜色偏浅的原因是提取到的色素太少，可在95%的酒精中加入适量无水碳酸钠去除其中水分来提高无水乙醇的萃取率，B正确； C、用2mol/L的NaCl溶液提取新鲜洋葱DNA并用二苯胺试剂检测时蓝色偏淡的原因是提取到的DNA较少，若将2mol/LNaCl溶液更换成1mol/L的NaCl溶液，会导致提取到的DNA更少，用二苯胺试剂检测时蓝色更浅，C错误； D、因为蝗虫卵巢里的卵母细胞不能连续进行完整的减数分裂过程（即减数分裂没有进行彻底），而精巢里的精原细胞可以，并且精巢中发生减数分裂的细胞较多，所以实验可将蝗虫卵巢换成精巢来观察减数分裂各时期细胞，D正确。 故选C。 2．（2025·山东泰安·三模）关于“DNA的粗提取与鉴定”、“DNA片段的扩增及电泳鉴定”实验，下列说法正确的是（    ） A．将过滤的洋葱研磨液低温放置几分钟，取沉淀物备用 B．在白色丝状物中加入二苯胺试剂即可出现蓝色 C．根据待分离DNA片段的大小，用扩增缓冲液配制成琼脂糖溶液 D．加样孔要留出一个孔加入指示分子大小的标准参照物 【答案】D 【分析】DNA不溶于酒精，而某些蛋白质溶于酒精；鉴定DNA时，需要先将DNA溶解在NaCl溶液中，再与二苯胺溶液混合，并在水浴加热条件下呈现蓝色。 【详解】A、将过滤的洋葱研磨液低温放置几分钟后取上清液备用，A错误； B、将白色丝状物溶于2mol/L的NaCl溶液中再加入二苯胺试剂，需沸水浴加热可出现蓝色，B错误； C、根据待分离DNA片段的大小，用电泳缓冲液配制成琼脂糖溶液，C错误； D、DNA相对分子质量标准物（DNAMarker）是一组已知长度和含量的标 准DNA片段混合物，在电泳中能作为参照物；加样孔要留出一个孔加入指示分子大小的标准参照物，D正确。 故选D。 3．（2025·甘肃白银·三模）下列有关“DNA粗提取与鉴定”“DNA片段的扩增及电泳鉴定”实验的叙述，错误的是（    ） A．将洋葱研磨液离心后保留上清液并加入冷酒精静置后，可收集到DNA B．电泳鉴定DNA利用了DNA在电场中会向着与它所带电荷相反的电极移动的原理 C．电泳鉴定DNA时，将电泳缓冲液加入电泳槽中，电泳缓冲液不能没过凝胶 D．待指示剂前沿迁移接近凝胶边缘时需停止电泳，并取出凝胶置于紫外灯下观察和照相 【答案】C 【分析】DNA不溶于酒精，而某些蛋白质溶于酒精；鉴定DNA时，需要先将DNA溶解在NaCl溶液中，再与二苯胺溶液混合，并在水浴加热条件下呈现蓝色。 【详解】A、将洋葱研磨液离心后保留上清液并加入冷酒精静置后，可收集到DNA，A正确； B、电泳是指带电粒子在电场的作用下发生迁移的过程，由于同性相斥、异性相吸，带电分子会向着与其所带电荷相反的电极移动，B正确； C、将电泳缓冲液加入电泳槽中，电泳缓冲液需要没过凝胶1mm为宜，C错误； D、将电泳缓冲液加入电泳槽，待指示剂前沿迁移接近凝胶边缘时停止电泳，以防止样品流失到缓冲液中，之后取出凝胶置于紫外灯下观察和照相，D正确。 故选C。 4．（2025·山西晋城·三模）几种限制酶的识别序列和切割位点如表所示。下列相关叙述正确的是（　　） 限制酶 识别序列和切割位点 BamHI 5'-G↓GATCC-3' Sau3AI 5'-↓GATC-3' Acc65I 5'-G↓GTACC-3′ A．3种限制酶切割形成的末端中，既有黏性末端又有平末端 B．经Acc65I酶切后得到的黏性末端序列为5'-GTAC-3′ C．能用Sau3AI酶切的DNA序列亦可被BamHI酶切 D．目的基因和质粒分别用BamHI和Sau3AI酶切后，用DNA连接酶连接形成的重组质粒可被BamHI酶切 【答案】B 【分析】基因工程的工具： 1、限制酶：能够识别双链DNA分子的某种特定核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断裂； 2、DNA连接酶：连接的是两个核苷酸之间的磷酸二酯键； 3、运载体：常用的运载体：质粒、噬菌体的衍生物、动植物病毒。 【详解】A、由表可知，BamHI 识别序列为5′−G↓GATCC−3′，Sau3AI 识别序列为5′−↓GATC−3′ ，Acc65I 识别序列为5′−G↓GTACC−3′ ，这三种限制酶切割后形成的都是黏性末端，没有平末端，A错误； B、Acc65I 的识别序列是 5'-G↓G TACC-3'，切割位点在 G 和 G 之间，经Acc65I 酶切后得到的黏性末端序列为5'-GTAC - 3'，B正确； C、BamHI 的识别序列是5'-G↓GATCC-3'，Sau3AI 的识别序列是5'-GATC - 3'，能被Sau3AI 酶切的 DNA 序列不一定能被BamHI 酶切，因为BamHI识别的序列是特定的，C错误； D、目的基因和质粒分别用BamHI和Sau3AI酶切后，用DNA连接酶连接形成的重组质粒可被Sau3AI酶切，但不一定能被BamHI酶切，D错误。 故选B。 5．（2025·辽宁·三模）限制酶来源于细菌的“限制-修饰”系统（R-M系统）。典型的R-M系统由限制酶和甲基化酶构成，通常成对出现，一般具有相同的DNA识别位点。如图为细菌利用“限制-修饰”系统抵御噬菌体入侵的示意图，下列相关叙述错误的是（　　）    注：REase表示限制酶，MTase代表甲基化酶。 A．REase能识别双链DNA上的特定碱基序列并切割特定部位的磷酸二酯键 B．DNA分子经限制酶切割产生的片段末端通常有两种形式 C．MTase作用时可阻止噬菌体的限制酶破坏细菌的DNA分子 D．R-M系统中限制酶和甲基化酶成对出现是细菌在进化中形成的防御机制 【答案】C 【分析】噬菌体侵染细菌的过程：吸附→注入→复制→组装→释放。大肠杆菌能合成限制酶，识别并切割外来DNA分子并使其失去活性，进而限制外来DNA的入侵，但自身DNA不会被破坏，可能是同时能产生修饰酶，对自身DNA进行了修饰，防止自身DNA被限制性内切酶破坏。 【详解】A、REase表示限制酶，其作用是能识别双链DNA上的特定碱基序列并切割特定部位的磷酸二酯键，A正确； B、DNA分子经限制酶切割产生的片段末端通常有平末端和黏性末端两种形式，B正确； C、据题图分析可知，MTase作用时可阻止细菌的限制酶破坏自身的DNA分子，C错误； D、R-M系统是细菌在进化过程中形成的一种防御机制，用于抵御噬菌体的入侵。在这个系统中，限制酶和甲基化酶通常成对出现，具有相同的DNA识别位点。这种成对出现的机制可以确保细菌的DNA分子在受到噬菌体攻击时能够得到有效的保护，D正确。 故选C。 6．（2025·福建泉州·三模）基因工程的诞生和发展，离不开科学发现和技术发展的支持。下列有关叙述错误的是（　　） A．质粒的发现为基因工程提供了基因转移的“分子运输车” B．DNA合成仪的问世为目的基因的检测与鉴定提供了方便 C．PCR为获取目的基因提供了有效手段 D．基因组编辑技术的发明为目的基因的定向变异提供新途径 【答案】B 【分析】关于限制酶，考生可以从以下几方面把握：（1）来源：主要从原核生物中分离纯化出来。（2）特异性：能够识别双链DNA分子的某种特定核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断裂。（3）结果：形成黏性末端或平末端。 【详解】A、“分子运输车”是基因进入受体细胞的载体（或运载体），常用的运载体包括质粒、动植物病毒、噬菌体等，某些病毒可作为基因工程的“分子运输车”，A正确； B、DNA合成仪可以用于体外DNA分子小的片段的合成，因此为小分子量的DNA的合成、PCR扩增中引物的合成以及基因工程中基因探针的制作提供了方便，B错误； C、1985年穆里斯等人发明了PCR技术，为获取目的基因提供了有效手段，C正确； D、基因组编辑技术的发明为目的基因的定向变异提供新途径，D正确。 故选B。 二、解答题 7．（2025·广东惠州·三模）桃源黑猪是我国地方猪种的典型代表，具有瘦肉率低的缺陷。MSNT（肌肉生长抑制素）是控制动物“双肌性状”的基因，其功能为可抑制动物骨骼肌增生，增加脂肪沉积。研究人员利用sgMSNT/Cas9复合物敲除MSNT基因获得了桃源黑猪新品种。图1中的sgMSNT/Cas9复合物中，sgMSNT是能准确识别MSNT基因序列的RNA，并引导Cas9蛋白对DNA进行切割。图2为利用该技术成功敲除MSNT基因后，通过胚胎工程获得桃源黑猪新品种的操作步骤。回答下列问题： (1)Cas9蛋白相当于 酶，可催化 键断裂，若图1中复合物所识别的DNA序列为5′-CCATC-3′，则sgMSNT的序列为 。 (2)图1所示技术可弥补桃源黑猪瘦肉率低的缺陷的原因是 。 (3)图2中形成重构胚后可通过 法（写1种）激活，为获得更多胚胎，可在胚胎发育到 期时进行 。 【答案】(1) 限制 磷酸二酯 5′-GAUGG-3′ (2)sgMSNT/Cas9复合物通过使MSNT基因被切割破坏，抑制MSNT基因表达，从而达到促进桃源黑猪骨骼肌增生，减少脂肪沉积，瘦肉率增加的效果。 (3) 电刺激、Ca2+载体、乙醇、蛋白酶合成抑制剂 囊胚或桑葚胚 胚胎分割 【分析】基因工程的基本操作步骤主要包括：（1）目的基因的获取；（2）基因表达载体的构建（核心）；（3）将目的基因导入受体细胞；（4）目的基因的检测与鉴定。 【详解】（1）据题干信息“Cas9蛋白对DNA进行切割”可知，Cas9蛋白相当于限制酶；故可可催化磷酸二酯键的断裂；sgMSNT是能准确识别MSNT基因序列的RNA，据图可知，sgMSNT可与靶核酸分子（需要切割的DNA片段）互补配对，若所识别的DNA序列为5′-CCATC-3′，结合碱基互补配对和双链反向平行关系，则sgMSNT的序列为5′-GAUGG-3′。 （2）sgMSNT/Cas9复合物通过使MSNT基因被切割破坏，抑制MSNT基因表达，从而达到促进桃源黑猪骨骼肌增生，减少脂肪沉积，瘦肉率增加的效果，以此来弥补桃源黑猪瘦肉率低的缺陷。 （3）胚激活可通过电刺激、Ca2+载体、乙醇、蛋白酶合成抑制剂等方法来进行；为获得更多胚胎，可进行胚胎分割，即在胚胎发育到囊胚或桑葚胚时进行胚胎分割。 8．（2025·浙江·三模）生物某种性状缺失的原因有多种，如基因突变、染色体畸变、DNA甲基化等。为确定某易感锈病小麦的易感性状是否为基因突变导致的，对该易感锈病小麦的DNA进行了相关检测。回答下列问题： (1)DNA鉴定时，先利用 技术扩增DNA，再经 后电泳分离，根据电泳条带情况判断是否为基因突变引发。更精确的方法是对易感锈病小麦进行DNA ，并将结果与基因数据库中小麦基因组序列进行 ，判断是否发生突变以及突变的 。 (2)提取DNA时，需对样本进行冷冻研磨。研磨前进行冷冻的目的是 ，研磨时加入的研磨液中含有十二烷基硫酸钠（SDS）和乙二胺四乙酸二钠（EDTA），其中EDTA的作用是 。 (3)PCR时，向离心管中加入PCR扩增缓冲液、模板DNA、F1-R1、F2-R2和F3-R3三对引物、无菌水，还有 ，离心后进行PCR，PCR条件程序为预变性10min→循环（变性1min→退火1min→延伸1min）35轮→延伸10min，其中预变性10min的目的主要是 。 (4)电泳时，将样品加到靠近电源 的加样孔内，电泳缓冲液中含有少许溴酚蓝，溴酚蓝在琼脂糖凝胶中的迁移速率比DNA ，因此可根据溴酚蓝的所在位置确定 时间。凝胶中含有荧光染料，便于在 光下观察DNA条带位置。 【答案】(1) PCR/PCR技术 限制酶切割 测序 比对 类型 (2) 冷冻后的结构易破坏，有利于研磨 EDTA：抑制DNA酶活性，防止核DNA被酶解 (3) dNTP、TaqDNA聚合酶 使模板DNA完全变性（或使模板DNA充分解旋） (4) 负极 快 关闭电泳仪电源（电泳） 紫外 【分析】基因突变是指基因内部特定核苷酸序列发生改变的现象或过程。DNA分子上碱基对的替换、插入或缺失都可以引起核苷酸序列的变化，从而引起基因结构的改变。鉴定基因突变在分子水平的检测需获得大量DNA后进行相关测定。PCR（聚合酶链式反应）是一种用于放大扩增特定的DNA片段的分子生物学技术，它可看作是生物体外的特殊DNA复制。 【详解】（1）获得的PCR产物可以直接电泳，比较DNA片段的长度进行判断；也可用特定的限制酶能否被识别并切割来判断某一位点是否发生突变。经初步确定后，最终需要对DNA测序与基因数据库中储存的序列进行比对，确定基因突变的具体类型； （2）提取DNA是为获得PCR的模板，既要使DNA充分释放又不能破坏DNA结构。因此，对细胞研磨要充分，冷冻后更易破坏细胞壁和各种膜结构，研磨液的作用主要使两个方面：SDS破坏组蛋白结构使其与DNA分离，另一方面EDTA抑制了DNA酶的活性，防止DNA被破坏； （3）PCR在离心管中进行，该体系中需要加入缓冲液、DNA模板、原料4种dNTP、引物、TaqDNA聚合酶、最加无菌水调整总体积。设定PCR程序，预变性的时间较循环中的变性时间长，目的是使模板完全解旋变性使之能与引物配对结合； （4）电泳PCR产物，区分电泳槽的正负极和凝胶加样孔一端朝向负极，向电泳槽中加入电泳缓冲液，使其没过凝胶。溴酚蓝作为电泳指示剂是分子量比DNA的小，故在凝胶中迁移速率更快，可作为电泳进行时间的判断，在快迁移出凝胶前停止电泳。DNA荧光染料须在紫外灯下才会发出荧光。 基因工程的基本操作程序和应用考点02 一、单选题 1．（2025·贵州遵义·三模）骨质疏松症是一种以骨量减少、骨组织变薄为特征的系统性骨病。研究者将人BMP-2基因、CXCR4基因与双歧杆菌ClyA基因拼接后，导入双歧杆菌，用于治疗模型鼠骨质疏松症。其过程及作用机制如图所示。下列相关叙述错误的是（　　）    注：ClyA为双歧杆菌的一种细胞膜蛋白；BMP-2为骨形态发生蛋白2；CXCR4可以将基质细胞迁移到骨质疏松处 A．重组质粒上应含有双歧杆菌ClyA基因的特异性启动子 B．BMP-2基因和CXCR4基因需要拼接到ClyA基因下游 C．培养重组双歧杆菌的培养基中应加入抗生素防止杂菌污染 D．胞外囊泡可能诱导基质细胞迁移到骨质疏松处并分化为成骨细胞 【答案】C 【分析】转录过程以四种核糖核苷酸为原料，以DNA分子的一条链为模板，在RNA聚合酶的作用下消耗能量，合成RNA。翻译过程以氨基酸为原料，以转录过程产生的mRNA为模板，在酶的作用下，消耗能量产生多肽链。多肽链经过折叠加工后形成具有特定功能的蛋白质。 【详解】A、为了使BMP-2和CXCR4基因在双歧杆菌中表达，重组质粒需要包含双歧杆菌ClyA基因的特异性启动子，以确保基因的正确转录和表达，A正确； B、将BMP-2和CXCR4基因拼接到ClyA基因下游，可以利用ClyA基因的启动子和调控序列，确保这些基因在双歧杆菌中正确表达，B正确； C、双歧杆菌是一种益生菌，抗生素可能会抑制双歧杆菌的生长，因此不适用于培养双歧杆菌，C错误； D、分析题意可知，CXCR4可以将基质细胞迁移到骨质疏松处，而BMP-2为骨形态发生蛋白，BMP-2基因可以促进这些细胞分化为成骨细胞，从而帮助修复骨质疏松，通过双歧杆菌释放的胞外囊泡可能通过上述过程诱导基质细胞迁移到骨质疏松处并分化为成骨细胞，D正确， 故选C。 2．（2025·江苏·三模）琼脂糖凝胶电泳通常用于PCR产物的鉴定，相关叙述正确的是（    ） A．DNA分子所带电荷越多，在凝胶中的迁移速率越快 B．用微量移液器将PCR产物与核酸染料的混合物缓慢注入凝胶的加样孔内 C．电场强度增大，DNA在凝胶中的迁移速率加快，电泳时的电压一般为1~5V D．PCR非特异性扩增产物电泳、样品上样量过多电泳均会导致电泳条带模糊 【答案】D 【分析】PCR的产物一般通过琼脂糖凝胶电泳来鉴定。在凝胶中DNA分子的迁移速率与凝胶的浓度、DNA分子的大小和构象等有关，凝胶中的DNA分子通过染色，可以在波长为300 nm的紫外灯下被检测出来。 【详解】A、在琼脂糖凝胶电泳中，DNA分子在凝胶中的迁移速率主要取决于DNA分子的大小，而非所带电荷多少。因为DNA分子本身带有大量负电荷，在电场中都会向正极移动，且在凝胶介质中，分子大小对迁移的阻碍作用更为关键，A正确； B、用微量移液器将PCR产物缓慢注入凝胶的加样孔内，核酸染料是在制胶时加入到琼脂糖凝胶中，而不是与PCR产物混合后注入加样孔，B错误； C、电场强度增大，DNA在凝胶中的迁移速率确实会加快，但电泳时的电压一般为5 - 15V，而不是1 - 5V，C错误； D、CR非特异性扩增产物电泳时，由于存在多种不同的扩增片段，会导致电泳条带混乱模糊；样品上样量过多时，会使条带变宽、分辨率降低，也会导致电泳条带模糊，D正确。 故选D。 3．（2025·湖北·三模）科学家将金鱼草的橙色花青素合成基因导入水稻，培育出“黄金大米”。为确保其安全性，需特别检测（    ） A．花青素合成基因是否整合到水稻基因组 B．转基因大米中维生素A前体含量是否稳定 C．花青素合成酶是否会引起人体过敏反应 D．转基因水稻花粉是否会导致邻近杂草变异 【答案】C 【分析】基因工程的程序包括获取目的基因、基因表达载体的构建、将目的基因导入受体细胞，目的基因的检测与鉴定。 【详解】A、花青素合成基因是否整合到水稻基因组中这是转基因成功的标志，不是确保转基因水稻是否安全的必选项，A错误； B、题意显示，转基因大米中维生素A前体含量是否稳定只能检测是否能具有黄金大米的特性，而不属于安全性检测，B错误； C、科学家将金鱼草的橙色花青素合成基因导入水稻，培育出“黄金大米”，为了确保其安全性，需要特别检测花青素合成酶是否会引起人体过敏反应，C正确； D、转基因水稻花粉是否会导致邻近杂草变异这属于生态检测，不属于对人类食用的安全性检测，D错误。 故选C。 4．（2025·江西景德镇·三模）转基因抗草甘膦作物，如转基因的匍匐剪股颖（存在抗草甘膦的EPSPS基因）的大面积种植可以给我们带来巨大的经济效益，伴随而来的生态风险也引起了人们广泛关注。研究人员将一高尔夫球场作为控制区，种入转基因甘膦匍匐剪股颖，在控制区外不同位点（如图所示）种植了若干株非转基因的匍匐剪股颖和亲缘物种作为哨兵植物。为确定转基因作物向其同种或亲缘物种转移EPSPS基因的情况，一段时间后需将用于监测的哨兵植物的种子收集并培育成幼苗。下列叙述错误的是（    ） A．检测EPSPS基因流入幼苗的方法为提取幼苗叶片中的DNA为模板，利用针对EPSPS基因设计的特定引物进行PCR并电泳 B．推测哨兵植物主要放置在顺风向的原因是花粉可以随风传播到较远的距离，从而造成基因流动 C．可以通过设置隔离带来防止转基因花粉传播到其他植物 D．可将圆锥花序直接浸没在含农杆菌的溶液中一段时间，然后培养植株即可获得转基因匍匐剪股颖 【答案】D 【分析】基因工程技术的基本步骤：（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法。（4）目的基因的检测与鉴定：分子水平上的检测和个体水平上的鉴定。 【详解】A、要检测EPSPS基因是否流入幼苗，提取幼苗叶片中的DNA作为模板是合理的。 利用针对EPSPS基因设计的特定引物进行PCR，可以扩增出EPSPS基因片段，再通过电泳分离和检测，能够判断是否存在该基因，A正确； B、花粉可以随风传播，顺风时传播距离会更远。 将哨兵植物放置在顺风方向，更有可能捕获到因花粉传播而带来的基因流动情况，以此监测转基因作物基因是否转移到其他植物中，B正确； C、设置隔离带能够在一定程度上阻挡转基因花粉的传播路径。 从而阻止转基因花粉传播到其他植物，减少基因漂移等生态风险，C正确； D、仅仅将圆锥花序直接浸没在含农杆菌的溶液中一段时间，然后培养植株，这种操作不一定能成功获得转基因匍匐剪股颖。 因为农杆菌介导的转化过程较为复杂，还需要考虑农杆菌的转化效率、植物的组织培养条件等多种因素，并非如此简单的操作就能完成，D错误。 故选D。 5．（2025·福建三明·三模）关于DNA片段的扩增及电泳鉴定实验，下列叙述正确的是（    ） A．PCR扩增缓冲液中，一般要添加Ca2+以激活TaqDNA聚合酶 B．电泳缓冲液中加入琼脂糖及核酸染料后，沸水浴至琼脂糖融化 C．将电泳缓冲液加入电泳槽后，再将凝固的凝胶放入电泳槽内 D．将含指示剂的凝胶载样缓冲液与PCR产物混合液缓慢注入加样孔内 【答案】D 【分析】PCR（聚合酶链式反应）基于DNA半保留复制原理，在体外模拟体内DNA复制过程。通过高温变性使双链DNA解旋为单链；低温退火让引物与模板DNA单链互补配对；适温延伸时TaqDNA聚合酶以dNTP为原料，从引物3’端开始，沿着模板链合成互补DNA链。经过多次循环，实现特定DNA片段的指数级扩增。 【详解】A、PCR扩增缓冲液中，一般要添加Mg2+以激活TaqDNA聚合酶，而不是Ca2+，Mg2+能与dNTP结合形成复合物，为TaqDNA聚合酶提供催化活性所需的环境，A错误； B、琼脂糖应先在电泳缓冲液中加热至完全融化，待冷却至合适温度（如50−60°C）后，再加入核酸染料，而不是沸水浴且在琼脂糖融化后再加入核酸染料，沸水浴操作不当可能造成琼脂糖溶液飞溅，且过早加入核酸染料可能影响染料活性及实验效果，B错误； C、应先将凝固的凝胶放入电泳槽内，再加入电泳缓冲液，使缓冲液没过凝胶，这样能保证凝胶在电泳过程中处于合适的电场环境，若先加缓冲液再放凝胶，可能导致凝胶放置位置不佳，影响电泳效果，C错误； D、将含指示剂的凝胶载样缓冲液与PCR产物混合液缓慢注入加样孔内，载样缓冲液中的甘油等成分可增加混合液密度，使混合液沉入加样孔，指示剂可帮助观察电泳进程，缓慢注入可防止混合液溢出加样孔，避免样品间相互污染，D正确。 故选D。 6．（2025·贵州遵义·三模）为确定某目的基因是否导入大肠杆菌，可利用PCR扩增受体菌的DNA，并通过琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物。下列相关叙述错误的是（　　） A．筛选导入目的基因的大肠杆菌需要选择培养基 B．大肠杆菌培养和PCR扩增均需要进行无菌操作 C．PCR所需引物应分别与目的基因模板链的5'端互补 D．通过凝胶电泳条带可初步判断PCR扩增是否成功 【答案】C 【分析】PCR技术：①概念：PCR全称为聚合酶链式反应，是一项在生物体外复制特定DNA的核酸合成技术；②原理：DNA复制；③条件：模板DNA、四种脱氧核苷酸、一对引物、热稳定DNA聚合酶（Taq酶）；④方式：以指数的方式扩增，即约2n；⑤过程：高温变性、低温复性、中温延伸。 【详解】A、筛选导入目的基因的大肠杆菌需要选择培养基，筛选出含目的基因的大肠杆菌，淘汰未转入目的基因的大肠杆菌，A正确； B、大肠杆菌培养和PCR扩增均需要进行无菌操作，以避免杂菌污染，B错误； C、PCR所需引物应分别与目的基因模板链的3'端互补，C错误； D、若PCR成功，则通过凝胶电泳可出现相应的条带，D正确。 故选C。 7．（2025·甘肃白银·三模）从苏云金杆菌中提取出来的抗虫蛋白基因是基因工程中常用的抗虫基因。利用引物对某转基因抗虫植物中的抗虫蛋白基因进行PCR扩增，并进行琼脂糖凝胶电泳，发现电泳槽中出现了非特异性扩增条带。其原因不可能是（　　） A．未加入模板 B．引物特异性差 C．DNA聚合酶质量不好 D．PCR循环次数过多 【答案】A 【分析】PCR技术是体外DNA复制的过程，在PCR反应体系中添加模板、引物、四种脱氧核苷酸、Taq酶（耐高温的DNA聚合酶）等条件。其中引物的作用是使耐高温的DNA聚合酶能够从引物的3，端开始连接脱氧核苷酸（定位DNA合成的起始点）。PCR中每次循环的步骤依次是高温变性、低温复性和中温延伸。在凝胶中DNA分子的迁移速率与凝胶的浓度、DNA分子的大小和构象有关，所以PCR的产物常用琼脂糖凝胶电泳来鉴定。 【详解】A、如果未加入模板DNA，PCR反应将无法进行，理论上不会产生任何扩增产物（包括非特异性扩增）。因此，未加入模板不会导致非特异性扩增，而是可能导致无扩增产物，A符合题意； B、引物设计不合理（如引物太短、GC含量不合适、存在重复序列等）可能导致其与非目标序列结合，导致出现非特异性扩增条带，B不符合题意； C、DNA聚合酶质量不好，可能在PCR过程中产生非特异性扩增（如酶活性不纯或存在外切酶污染），导致出现非特异性扩增条带，C不符合题意； D、PCR循环次数过多，可能导致引物与非目标序列结合的概率增加，尤其是在后期循环中，目标序列已大量扩增，引物可能与非目标序列结合，导致出现非特异性扩增条带，D不符合题意。 故选A。 8．（2025·河南开封·三模）某科研团队拟利用CRISPR/Cas9技术对病毒复制酶基因进行定向编辑并导入怀地黄细胞中，结合植物组织培养技术，培育出脱毒且抗病毒的怀地黄新品种。下列叙述正确的是（    ） A．用茎尖进行植物组织培养获得脱毒苗是因为病毒无法进入茎尖细胞 B．CRISPR/Cas9基因编辑技术可以使病毒复制酶基因发生随机突变 C．进行植物组织培养时需要在培养基中添加干扰素以防止细菌的污染 D．需要对培育出的再生植株进行病毒接种实验以验证其抗病毒能力 【答案】D 【分析】植物细胞工程的基本技术有植物组织培养技术、植物体细胞杂交技术等。植物组织培养是指将离体的植物器官、组织或细胞等培养在培养基上，给予适宜的培养条件，诱导其形成完整植株的技术。植物体细胞杂交是指将不同来源的植物体细胞在一定条件下融合成杂种细胞，进而培育成新植物体的技术。利用植物细胞工程，可以快速繁殖优良品种、培育作物新品种、进行作物脱毒和细胞产物的工厂化生产等，有效提高生产效率。 【详解】A、植物顶端分生区附近（如茎尖）的病毒极少，甚至无病毒，故用茎尖进行植物组织培养可获得脱毒苗，A错误； B、依题意，CRISPR/Cas9技术是对基因进行定向编辑（如敲除或替换），而非引发随机突变，B错误； C、干扰素是一种具有干扰病毒复制作用的糖蛋白，对细菌无效，植物组织培养中防止细菌污染需添加抗生素（如青霉素），C错误； D、通过基因编辑获得的植株需实际接种病毒，观察其是否表现抗性，以验证抗病毒能力，D正确。 故选D。 9．（2025·陕西安康·三模）PCR技术可实现基因的定点突变。研究人员设计了与蛋白A基因结合的两对引物（引物B和C中都替换了一个碱基）如图1所示。研究人员按照如图2所示的方式进行4次PCR扩增，以获得定点突变的新的蛋白A基因。下列相关叙述错误的是（    ）    A．PCR1体系和PCR2体系必须分开进行 B．PCR3体系中应该加入引物B和C C．PCR4体系中应该加入引物A和D D．DNA聚合酶能够从引物的3'端开始连接脱氧核苷酸 【答案】B 【分析】PCR技术的PCR全称为聚合酶链式反应，是一项在生物体外复制特定DNA的核酸合成技术，其原理为DNA复制，该过程的进行首先要有一段已知核苷酸序列的目的基因以便合成一对引物，其过程为：高温变性：DNA解旋过程（PCR扩增中双链DNA解开不需要解旋酶，高温条件下氢键可自动解开）；低温复性：引物结合到互补链DNA上；中温延伸：合成子链。 【详解】A、PCR1和PCR2分别以不同的引物对蛋白A基因的不同片段进行扩增，如果不分开进行，引物会相互干扰，无法准确地扩增出所需的特定片段，所以PCR1体系和PCR2体系必须分开进行，A正确； B、从图2可以看出，PCR3是对PCR1和PCR2产物混合复性后的产物进行扩增，其目的是将两个带有部分突变序列的片段连接起来，此时不需要引物B和C，因为引物B和C是用于PCR1和PCR2中引入突变碱基的，在PCR3中应利用PCR1和PCR2产物的互补配对来进行延伸，B错误； C、PCR4是最终获得完整的新的蛋白A基因的步骤，此时需要扩增出完整的基因，引物A和D可以分别结合在基因两端，从而扩增出完整的含有定点突变的新的蛋白A基因，所以PCR4体系中应该加入引物A和D，C正确； D、DNA聚合酶具有特定的作用特点，它能够从引物的3'端开始，按照模板链的碱基序列，连接脱氧核苷酸，合成新的DNA链，这是PCR技术能够实现DNA扩增的基础原理之一，D正确。 故选B。 10．（2025·江西·三模）细胞核定位信号（NLS）能够促进蛋白转移到细胞核中，科学家将 NLS 序列与绿色荧光蛋白（GFP）基因融合插入到载体pRI101中,获得pRI101-NLS-GFP 表达载体,利用农杆菌转化法在烟草中表达。载体pRI101-NLS-GFP的构建图谱见下图，下列有关描述正确的是（    ） A．对融合基因PCR 时需在引物的3'端分别添加限制酶 Nde I和 Sma I的识别序列 B．推测农杆菌细胞的解旋酶基因前端含有 NLS 核定位信号 C．融合基因插入到T-DNA 中确保其能整合到烟草的质 DNA 中 D．含该重组质粒的农杆菌侵染烟草，一段时间后观察发现荧光仅存在细胞核 【答案】D 【分析】基因工程技术的基本步骤： （1）目的基因的筛选和获取 从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。 （2）基因表达载体的构建 基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等，标记基因可便于目的基因的鉴定和筛选，是基因工程的核心步骤。 （3）将目的基因导入受体细胞 将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法。 将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法。 （4）目的基因的检测与鉴定 分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA是否插入目的基因——PCR等技术；②检测目的基因是否转录出了mRNA——PCR等技术；③检测目的基因是否翻译成蛋白质——抗原—抗体杂交技术。 个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。 【详解】A、表达载体的目的基因两端分别是限制酶 Nde I和Sma I的酶切位点，为了让目的基因准确的连接到质粒上，PCR延伸方向是5'到3'，PCR 时需要在特异性引物的5'端分别添加限制酶 Nde I和Sma I的识别序列，A错误； B、解旋酶在核糖体上合成，再转运到细胞核中，推测真核细胞解旋酶基因前端有NLS核定位信号，而农杆菌属于原核细胞，没有细胞核，解旋酶基因前端没有NLS核定位信号，B错误； C、融合基因插入到T-DNA中，确保其能整合到烟草的染色体DNA中，不是质DNA中，C错误； D、将含pRI101-NLS-GFP重组质粒的农杆菌侵染烟草，表达后绿色荧光蛋白含有细胞核定位序列，会转移到细胞核中，观察烟草细胞荧光信号仅存在细胞核中，D正确。 故选D。 11．（2025·陕西宝鸡·三模）新冠疫情防控的一个重要技术手段是荧光定量PCR。该技术原理如图，在PCR反应体系中加入引物的同时，加入与某条模板链互补的TaqMan荧光探针，当耐高温的DNA聚合酶催化子链延伸至探针处时会水解探针，使荧光基团R分离下来，发出荧光。通过反应体系的荧光达到指定强度时的扩增轮数，即CT值，来判断待测样品中目标核酸的含量。下列叙述不正确的是（　　） A．新冠病毒采集的样品需先进行逆转录再进行荧光定量PCR B．CT值越高，采集样品中的新冠病毒含量也越高 C．TaqMan探针的设计应主要依据新冠病毒RNA内部的一段序列 D．如果没有检测到荧光信号，初步推测样本中不含有新冠病毒 【答案】B 【分析】1、PCR原理：在解旋酶作用下，打开DNA双链，每条DNA单链作为母链，以4种游离脱氧核苷酸为原料，合成子链，在引物作用下，DNA聚合酶从引物3端开始延伸DNA链，即DNA的合成方向是从子链的5′端自3′端延伸的。实际上就是在体外模拟细胞内DNA的复制过程。DNA的复制需要引物，其主要原因是DNA聚合酶只能从3′端延伸DNA链； 2、PCR过程： （1）变性：当温度上升到90 ℃以上时，氢键断裂，双链DNA解旋为单链； （2）复性：当温度降低到50℃左右是，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合； （3）延伸：温度上升到72 ℃左右，溶液中的四种脱氧核苷酸，在DNA聚合酶的作用下，根据碱基互补配对原则合成新的DNA链。 【详解】A、新冠病毒的遗传物质是RNA，而PCR扩增的是DNA，所以新冠病毒采集的样品需先通过逆转录将RNA逆转录成DNA，再进行荧光定量PCR，A正确； B、CT值是反应体系的荧光达到指定强度时的扩增轮数，CT值越高，意味着达到指定荧光强度所需的扩增轮数越多，说明初始模板量（即采集样品中的新冠病毒含量 ）越少，B错误； C、TaqMan荧光探针要与新冠病毒核酸特异性结合，其设计应主要依据新冠病毒RNA内部的一段序列 ，C正确； D、该技术通过水解TaqMan荧光探针产生荧光信号来检测新冠病毒核酸，若没有检测到荧光信号，初步推测样本中不含有新冠病毒核酸，即不含有新冠病毒，D正确。 故选B。 12．（2025·河北秦皇岛·三模）科学家利用PCR技术扩增人乳头瘤病毒HPV—16L1基因，构建了含HPV—16L1基因的表达载体pBI——L1，经根瘤农杆菌介导转化，获得了转基因烟草植株。该技术利用转基因烟草作为生物反应器，生产出了纯度较高的HPV——16Ll蛋白。下列叙述正确的是（    ） A．构建表达载体pBI——L1时可使用两种不同限制酶以确保正确连接 B．可以用DNA分子杂交法检测再生植株是否表达出HPV-16L1蛋白 C．利用PCR扩增HPV—16L1基因的不需要已知该基因的一段碱基序列 D．必须选用烟草的受精卵作为受体细胞才能保证每个细胞中含有目的基因 【答案】A 【分析】基因工程技术的基本步骤： （1）目的基因的筛选与获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。 （2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。 （3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法。 （4）目的基因的检测与鉴定。 【详解】A、用两种不同限制酶，可保证目的基因和载体定向连接，且不发生自身环化，即构建表达载体pBI——L1时可使用两种不同限制酶以确保正确连接，A正确； B、可以用抗原-抗体杂交法检测再生植株是否表达出HPV-16L1蛋白，B错误； C、利用PCR扩增HPV—16L1基因的需要已知该基因的一段碱基序列用于合成引物，因为PCR扩增过程中需要设计相应的引物，C错误； D、未必选用烟草的受精卵作为受体细胞才能保证每个细胞中含有目的基因，转基因烟草的培育可以使用烟草的愈伤组织作为受体细胞，D错误。 故选A。 13．（2025·四川达州·三模）将抗除草剂基因转入油菜中，得到转基因油菜，在转基因油菜种植多年后，调查发现在公路边的野生油菜有70%含有抗除草剂基因。下列叙述错误的是（    ） A．野生油菜体内的抗除草剂基因主要源自转基因油菜的花粉 B．70%的野生油菜体内出现抗除草剂基因可能是基因重组的结果 C．将抗除草剂基因转入油菜细胞后即可培育出新物种 D．大量使用单一除草剂会导致环境污染，降低生物多样性 【答案】C 【分析】基因工程又叫DNA重组技术，是指按照人们的意愿，进行严格的设计，并通过体外DNA重组和转基因等技术，赋予生物以新的遗传特性，从而创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。 【详解】 A、转基因油菜含抗除草剂基因的花粉传播到野生油菜上后，产生的后代体内也含有抗除草剂基因，A正确； B、70%的野生油菜具有抗除草剂基因是转基因油菜中的抗除草剂基因转入野生油菜并通过自然选择产生的，属于基因重组，B正确； C、含抗除草剂基因的野生油菜发生了进化，但还不是新的物种，C错误； D、大量使用单一除草剂会导致环境污染，会杀死很多杂草和农作物，降低生物多样性，D正确。 故选C。 二、多选题 14．（2025·江苏常州·三模）如图表示花粉管通道法介导植物基因转移。下列说法正确的是（　　） A．花粉管通道法可适用获得转基因抗虫棉花 B．相比于农杆菌转化法，花粉管通道法避免了植物组织培养这一操作 C．必须在雌蕊成熟时才能进行图中所示的处理方法 D．外源DNA不需要构建基因表达载体，就能借助花粉管通道进入受体细胞并表达 【答案】ABC 【分析】1、将目的基因导入植物细胞（1）农杆菌转化法（2）花粉管通道法：这是我国科学家独创的一种方法，是一种十分简便经济的方法。（我国的转基因抗虫棉就是用此种方法获得的）。 2、将目的基因导入动物细胞方法：显微注射技术。（最有效一种方法）。 3、将目的基因导入微生物细胞：Ca2+处理法（感受态细胞法）。 【详解】A、花粉管通道法是一种常用的植物基因转移方法，适用于多种植物，包括棉花，A正确； B、花粉管通道法可以直接实现转基因植物的自然生成，而农杆菌转化法还需要对成功导入目的基因的受体细胞进行植物组织培养获得转基因植物，故花粉管通道法避免了植物组织培养这一操作，B正确； C、授粉过程需要在雌蕊成熟后，因此，花粉管通道法也应该必须在雌蕊成熟时才能进行图中所示的处理方法，C正确； D、要让目的基因进入受体细胞后能稳定存在并得到复制和表达，不管采用什么导入方法，都需要构建重组载体才能实现，外源DNA也需要构建基因表达载体，才能借助花粉管通道进入受体细胞并表达，D错误。 故选ABC。 15．（2025·江西景德镇·三模）CRISPR/Cas9基因编辑技术根据靶基因序列设计向导sgRNA，精确引导核酸酶Cas9切割与sgRNA配对的DNA，相关酶在修复断裂DNA的过程中会改变连接部位的碱基序列。科研人员通过删除编码PD-1蛋白基因的2、3、4片段造成蛋白质的功能缺失，制作PD-1基因敲除鼠的流程如图1所示。已知P1和P2是PCR的引物，下列相关分析正确的是（    ） A．核酸酶Cas9敲除2、3、4片段作用在磷酸二酯键，引起的变异属于基因重组 B．如果想让某个基因失去功能，也可以利用基因编辑来破坏目的基因 C．欲将基因的2、3、4共3个片段切除，敲除前需要设计2个向导sgRNA D．sgRNA会因错误结合而出现“脱靶”现象，一般sgRNA序列越短，脱靶率越低 【答案】BC 【分析】电泳是指带电粒子在电场的作用下，向与其携带电荷相反的电极迁移的过程。不同带电粒子因分子大小、形状、所带电荷等因素不同，迁移速率也会有所差异。核酸是带负电的生物大分子，其迁移速率主要受核酸片段长度的影响，在电场强度一定时，核酸分子越大，向正极迁移速率越慢。 【详解】A、核酸酶Cas9敲除2、3、4片段作用在磷酸二酯键，这种变异是由于基因中碱基对的缺失导致的，属于基因突变，而不是基因重组，A错误； B、因为基因编辑技术可以通过对基因进行切割、修复等操作改变基因结构，所以如果想让某个基因失去功能，利用基因编辑来破坏目的基因是可行的，B正确； C、要将基因的2、3、4共3个片段切除，需要在2片段的上游和4片段的下游分别设计一个向导sgRNA，共2个向导sgRNA，这样才能精准定位并切割相应区域，C正确； D、sgRNA会因错误结合而出现“脱靶”现象，一般sgRNA序列越长，与靶序列的特异性结合越强，脱靶率越低；序列越短，特异性越差，脱靶率越高，D错误。 故选BC。 16．（2025·湖南郴州·三模）蛋白A是动物细胞分泌的一种优质蛋白，为使得大肠杆菌具备合成蛋白A的能力，研究人员进行了如图1所示的操作，图2表示3种限制酶的切割位点。下列叙述正确的是（　　） A．利用PCR技术扩增基因A应选择的一对引物是引物2和引物3 B．为使得扩增出的目的基因带有限制酶的切割序列，上游引物序列为5'……GGATCCATTACGGATCG……3' C．抗生素M应为氯霉素，在该平板上能生长的菌落就是含有重组质粒的大肠杆菌 D．从动物细胞提取DNA扩增获得的基因A正确导人大肠杆菌后能正常表达出蛋白质A 【答案】AB 【分析】1、PCR原理：在高温作用下，打开DNA双链，每条DNA单链作为母链，以4种游离脱氧核苷酸为原料，合成子链，在引物作用下，DNA聚合酶从引物3'端开始延伸DNA链，即DNA的合成方向是从子链的5'端自3'端延伸的。实际上就是在体外模拟细胞内DNA的复制过程。 2、基因工程的基本操作步骤包括获取目的基因、构建重组DNA分子、将重组DNA 分子导入受体细胞、检测目的基因及其表达产物等。 【详解】A、引物均是5'端→3'端，且根据目的基因部分已知序列设计合成，与目的基因3'端（—OH端）碱基互补配对，扩增基因A应选择的是引物2和引物3，A正确； B、由图1可知上游引物2序列应为5'…ATTACGGATCG…3'，由于目的基因需要插入载体的启动子和终止子之间，故需要的限制酶为BamHⅠ和SalⅠ，根据图2中限制酶的酶切位点可知，为使得扩增出的目的基因带有限制酶的切割序列应添加在引物的5'端，综上应选择的引物2是5'……GGATCCATTACGGATCG……3'，B正确； C、图1中质粒插入目的基因时，四环素抗性基因被破坏了，所以制备含抗生素M的培养基时，抗生素M是指氯霉素，但能在平板上生长的菌落可能是含有空载质粒的大肠杆菌，C错误； D、从动物细胞提取DNA扩增获得的基因A中含有内含子序列，直接导入原核生物中转录翻译，过程中没有相应的加工过程，所以不能正确表达出分泌蛋白质A，D错误。 故选AB。 17．（2025·吉林·三模）春季是感冒多发季，很多人感染甲流或细菌性感冒，出现高烧、咳嗽、乏力、呕吐等症状，为确诊病原体是否为甲流病毒（遗传物质为单链RNA），通常采用PCR和琼脂糖凝胶电泳技术鉴定，以下分析正确的是（    ） A．呼吸道取样，提取RNA，先逆转录成cDNA，再进行PCR扩增 B．PCR扩增时，引物越短，特异性越强，鉴定时只出现特异性条带 C．电泳原理是利用DNA的带电粒子向与它所带电荷相反的电极移动 D．若确诊患者感染甲流病毒，可通过注射抗生素进行治疗 【答案】AC 【分析】有关PCR技术的相关知识： （1）概念：PCR全称为聚合酶链式反应，是一项在生物体外复制特定DNA的核酸合成技术。 （2）原理：DNA复制。 （3）前提条件：要有一段已知目的基因的核苷酸序以便合成一对引物。 （4）过程：①高温变性：DNA解旋过程；②低温复性：引物结合到互补链DNA上；③中温延伸：合成子链。PCR扩增中双链DNA解开不需要解旋酶，高温条件下氢键可自动解开。 【详解】A、由于RNA相比DNA稳定性差，往往将病毒样本的RNA反转录成cDNA，扩增之后进行分段测序，A正确； B、用于PCR的引物长度通常为20～30核苷酸。引物越短，特异性越弱，B错误； C、电泳原理是利用DNA的带电粒子向与它所带电荷相反的电极移动，C正确； D、抗生素往往用于治疗细菌感染而引起的疾病，对于甲流病毒引起的感冒应选择抗病毒药物，D错误。 故选AC。 三、实验题 18．（2025·山西晋中·三模）聚乙烯（PE）塑料因结构稳定难以降解，易造成“白色污染”。某研究团队拟通过基因工程改造大肠杆菌，使其分泌PE降解酶，并通过发酵工程规模化生产该工程菌。请回答下列问题： (1)基因表达载体的构建过程中常采用两种不同的酶进行切割，使用双酶切的优点是 。 (2)尽管目的基因成功导入大肠杆菌，大肠杆菌也未必能成功产生PE降解酶，可能的原因有 （答出1点）。 (3)为检验工程菌对PE的降解效果，科研人员设计了对照实验，对照组为含PE薄膜的培养基+普通大肠杆菌，实验组的处理是 ，其他条件相同且适宜，培养一段时间后，可观察的指标包括 （答出2项）。 (4)若在实际应用中发现用发酵工程产生的发酵液处理PE，PE被降解的效率较低，则可能的原因是 （答出2点）。 (5)科学家在工程菌中引入“自杀基因”，使其在特定环境信号（如光照、特定化学物质缺乏）下启动自毁程序。科学家这样设计的意义是 。 【答案】(1)使目的基因定向插入载体，避免载体和目的基因反向连接或自身环化 (2)目的基因未能成功转录；目的基因转录产生的mRNA未能正常翻译产生PE降解酶 (3) 含PE薄膜的培养基+（大肠杆菌）工程菌 培养基中PE薄膜的重量减少量；PE薄膜表面的破损程度（或透明圈形成） (4)工程菌中目的基因表达量不足、酶分泌能力不足、酶活性低、发酵条件（如温度、pH、溶氧量）不适宜、PE分散不均等 (5)避免“工程菌”释放到环境中引发生态风险 【分析】基因工程技术的基本步骤：目的基因的获取；基因表达载体的构建；将目的基因导入受体细胞；目的基因的检测与鉴定。 【详解】（1）用一种酶切割目的基因和载体时，产生的两端切口相同，容易发生目的基因的自身环化和倒接到运载体上，因此双酶切的优点是使目的基因定向插入载体，避免载体和目的基因反向连接或自身环化。 （2）目的基因成功导入大肠杆菌，大肠杆菌也未必能成功产生PE降解酶，原因可能是目的基因未能成功转录；目的基因转录产生的mRNA未能正常翻译产生PE降解酶。 （3）实验目的是检验工程菌对PE的降解效果，自变量是菌种的类型，因此对照组为含PE薄膜的培养基+普通大肠杆菌，实验组的处理含PE薄膜的培养基+（大肠杆菌）工程菌，因变量是PE的降解效果，因此可观察的指标包括培养基中PE薄膜的重量减少量；PE薄膜表面的破损程度（或透明圈形成）。 （4）用发酵工程产生的发酵液处理PE，PE被降解的效率较低，则可能的原因是工程菌中目的基因表达量不足、酶分泌能力不足、酶活性低、发酵条件（如温度、pH、溶氧量）不适宜、PE分散不均等 （5）科学家在工程菌中引入“自杀基因”，使其在特定环境信号（如光照、特定化学物质缺乏）下启动自毁程序的意义是避免“工程菌”释放到环境中引发生态风险。 19．（2025·四川乐山·三模）我国科学家将抗虫基因A、抗冻基因B导入番茄，获得了抗虫、耐寒的转基因番茄。所选用的抗虫基因A、抗冻基因B及质粒的限制酶切割位点如图所示。 (1)将抗虫基因A和质粒连接的过程需要用到的酶有 （填图中限制酶）和DNA连接酶。将抗虫基因A与质粒连接后，再将抗冻基因B连接到重组质粒上所用的限制酶是 。 (2)构建好的基因表达载体需要通过一定的方式才能进入受体细胞。我国科学家采用了他们独创的一种方法 ，将目的基因导入番茄细胞。除此之外，将目的基因导入植物细胞常用的方法还有农杆菌转化法。 (3)农杆菌细胞内含有Ti质粒，当它侵染植物细胞后，能将Ti质粒上的T-DNA转移到 ，并且将其整合到 上。 (4)抗虫基因A导入番茄细胞后，若要检测抗虫基因A是否插入番茄染色体中，需要从番茄细胞中提取 进行DNA分子杂交，DNA分子杂交时应使用的探针是 。 (5)若要通过实验检测抗虫基因A在番茄细胞中是否表达为抗虫蛋白，请简要写出实验思路 。 【答案】(1) NdeI、XbaI BamHI (2)花粉管通道法 (3) 被侵染的细胞 该细胞的染色体DNA (4) 核染色体DNA 被标记的抗虫基因A的单链DNA片段 (5)取转基因番茄叶片细胞提取蛋白质，用抗虫蛋白A的抗体进行抗原—抗体杂交。若出现特异性杂交带，则表明抗虫基因A成功表达 【分析】1、基因工程的一般操作步骤有：目的基因的获取、基因表达载体的构建、目的基因导入受体细胞、目的基因的检测与表达；其中获取的目的基因常用PCR技术进行扩增；基因工程的工具酶有限制酶和DNA连接酶，通常要用同一种限制酶分别切割质粒和含目的基因的DNA片段，然后再用DNA连接酶连接成重组质粒。 2、PCR技术：概念：PCR全称为聚合酶链式反应，是一项在生物体外复制特定DNA的核酸合成技术。原理：DNA复制。前提条件：要有一段已知目的基因的核苷酸序以便合成一对引物。条件：模板DNA、四种脱氧核苷酸、一对引物、热稳定DNA聚合酶（Taq酶）。过程：①高温变性：DNA解旋过程；②低温复性：引物结合到互补链DNA上；③中温延伸：合成子链．PCR扩增中双链DNA解开不需要解旋酶，高温条件下氢键可自动解开。 【详解】（1）利用同一种限制酶切割质粒和目的基因产生的黏性末端相同，这样容易导致质粒和目的基因自身环化。据图可知，抗虫基因A的两端含有限制酶Nde I和Xba I识别位点，质粒中也有这两种酶的识别位点，因此将抗虫基因A和质粒连接的过程需要用到的酶有Nde I和Xba I分别切割目的基因，然后用DNA连接酶连接起来。抗冻基因B的两端和质粒中都存在限制酶BamH I识别位点，因此将抗虫基因A与质粒连接后，再将抗冻基因B连接到重组质粒上所用的限制酶是BamH I。 （2）构建好的基因表达载体需要通过一定的方式才能进入受体细胞，将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法，我国科学家独创的转基因操作方法是花粉管通道法。 （3）当农杆菌侵染植物细胞后，能将Ti质粒的T-DNA转移到被侵染的细胞（受体细胞），并且将其整合到受体细胞的染色体DNA上。 （4）若要检测目的基因是否插入染色体中，提取番茄细胞中核染色体DNA进行DNA分子杂交。基因探针是一段被标记的抗虫基因A的单链DNA片段，能与目的基因进行碱基互补配对。 （5）由于抗原与抗体的结合具有特异性，故若要通过实验检测目的基因在受体细胞中是否表达出相应蛋白质，即可以以转基因番茄叶片细胞为材料提取蛋白质，用抗虫蛋白A的抗体进行抗原—抗体杂交；若出现杂交带，则证明表达出相应蛋白质。 20．（2025·安徽·三模）流感病毒分为甲、乙、丙三型，根据H抗原和N抗原不同，甲型流感病毒又分为许多亚型，其中H3N2主要感染人类，H5亚型毒株不仅对禽类危害大，还能感染人类。某科研团队基于人一禽流感共预防的设想，尝试了共表达DNA疫苗—p—H5/H3质粒的策略。回答下列问题： (1)获取H3病毒和H5病毒的RNA，通过 过程得到它们的DNA，并进一步获取H3基因和H5基因。 (2)利用p质粒和H3基因、H5基因构建p—H5/H3的设计思路如下图；其中限制酶XhoI、NheI、ClaI识别序列和切割位点分别是：5′-C↓TCGAG-3'、5′-G↓CTAGC-3'、5′-AT↓CGAT—3'。 ①任选限制酶XhoI、NheI和ClaI中的一种，写出经其切割产生的DNA片段的末端 。 ②据图判断，过程Ⅱ中处理p—H5质粒的限制酶是 ；参照图中H3基因上限制酶切割位点的标识方法，标出H5基因上限制酶的切割位点 。 (3)结果检测：实验组小鼠分别注射p—H5/H3、p—H5、p—H3，对照组注射质粒p，在完成三次免疫的10天后从脾脏中分离淋巴细胞，分别加入H5或H3流感亚型病毒，进行特异性刺激，48h后进行淋巴细胞增殖检测；检测结果表明，p—H5/H3可以针对相关亚型流感病毒形成有效保护。 ①从脾脏中分离淋巴细胞，是因为 。 ②进行淋巴细胞增殖检测时，悬浮细胞用离心法收集，贴壁细胞的收集方法是 。 【答案】(1)逆转录/反转录 (2) 或或 ClaI和XhoI (3) 脾脏是淋巴（或免疫）细胞集中分布的场所 （弃去培养液，）加入胰蛋白酶消化后，离心收集 【分析】基因工程技术的基本步骤：（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。（4）目的基因的检测与鉴定。 【详解】（1）由RNA到DNA的过程是逆转录过程，故获取H3病毒和H5病毒的RNA，通过逆转录过程得到它们的DNA，并进一步获取H3基因和H5基因。 （2）①据图分析， XhoI的识别序列是 5′‐C↓TCGAG‐3′，其对应的模板链是3'-GAGCTC-5'，在C↓T之间切割后可形成的黏性末端（同理可得NheI和ClaI的切割后的末端分别是）。 ②分析图示，观察p一H5/H3及H基因上的限制酶的识别序列与切割位点，判断过程I中处理 pH-5质粒的限制酶是ClaT和XhoI；参照 H3 基因两端所标示的限制酶切点方法，可在 H5 基因右侧标出 XhoI 的切割位点(左侧与质粒连接处为 NheI，右侧与质粒连接处为 XhoI)，故绘制图形如下： （3）①由于脾脏是淋巴（或免疫）细胞集中分布的场所，含有大量的淋巴细胞，故从脾脏中分离淋巴细胞。 ②进行淋巴细胞增殖检测时，悬浮细胞用离心法收集，贴壁细胞的收集方法是（弃去培养液，）加入胰蛋白酶消化后，离心收集。 21．（2025·河南开封·三模）河南省伏牛山地区分布着多种耐旱植物，柽柳是其中重要的生态修复物种。研究发现，柽柳基因的表达产物可显著增强植物对干旱和高盐胁迫的耐受性。某科研团队利用下图所示质粒构建基因表达载体，然后通过农杆菌转化法将基因导入伏牛山濒危植物太行花中，以提高其抗逆性。回答下列问题。 (1)启动子①应与基因链的 (填“3'”或“5'”)端相连。 (2)为验证转化后的农杆菌是否携带重组质粒，该科研团队采用多重技术(一种在单次反应中通过多对引物同时扩增多个目标序列的技术)进行检测。具体方法为：将下表所示的3对引物加入同一体系中，对转化后的农杆菌进行扩增，扩增产物通过琼脂糖凝胶电泳进行分离检测。 引物 扩增片段 扩增基因 扩增基因 扩增基因 转化成功的农杆菌电泳结果应显示 个条带；如果用同样的方法检测转化成功的太行花植株，结果仅显示2个条带，原因是 。 (3)已知组成型启动子可以持续、高效地启动基因的表达，干旱诱导型启动子仅在干旱胁迫下启动基因表达。若将启动子①设计为干旱诱导型启动子，则启动子②应设计为 (填“组成”或“干旱诱导”)型启动子，这样导入太行花组织细胞的结果是 。 (4)科研团队对转基因太行花进行 水平验证，结果显示转基因太行花的抗逆性并未达到预期。为提升蛋白的生物活性，科研团队计划通过蛋白质工程对其进行改造。以下是相关步骤(含2个干扰项)，请按正确顺序排列： 。 ①通过射线衍射技术分析原始蛋白的盐碱敏感区域空间结构 ②利用计算机优化原始蛋白三维构象 ③采用定点突变技术修改基因的脱氧核苷酸序列 ④通过技术随机诱变基因序列 ⑤推导出耐盐碱功能所需的关键氨基酸替换位点 ⑥将改造后的基因导入受体细胞并检测其耐盐碱能力 ⑦推测出序列并人工合成新的氨基酸链 【答案】(1)5’ (2) 3 农杆菌中的 基因不会被整合到植物基因组中 (3) 组成 在干旱条件下，NtNAC1 基因表达增强，提高植物的抗逆性 (4) 个体/个体水平 ① → ⑤ → ② → ③ → ⑥ 【分析】基因工程技术的基本步骤：1、目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。2、基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。3、将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法。4、目的基因的检测与鉴定：分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA是否插入目的基因--DNA分子杂交技术；②检测目的基因是否转录出了mRNA--分子杂交技术；③检测目的基因是否翻译成蛋白质--抗原-抗体杂交技术。个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。 【详解】（1）启动子①应与 NtNAC1 基因的 5’ 端相连，启动子是RNA聚合酶识别和结合的位点，使得转录开始； （2）转化成功的农杆菌电泳结果应显示 3 个条带，包括基因，基因，基因；如果用同样的方法检测转化成功的太行花植株，结果仅显示 2 个条带，原因是 农杆菌中的 Hyg 基因不会被整合到植物基因组中，所以不会显示出Hyg基因对应的条带； （3）若将启动子①设计为干旱诱导型启动子，则启动子②应设计为 组成 型启动子，这样导入太行花组织细胞的结果是 在干旱条件下，NtNAC1 基因表达增强，提高植物的抗逆性； （4）科研团队对转基因太行花进行 个体水平验证，结果显示转基因太行花的抗逆性并未达到预期。为提升 NtNAC1 蛋白的生物活性，科研团队计划通过蛋白质工程对其进行改造。以下是相关步骤（含2个干扰项），请按正确顺序排列：① → ⑤ → ② → ③ → ⑥。 22．（2025·陕西咸阳·三模）水稻在生长过程中容易感染病虫害，从而引起作物减产。C蛋白和V蛋白分别对水稻螟蛾科害虫和夜蛾科害虫有较强的杀伤效果，科研人员构建了C—V抗虫融合基因（简称C—V基因）表达载体，通过农杆菌转化法将C—V基因表达载体导入水稻叶肉细胞，使其表达出C—V联合蛋白，从而培育出转基因抗虫水稻新品种，过程如图1。所示。回答下列问题：    (1)科研人员进行PCR1和PCR2时，扩增体系中需要分别加入C基因和V基因，其作用均是 。 (2)据图分析，PCR扩增时需要设计引物，为了使C基因和V基因能够正确相连，设计引物2和引物3时，引物序列除了能与模板DNA结合，还需要遵循的原则是 ，因此PCR1和PCR2需要在 （填“同一个”。或“不同”）PCR反应体系中进行。同时，为了使连接后的C—V基因能够正确插入载体中，需要在引物1和引物4的5端插入相关 酶的识别序列。 (3)进行PCR3时，不需要额外添加引物，此反应体系中具有引物效果的是 。 (4)用抗C蛋白抗体和抗V蛋白抗体检测转基因抗虫水稻中的蛋白质，结果如图2所示，1～7为被检测的转基因抗虫水稻，WT表示野生型水稻。    ①转基因抗虫水稻6体内未检测到C蛋白和V蛋白，其原因可能是 （答两点）。 ②为评价转基因抗虫水稻的抗虫效果，探究思路是向非转基因水稻和转基因抗虫水稻 （填序号）接种等量的 ，观察其抗虫效果。 【答案】(1)提供DNA复制的模板 (2) 引物2和引物3的5'端存在部分碱基序列能互补配对 不同 限制 (3)C基因和V基因的两条添加了引物2、3序列的DNA链 (4) 转基因抗虫水稻6中的C-V基因不能转录，转基因抗虫水稻6中的C-V基因转录产生的mRNA不能翻译，转基因抗虫水稻6中未导入C-V基因（或导入的是空载体） 2、5、7 水稻螟蛾科害虫和夜蛾科害虫 【分析】基因工程技术的基本步骤： （1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成； （2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等； （3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样．将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法； （4）目的基因的检测与鉴定：分子水平上的检测和个体水平上的鉴定。 【详解】（1）扩增体系中需要加入C基因和V基因，其作用是提供DNA复制的模板； （2）设计引物2和引物3时，引物序列除了能与模板DNA结合，还需要引物2和引物3的5'端存在部分碱基序列能互补配对。由于引物2和引物3部分碱基序列互补，若在同一PCR反应体系中进行PCR1、PCR2，则可能会出现引物互补及降低PCR效率等情况，因此PCR1 和PCR2需要在不同PCR反应体系中进行。同时，为了使连接后的C-V基因能够插入载体中，需要在引物1和引物4的5'端插入限制酶的识别序列； （3）通过PCR1 和PCR2扩增反应得到C基因和V基因有部分碱基序列互补，以两者为模板进行PCR3扩增反应时，C基因和V基因的两条添加了引物2、3序列的DNA链具有引物效果； （4）①根据图2电泳结果可知，转基因抗虫水稻2、5、7成功导入C-V基因且能表达，而转基因抗虫水稻6体内未检测到C蛋白和V蛋白，可能是因为转基因抗虫水稻6中的C-V基因不能转录或C-V基因转录产生的mRNA不能翻译，还可能是因为转基因抗虫水稻6中未导入C-V基因； ②若要评价转基因抗虫水稻的抗虫效果，则应该向非转基因水稻和转基因抗虫水稻2、5、7接种等量的水稻螟蛾科害虫和夜蛾科害虫，然后观察其抗虫效果。 23．（2025·湖南永州·三模）在应对全球粮食危机和气候变化的双重挑战下，中国科学家团队研发了人工淀粉合成途径（ASAP），利用10余种酶将CO2和H2O高效转化为淀粉。现需构建重组大肠杆菌来合成其中的三种关键酶：酶a（基因A，1.5kb）、酶b（基因B，2.0kb）和酶c（基因C，2.5kb），科研人员选择质粒pET28a（5.3kb）为载体。将从甲植物中扩增出的基因A、B、C依次插入到多克隆位点（MCS，约含30个碱基对），如下图所示。回答下列有关问题： 注：①F1~F3、R1~R3为引物；P1~P5为启动子；KanR为卡那霉素抗性基因；ori为复制原点。②限制酶SalⅠ与XhoⅠ的识别序列不同，但酶切后产生的粘性末端相同。 (1)启动子决定了基因的转录位置和方向，从转录角度分析图中P1、P3与P2的相对方向不同的原因是 。在构建基因表达载体时，为了使来自甲植物的基因A、B、C在受体菌中高效表达，其上游的启动子P4应选择 （填“甲植物”或“大肠杆菌”）的启动子。 (2)pET28a中只有一个SalⅠ和NotⅠ酶切位点，且无酶XhoⅠ的识别序列。为了使基因A、B、C依次正向插入pET28a的MCS中，在PCR扩增基因A、B、C时需在引物 的5'端添加限制酶XhoⅠ的识别序列，其它引物的5'端添加限制酶 的识别序列。 (3)初步检验重组质粒pET28a-ABC是否构建成功：获取部分重组质粒，用限制酶SalⅠ、NotⅠ、XhoⅠ充分处理，电泳分离酶切产物。从泳道中的条带数量和大小分析（过小的DNA片段无法通过电泳有效检测出来），当电泳结果为 时，表明成功构建了pET28a-ABC。 (4)将重组质粒导入大肠杆菌前，需先用钙离子处理大肠杆菌，作用是 。最后利用 工程对纯化的转基因大肠杆菌大规模培养生产酶。 (5)与植物光合作用合成淀粉不同，“人工合成淀粉途径”实现了在实验室中从CO2到淀粉分子的全合成。该研究成果尚处于实验室阶段，若未来能够大面积推广应用，可解决当前人类面临的哪些生态环境问题： （至少答出两点）。 【答案】(1) 基因A、B、C转录的模板链不同 大肠杆菌 (2) F1、F2、F3 SalⅠ、NotⅠ (3)出现1条泳带，大小约为11.3kb (4) 使大肠杆菌细胞处于感受态 发酵 (5)能节约大量耕地；能减少水资源消耗；可以减少因农药、化肥的使用带来的环境污染；能缓解温室效应，促进“碳中和” 【分析】基因工程技术的基本步骤：目的基因的获取：利用PCR技术扩增和人工合成。基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。目的基因的检测与鉴定。 【详解】（1）转录是以基因的一条链（模板链）为模板合成RNA的过程，基因A、B、C转录的模板链不同，P1、P3与P2的相对方向不同；将从甲植物中扩增出的基因转到大肠杆菌中表达，宿主细胞是大肠杆菌，因此目的基因上游的启动子P4应选择大肠杆菌的启动子。 （2）为了使基因A、B、C依次正向插入pET28a的MCS中，需要在目的基因两侧加入相应限制酶的识别序列，PCR扩增时合成子链的方向为5，→3，，即在引物的3，端加入原料合成子链，且基因A、B、C均经XhoⅠ+NotⅠ酶切，因此在PCR扩增基因A、B、C时需在引物F1、F2、F35，端添加限制酶XhoⅠ的识别序列，其它引物的5'端添加限制酶SalⅠ或NotⅠ，限制酶SalⅠ与XhoⅠ的识别序列不同，但酶切后产生的粘性末端相同，且质粒经SalⅠ、NotⅠ酶切。 （3）酶a（基因A，1.5kb）、酶b（基因B，2.0kb）和酶c（基因C，2.5kb），选择质粒pET28a（5.3kb）为载体，依次插入到多克隆位点（MCS，约含30个碱基对），构建的重组质粒pET28a-ABC大小为1.5+2.0+2.5+5.3-0.03≈11.3kb。在电泳中显示为一条带。 （4）钙离子处理大肠杆菌，可以增大细胞膜的通透性，使大肠杆菌细胞处于感受态；发酵工程，是指采用现代工程技术手段，利用微生物的某些特定功能，为人类生产有用的产品，或直接把微生物应用于工业生产过程的一种新技术。利用发酵工程对纯化的转基因大肠杆菌大规模培养生产酶。 （5）“人工合成淀粉途径”实现了在实验室中从CO2到淀粉分子的全合成，能节约大量耕地；能减少水资源消耗；可以减少因农药、化肥的使用带来的环境污染；能缓解温室效应，促进“碳中和”。 24．（2025·河南·三模）IKK激酶山IKKα、IKKβ和IKKγ三种亚基组成，该酶参与动物体内免疫细胞的分化。临床上发现某重症联合免疫缺陷（SCID）患儿的IKKβ基因编码区第1183位碱基T突变为C。为研究该患儿发病机制，研究人员应用大引物PCR定点诱变技术获得突变基因，并培育出SCID模型小鼠。图1为定点诱变获得突变基因的过程。 (1)在定点诱变获取突变基因时，PCR1中使用的引物有 ，PCR2中使用的引物有 。PCR1和PCR2不能在同一个反应体系中进行，原因是 。 (2)PCR在第一个循环之前通常将DNA样品加热至95℃数分钟进行预变性处理，其目的是 。由于大引物较长，含C与G的碱基较多，为减少非目标基因的获得，在PCR2复性过程中应采取的措施是 。 (3)培育模型鼠的过程中，需用限制酶SacⅠ、HindⅢ对突变基因和载体进行双酶切，双酶切的优点是 。研究人员经鉴定、筛选获得一只转基因杂合鼠HE，让HE与野生鼠杂交得F1，F1雌雄鼠随机交配得F2。对F2中纯合野生鼠WT、纯合突变鼠HO、杂合鼠HE三种小鼠胸腺淋巴细胞中组成IKK激酶的三种亚基进行提纯和电泳，结果如图2。据此结果推测SCID患者免疫缺陷产生的机制是 。 【答案】(1) 引物A、引物C 引物B、大引物b 引物之间能结合，会干扰引物和模板链的结合，影响PCR过程 (2) 增加大分子模板DNA彻底变性的概率 适当提高退火温度 (3) 防止质粒和目的基因的自身环化及反向连接 IKKβ基因突变导致IKKβ含量减少，IKK激酶活力降低，不利于免疫细胞的分化 【分析】PCR是利用DNA在体外摄氏95°高温时变性会变成单链，低温（经常是60°C左右）时引物与单链按碱基互补配对的原则结合，再调温度至DNA聚合酶最适反应温度（72°C左右），DNA聚合酶沿着磷酸到五碳糖(5'-3')的方向合成互补链。基于聚合酶制造的PCR仪实际就是一个温控设备，能在变性温度，复性温度，延伸温度之间很好地进行控制。 【详解】（1）在PCR反应体系中，需要加入引物和IKKβ基因外，还需要加入TaqDNA聚合酶（耐高温DNA聚合酶）、4种脱氧核苷酸（原料）、缓冲液（维持pH）、Mg2+（激活DNA聚合酶）等；在图1获取突变基因过程中，分析题图可知，在PCR1中，需要两种引物，将来在切取IKKβ基因时，需要在基因的左侧用限制酶HindⅢ来切割，在基因的右侧用限制酶SacⅠ来切割，因此在该基因的左端应有限制酶HindⅢ识别的序列，在基因的右端应有限制酶SacⅠ识别的序列，因此在PCR1中结合到基因右端的引物序列从5′到3′端的开始部位应含有限制酶SacⅠ识别的序列，所以要用到引物C，从题图中看，另一个引物从5′到3′端的序列中开始部位应含有突变碱基C，所以要用到引物A。从图中看，在PCR2中，有一个引物结合到了基因的左端，在它从5′到3′的序列的开始部位应含有限制酶HindⅢ识别的序列，所以要用到引物B，而另外的一个引物就是大引物中的一条链，它应该结合到基因的右端，且从5′到3′端的序列中开始部位应含有SacⅠ识别的序列，从图中看，它是大引物的b链。由于PCR1和PCR2过程使用的引物之间能结合，因而会干扰引物和模板链的结合，影响PCR过程，因此PCR1和PCR2不能在同一个反应体系中进行，需要分开进行。 （2）PCR在第一个循环之前通常将DNA样品加热至95℃数分钟进行预变性处理，这样可以增加大分子模板DNA彻底变性的概率，为后续的PCR过程创造条件。由于大引物较长，含C与G的碱基较多，为减少非目标基因的获得，在PCR2复性过程中应适当提高退火温度，便于引物与模板链的结合。 （3）培育模型鼠的过程中，需用限制酶SacⅠ、HindⅢ对突变基因和载体进行双酶切，双酶切能保证质粒和目的基因的正确连接，避免自身环化及反向连接。研究人员经鉴定、筛选获得一只转基因杂合鼠HE，让HE与野生鼠杂交得F1，F1雌雄鼠随机交配得F2。对F2中纯合野生鼠WT、纯合突变鼠HO、杂合鼠HE三种小鼠胸腺淋巴细胞中组成IKK激酶的三种亚基进行提纯和电泳，结果显示HO小鼠体内不含IKKβ或含量很少，因而可推测IKKβ基因突变导致IKKβ含量减少，IKK激酶活力降低，不利于免疫细胞的分化，进而导致SCID患者表现为免疫缺陷。 25．（2025·江西景德镇·三模）已知酿酒酵母菌不能吸收纤维素，科研人员利用基因工程技术将EG基因等基因分多步导入酿酒酵母菌，获取可以直接利用纤维素发酵的酿酒酵母工程菌。 (1)构建基因表达载体是基因工程的核心步骤，科研人员采用以下两种方法构建含有EG基因的表达载体。 ①双酶切法：如上图标注了载体、EG基因的限制酶切点、EG基因两端的部分序列，已知酿酒酵母菌不能合成尿嘧啶，图中的标记基因为尿嘧啶合成基因。 结合图中信息分析，在扩增EG基因时应在引物的 （填“5'”或“3'”）端添加 限制酶的识别序列，设计的引物序列为 。（从5'端书写，写出前12个碱基序列即可） ②同源重组法：是指发生在两个DNA分子的同源序列（DNA序列相同或近似）之间直接进行交换的一种重组形式。利用同源重组的方法可以将目的基因插入到表达载体上，如右图所示。该操作可通过PCR技术在任一位点实现质粒的线性化，只要将目的基因两端带有与线性化质粒两端同源的DNA序列，在重组酶的作用下即可实现质粒上的同源重组，被称为体外同源重组。真核生物有性生殖过程中发生在 之间的基因重组，为体外同源重组提供了依据。与双酶切法相比，同源重组法构建基因表达载体的突出优点是 。 (2)导入上述重组质粒的酿酒酵母菌应在 的培养基上筛选培养。将筛选得到的菌株接种到液体培养基中培养一段时间，通过检测 ，以确定其发酵效果。 【答案】(1) 5' BamHI、Sacl 5'GGATCCGAATCG、5'GAGCTCAGCCTA 同源染色体非姐妹染色单体 在重组酶的作用下可以实现载体上任一点与目的基因的重组 (2) 不含尿嘧啶 酒精的含量 【分析】1、基因工程的操作步骤：目的基因的获取、基因表达载体的构建、目的基因导入受体细胞、目的基因的检测与鉴定。 2、PCR技术扩增目的基因 （1）原理：DNA双链复制 （2）过程： 第一步：加热至90～95℃使DNA解链； 第二步：冷却到55～60℃，引物结合到互补DNA链； 第三步：加热至70～75℃，热稳定DNA聚合酶从引物起始互补链的合成。 【详解】（1）①利用PCR扩增EG基因时，由于XbaⅠ会破坏EG基因，HindⅢ会破坏尿嘧啶合成基因，且保证目的基因的正确连接，需要在一对引物的5'端添加BamHI、Sacl两种限制酶识别序列。依据图中已知碱基序列和两种内切酶的识别序列，在PCR扩增仪中加入的引物的碱基序列为5'GGATCCGAATCG、5'GAGCTCAGCCTA。 ②真核有性生殖过程中发生在同源染色体非姐妹染色单体之间的基因重组，为体外同源重组提供了依据。由题意可知，同源重组可通过PCR技术在任一位点实现质粒的线性化，与双酶切法相比，同源重组法构建基因表达载体的突出优点是在重组酶的作用下可以实现载体上任一点与目的基因的重组。 （2）由题意可知，酿酒酵母菌不能合成尿嘧啶，图中的标记基因为尿嘧啶合成基因，所以应在不含尿嘧啶的培养基上筛选培养，一般酿酒酵母菌不能吸收纤维素，而酿酒酵母工程菌可以直接利用纤维素发酵，发酵的产物是酒精，所以将筛选得到的菌株接种到液体培养基中培养一段时间，通过检测酒精含量，可确定发酵效果。 26．（2025·内蒙古通辽·三模）组织型纤溶酶原激活剂（t-PA）是一种血栓溶解剂，难以从天然组织中提取或人工合成。科研人员从人胎盘染色体基因库中筛选出t-PA基因，将其与质粒结合，导入人黑色素瘤细胞中构建工程细胞，以生产t-PA。回答下列问题： (1)用PCR技术扩增t-PA基因时的步骤及设定的参数如图1所示。引物在步骤 中与模板链结合，步骤丁的目的是 。步骤戊应设定跳转到步骤 。 (2)PCR需要设计两种引物，如图2所示。图示中可作为引物的是 （填序号），原因是 。 (3)t-PA基因及构建表达载体的过程如图3所示。为保证t-PA基因与质粒高效连接，应选用图3中的限制酶 进行切割。 (4)与使用大肠杆菌为受体工程细胞相比，用人黑色素瘤细胞的优点是 。 【答案】(1) 丙 合成子链DNA 乙 (2) ②③ DNA聚合酶只能从引物的3′端开始连接脱氧核苷酸 (3)XmaⅠ和BglⅡ (4)人黑色素瘤细胞具有内质网和高尔基体，能对t-PA进行加工和修饰 【分析】1、作为运载体必须具备的条件：①能在受体细胞中复制并稳定保存； ②具有一至多个限制酶切点，供外源DNA片段插入；③具有标记基因，供重组DNA的鉴定和选择；④是安全的，对受体细胞无害，而且要易从供体细胞分离出来。 2、蛋白质工程是在基因工程基础上延伸出的第二代基因工程，因为是对现有蛋白质的改造或制造新的蛋白质，所以必须通过基因修饰或基因合成实现。通过蛋白质工程生产出来的蛋白质更加符合人类生产和生活的需要。 【详解】（1）步骤乙为高温解旋，步骤丙降低温度，使得引物与模板链结合,合成子链DNA；步骤丁为子链延伸；步骤戊应设定跳转到步骤乙，开始下一轮PCR，完成多次循环。 （2）引物与模板链的3'端结合，引物②③可作为图示DNA的引物；DNA聚合酶只能从引物的3′端开始连接脱氧核苷酸，因此只能选择引物②③来扩增t-PA基因。 （3）t-PA基因左侧的粘性末端为5，CCGG 3，，质粒上的XmaⅠ酶切后可以产生该黏性末端，t-PA基因右侧的粘性末端为5，GATC 3，，质粒上的BglⅡ酶切后可以产生该黏性末端，为保证t-PA基因与质粒高效连接，应选用图3中的限制酶XmaⅠ和BglⅡ。 （4）人黑色素瘤细胞具有内质网和高尔基体，与使用大肠杆菌为受体工程细胞相比，用人黑色素瘤细胞能对t-PA进行加工和修饰，使目的基因高效表达。 27．（2025·广西柳州·三模）IL—2（白细胞介素—2）是一种具有抗肿瘤作用的细胞因子，B7是诱导特异性免疫的共刺激分子。研究通过在肿瘤细胞中表达IL—2或联合表达IL—2、B7，诱导机体产生抗肿瘤免疫应答，为IL—2基因治疗进入临床提供依据。回答下列问题： (1)重组逆转录病毒的构建（部分过程见图1、图2）：根据图11-1进行分析，对逆转录病毒载体及IL-2基因片段都使用 （填序号）酶处理（A．EcoRI  B．HindIII  C．HpaI  D．BamHI），并在 酶的作用下连接获得IL-2重组载体。先用 处理大肠杆菌细胞，再将重组载体导入，扩增后提取大肠杆菌DNA鉴定目的基因。利用上述限制酶进行酶切，由图2可知，IL-2基因已定向插入载体内，基因长度约为 bp。将IL-2重组载体转染至CRIP细胞（某种能被逆转录病毒感染的宿主细胞），在多孔细胞板进行 培养并筛选阳性细胞，收集含有IL—2病毒的上清液。 (2)IL-2基因导入肿瘤细胞及表达检测：取病毒上清液感染小鼠胰腺癌细胞，提取肿瘤细胞内 ，构建RT—PCR（逆转录聚合酶链式反应）体系，分析确定肿瘤细胞内IL-2基因是否正常插入到染色体DNA。 (3)B7基因导入肿瘤细胞及表达检测：再将B7基因导入上述转基因肿瘤细胞，培养后提取蛋白质，加入带有荧光染料的单克隆抗体，利用 技术检测B7基因的表达水平。 (4)体内致瘤性实验：将同品系小鼠分成3组，背部皮下注射 肿瘤细胞的小鼠作为对照组，皮下注射已导入IL-2基因的肿瘤细胞的小鼠以及已导入IL-2和B7双基因的肿瘤细胞的小鼠作为实验组，观察小鼠肿瘤的生长情况，根据下图可以得出结论： ① ；② 。 (5)分析与讨论：IL—2是重要的免疫调节细胞因子，能诱导T淋巴细胞的增殖。转基因肿瘤细胞通过细胞因子的分泌调节激活了小鼠体内的 免疫，使机体产生抗肿瘤免疫效应。 【答案】(1) AD DNA连接 Ca2+ 300 克隆化 (2)RNA (3)抗原—抗体杂交 (4) 导入空载体（或“未转基因”“未导入外源基因”） 与对照组比较，导入ⅡL−2基因的肿瘤细胞和导入IL−2和B7双基因肿瘤细胞的小鼠的肿瘤生长受抑制 导入Ⅱ−2和B7双基因肿瘤细胞的小鼠比只导入Ⅱ−2基因肿瘤细胞的小鼠的肿瘤生长受抑制程度更大，出现肿瘤的时间延迟 (5)细胞 【分析】基因工程需要四个步骤：目的基因的筛选与获取、基因表达载体的构建、将目的基因导入受体细胞、目的基因的检测与鉴定。 【详解】（1）逆转录病毒载体上便于目的基因插入的限制酶有EcoR Ⅰ 、Hpa Ⅰ、Xho Ⅰ和BamH Ⅰ，IL-2基因片段及旁侧序列上有四个限制酶，分别是EcoR Ⅰ 、Hind Ⅲ 、Hpa Ⅰ和BamH Ⅰ，其中Hind Ⅲ 、Hpa Ⅰ位于基因内部，不能用于构建表达载体，所以选择逆转录病毒载体和IL-2基因片段共有的限制酶，即EcoR Ⅰ 和BamH Ⅰ。DNA连接酶能够能够将两个DNA片段连接起来，所以借助于DNA连接酶逆转录病毒载体及IL-2基因片段获得重组载体。将重组载体导入感受态大肠杆菌（用钙离子处理大肠杆菌），扩增后提取大肠杆菌DNA鉴定目的基因。比较图乙中空载体和重组载体的酶切图，重组载体比空载体多出300 bp的电泳条带，所以基因长度约为300 bp。将IL-2重组载体转染至CRIP细胞，在多孔细胞板进行克隆培养并筛选阳性细胞，收集含有IL-2病毒的上清液。 （2）IL-2基因导入肿瘤细胞及表达检测：取病毒上清液感染小鼠胰腺癌细胞，提取肿瘤细胞内RNA，构建RT-PCR（逆转录·聚合酶链式反应）体系，PCR结果利用琼脂糖凝胶电泳分析，确定肿瘤细胞内IL-2基因已正常转录。 （3） B7基因导入肿瘤细胞及表达检测：再将B7基因导入上述转基因肿瘤细胞，培养后提取蛋白质，加入单克隆抗体作探针，蛋白质之间存在相互作用，所以利用抗原-抗体杂交技术检测B7基因的表达水平。 （4）将同品系小鼠分成三组，背部皮下注射未导入外源基因肿瘤细胞的小鼠作为对照组，皮下注射导入IL−2基因的肿瘤细胞、导入lL−2和B7双基因的肿瘤细胞作为实验组，观察小鼠肿瘤的生长情况。图3横坐标是肿瘤细胞接种后的天数，纵坐标是肿瘤的平均直径。随着肿瘤接种后天数的增加，对照组、实验组（导入IL−2基因的肿瘤细胞及导入lL−2和B7双基因的肿瘤细胞）的肿瘤直径均增加，在相同时间内，两个实验组的肿瘤直径增加值均低于对照组，且导入IL−2和B7双基因的肿瘤细胞的直径增加值低于导入IL−2基因的肿瘤细胞的，由此可以得出结论：①与对照组比较，导入IL−2基因的肿瘤细胞和导入IL−2和B7双基因肿瘤细胞的小鼠的肿瘤生长受抑制；②导入IL−2和B7双基因肿瘤细胞的小鼠比只导入IL−2基因肿瘤细胞的小鼠的肿瘤生长受抑制程度更大，成瘤时间延迟。 （5）肿瘤的裂解要依赖于活化的细胞毒性T细胞，IL-2是重要的免疫调节细胞因子，能诱导T淋巴细胞的增殖。转基因肿瘤细胞通过细胞因子的分泌调节激活了小鼠体内的细胞免疫，使机体产生抗肿瘤免疫效应。 四、解答题 28．（2025·山西·三模）某研究者用基因工程技术获得目的基因高效表达的大肠杆菌，构建重组质粒时，用EcoRI和KpnI两种限制酶同时切割质粒。图甲为两种质粒，其中lacZ基因编码产生的β-半乳糖苷酶可以分解X-gal产生蓝色物质，使菌落呈现蓝色，否则菌落为白色。图乙为目的基因（呈现出两端的部分碱基序列）。图丙为限制酶识别序列及切割位点。请回答下列问题： (1)不选用图甲中质粒B的原因是 。 (2)为保证目的基因能与质粒A正确连接，科研人员需利用PCR技术修饰并扩增目的基因，所设计的一对引物的碱基序列分别为5'- -3'、5'- -3'（只写出前10个碱基）。 (3)为筛选出导入重组质粒的大肠杆菌，排除未导入质粒的大肠杆菌和导入质粒而非重组质粒的大肠杆菌的干扰，使用了添加 等成分的培养基进行培养。若菌落呈现 ，则为所选大肠杆菌。 【答案】(1)用KpnⅠ和EcoRⅠ同时切割质粒B时，不仅会破坏复制原点，而且会切除启动子 (2) GAATTCATGT GGTACCCTAG (3) 氨苄青霉素、X-gal 白色 【分析】PCR原理：在高温作用下，打开DNA双链，每条DNA单链作为母链，以4种游离脱氧核苷酸为原料，合成子链，在引物作用下，DNA聚合酶从引物3'端开始延伸DNA链，即DNA的合成方向是从子链的5'端向3'端延伸的。实际上就是在体外模拟细胞内DNA的复制过程。 【详解】（1）质粒B中的KpnⅠ限制酶的酶切位点位于复制原点，如果用KpnⅠ切割质粒B，会破坏复制原点，使得质粒无法大量复制。用KpnⅠ和EcoRⅠ同时切割质粒B时，还会切除启动子。 （2）目的基因要与质粒正确连接，需要在目的基因两端添加与质粒酶切后相同的黏性末端。已知用EcoRⅠ和KpnⅠ两种限制酶切割质粒，EcoRⅠ识别的序列是5'GAATTC3'，KpnⅠ识别的序列是5'GGTACC3'。从图乙目的基因序列和转录方向可知，要添加EcoRⅠ和KpnⅠ的酶切位点，且根据引物与模板链3′端结合，以及反向互补的原则，设计的引物序列分别为5′-GAATTCATGT-3′（与对应目的基因的3′TACA5'互补，添加EcoRⅠ酶切位点5'GAATTC3'）、5′-GGTACCCTAG-3′（与对应目的基因的3′GATC5'互补，添加KpnⅠ酶切位点5'GGTACC3'）。 （3）筛选时，培养基中应添加氨苄青霉素，因为质粒上有氨苄青霉素抗性基因，能使含质粒的大肠杆菌在含有氨苄青霉素的培养基上生长，从而排除未导入质粒的大肠杆菌。同时，培养基中还应添加X-gal，用于区分导入空质粒和导入重组质粒的大肠杆菌。若菌落为白色，则导入的是重组质粒。因为目的基因插入lacZ基因中，破坏了lacZ基因，使其不能编码产生β-半乳糖苷酶，无法分解X-gal产生蓝色物质，所以菌落呈白色；而导入空质粒的大肠杆菌，lacZ基因正常，能分解X-gal，菌落会呈现蓝色。 29．（2025·甘肃天水·三模）与普通玉米相比，甜玉米细胞中可溶性糖向淀粉的转化较慢，导致可溶性糖含量高，汁多质脆。为提高甜玉米的商品价值，科研人员培育出了超量表达G蛋白的转基因甜玉米新品种。在超量表达G基因载体的构建中，所用DNA片段和Ti质粒的酶切位点如图1、2所示。回答下列问题： (1)为培育出超量表达G蛋白的转基因甜玉米，应将G基因插入Ti质粒的T-DNA中。为使DNA片段能定向插入T-DNA中，可用PCR技术在DNA片段的两端添加限制酶识别序列，M、N端添加的序列所对应的限制酶分别是 。 (2)已知在单子叶植物的伤口处涂抹酚类化合物，则可以用农杆菌侵染玉米等单子叶植物。用于构建基因表达载体的质粒用限制酶切割后，可通过 的方法检测质粒是否被切开。构建好基因表达载体后，依次在含 的培养基上培养，筛选出可能含有目的基因的农杆菌，再用 法将重组质粒导入到植物体中。 (3)若某次实验电泳结果发现：实验组和对照组都没有任何条带，从PCR操作过程角度解释可能的原因是 （至少答出2点）。 【答案】(1)NotI、SacI (2) 电泳 卡那霉素、潮霉素 农杆菌转化 (3)复性温度太高、引物自连或互连（至少答出2点） 【分析】基因工程的关键步骤是构建基因表达载体，基因表达载体主要由启动子、目的基因、标记基因和终止子组成，其中标记基因用于筛选重组DNA分子，可以是四环素、氨苄青霉素等抗性基因，也可以是荧光蛋白基因或产物能显色的基因。 【详解】（1）G基因中含EcoRI、BamHI、HindⅢ 三种限制酶的识别序列，因此切割G基因不能用这三种酶，要选择质粒中对应的NotI、SacI两种限制酶。要使DNA片段能定向插入T-DNA中，则M端应连接Ti质粒的终止子端，N端（强启动子端）连接潮霉素抗性基因端，因此M、N端添加的限制酶识别序列分别对应NotI、SacI。 （2）用于构建基因表达载体的质粒呈环状，用限制酶切割后可得到线性DNA，环状DNA和线状DNA在电场中迁移速率不同，因此，可通过电泳（琼脂糖凝胶电泳）的方法检测质粒是否被切开。Ti质粒中含有卡那霉素、潮霉素抗性基因，构建好基因表达载体后，依次在含卡那霉素、潮霉素的培养基上培养，可筛选出可能含有目的基因的农杆菌。受体细胞是植物细胞时，可用农杆菌转化法将重组质粒导入到植物的愈伤组织中。 （3）如果复性温度太高，引物与模板链无法结合，则得不到PCR产物；如果引物自连或互连，都使得引物无法与模板链结合，则得不到PCR产物。　 30．（2025·陕西咸阳·三模）科研人员将蛋白A基因和蛋白B基因插入质粒上构建重组表达质粒，导入酵母菌获得融合蛋白AB，其制备过程如图所示，其中相关识别序列如表。回答下列问题： 限制酶 BamH1 EcoR I Mbo I HaeIII 识别序列和切割位点（5-3） G↓GATCC G↓AATTC ↓GATC GG↓CC (1)PCR1和PCR2是在两个不同反应体系中进行的，两个反应体系中加入的不同物质是 ，PCR1和PCR2的目的是 。从而有利于基因A和基因B融合。过程②时不需要加入的引物是 。 (2)为了将融合基因与质粒进行正向连接，选择其中的两种限制酶切割质粒，不选另外两种限制酶的理由是 。为了使融合基因与质粒用相同的限制酶处理后能够产生相同的末端（便于连接），应在设计的引物P1的5端加上限制酶 的识别序列。 (3)确保重组质粒能在大肠杆菌中扩增的元件是 过程③将重组质粒导入大肠杆菌时要用 处理大肠杆菌，目的是 。 【答案】(1) （模板、）引物 扩增出末端部分碱基序列互补配对的基因A和基因B的单链 P2和P3 (2) BamHI在启动子和终止子外，因此不能选用BamHI；BamHI识别序列也能被MoI切割，因此也不能选用MboI HaeⅢ (3) 复制原点 Ca2+（CaCl2） 使大肠杆菌处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态 【分析】1、PCR是聚合酶链式反应的缩写。它是一项根据DNA半保留复制的原理，在体外提供参与DNA复制的各种组分与反应条件，对目的基因的核苷酸序列进行大量复制的技术。 2、题图所示重组PCR技术，是通过对引物的“接头”设计，将两个基因连接到一起，其本质上仍然是PCR技术。 【详解】（1）PCR1和PCR2是在两个不同反应体系中进行，扩增的是两个不同的基因，所以加入的模板不同，引物也不同；PCR1和PCR2的目的是扩增出末端部分碱基序列互补配对的基因A和基因B单链，以便于将两个基因链接到一起。过程②时不需要加入的引物是P2和P3。 （2）由于BamHI在启动子和终止子外，因此不能选用BamHI，且BamHI识别序列也能被MoI切割，因此也不能选用MboI，所以选择EcoR I与HaeⅢ两种限制性内切酶。根据图中融合基因AB表达方向与质粒中EcoR I与HaeⅢ酶切点的位置可知，应在设计的引物P1的5'端加上限制酶HaeⅢ的识别序列。 （3）确保重组质粒能在大肠杆菌中扩增的元件是复制原点。将外源DNA分子导入大肠杆菌前要用钙离子处理大肠杆菌，目的是增大大肠杆菌细胞膜的通透性，使大肠杆菌处于一种能吸收周围环境中DNA分子的感受态。 31．（2025·甘肃白银·三模）全球工业化使环境雌激素（EEs）污染日益加剧，开发灵敏、简便的环境监测方法成为一项紧迫任务。研究发现，在EEs诱导下，斑马鱼幼鱼能够从无到有地表达卵黄蛋白原，且表达水平与水体中EEs浓度呈正相关。斑马鱼幼鱼通体透明，成功转入荧光蛋白基因后容易观察到其体内的荧光情况。回答下列问题： (1)根据斑马鱼幼鱼的特征，如果先给无启动子的荧光蛋白基因加上 基因的特异性启动子，就可利用基因工程构建能够监测水体中EEs污染情况的转基因斑马鱼，科研人员可以通过 （写出一种方法）获取该特异性启动子。 (2)pEGFP-1是一种无启动子的EGFP（一种绿色荧光蛋白）基因载体。下图为pEGFP-1质粒简化图谱，最好选择 酶将所选的特异性启动子序列正确地插入pEGFP-1质粒中，然后将构建成功的基因表达载体通过 法注入斑马鱼受精卵，最终获得转基因斑马鱼。 注：ori为复制起点；为卡那霉素抗性基因；MCS为外源DNA的插入部位；SV40poly（A）为转录终止信号 (3)检查转基因斑马鱼是否培育成功也是基因工程的重要环节。请利用EGFP，从个体生物学水平描述转基因斑马鱼的鉴定方法： 。 (4)经过个体生物学水平筛选成功的转基因斑马鱼能否投入实际生产使用，并说明理由： （合理即可）。 【答案】(1) 卵黄蛋白原 从已知结构和功能的卵黄蛋白原基因中进行筛选（或人工合成或基因文库或PCR） (2) HindⅢ、BamHⅠ、DNA连接 显微注射 (3)将转基因斑马鱼在EEs污染的水体中培养，直接观察幼鱼个体是否发出绿色荧光 (4)①不能（否），因为在EEs污染的水体中发出荧光的转基因斑马鱼不一定能够将这一特性遗传给下一代，所以需要继续培养直至得到稳定遗传的纯合子；②不能（否），转基因斑马鱼进入水域后可能会对野生斑马鱼种群造成“基因污染”，破坏生态系统原有的平衡；③能，在EEs诱导下，斑马鱼表达卵黄蛋白原的水平与水体中EEs浓度呈正相关，利用转基因斑马鱼幼鱼可以直观、简便、灵敏地监测水体中EEs污染程度等 【分析】基因工程的操作步骤：获取目的基因（基因文库、PCR、人工合成）；构建基因表达载体（含标记基因、启动子、终止子、目的基因、复制原点等）；把目的基因导入受体细胞（显微注射法、农杆菌转化法、基因枪法、花粉管通道法、钙离子处理法）；目的基因的检测和鉴定（分子水平和个体水平检测，前者包括DNA分子杂交、分子杂交和抗原抗体杂交；后者如抗虫抗病接种实验）。 【详解】（1）题意显示，“在EEs诱导下，斑马鱼幼鱼能够从无到有地表达卵黄蛋白原，且表达水平与水体中EEs浓度呈正相关。斑马鱼幼鱼通体透明，成功转入荧光蛋白基因后容易观察到其体内的荧光情况”可知，若要利用基因工程构建能够监测水体中EEs污染情况的转基因斑马鱼，需要先给无启动子的荧光蛋白基因加上卵黄蛋白原基因的启动子，利用基因工程构建转基因斑马鱼。当水体中含有EEs时，在EEs诱导下，卵黄蛋白原基因的启动子被激活，使荧光蛋白基因表达出荧光蛋白，并且表达水平和水体中EEs浓度呈正相关。由此可通过观察转基因斑马鱼的荧光强度判断水体中EEs污染程度。因此构建监测水体中EEs污染情况的转基因斑马鱼时，目的基因是卵黄蛋白原基因的启动子和无启动子的荧光蛋白基因。获取该启动子的方法有从已知结构和功能的卵黄蛋白原基因中进行筛选、人工合成（或化学合成）、构建基因文库、PCR等。 （2）根据题干信息“pEGFP-1是一种无启动子的EGFP（一种绿色荧光蛋白）基因载体”及图中备注可知，卵黄蛋白原基因的启动子需插入EGFP基因的上游MCS（外源DNA的插入部位）位置，该位置有HindⅢ和BamHⅠ两种限制酶的切割位点，选择单酶切可能导致目的基因序列和质粒自身环化或反向连接，所以最好选择两种限制酶切割，然后用DNA连接酶将目的基因和pEGFP-1质粒连接，构建EGFP基因表达载体。受体细胞是动物细胞，所以导入的方法选择显微注射法。 （3）题干要求在个体生物学水平的角度，因而可利用EGFP这一指标，说明可通过直接观察幼鱼个体是否发出绿色荧光来鉴定转基因斑马鱼是否转基因成功。 （4）经过个体生物学水平筛选成功的转基因斑马鱼能否投入实际生产使用，可从多个角度作答。如果要投入实际生产并扩大培养，一般需要考虑稳定遗传的品种，而转基因斑马鱼转入目的基因的数量和位置未知，因而不能直接投入使用；在EEs污染的水体中发出荧光的转基因斑马鱼不一定能够将该特性遗传给下一代，所以需要继续培养直至得到稳定遗传的纯合子。转基因斑马鱼进入水域后可能会对野生斑马鱼种群造成“基因污染”，破坏生态系统原有的平衡，因而不能直接使用；能直接投入使用的原因是，在EEs诱导下，斑马鱼表达卵黄蛋白原的水平与水体中EEs浓度呈正相关，利用转基因斑马鱼幼鱼可以直观、简便、灵敏地监测水体中EEs污染程度等。 32．（2025·山东泰安·三模）科研人员尝试利用鸡新城疫病毒（HB1）基因和传染性支气管炎病毒（H120）基因，采用基因工程技术培育转基因工程菌，以制备二联体疫苗，所需要的限制酶的识别序列和切割位点如表所示，培育流程如图所示。 限制酶 BclI PvitⅡ XbaI Sau3AI 识别序列和切割位点（5′-3'） T↓GATCA CAG↓CTG T↓CTAGA ↓GATC (1)根据图示信息，应选用限制酶 切割质粒，不选用其他限制酶的原因是 。 (2)为保证融合基因与质粒的正向连接，在设计PCR引物时，应在b链对应引物的 （填“3'”或“5′”）端添加限制酶 （填种类）的识别序列。根据图表信息，写出该引物的12个碱基序列5′- -3′。 (3)为筛选出导入了基因表达载体的大肠杆菌，培养基甲中应添加 （填“四环素”或“青霉素”）,培养基乙中应添加 （填“四环素”或“青霉素”）,菌落 （填图中数字）中的大肠杆菌可用来制备疫苗。 【答案】(1) XbaI、PvitⅡ 限制酶BclI的识别和切割位点不在启动子和终止子之间的片段中,限制酶Sau3AI不仅切割自己的识别位点,也会切割BclI的识别位点 (2) 5′ XbaI TCTAGAAGCTCA (3) 四环素 青霉素 3和5 【分析】基因工程的基本操作步骤主要包括四步：①目的基因的获取；②基因表达载体的构建；③将目的基因导入受体细胞；④目的基因的检测与表达。其中，基因表达载体的构建是基因工程的核心。 【详解】（1）限制酶BclI的识别和切割位点不在启动子和终止子之间的片段中，限制酶Sau3AI不仅切割自己的识别位点，也会切割BclI的识别位点，因此应选择XbaI、PvitⅡ切割质粒，可避免质粒自连及目的基因反接。 （2）b链为基因的模板链，接入质粒后b链的3，端→5，端为启动子到终止子方向，因此在设计PCR引物时，应在b链对应引物的5，端加上XbaI序列（5，TCTAGA3，），在a链对应引物的5，端加上PvitⅡ序列。b链对应引物的5，端加上XbaI序列，且b链的引物与b链的3端配对，序列为5，AGCTCA3，，故该引物的12个碱基序列5，-TCTAGAAGCTCA-3，。 （3）基因表达载体上含有四环素抗性基因，培养基甲中添加四环素可以筛选出重组质粒；重组质粒中青霉素抗性基因被破坏，因此培养基乙中应添加青霉素，以利用影印接种法来筛选重组菌；在甲中能生长、乙中不能生长的为重组菌落，即3和5中的大肠杆菌可用来制备疫苗。 33．（2025·湖南湘西·三模）某真菌W基因编码的纤维素酶含有一段疏水信号肽，可在内质网加工后分泌至胞外。已知W基因转录产物序列如下（部分）：5'-UGAAC-GCUA…（中间序列）…GUCGACUCG-3'。现需将其转入大肠杆菌表达，所用质粒如图1。 限制酶 BamHI EcoRI MfeI KpnI HindIII 识别序列和切割位点 G↓GATCC G↓AATTC C↓AATTG GGTAC↓C A↓AGCTT 图3 (1)若需在细菌中表达可分泌的成熟酶，应选择 和 进行双酶切（从上述酶中选择），其科学依据是 ； (2)若直接将含信号肽的W基因转入大肠杆菌，预测表达产物无法分泌的原因： 。 (3)Ca2+处理可使大肠杆菌细胞膜形成短暂通透性孔道，此时细胞处于 态。若改用Mg2+处理，转化效率显著下降，其分子机制是 。 (4)扩增W基因编码链时，与其模板链结合区序列为 （从转录产物推导至少4碱基）。 【答案】(1) BamHI HindIII 双酶切确保定向插入，避免反向连接 (2)大肠杆菌缺乏内质网和高尔基体，无法加工真核生物的信号肽，导致表达的蛋白质前体滞留在细胞内，无法分泌 (3) 感受 Ca2+通过中和细胞膜表面负电荷，促进DNA吸附并形成孔道，而Mg2+无法有效中和电荷，导致DNA吸附和进入效率降低 (4)5'-GTCGAC-3' 【分析】基因工程技术的基本步骤：（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。（4）目的基因的检测与鉴定。 【详解】（1）结合题图分析可知，W基因右侧只能用HindⅢ切割，W基因左侧有BamHI、KpnI、EcoRI三种酶切位点，结合质粒情况及切割位点识别序列，应使用限制酶MfeⅠ、HindⅢ切割图中质粒，使用限制酶EcoRⅠ（切割出的黏性末端与MfeI相同）、HindⅢ切割图中含W基因的DNA片段，以获得能正确表达W基因的重组质粒，因为限制酶MfeⅠ和限制酶EcoRⅠ切割露出相同的黏性末端。 （2）大肠杆菌缺乏内质网和高尔基体，无法加工真核生物的信号肽，导致表达的蛋白质前体滞留在细胞内，无法分泌，故若直接将含信号肽的W基因转入大肠杆菌，预测表达产物无法分泌。 （3）Ca2+处理可使大肠杆菌细胞膜形成短暂通透性孔道，此时细胞处于感受态，即处于易于吸收环境中DNA分子的状态；Ca2+通过中和细胞膜表面负电荷，促进DNA吸附并形成孔道，而Mg2+无法有效中和电荷，导致DNA吸附和进入效率降低，故若改用Mg2+处理，转化效率显著下降。 （4）根据转录产物序列5'-UGAAC-GCUA…（中间序列）…GUCGACUCG-3'可知，编码链为5'-TGAACGCTA...GTCGACTCG-3 '，模板链互补区序列为3'-ACTTGCGAT…CAGCTGAGC-5 '。 34．（2025·山西临汾·三模）某科研团队从某细菌中提取抗盐基因，将该基因转入烟草培育成抗盐烟草。下图是转基因抗盐烟草的培育过程，外源DNA片段和Ti质粒上都有4种限制酶的切割位点，虚线箭头表示转录的方向。请分析回答下列问题。 (1)用图中的Ti质粒和抗盐基因构建重组质粒时，为防止自身环化和反向连接，最好选择图中的限制酶 ，对抗盐基因进行扩增常用 技术。 (2)将重组质粒A导入到农杆菌的方法常用 法。将抗盐基因导入植物细胞除了图中的方法外还可以用 法（写出一点）。 (3)筛选成功导入抗盐基因的烟草细胞 （填“可以”或“不可以”）用含有M抗生素的培养基进行筛选，原因是 。 (4)对转基因烟草进行个体水平的检测方法是 。 【答案】(1) BamHI和HindIII PCR (2) 钙离子（Ca2+）处理 花粉管通道 (3) 不可以 农杆菌侵染烟草细胞后，T-DNA携带抗盐基因转移并整合到烟草细胞染色体DNA上，而M抗生素抗性基因不在T-DNA上 (4)在高盐（或盐水或相应）环境中培养烟草幼苗，观察其能否正常生长 【分析】分析题图：图示是转基因抗盐烟草的培育过程，其中①表示含有目的基因的外源DNA分子；②表示质粒；③表示基因表达载体的构建过程；④表示采用农杆菌转化法将目的基因导入受体细胞；⑤表示脱分化过程；⑥表示再分化过程。 【详解】（1）根据图示信息可知，要讲目的基因定向插入质粒的启动子和终止子之间，且不能破坏目的基因，而且为了防止自身环化和反向连接，最好选择图中的限制酶BamHI和HindIII，利用PCR技术扩增目的基因。 （2）将重组质粒A导入到农杆菌常用钙离子处理法，使细菌处于感受态状态；图中将抗盐基因导入植物细胞的方法是农杆菌转化法，除了图中的方法外还可以用花粉管通道法。 （3）农杆菌侵染烟草细胞后，T-DNA携带抗盐基因转移并整合到烟草细胞染色体DNA上，而M抗生素抗性基因不在T-DNA上，所以不能用含有M抗生素的培养基进行筛选。 （4）在个体水平检测可以在高盐（或盐水或相应）环境中培养烟草幼苗，观察其能否正常生长。 35．（2025·宁夏银川·二模）胶原蛋白在维持器官、组织、细胞等方面发挥着关键性作用。科学家将合成胶原蛋白的基因kit导入大肠杆菌构建基因工程菌，过程如图所示。请据图回答下列问题： (1)目的基因与质粒连接后可以导入到不同物种细胞中表达出同种蛋白质，其原理是 。 (2)已知kit基因的部分序列见下，采用PCR技术进行扩增时，选用的引物为 （填字母）。为使基因与质粒成功连接，适宜的方法是在引物的 端添加 两种限制酶识别序列。 5'—CGGGATCCA………………AGAATTCCG—3' 3'—GCCCTAGGT………………TCTTAAGGC—5' A．5'—GCCCTAGGT—3'  B．5'—CGGAATTCT—3' C．5'—CGGGATCCA—3'  D．5'—GCCTTAAGA—3' (3)酶切kit基因，并与质粒中长度为170bp的片段进行置换，构建重组质粒pET-28a（+）-kit，用HindⅢ酶分别酶切pET-28a（+）和pET-28a（+）-kit，获得如下表所示片段。 质粒类型 pET-28a（+） pET-28a（+）-kit HindIII酶切片段 1000bp，2550bp 1000bp、2000bp、700bp 则kit基因长度为 ，由此判定kit基因上有 个HindⅢ酶切位点，原因是 。 【答案】(1)密码子具有通用性（生物共用一套遗传密码） (2) BC 5' BamHl和EcoRⅠ (3) 320bp 2 pET-28a（+）原有的两个HindⅢ位点被目的基因置换走一个后，得到环状的pET-28a（+）-kit仍然被HindⅢ限制酶切割成3段 【分析】限制酶能够识别双链DNA分子的特定核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的磷酸二酯键断开。选择合适的限制酶对目的基因和质粒进行切割的原则：①不能破坏目的基因；②不能破坏所有的抗性基因（至少保留一个）；③最好选择两种限制酶分别切割质粒和目的基因，防止目的基因和质粒反向连接，同时要防止目的基因自身环化和质粒的自身环化。 【详解】（1）目的基因与质粒连接后可以导入到不同物种细胞中表达出同种蛋白质，其原理是所有生物共用一套遗传密码。 （2）在PCR中，引物与模板链的3'端碱基互补配对，并且引物的方向与模板链走向相反，因此与图中kit 基因上面一条链结合的引物，其序列应为5'-CGGAATTCT-3'，与kit 基因下面一条链结合的引物其序列应为5' -CGGGATCCA-3'，综上所述，AD错误，BC正确；由于ori复制原点中含有限制酶HindⅢ的识别序列，因此不能用限制酶HindⅢ来切割质粒，否则会破坏复制原点，只能用限制酶BamHⅠ和EcoRⅠ对质粒 pET-28a（+）进行双酶切，这样可以防止目的基因与质粒的自身环化以及任意连接；同时要在 kit 基因两端也连上限制酶BamHⅠ和EcoRⅠ的识别序列，由于DNA聚合酶只能从引物的3'端连接脱氧核苷酸延伸子链，因此必须将限制酶BamHⅠ和EcoRⅠ的识别序列连接至引物的5'端。 （3）观察质粒 pET-28a（+） 图可知，在该质粒上有两个HindⅢ的识别序列，一个在启动子和终止子之间，一个在复制原点ori中，因此用HindⅢ切割质粒 pET-28a（+）后，可得到两个片段，通过表格可知，这两个片段长度分别为1000bp和2550bp，说明质粒pET-28a（+） 总长度是1000bp+2550bp=3550bp；利用双酶切法将 kit 基因与质粒 pET-28a（+） 长度为170bp片段进行置换后，形成的重组质粒 pET-28a（+）-kit 能被HindⅢ切割成三个片段，长度分别是1000bp、2000bp、700bp，说明置换后的kit 基因上含有两个HindⅢ的识别序列，再加上复制原点ori中的一个HindⅢ的识别序列，共三个HindⅢ的识别序列，经HindⅢ酶切后才能将重组质粒pET-28a（+）-kit 切成3段。利用这三段的长度可计算出重组质粒 pET-28a（+）-kit 的总长度为1000bp+2000bp+700bp=3700bp，由于kit 基因与长度为170bp片段进行置换，设kit 基因长度为n，可列出等式：3550+n-170=3700bp，故可计算出kit 基因长度为n=320bp。 36．（2025·安徽合肥·三模）低温是早春和晚秋作物生长的重要环境胁迫因子，可导致植物的叶出现脱水萎蔫。科研人员以一种农杆菌 Ti质粒为载体，将由低温诱导启动子RD29A控制的拟南芥耐寒基因 AtCOR15a导入番茄基因组，以期改良番茄的耐寒性，为培育耐寒性番茄新品种奠定基础。回答下列问题。 (1)低温诱导启动子 RD29A的作用是 。请在图中标明重组后拟南芥耐寒基因 AtCOR15a 和低温诱导启动子RD29A 的位置 。 (2)将含有基因 AtCOR15a的重组 Ti质粒转入农杆菌，再用农杆菌侵染番茄无菌苗子叶，使用抗生素 筛选出具有该抗生素抗性的幼苗后，还需提取抗性幼苗的染色体DNA 进行PCR 鉴定, 目的是 。 (3)通过对番茄幼苗的总 RNA 进行测定，获得基因 AtCOR15a相对表达量最高的3个株系A1、A33、A37。为进一步从个体水平对这些株系幼苗的耐寒性进行评估，简要写出实验设计思路 。 【答案】(1) 低温条件下，被RNA聚合酶识别和结合，驱动AtCOR15a基因的转录 (2) 卡那霉素 检测番茄的染色体DNA 上是否插入了AtCOR15a基因 (3)以野生型番茄和A1、A33和 A37株系番茄为材料，低温处理相同时间后，观察低温条件下番茄叶的脱水萎蔫程度，比较各材料间耐寒性的差异 【分析】基因工程技术的基本步骤： （1）目的基因的获取方法：从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。 （2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。 （3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。 （4）目的基因的检测与鉴定：分子水平上的检测和个体水平上的鉴定。 【详解】（1）启动子的作用是提供RNA聚合酶识别和结合的位点，驱动基因转录出mRNA，所以低温诱导启动子RD29A的作用是低温条件下，被RNA 聚合酶识别和结合，驱动AtCOR15a基因的转录。因为Ti质粒的T-DNA可转移至受体细胞并整合到受体细胞的染色体DNA上，所以重组后拟南芥耐寒基因AtCOR15a和低温诱导启动子RD29A应位于T-DNA内，结果如图。 （2）由图可知，重组Ti质粒上含卡那霉素抗性基因，所以使用抗生素卡那霉素筛选出具有该抗生素抗性的幼苗，提取抗性幼苗的染色体DNA进行PCR鉴定，目的是检测番茄的染色体DNA上是否插入了AtCOR15a基因。 （3）本实验的目的是为进一步从个体水平对获得基因AtCOR15a相对表达量最高的3个株系A1、A33、A37的耐寒性进行评估，自变量为番茄幼苗的种类，因变量为番茄叶的脱水萎蔫程度，实验设计思路为以野生型番茄和A1、A33和A37株系番茄为材料，低温处理相同时间后，观察低温条件下番茄叶的脱水萎蔫程度，比较各材料间耐寒性的差异。 37．（2025·安徽六安·三模）A蛋白是某种激素合成的关键酶。为鉴定该激素合成的部位及生理作用，科研团队利用无缝克隆技术将A蛋白结合蛋白基因（P基因）与葡萄糖苷酸酶基因（GUS基因）融合，构建A蛋白检测探针，通过农杆菌转化法导入拟南芥进行实验。相关原理、过程及质粒的结构如下图所示。 注：①bar为抗草甘膦（一种除草剂）基因；Tetr为四环素抗性基因；Ampr为氨苄青霉素抗性基因②F1、F2、R1、R2为引物③BamH I、Sma I、Bcl I为限制酶 (1)无缝克隆时所需的酶除T5核酸外切酶外还有 和 。用无缝克隆技术构建GUS-P融合基因的关键是R2引物 端序列与 互补。 (2)利用双酶切法将融合基因插入Ti质粒，选用的限制酶为 。扩增融合基因所需的引物R1和F2应选用下列引物组合为 。 ①5'-…CTTGGATGAT-3'②5'-…TAAGTTGTCT-3'③5'-…ATTCAACAGA-3' ④5'-…TCTGTTGAAT-3' 【答案】(1) DNA聚合酶 DNA连接酶 5' F1（或P基因左侧序列） (2) Bcl I和Sma I ①④ 【分析】基因工程的基本操作步骤主要包括四步：①目的基因的获取；②基因表达载体的构建；③将目的基因导入受体细胞；④目的基因的检测与表达。 【详解】（1）由题图信息可知，利用无缝克隆技术将A蛋白结合蛋白基因（P基因）与葡萄糖苷酸酶基因（GUS基因）融合，构建A蛋白检测探针，所以无缝克隆时所需的酶除T5核酸外切酶外还有DNA聚合酶和DNA连接酶。DNA的两条链是反向平行的，用无缝克隆技术构建GUS-P融合基因的关键是R2引物5'端序列与F1（或P基因左侧序列）3'互补。 （2）利用双酶切法将融合基因插入Ti质粒的T-DNA区，如果使用BamH I，会将Ti质粒上的复制原点切掉，故选用的限制酶为Bcl I和Sma I。根据融合基因的放大图可知，扩增时以DNA的两条链分别作模板，扩增融合基因所需的引物R1和F2应选用下列引物组合为3'端序列可以与④5'-…TCTGTTGAAT-3'配对，5'端序列的互补链可以与①5'-…CTTGGATGAT-3'配对，因此选用的引物组合为①④。 38．（2025·宁夏石嘴山·三模）番茄红素具有一定的抗癌效果。普通番茄合成的番茄红素易在番茄红素环化酶的催化下转化为胡萝卜素。科学家利用基因工程设计的重组DNA（质粒三）能表达出双链RNA（发卡），番茄细胞可识别双链RNA并将该双链RNA和具有相同序列的单链RNA一起降解，从而阻止番茄红素的转化，提高番茄红素的产量。下图为利用质粒一和目的基因构建重组质粒三的过程示意图。回答下列问题：    (1)质粒通常用作基因进入受体细胞的载体，它能供外源DNA片段（基因）插入的原因是 。 (2)对质粒二开环需用到的限制酶是 。为了防止其自身环化，需进行去磷酸化，即去除开环的质粒两端的 个磷酸基团。 (3)构建质粒三时，最好在A、B两端分别加 、 的识别序列，目的是 。 (4)质粒三导入受体细胞并表达后，形成双链RNA（发卡）的原因是 。“发卡”在受体 进行PCR扩增。 【答案】(1)质粒DNA上有一个至多个限制酶的切割位点 (2) BamHⅠ酶 2/两/二 (3) Ecl酶 BamHⅠ酶 确保目的基因反向连接 (4) 转录后的RNA分子中存在互补配对的碱基序列 不能 【分析】分析题图：重组DNA（质粒三）的构建过程，该质粒能表达出双链RNA（发卡），番茄细胞可以识别侵入的双链RNA并将该双链RNA及具有相同序列的单链RNA一起降解，提高了果实中番茄红素的含量。 【详解】（1）质粒通常用作基因进入受体细胞的载体，其之所以能供外源DNA片段（基因）插入，是由于在质粒DNA上具有一个至多个限制酶的切割位点。 （2）据图可知，质粒二的开环需要用到限制酶——BamHⅠ酶。开环后，环状质粒变为了一条双链DNA，含有2个磷酸基团，所以去磷酸化，需要去除两个磷酸基团。 （3）为了确保目的基因的反向连接，通常采用双酶切法，所以构建质粒三时，最好在A、B两端分别加上Ecl酶和BamHⅠ酶的识别序列。 （4） 质粒三导入受体细胞并表达后，形成双链RNA（发卡）的原因是转录后的RNA分子中存在互补配对的碱基序列。PCR为体外扩增DNA的过程，“发卡”在受体不能进行PCR扩增。 39．（2025·湖南长沙·三模）t-PA蛋白能降解血栓，是脑血栓患者的特效药，但其促进血栓溶解的特异性不高。若将t-PA蛋白第84位的氨基酸替换成丝氨酸（密码子是UCU），获得改良的t-PA蛋白，其溶解血栓的效率明显提升。图1和图2为改造t-PA蛋白基因及构建表达载体的过程。请回答下列问题： (1)在PCR技术中高温变性的目的是 。PCR的产物一般通过 来鉴定。若PCR扩增没有获得扩增产物，下列解释合理的有 。 ①复性温度过高②复性温度过低③缓冲液中缺少镁离子④引物之间形成二聚体 (2)图1中黑点表示突变位点的碱基，若要得到改良t-PA蛋白，则引物b中该位点的碱基是5' 3'（写3个碱基）。重叠延伸得到的改良t-PA蛋白基因非模板链序列为5'-TGAAACGCT…（中间序列）…GTCGGCTCG-3'。为了便于将扩增后的基因和质粒pCLY11成功构建成重组质粒，需在引物的5'端添加限制酶酶切序列，请写出PCR3扩增中引物a的碱基序列5'- -3'（要求：写出15个碱基）。 (3)运用乳房生物反应器可以从转基因牛的乳汁中获得t-PA改良蛋白，请完善以下流程： ①将t-PA改良基因与乳腺特异性启动子连接，构建表达载体； ② ； ③ ，移植到代孕母牛子宫； ④筛选转基因牛，从乳汁中提取t-PA蛋白。 (4)对乳汁t-PA进行活性检测，应以t-PA溶液为阳性对照，以 为阴性对照。 【答案】(1) 使双链DNA解链为单链（或破坏氢键） （琼脂糖凝胶）电泳 ①③④ (2) AGA（对应模板链AGA→密码子UCU的互补链为AGA） 5'-CCCGGGTGAAACGCT-3' (3) 通过显微注射法将重组质粒导入受精卵 将受精卵体外培养至早期胚胎 (4)正常母牛乳汁/非转基因母牛乳汁 【分析】基因工程技术的基本步骤：目的基因的获取、基因表达载体的构建、将目的基因导入受体细胞、目的基因的检测与鉴定。 【详解】（1）在PCR技术中高温变性的目的是双链DNA解聚为单链，利用了DNA热变性原理。PCR的产物一般通过琼脂糖凝胶电泳来鉴定。PCR的条件：模板DNA、四种脱氧核苷酸、一对引物、热稳定DNA聚合酶；过程：高温变性：DNA解旋过程；低温复性：引物结合到互补链DNA上；中温延伸：合成子链。PCR扩增中双链DNA解开不需要解旋酶，高温条件下氢键可自动解开。因此若PCR扩增没有获得扩增产物可能是因为①复性温度过高，③缓冲液中缺少镁离子，④引物之间形成二聚体。 （2）已知t-PA蛋白第84位是半胱氨酸，相应的基因模板链（图中t-PA基因的上链）上的碱基序列是ACA，则半胱氨酸的密码子为UGU，而丝氨酸的密码子是UCU，由此可知，若要将t-PA蛋白第84位的半胱氨酸换成丝氨酸，则t-PA基因上链第84位发生碱基替换为ACA→AGA，图中显示引物b与t-PA基因的下链互补，故其中相应部位的碱基与上链相同，即该部位的碱基是AGA。重叠延伸得到的改良t-PA蛋白基因非模板链序列为5'-TGAAACGCT…（中间序列）…GTCGGCTCG-3'。为了便于将扩增后的基因和质粒pCLY11成功构建成重组质粒，需在引物的5'端添加限制酶酶切序列，PCR3扩增中引物a的碱基序列5'-CCCGGGTGAAACGCT-3' （3）运用乳房生物反应器可以从转基因牛的乳汁中获得t-PA改良蛋白，请完善以下流程： ①将t-PA改良基因与乳腺特异性启动子连接，构建表达载体；  ②通过显微注射法将重组质粒导入受精卵；  ③将受精卵体外培养至早期胚胎，移植到代孕母牛子宫；  ④筛选转基因牛，从乳汁中提取t-PA蛋白。 （4）对乳汁t-PA进行活性检测，应以t-PA溶液为阳性对照，以正常母牛乳汁（非转基因母牛乳汁）为阴性对照。 40．（2025·甘肃白银·三模）拟南芥是科学研究中的模式植物。某科研人员将黄粉虫细胞内的抗冻蛋白基因TmAFP与Ti质粒连接形成基因表达载体导入拟南芥细胞中，以获得耐低温拟南芥，过程所用的基因、Ti质粒、限制酶的识别序列及切割位点如图1所示。请回答下列问题： (1)对TmAFP基因进行PCR扩增，在PCR反应体系中加入的缓冲液中含有Mg2+，Mg2+的作用是 。利用PCR的方法扩增TmAFP基因时需要引物，引物的作用是 。 (2)为了使TmAFP基因插入Ti质粒，设计引物时需要在A端引物的5'端和B端引物的5'端分别添加 （填限制酶）的识别序列。结合目的基因的部分碱基序列，请设计引物的碱基序列。 引物1（A端的引物）：5′— —3'； 引物2（B端的引物）：5'— —3'。 (3)为了筛选出成功导入含抗冻蛋白基因TmAFP的重组质粒的农杆菌，一般可进行如下步骤。 第一步：让农杆菌在含 的培养基上培养，得到如图2所示的菌落。 第二步：再将灭菌绒布按到培养基上，使绒布面沾上菌落，然后将绒布按到含 的培养基上培养，得到如图3所示的结果（空圈表示与图2对照无菌落的位置）。 第三步：选出图2培养皿中的某些菌落进行培养，即可得到含重组质粒的农杆菌。其中图2中的菌落 （填数字）表示含重组质粒的农杆菌。 【答案】(1) 激活耐高温的DNA聚合酶 使（耐高温的）DNA聚合酶能够从引物的3'端连接脱氧核苷酸 (2) MunI、XmaI CAATTGTCTGTTGAAT CCCGGGCCTGGATGAT (3) 潮霉素 四环素 5、6 【分析】基因工程的基本操作步骤主要包括四步：目的基因的获取；基因表达载体的构建；将目的基因导入受体细胞；目的基因的检测与表达。 【详解】（1）对TmAFP基因进行PCR扩增，在PCR反应体系中加入的缓冲液中含有Mg2+，Mg2+的作用是激活耐高温的DNA聚合酶。引物的作用是使（耐高温的）DNA聚合酶能够从引物的3'端连接脱氧核苷酸。 （2）为了保证引物与扩增的基因碱基互补配对，保证目的基因正常扩增，应将限制酶的识别序列设计在引物的5'端。根据题图可知，不能选择EcoRI切割质粒，因为该酶的识别序列在启动子中，也不能选择NheI切割质粒，因为该酶的识别序列在质粒上有两个部位，其中一个识别序列在潮霉素抗性基因中，因此需选择MunI、XmaI切割质粒，为了保证TmAFP基因正确连接进入质粒中，则A端需添加MunI的识别序列，B端添加XmaI的识别序列。据图中限制酶识别序列及切割位点可知，A端引物的5'端需添加的MunI识别序列是5'—CAATTG—3'，A端引物后续序列应与A端所显示的3'—AGACAACTTA—5'互补，则A端引物的序列是5'—CAATTGTCTGTTGAAT—3'；B端引物的5'端需添加的XmaI识别序列是5'—CCCGGG—3'，B端引物后续序列应与B端所显示的5'—CCTGGATGAT—3'相同，即B端引物的序列是5'—CCCGGGCCTGGATGAT—3'。 （3）分析图1可知，该基因工程中，最好选择限制酶MunI、XmaI切割质粒，但是利用XmaI切割将会破坏四环素抗性基因。故在筛选过程中，首先让农杆菌在含潮霉素的培养基上培养，得到图2的菌落是含有目的基因及潮霉素抗性基因的菌落，再将灭菌绒布按到培养基上，使绒布面沾上菌落，然后将绒布按到含四环素的培养基上培养，得到如图3所示的结果，所以选出图2中有但图3中对应部位没有的菌落进行培养，就可以得到含重组质粒的农杆菌，即图2中的菌落5、6表示含重组质粒的农杆菌。 41．（2025·浙江·三模）番茄细菌性斑疹病是番茄种植产业中较严重的病害，具有发病迅速、防治难等特点，主要由丁香假单胞杆菌感染引起。研究发现：植物体内芦丁等类黄酮类次生代谢产物含量增多时可增强植物对细菌或真菌病害的抗性。而经拟南芥AtMYB11或AtMYB12基因（简称A基因）转化的烟草、番茄等植株可提高芦丁等物质的合成量。现欲向番茄植株内转入A基因进而选育出高抗病番茄品系。 抗生素 功能作用 潮霉素、卡那霉素、庆大霉素、链霉素 通过抑制核糖体功能达到杀死细菌、动物、植物细胞的效果。 羧苄青霉素 通过抑制细菌细胞壁的形成达到杀死细菌的效果； 可分解生成生长素类物质，刺激植物愈伤组织的形成与增殖。 (1)目的基因的获取。一般情况下目的基因片段越小，重组效率和导入效率均越高。从拟南芥提取的A基因长度约为3000bp，若要提高目的基因与质粒重组效率，可以 获取A基因。 (2)目的基因的扩增与重组质粒的构建。若获取的A基因无上述限制性内切核酸酶识别序列，PCR扩增A基因时，需在两种引物的 端（填“5′”或“3′”）添加相应的识别序列。为成功选育出高抗病番茄品系，构建重组质粒应选择 酶对图示质粒进行切割。 (3)重组质粒的导入。将农杆菌放入低温、低浓度的 溶液中处理以改变细胞膜的通透性，使之成为感受态细胞。再在低温条件下与重组质粒混合，以低温条件处理的作用是 ，然后进行短暂的热刺激处理，使外源重组质粒转入农杆菌细胞。将转化后的农杆菌置于摇床慢速培养一段时间，其目的是使农杆菌从感受态恢复正常状态，从而 。因此，在培养基中加入 ，才能初步选出导入重组质粒的大量农杆菌。 (4)农杆菌与番茄细胞共培养与筛选。根据表格信息，将农杆菌与番茄细胞共培养一段时间后，番茄外植体培养基要加入 （抗生素）以杀灭农杆菌。之后培养过程中培养基中加入 以筛选出含有A基因的番茄细胞。 (5)转基因植株的扩增。为了获得更多的A基因番茄植株，对脱分化形成愈伤组织进行继代培养，影响继代培养物生成再生植株的因素除培养条件（温度、光照等）、培养基中营养物质和植物生长调节剂的浓度和配比外，还有 （写出2点）。 【答案】(1)从cDNA文库中 (2) 5' NcoI和BglⅡ (3) CaCl2 使外源DNA黏附于农杆菌表面 表达抗性基因，并大量增殖 卡那霉素 (4) 羧苄青霉素 潮霉素 (5)外植体的来源和生理状态、继代培养次数、愈伤组织细胞的基因型等 【分析】基因工程技术的基本步骤：（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成；（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等；（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样．将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法；（4）目的基因的检测与鉴定：分子水平上的检测和个体水平上的鉴定。 【详解】（1）目的基因越小，重组效率和导入效率均越高,cDNA文库是以成熟mRNA为模板逆转录合成的，故cDNA文库中的基因没有内含子，其基因片段相对较小，故可从cDNA文库中获取A基因。 （2）在PCR扩增时，引物与模板链的3′端结合，则在引物的5′端添加限制性内切酶识别序列。将目的基因导入质粒的T-DNA上，既要考虑潮霉素抗性基因、绿色荧光蛋白基因的完整性，还要避免质粒的自身环化和反向连接[双酶切]，所以选择NcoI和BglⅡ酶对图示质粒进行切割。 （3）将重组质粒导入农杆菌时，先将农杆菌放入低浓度的CaCl₂溶液中可使其成为感受态细胞，使其处于一种易于吸收周围环境DNA分子的状态。再在低温条件下与重组质粒混合，低温条件处理使外源DNA黏附于农杆菌表面。农杆菌从感受态恢复正常状态，恢复其正常生理功能以表达抗性基因，并大量增殖。重组质粒的标记基因中，卡那霉素连接的是原核生物的启动子，而潮霉素抗性基因连接的真核生物的启动子，因此在培养基中加入卡那霉素，才能初步选出导入重组质粒的大量农杆菌。 （4）题干信息中，羧苄青霉素能抑制细菌细胞壁的形成达到杀死细菌的效果，因此将农杆菌与番茄细胞共培养一段时间后，番茄外植体培养基要加入羧苄青霉素以杀灭农杆菌。欲筛选导入了目的基因的番茄细胞，可在培养基中添加潮霉素，不含有潮霉素的番茄细胞不含有目的基因，且在含有潮霉素的培养基中不能存活。 （5）影响愈伤组织能否成功再生出植株的因素有：培养条件如光温、培养基配方如植物激素配比等，由于细胞不能无限分裂，所以影响因素还有愈伤组织的基因型、愈伤组织继代的次数以及外植体的来源和生理状态等。 42．（2025·河南·三模）GRF是一种在植物中广泛存在的特异性转录因子，在植物的生长发育和胁迫响应过程中发挥着重要作用。BpGRF4为白桦GRF基因家族成员，科研人员通过农杆菌转化法获得了白桦过表达BpGRF4株系，用以探究BpGRF4在白桦植株生长发育过程中的作用。 (1)科研人员首先提取野生型白桦的根、茎、叶的总RNA，通过 获得cDNA；然后以获得的cDNA为模板通过PCR获得BpGRF4基因，利用PCR扩增BpGRF4基因时，每次循环需要经过三步，依次是 ；以根、茎、叶的总RNA为模板，说明在这三个器官中BpGRF4的表达量 （填“高”或“低”）。 (2)利用PCR扩增该基因时，加入的一个引物序列是ATGGATTTTGGGGTAGTGGGTT，根据该序列 （填“能”或“不能”）推测出另一个引物的序列，原因是 。 (3)科研人员使用T4 DNA连接酶将获得的BpGRF4基因片段连接到A载体限制酶NocI的酶切位点上，构建过表达载体，可推测获得的BpGRF4基因两端有 个限制酶NocI的酶切位点。将构建的过表达载体导入农杆菌中，需先用Ca2+处理农杆菌，其目的是 。 (4)利用农杆菌转化法得到过表达BpGRF4的白桦转基因株系OE-3，科研人员统计了1树龄的野生型白桦植株（WT）和1树龄的OE-3的表型，结果如图所示，说明BpGRF4是通过 来促进白桦植株的生长发育的。将WT与OE-3杂交，能否预测子一代的株高？请说明理由： 。 【答案】(1) 逆转录 变性、复性（或退火）、延伸 高 (2) 不能 引物是根据目的基因两端的序列设计的，与模板链互补，两个引物序列之间无关 (3) 2 使农杆菌处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态（或使农杆菌处于感受态） (4) 增加节间长度、分枝数量和分枝长度 无法预测子一代的株高，OE-3中转入的BpGRF4基因的数量及基因位置均未知 【分析】基因工程的基本操作程序有四步：①目的基因的获取，②基因表达载体的构建，③将目的基因导入受体细胞，④目的基因的检测与鉴定。 【详解】（1）以RNA为模板通过逆转录可获得cDNA。利用PCR扩增目的基因时，PCR扩增每次循环都需要经过变性—复性（或退火）—延伸三步。基因在细胞中会选择性表达，选择野生型白桦的根、茎、叶的总RNA为模板，说明在这三个器官中BpGRF4的表达量高。 （2）引物是根据目的基因两端的序列设计的，与模板链互补，两个引物序列之间无关，所以不能通过一个引物序列来推测另一个引物序列。 （3）通过题干信息分析可知，限制酶NocI为唯一所用限制酶，所以目的基因两端各有1个限制酶NocI的酶切位点。Ca2+处理农杆菌的目的是使农杆菌处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态。 （4）分析图中的信息可知，与野生型白桦植株相比，过表达株系OE-3的节间长度、分枝数量和分枝长度均增加，说明BpGRF4是通过增加节间长度、分枝数量和分枝长度来促进白桦植株的生长发育的。将WT与OE-3杂交，无法预测子一代的株高，因为OE-3中转入的BpGRF4基因的数量及基因位置均未知。 43．（2025·浙江温州·三模）LfcinB是一种阳性离子抗菌肽，其正电荷数决定其抗菌能力。因其分子量较小而易被分解，导致其产量低、较难获取。现利用基因工程技术制备LfcinB，以期获得更高效率的生产应用。回答下列问题：    (1)LfcinB易导致原核宿主裂解死亡，因此往往需要带负电的蛋白（APBSP）与LfcinB相连接形成融合蛋白，以防止这一现象的发生，原因是 。 (2)APBSP-LfcinB基因片段的合成和扩增。利用PCR技术获取APBSP-LfcinB融合基因（获取过程如图1）并扩增，PCR时，引物可以 （A．为Taq DNA聚合酶提供结合位点 B．决定扩增产物大小 C．决定反应的特异性 D．决定变性时间）。以融合基因表达获得的融合蛋白，为方便除去APBSP蛋白而仅获得LfcinB，需在融合蛋白连接处引入甲酸裂解位点（对应的mRNA序列为5'GACCCA-3'）。因此在PCR扩增APBSP基因时，需在 （填“引物1”或“引物2”）的5'端引入甲酸裂解位点的对应序列，其在引物中对应的序列为5'- -3'。 (3)重组载体的构建与克隆。所用表达载体（图2）可将M和N之间的片段整合到酵母菌的染色体上，其中M是甲醇诱导型启动子、Q是终止子。将酶切的质粒与融合基因连接构建重组质粒，并导入大肠杆菌。将大肠杆菌接种至含 的LB培养基中培养和筛选。 (4)重组质粒导入酵母菌。利用图中的限制酶 处理重组质粒，使其线性化，线性化处理的目的可能是 。在低温条件下，将线性化重组质粒与一种毕赤酵母（甲醇营养型酵母菌，且是组氨酸缺失突变体）混合，在50%聚乙二醇溶液中进行短暂的 处理，实现对毕赤酵母的转化。然后将其接种于不含 的培养基，筛选出导入重组质粒的毕赤酵母， (5)融合蛋白的诱导表达。将所选菌株在液体培养基中连续培养若干天，每隔24小时在培养基中加入甲醇，其目的是 。 (6)LfcinB的分离纯化和检测。将含有融合蛋白的上清液收集至离心管中，加入等体积的甲酸处理一定时间，收集固形物并用适量溶液溶解后，用 方法对产物进行分离纯化，再进行检测与鉴定。 【答案】(1)中和 LfcinB的正电荷，抑制其对原核宿主的杀伤作用/提高分子量，增加产物的稳定性 (2) ABC 引物2 5'-TGGGTC-3' (3)含氨苄青霉素 (4) 限制酶SacⅠ 有利于导入酵母菌并整合在酵母菌染色体上 热刺激 组氨酸 (5)诱导融合基因表达，同时为毕赤酵母提供碳源和能量/营养物质 (6)电泳 【分析】1、PCR技术是对体内DNA复制过程的模仿，也需要模板、原料、酶和引物等。待扩增的DNA分子是模板，原料是4种脱氧核苷三磷酸，即dNTP，N代表A、T、G、C四种碱基。 2、基因工程的基本操作步骤包括获取目的基因、构建重组DNA分子、将重组DNA 分子导入受体细胞、检测目的基因及其表达产物等。 【详解】（1）LfcinB易导致原核宿主裂解死亡，该过程中带负电的蛋白（APBSP）与LfcinB相连接形成融合蛋白，由于LfcinB的正电荷被中和，进而抑制其对原核宿主的杀伤作用，因而LfcinB的抗菌能力下降，进而避免了宿主细胞被裂解。 （2）APBSP-LfcinB基因片段的合成和扩增。利用PCR技术获取APBSP-LfcinB融合基因（获取过程如图1）并扩增，PCR时，引物可以决定扩增产物大小、也可以决定反应的特异性，还可以为DNA聚合酶提供结合位点，进而驱动子链延伸，即ABC正确。以融合基因表达获得的融合蛋白，为方便除去APBSP蛋白而仅获得LfcinB，需在融合蛋白连接处引入甲酸裂解位点，因此在PCR扩增APBSP基因时，需在“引物2”的5'端引入甲酸裂解位点的对应序列，由于甲酸裂解位点对应的mRNA序列为5'GACCCA-3'，结合模板链的方向可确定，在引物中添加的对应的序列为5'-TGGGTC-3'。 （3）重组载体的构建与克隆。所用表达载体可将M和N之间的片段整合到酵母菌的染色体上，其中M是甲醇诱导型启动子、Q是终止子。将EcoRⅠ和酶和NotⅠ酶切的质粒与融合基因连接构建重组质粒，并导入大肠杆菌。将大肠杆菌接种至含氨苄青霉素的LB培养基中培养和筛选，因为重组质粒中含有抗氨苄青霉素的抗性基因。 （4）重组质粒导入酵母菌。可利用图中的限制酶SacⅠ酶切处理重组质粒，使其线性化，线性化处理有利于重组质粒导入酵母菌并整合在酵母菌染色体上，避免质粒的自主复制，提高整合效率。在低温条件下，将线性化重组质粒与一种毕赤酵母（甲醇营养型酵母菌，且是组氨酸缺失突变体）混合，在50%聚乙二醇溶液中进行短暂的热刺激处理，实现对毕赤酵母的转化。然后将其接种于不含组氨酸的培养基，这是因为成功导入目的基因的酵母菌可以合成组氨酸，进而使得发生转化的酵母菌能正常生长，据此可筛选出导入重组质粒的毕赤酵母， （5）融合蛋白的诱导表达。将所选菌株在液体培养基中连续培养若干天，每隔24小时在培养基中加入甲醇，该操作的目的是诱导融合基因表达，同时为毕赤酵母提供碳源和能量。 （6）LfcinB的分离纯化和检测。将含有融合蛋白的上清液收集至离心管中，加入等体积的甲酸处理一定时间，收集固形物并用适量溶液溶解后，用电泳的方法对产物进行分离纯化，再进行检测与鉴定。 44．（2025·江苏·三模）病毒诱导的基因沉默技术（VIGS）是利用病毒载体携带目的基因侵染植物细胞，在植物细胞中复制产生dsRNA（双链RNA），激活植物自身的基因沉默机制，降解植物目标mRNA的技术。叶用莴苣生长到一定时期极易抽薹（茎迅速生长），从而导致莴苣减质减产。研究表明LsMET1基因（甲基转移酶1基因）促进叶用莴苣抽薹，研究人员利用VIGS尝试使LsMET1基因沉默来验证该观点，主要操作如图。请回答下列问题。 (1)过程①反应体系中加入的物质除引物、原料、模板外，还有 ，下列四种引物中用于过程①的是 。 A．5'GAATTCATGA………………………3'    B．5'CTTAAGTTAC………………………3' C．5'CTGCAGTAGA………………………3'    D．5'GACGTCATCT………………………3' (2)过程②将环状DNA扩增为线性DNA的目的是 。 (3)在TRV1、TRV2质粒中插入双启动子目的是 。过程④将TRV1质粒和重组质粒导入农杆菌后，在培养基中应加入 进行筛选。 (4)导入植物细胞的CP-LsMET1-RZ基因转录后在 催化下，被剪切为CPRNA、LsMET1 RNA、RZRNA。LsMET1 RNA诱导内源LsMET1基因沉默的机制如图2，AGO1蛋白选择性降解3'端稳定性较低的一条链。据图分析，向农杆菌中导入TRV1质粒的目的是 ，激活的RISC有的能诱导LsMET1 mRNA降解，有的不能诱导LsMET1 mRNA降解，其原因是 。 (5)研究人员测定了LsMET1表达量和抽墓（茎生长）状况，结果如图3。该实验结果与预期是否一致，并说明理由。 。 【答案】(1) 逆转录酶、TaqDNA聚合酶（Mg2+缓冲液） A、C (2)有利于目的基因与载体连接 (3) 提高目的基因的表达水平 氨苄青霉素和卡那霉素 (4) CP-LsMET1-RZRNA中的RZRNA片段（自切割核糖核酸酶） 在植物细胞中合成RNA聚合酶，催化合成dsRNA AGO1蛋白水解siRNA的链不同 (5)一致，实验组LsMET1基因表达量明显下降，茎生长受抑制。 【分析】RNA是在细胞核中，以DNA的一条链为模板合成的，这一过程称为转录。分析题文描述和图2可知：RNA干扰是一种双链RNA介导的机制，在转录后水平调控基因表达，其工作原理是将双链RNA（dsRNA）切割产生的siRNA片段与一系列酶结合组成诱导沉默复合体（RISC），激活的RISC通过碱基配对结合到与siRNA同源的mRNA上，并切割该mRNA，导致翻译过程无法进行。 【详解】（1）图中过程①是由RNA获得目的基因的过程，该过程首先应经逆转录获得DNA，随后进行PCR扩增，所以反应体系中加入的物质除引物、原料、模板外，还有逆转录酶、TaqDNA聚合酶（Mg2+缓冲液，用于激活TaqDNA聚合酶）。 扩增过程中子链延伸的方向为5'端→3'端，结合图中序列可知，应选择引物A和C进行扩增。 （2）过程②将环状DNA扩增为线性DNA有利于目的基因与载体连接。 （3）启动子的作用是与RNA聚合酶结合，启动转录，在TRV1、TRV2质粒中插入双启动子可有效提高目的基因的转录水平。由于导入的TRV1质粒含有氨苄青霉素抗性基因、重组质粒含有卡那霉素抗性基因，所以在培养基中应加入氨苄青霉素和卡那霉素进行筛选。 （4）由图1注可知，RZ为自切割核糖核酸酶基因，所以导入植物细胞的CP-LsMET1-RZ基因转录后在CP-LsMET1-RZRNA中的RZRNA片段（自切割核糖核酸酶）催化下，被剪切为CPRNA、LsMET1 RNA、RZRNA。由图1可知，RdRp为病毒的RNA聚合酶基因，向农杆菌中导入TRV1质粒的目的是在植物细胞中合成RNA聚合酶，催化合成dsRNA，由于AGO1蛋白选择性降解3'端稳定性较低的一条链，而不同LsMET1链的稳定性，即AGO1蛋白水解siRNA的链不同，所以激活的RISC有的能诱导LsMET1 mRNA降解，有的不能诱导LsMET1 mRNA降解。 （5）由图3可知，实验组较对照组LsMET1基因表达量明显下降，茎生长受抑制，说明实验结果与预期一致。 45．（2025·河南·三模）科研人员利用农杆菌介导的喷花法（即将农杆菌悬浮液用微型喷壶均匀喷洒于棉花柱头和花药等器官上）将海岛棉中控制纤维发育良好的目的基因GbHCT与草铵麟除草剂抗性基因导入陆地棉Y1169中（如图），研究棉花株高、有效铃数等农艺性状的改变与目的基因GbHCT插入的关系。回答下列相关问题： (1)GbHCT基因包括GbHCT13、GbHCTI5两种，首先用PCR技术对基因分别扩增，扩增两基因时均需要引物，引物的作用是 ，该过程中为激活参与反应的酶需在缓冲液中添加 。 (2)利用BglⅡ与BstEⅡ对pCAMBIA3301载体进行双酶切的优点是 。用PCR技术扩增GbHCT基因时，对目的基因的引物的操作是 。 (3)研究人员将带有pCAMBIA3301－GbHCT重组载体的农杆菌菌液通过喷花法转化到棉花中，其原理是 。在幼苗期对每株植株的同一叶片涂抹大田适用的草铵麟除草剂，该操作的目的是 ，此时草铵膦除草剂抗性基因属于 。 (4)下表为两个转基因棉花品系农艺性状与非转基因陆地棉Y1169对照组之间的比较。 品系 株高 有效果枝数 有效铃数 转GbHCT13 85.10 11.10 14.96 转GbHCT15 83.35 12.78 17.14 Y1169 79.70 9.30 9.20 据此得出的实验结论是 。 【答案】(1) 使DNA聚合酶从引物的3＇端开始连接脱氧核苷酸 Mg2+ (2) 避免载体的自身环化，确保目的基因与载体定向连接 在扩增时通过在引物的5＇端设计相应酶的识别序列，而实现目的基因两侧存在BglⅡ与BstEⅡ的酶切位点 (3) 农杆菌中Ti质粒上的T-DNA可将目的基因插入棉花细胞的染色体DNA上 筛选导入目的基因的棉花植株 标记基因 (4)与非转基因棉花相比，2个转基因品系的各项农艺性状均有提高，其中转GbHCT15品系优势更明显 【分析】基因工程的基本操作步骤主要包括四步：①目的基因的获取；②基因表达载体的构建；③将目的基因导入受体细胞；④目的基因的检测与表达。其中，基因表达载体的构建是基因工程的核心。引物是一小段能与DNA母链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸。用于PCR的引物长度通常为20~30个核苷酸； 转化是指目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程。 【详解】（1）GbHCT基因包括GbHCT13、GbHCTI5两种，首先用PCR技术对基因分别扩增，扩增两基因时均需要引物，引物的作用是使DNA聚合酶从引物的3＇端开始连接脱氧核苷酸，该过程中需在缓冲液中添加Mg2+，因为Mg2+能激活DNA聚合酶。且该过程中用到的是耐高温的DNA聚合酶。 （2）结合图示可以看出，在构建目的基因表达载体时，使用BglⅡ与BstEⅡ对pCAMBIA3301载体进行双酶切，采用双酶切的优势是避免载体的自身环化，确保目的基因与载体定向连接。用PCR技术扩增GbHCT基因时，需要对目的基因的引物进行的操作是在引物的5＇端设计相应酶的识别序列，进而在目的基因的两侧构建BglⅡ与BstEⅡ的酶切位点。 （3）研究人员将带有pCAMBIA3301－GbHCT重组载体的农杆菌菌液通过喷花法转化到棉花中，这是因为农杆菌中Ti质粒上的T-DNA可将目的基因插入棉花细胞的染色体DNA上，进而实现转化。在幼苗期对每株植株的同一叶片涂抹大田适用的草铵麟除草剂，其目的是筛选导入目的基因的棉花植株，因为重组质粒上带有草铵膦除草剂抗性基因，此时草铵膦除草剂抗性基因属于标记基因。 （4）下表为两个转基因棉花品系农艺性状与非转基因陆地棉Y1169对照组之间的比较可以看出2个转基因品系有效果枝数和有效铃数均增多，其中转GbHCT15品系优势更明显。 46．（2025·四川内江·三模）2-苯乙醇（2-PE）具有令人愉悦的玫瑰香气，常作为添加剂而广泛地应用于食品、化妆品和医药领域。酿酒酵母生产2-PE过程中，支路基因ARO8的表达会损耗中间代谢物而导致2-PE产量不高。科研人员欲使用CRISPR/Cas9基因编辑技术（CRISPR/Cas9系统编码的sgRNA可引导Cas9蛋白切割目的基因）对尿嘧啶营养缺陷型酿酒酵母进行编辑处理，以降低由ARO8基因导致的中间产物损耗来提高2-PE产量。生产过程如图1： 注：1.BclⅠ识别序列5'-TGATA-3'，SmiⅠ识别序列为5'- TTTAAA-3'，EcoRⅠ识别序列为5'- GAATTC-3'； 2.URA3基因表达产物可指导合成尿嘧啶，但当培养基中含有5-氟乳清酸（5-FOA）时，尿嘧啶可将5-FOA转化为有毒的5-氟尿嘧啶而抑制细胞生长。 回答下列问题： (1)构建基因表达载体。人工合成sgRNA对应的DNA片段时，应根据 基因的部分已知碱基序列等设计。据图分析可知，为保证sgRNA对应的DNA片段正确插入质粒1中，在进行PCR扩增时需在该DNA片段上下游分别添加 限制酶的识别序列，再用 连接。基因表达载体除了图示组成外，还需要有 。 (2)基因表达载体的扩增。在含有 的培养基上筛选培养导入重组质粒的大肠杆菌，提取质粒。 (3)导入受体细胞。用质粒2转化尿嘧啶营养缺陷型酿酒酵母，在 的平板上筛选成功导入质粒的酿酒酵母。Cas9蛋白在sgRNA引导下切割ARO8基因实现对ARO8基因的敲除。实现敲除后，为避免质粒残留带来后续影响，研究人员将获得的单菌落多次传代，随后稀释涂布在含有 的平板上，筛选并获得不再含有质粒2的菌落。 (4)表达水平检测。为验证ARO8基因的缺失对2-PE合成的影响，研究人员对2-PE发酵产量进行了检测，结果如图2.实验结果说明 。 【答案】(1) ARO8 Bcl I、Smi I DNA连接酶 复制原点 (2)氨苄青霉素 (3) 缺乏尿嘧啶 5-氟乳清酸（5-FOA） (4)ARO8基因的缺失能提高2-PE产量（或“ARO8的表达会导致2-PE产量较低”） 【分析】基因工程技术的基本步骤：（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成；（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等，标记基因可便于目的基因的鉴定和筛选。启动子是驱动基因转录的元件，而终止子是指示转录终止的位置；（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法；（4）目的基因的检测与鉴定：分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA是否插入目的基因——DNA分子杂交技术；②检测目的基因是否转录出了mRNA——分子杂交技术；③检测目的基因是否翻译成蛋白质——抗原-抗体杂交技术。个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。 【详解】（1）图中显示，CRISPR/Cas9系统编码的sgRNA可通过碱基互补配对与ARO8基因进行结合，引导Cas9蛋白切割ARO8，所以，人工合成sgRNA对应的DNA片段时，应根据ARO8基因的部分已知碱基序列等设计。图中质粒1中，启动子与终止子之间依次有Bcl I、Smi I、EcoR I的酶切位点，而EcoR I会破坏氨苄青霉素抗性基因，在进行PCR扩增时需在sgRNA对应的DNA片段上下游分别添加Bcl I、Smi I限制酶的识别序列，再用DNA连接酶进行连接。基因表达载体的组成包括目的基因、复制原点、启动子、终止子和标记基因。图1中的质粒2即基因表达载体，其中显示了启动子、终止子、Cas9基因和sgRNA对应的DNA片段（目的基因）、URA3基因和氨苄青霉素抗性基因（标记基因，它们的表达产物便于目的基因的检测与受体细胞的筛选）。所以基因表达载体除了图示组成外，还需要有复制原点。 （2）因为基因表达载体含氨苄青霉素抗性基因，所以进行基因表达载体的扩增时，可以在含有氨苄青霉素的培养基上筛选培养导入重组质粒的大肠杆菌，提取质粒。 （3）同理，用质粒2转化尿嘧啶营养缺陷型酿酒酵母，在不含尿嘧啶的平板上筛选成功导入质粒的酿酒酵母。基因表达载体上的URA3基因的表达产物可指导合成尿嘧啶，但当培养基中含有5-氟乳清酸（5-FOA）时，尿嘧啶可将5-FOA转化为有毒的5-氟尿嘧啶而抑制细胞生长。Cas9蛋白在sgRNA引导下切割ARO8基因实现对ARO8基因的敲除。实现敲除后，为避免质粒残留带来后续影响，研究人员将获得的单菌落多次传代，随后稀释涂布在含有5-氟乳清酸（5-FOA）的平板上，筛选并获得不再含有质粒2的菌落。 （4）为验证ARO8基因的缺失对2-PE合成的影响，研究人员对2-PE发酵产量进行了检测，图2显示，在24h的发酵时间中，ARO8基因缺失的突变株生产的2-PE浓度比原型株更高，说明ARO8基因的缺失能提高2-PE产量（或“ARO8的表达会导致2-PE产量较低”）。 47．（2025·青海西宁·三模）北京大学贾桂芳课题组、美国芝加哥大学何川课题组、贵州大学宋宝安课题组将水稻转入肥胖基因（FTO基因），单株产量提高了三倍。科研人员构建含肥胖基因的重组质粒，主要技术流程如图所示。图中HindⅢ、BamHI、PstI、XhoI和EcoRI表示限制酶，NptⅡ为卡那霉素抗性基因。请回答下列问题： (1)获取FTO基因时，需要先从细胞中提取 ，再通过逆转录过程获得cDNA，进而通过PCR扩增FTO基因；引物的作用是 。 (2)PCR的产物可通过电泳鉴定，如果待测FTO基因片段的泳道出现杂带，原因可能是复性时温度偏 （填“高”或“低”），导致 。 (3)构建重组质粒时，先将Bt基因替换为FTO基因。扩增FTO基因前，要在两种引物的5'端加入图示限制酶 的识别序列。过程②构建重组质粒选用的酶是 。 (4)常用 法将FTO基因导入水稻细胞，转化后的细胞在培养基上培养。配制培养基时，除了营养物质和激素外，还需要的物质是 。 【答案】(1) mRNA/总RNA 使DNA聚合酶从引物的3'端开始连接脱氧核苷酸 (2) 低 引物与DNA模板非特异性结合增多，引物脱靶率较高，非特异性扩增产物增多 (3) PstⅠ、XhoⅠ BamHⅠ、EcoRⅠ和DNA连接酶/HindⅢ、EcoRⅠ和DNA连接酶 (4) 花粉管通道/农杆菌转化 卡那霉素 【分析】基因工程技术的基本步骤：（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成；（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等；（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法；（4）目的基因的检测与鉴定：分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA是否插入目的基因：DNA分子杂交技术；②检测目的基因是否转录出了mRNA：分子杂交技术；③检测目的基因是否翻译成蛋白质：抗原-抗体杂交技术；个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。 【详解】（1）获得目的基因的方法有逆转录法，因此需要先从细胞中提取mRNA，再通过逆转录过程获得cDNA。引物的作用是使DNA聚合酶从引物的3'端开始连接脱氧核苷酸。 （2）复性时温度偏低，引物与DNA模板非特异性结合增多，引物脱靶率较高，非特异性扩增产物增多，即扩增了一些非目的基因，电泳时泳道内可能会出现杂带。 （3）由图可知，构建过程中需要将Bt基因切除，重新将FTO基因连接到原Bt基因的位置，因此需要限制酶PstⅠ和XhoⅠ，再将“启动子—FTO基因—终止子”连接到含NptⅡ基因的质粒上时，需要限制BamHⅠ、EcoRⅠ和DNA连接酶，或HindⅢ、EcoRⅠ和DNA连接酶连接上述片段。 （4）用花粉管通道法（或农杆菌转化法）将目的基因转入植物细胞。成功导入FTO基因的水稻细胞含有卡那霉素抗性基因，所以配制培养基时，除了营养物质和激素外，还需要卡那霉素筛选成功导入目的基因的细胞。 48．（2025·河南郑州·三模）2，3一丁二醇是一种在食品工业、医药行业等诸多领域具有广泛应用价值的化合物，常用产气肠杆菌进行生产。产气肠杆菌发酵产生2，3—丁二醇的同时，也会生成乳酸、甲酸、乙酸等多种副产物，影响产量。回答下列问题。 (1)对产气肠杆菌进行纯培养时，下列接种过程的正确排序是 。培养过后，若在培养基中观察到不同形态的菌落，原因可能是 。    (2)已知P基因（位于拟核DNA分子中）与产气肠杆菌发酵过程中副产物的生成有关。研究人员拟用如下图所示的流程构建重组质粒，随后将其转入产气肠杆菌体内用以敲除P基因（敲除后的P基因将被有关的酶降解），请完善相关步骤。    ①要得到步骤③所示的重组质粒，应采用引物 和 对上述片段进行PCR扩增。 ②用限制酶 处理PCR产物，并用XholⅠ对质粒进行酶切。 ③将酶切后的PCR产物和质粒进行连接后得到如下重组质粒。    ④组成该质粒的结构还必须包括 （答出2点即可）等。 (3)将经上述流程获得的重组质粒导入产气肠杆菌并进行筛选，随后采用不同引物组合对筛选后的菌株进行PCR扩增，电泳检测结果如下图所示。其中，P基因已被敲除的有 。为检测该基因工程是否取得成功，最终应进行的操作为 。    【答案】(1) b、a、c、d 实验用菌液不纯（混入其他杂菌、在实验操作过程中被杂菌污染） (2) 1 4 BamHI和XhoI 启动子、终止子、复制原点、标记基因 (3) 样品1、样品2和样品4 进行个体生物学水平的检测，看筛选出来的菌株在生成2，4—丁醇的同时，副产物的合成量是否降低 【分析】基因工程技术的基本步骤：(1) 目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。(2) 基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子、复制原点和标记基因等。 【详解】（1）接种过程的正确排序：准备培养基、消毒接种环、取菌种、划线接种、培养。对应题干的顺序是b、a、c、d；若在培养基中观察到不同形态的菌落，原因可能是三方面：可能引入了其他微生物造成污染；某些菌株在培养过程中发生了基因突变； 接种时可能混入了不同菌株； （2）要得到步骤③所示的重组质粒，应采用引物1和4对上述片段进行PCR扩增，引物1和4能对应上启动子和终止子序列，能让P基因正常转录，引物2和3不满足条件；用限制酶XhoI 处理PCR产物，因为结合题图可以看出XhoI酶切位点有两个，分别在上游臂左侧和下游臂右侧，再用同种限制酶XholⅠ对质粒进行酶切；基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因、复制原点等； 用限制酶BamHI和XhoI共同处理PCR产物，可去除P基因，并在DNA连接酶作用下使上游臂和下游臂连接， 再用同种限制酶XholI对质粒进行酶切：基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基 因、启动子、终止子和标记基因、复制原点等： （3）P基因已被敲除的有：电泳结果中未出现P基因条带的菌株，其中，P基因已被敲除的有样品1、样品2和样品4；为检测该基因工程是否取得成功，最终应进行的操作为进行个体生物学水平的检测，做相应的抗性等接种实验检测等，看筛选出来的菌株在生成2，4—丁醇的同时，副产物的合成量是否降低，也就是检测副产物生成量是否减少，确认P基因敲除的效果。 49．（2025·福建三明·三模）我国是世界上最大的水稻生产国，水稻的栽培历史源远流长。在水稻育种方面，转基因技术已成为新品种培育的一条崭新途径，研究人员运用基因工程技术进行转基因水稻的研究。图1是研究人员利用T-DNA将目的基因导入水稻的一条染色体DNA局部示意图。    注：①图中灰色部分为带有目的基因的T-DNA片段。 ②酶切位点及引物2-5位于T-DNA末端区域。 回答下列问题： (1)由于该T-DNA长度过长，PCR无法扩增完整序列，为检测植株是否含有目的基因，应选取的引物是 （从引物2~引物5中选择），进行PCR及电泳检测，得到结果，如图2。其中，1和2分别为野生型和已知转基因植株作为对照， 为转基因植株。    (2)反向PCR技术是一种用于扩增已知序列侧翼未知DNA序列的技术。为进一步确定含目的基因的T-DNA插入染色体的具体位置，研究人员利用图2转基因植株2的染色体DNA检测，流程如图3。    通过过程Ⅰ、Ⅱ获得环状DNA后，过程Ⅲ应选取图1中的引物 扩增。为了验证T-DNA的定位，根据过程Ⅳ测序结果设计引物6，选取引物3和6，以植株2的染色体DNA为模板，进行PCR扩增，电泳结果获得扩增产物，说明植株2的T-DNA整合在 区域。利用引物3和6检测其他转基因植物，电泳结果显示仅部分转基因植物有PCR扩增产物，则说明 。 (3)对植株2自交所得子代植株DNA进行PCR检测，得到结果如图4。结合图1推测：子代PCR时除了使用了引物2和6组合外，还使用了引物 组合，根据PCR结果可以确定 为所需纯合转基因植株。    【答案】(1) 2和5 3-7 (2) 3和4 靠近引物6对应序列的染色体区域 T-DNA整合到染色体DNA上的位置是随机的（不是唯一的） (3) 1和6 4 【分析】PCR技术： （1）概念：PCR全称为聚合酶链式反应，是一项在生物体外复制特定DNA的核酸合成技术。 （2） 原理：DNA双链复制。 （3）前提条件：要有一段已知目的基因的核苷酸序以便合成一-对引物。 （4）条件：模板DNA、四种脱氧核苷酸、一对引物、热稳定DNA聚合酶(Taq酶)。 （5）过程：高温变性：DNA解旋过程(PCR扩增中双链DNA解开不需要解旋酶，高温条件下氢键可自动解开) ；低温复性：引物结合到互补链DNA上；中温延伸：合成子链。 【详解】（1）引物的作用是使DNA聚合酶从引物的3'端连接脱氧核苷酸，即子链延伸的方向是5'→3'端，根据DNA分子的方向可知，应选取的引物是引物2和引物5。1和2分别为野生型和已知转基因植株作为对照，3-7都有与2相同的条带，可知3-7为转基因植株。 （2）反向PCR技术是一种用于扩增已知序列侧翼未知DNA序列的技术，因是需对位置序列进行扩增，需选用引物3和引物4。植株2为转基因植株，选取引物3和6，电泳结果获得扩增产物，说明目的基因存在于未知序列，即靠近引物6对应序列的染色体区域。利用引物3和6检测其他转基因植物，电泳结果显示仅部分转基因植物有PCR扩增产物，说明部分与植株 2 的 T‐DNA 插入位点相同，其他株系则插入在不同位置，即T-DNA整合到染色体DNA上的位置是随机的。 （3）由图可知，电泳检测两种条带，一种是野生型，一种是转基因条带，引物2和6组合可扩增出转基因条带，引物1和6可扩增出野生型条带。仅有转基因条带而无野生型条带者，即可确定为所需的纯合转基因植株，即4为所需纯合转基因植株。 50．（2025·重庆·三模）甲硫氨酸作为必需氨基酸之一，是动物饲料中必不可少的添加剂。某科研小组以蜡样芽孢杆菌EN34为材料生产甲硫氨酸，但是产量不高。已知metI基因、metK基因与甲硫氨酸的合成和分解有关，metI基因指导合成的酶R可催化M转化为甲硫氨酸，metK基因指导合成的SAM合成酶可催化甲硫氨酸转化为S-腺苷甲硫氨酸（SAM）。回答下列问题： (1)甲硫氨酸是蜡样芽孢杆菌EN34的 （填“初生”或“次生”）代谢物。若要提高蜡样芽孢杆菌 EN34生产甲硫氨酸的产量，从调控metI基因与metK 基因表达的角度分析，应该进行的操作是 。 (2)该小组构建了含有某种强启动子（P43）和metI基因的基因表达载体，相关过程如图1所示。该过程需要用到的工具酶除图中的 HindⅢ和EcoRⅠ外，还有 。metI 基因表达时，以 （填“a”或“b”）链为转录的模板。科研中常用 （填离子）处理蜡样芽孢杆菌 EN34，有利于将 pEB03-P43-metI表达载体导入其中。 (3)该小组利用基因敲除技术（通过一定的途径使机体特定的基因失活或缺失）敲除蜡样芽孢杆菌 EN34 的metK基因后，将其相关DNA片段及野生型菌株的相关片段用PCR技术扩增，再进行电泳处理，结果如图2所示。分子在电泳过程中的迁移速率与 答出2点）等有关，据图2推测，该过程敲除基因的原理是 。 【答案】(1) 初生 增强metI基因的表达，抑制metK基因的表达（或敲除metK基因） (2) DNA连接酶 a Ca2+/钙 (3) 凝胶浓度、分子大小、分子构象 往metK基因中插入一段DNA序列，从而使原metK基因结构被破坏 【分析】1、基因工程技术的基本步骤：（1）目的基因的获取；（2）基因表达载体的构建；（3）将目的基因导入受体细胞；（4）目的基因的检测与鉴定。 2、利用PCR可以在体外进行DNA片段的扩增。PCR利用了DNA的热变性原理，通过调节温度来控制DNA 双链的解聚与结合PCR仪实质上就是一台能够自动调控温度的仪器。一次PCR一般要经历30次循环DNA分子具有可解离的基团，在一定的pH下，这些基团可以带上正电荷或负电荷。在电场的作用下，这些带电分子会向着与它所带电荷相反的电极移动，这个过程就是电泳。PCR的产物一般通过琼脂糖凝胶电泳来鉴定。在凝胶中DNA分子的迁移速率与凝胶的浓度、DNA分子的大小和构象等有关。凝胶中的DNA分子通过染色，可以在波长为300nm的紫外灯下被检测出来。 3、基因表达载体的组成：目的基因+启动子+终止子+标记基因。启动子是RNA聚合酶特异性识别和结合的DNA序列，是基因的一个组成部分，控制基因表达（转录）的起始时间和表达的程度。终止子是给予RNA聚合酶转录终止信号的DNA序列。 【详解】（1）甲硫氨酸作为必需氨基酸之一，是蜡样芽孢杆菌EN34生命活动所必需的物质，属于初生代谢物。metI基因指导合成的酶R可催化M转化为甲硫氨酸，metK基因指导合成的SAM合成酶可催化甲硫氨酸转化为S-腺苷甲硫氨酸（SAM），因此可增强metI基因的表达，增加酶R含量，抑制metK基因的表达，减少SAM合成酶含量，进而提高蜡样芽孢杆菌 EN34生产甲硫氨酸的产量。 （2）基因表达载体的构建过程中需要限制酶和DNA连接酶，由表达方向和限制酶的位置，可知metI 基因表达时，以a链为转录的模板。科研中常用Ca2+处理蜡样芽孢杆菌 EN34，使其处理一种能吸收周围环境中DNA分子的状态，有利于将 pEB03-P43-metI表达载体导入其中。 （3）在电泳过程中的迁移速率与凝胶浓度、分子大小、分子构象等有关，由图2可知，敲除基因处理的DNA分子大于野生型菌株，可知该过程敲除基因的原理是往metK基因中插入一段DNA序列，从而使原metK基因结构被破坏。 51．（2025·甘肃白银·三模）玉米又称棒子、苞米、苞谷等，是我国重要的粮食作物之一。研究玉米的光合作用速率和培育玉米新品种均具有重要的意义。玉米在早期光合作用的过程中会产生大量可溶性糖，可溶性糖在淀粉合成酶的作用下转化为淀粉，使玉米籽粒呈糯性。研究发现，与野生型相比，玉米的CST1基因缺失突变体光合作用速率下降。回答下列问题： (1)科研人员对玉米叶片的气孔开放程度进行检测，结果如图1所示，    据图分析，突变型玉米光合作用速率下降的原因可能是 。 (2)科研人员培育出超量表达P蛋白的转基因玉米，以提高玉米的营养价值。利用Ti质粒构建的基因表达载体如图2所示，其中强启动子能驱动基因的持续转录。将萌发的玉米种子的胚芽尖端割伤，有利于种子吸收酚类化合物。    ①在构建基因表达载体时，图2中切割目的基因的DNA片段应选用的限制酶是 。同时用农杆菌侵染玉米叶片外植体，其目的是 ，但科研人员在实验中发现，玉米等单子叶植物无法分泌酚类化合物，导致农杆菌难以感染，为了提高转化的成功率，可将萌发的玉米种子的胚芽尖端割伤，然后在伤口处 ，最后再置于农杆菌液中进行浸泡。 ②为了检测P蛋白基因是否整合到玉米细胞的染色体DNA上，初步检测时最好在培养基中加入 。 【答案】(1)突变型玉米的气孔开放程度低，CO2的吸收量减少，暗反应速率下降 (2) BamHⅠ和SacⅠ 通过农杆菌的转化作用，使目的基因进入植物细胞 添加酚类化合物 潮霉素 【分析】基因工程操作程序包括四个步骤：目的基因的获取、基因表达载体的构建、将目的基因导入受体细胞、目的基因的检测与鉴定。 【详解】（1）由图可知，相比于野生型，突变型气孔开放度降低，可知突变型玉米的气孔开放程度低，CO2的吸收量减少，暗反应速率下降，进而玉米光合作用速率下降。 （2） ①为了培育出超量表达P蛋白的转基因玉米，应将强启动子和P蛋白基因一同切割下来与质粒结合，目的基因需插入到T-DNA片段内，因此不能选择限制酶ClaⅠ，故左侧选择BamHⅠ；通过观察质粒上的启动子和终止子的方向，应选择SacⅠ，这样可以保证目的基因的转录方向和质粒上T-DNA片段转录方向一致，故图中切割目的基因的DNA片段应选用的限制酶是BamHⅠ和SacⅠ。用农杆菌侵染玉米叶片外植体，其目的是将重组Ti质粒导入受体细胞，使含P蛋白基因的T-DNA片段整合到玉米细胞染色体上并持续表达。由于玉米等单子叶植物无法分泌酚类化合物，导致农杆菌难以感染，为了提高转化的成功率，可将萌发的玉米种子的胚芽尖端割伤，然后在伤口处施加酚类化合物，最后再置于农杆菌液中进行浸泡。 ②目的基因是随着T-DNA片段一起整合到玉米细胞的染色体DNA上，T-DNA片段上除了含有目的基因还有潮霉素抗性基因，因此为了检测P蛋白基因是否整合到玉米细胞的染色体DNA上，初步检测时最好在培养基中加入潮霉素。 52．（2025·甘肃甘南·三模）shRNA表达载体产生的shRNA会形成发卡结构，其中单链结构由loop序列区编码后产生环形，而双链结构被RNaseⅢ类似酶Dicer剪切成为siRNA，siRNA可与靶基因表达产生的mRNA结合，导致mRNA被降解从而诱导靶基因沉默。利用该技术同时干扰植物甲KatB基因和KatC基因的表达，研究人员设计了shRNA表达载体，KatB和KatC转录模板链部分序列和shRNA表达载体的示意图如图1、2所示。回答下列问题:    (1)表达载体的RB和LB分别是T - DNA的右边界和左边界，其中表示终止子的序列是 。目的基因用限制酶XhoⅠ和SpeⅠ处理后可定向插入6×UAS的下游，原因是两者切割DNA产生的 不同。 (2)HPT表达的酶使细胞对抗生素——潮霉素B具有抗性。重组质粒转入受体菌后，培养液中添加一定量的潮霉素B，目的是 、 。 (3)为达到更高的干扰效率，目的基因①的序列与KatB和KatC基因 （填图中的区域）的序列一致。①的编码链5'～3'序列与②的 序列相同，理由是 。 (4)导入重组质粒的植物甲进行转化并用DEX诱导目的基因表达，检测基因的表达情况结果如图所示。植株M和N的表达情况不同，其原因可能是 。    【答案】(1) NOS （黏性）末端 (2) 杀死杂菌 筛选含有重组质粒的受体菌（去除质粒丢失的受体菌） (3) B区 转录模板链3'至5' 转录后产生的shRNA，其5'端与3'端的碱基互补配对，形成发卡结构 (4)植株N的KatC基因的mRNA不能完全被降解 【分析】基因工程基本操作程序：目的基因的获取、基因表达载体的构建、目的基因导入受体细胞和目的基因的检测与鉴定。 【详解】（1）HPT是潮霉素磷酸转移酶基因，其上游有启动子35S，下游的NOS则表示终止子。目的基因和T-DNA均含有限制酶XhoⅠ和SpeI的切割位点，两种酶切割DNA产生的黏性末端不同，使目的基因和T-DNA正向连接。 （2）HPT表达的潮霉素磷酸转移酶使细胞对抗生素潮霉素具有抗性。重组质粒中含有潮霉素磷酸转移酶基因（标记基因），当重组质粒转入受体菌后，向培养液中添加潮霉素，其一可杀死杂菌，同时能筛选出含有重组质粒的受体菌。 （3）KatB基因和KatC基因的B区序列差异小，目的基因①的序列与B区的序列一致，可实现SiRNA同时与两种靶基因的mRNA结合，高效地使两种基因沉默。shRNA的首端和末端互补配对，因此，①的非转录模板链5'至3'的序列与②的转录模板链3'至5'的序列相同，转录后产生shRNA，其中loop序列区编码后产生环形，从而形成发卡结构。 （4）分析题图可知，加入DEX后，植株M没有这两种基因表达出的蛋白质，说明KatB基因和KatC基因已完全沉默。植株N的KatC基因能表达出部分蛋白质，可能是KatC基因的mRNA不能完全被降解，导致KatC 基因不能完全沉默。 53．（2025·江西·三模）海洋中含有丰富的几丁质，科研工作者从红树林虾场土壤中筛选到一株能够分解几丁质的放线菌橙黄小单孢菌，通过设计特异性引物F（含限制酶 MfeⅠ的酶切位点）和R（含限制酶HindⅢ的酶切位点），以橙黄小单孢菌的基因组DNA 为模板进行PCR，克隆得到一个几丁质酶基因Machi3，并成功在大肠杆菌中表达。请回答下列有关问题： (1)进行PCR时，除了特异性引物和模板外，还要添加 （至少填2项），PCR产物通过琼脂糖凝胶电泳验证后，再对目的片段进行回收。 (2)将测序正确的Machi3和pET-28a质粒（见图1）用 进行酶切,回收目的基因片段和酶切质粒，用 连接构建重组表达质粒，并转化至大肠杆菌细胞中，对重组菌体进行培养，分离提纯重组几丁质酶。 (3)将重组几丁质酶液分别与α-几丁质、胶体几丁质、虾壳粉、淀粉、纤维素、不同脱乙酰度的壳聚糖（脱乙酰度50%、70%、80%、85%、90%、95%）进行反应,在最适反应温度和pH条件下,测定重组几丁质酶的酶活力（结果如图2），根据结果分析，其中 是重组几丁质酶的最适底物，推测壳聚糖脱乙酰度与重组几丁质酶水解效率的关系是 。 【答案】(1)耐高温DNA 聚合酶（Taq DNA 聚合酶），缓冲液，dNTP（4种游离的脱氧核苷酸） (2) 限制酶 MfeⅠ和限制酶 HindⅢ T4 DNA 连接酶或者 E. coli DNA 连接酶 (3) 胶体几丁质 在一定范围内（或“50%~95%的脱乙酰度的范围内”），随着壳聚糖脱乙酰度的增加（或“减少”）几丁质酶水解效率逐渐降低（或“增强”） 【分析】限制酶能够识别双链DNA分子的特定核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的磷酸二酯键断开。选择合适的限制酶对目的基因和质粒进行切割的原则：①不能破坏目的基因；②不能破坏所有的抗性基因（至少保留一个）；③最好选择两种限制酶分别切割质粒和目的基因，防止目的基因和质粒反向连接，同时要防止目的基因自身环化和质粒的自身环化。 【详解】（1）进行PCR时,需要添加特异性引物,模板DNA,耐高温DNA 聚合酶（Taq DNA 聚合酶），dNTP（4种游离的脱氧核苷酸），缓冲液。 （2）PCR 获取目的基因时，设计的特异性引物F含限制酶MfeⅠ的酶切位点和R含限制酶 HindⅢ的酶切位点，这样获得的目的基因两端含有相应的酶切位点，为了让目的基因与质粒准确的连接，质粒也要用相同的限制酶切割，故用限制酶 MfeⅠ和限制酶HindⅢ对目的基因和质粒进行双酶切，再用T4 DNA 连接酶或者E. coli DNA连接酶连接，构建基因表达载体。 （3）由柱状图分析可知，底物为胶体几丁质时，酶活力最高，说明胶体几丁质是几丁质酶的最适底物。根据第3~8根柱状图可知，随着脱乙酰度的减少，酶活力越来越强，说明几丁质酶的水解效率增强。由于实验只研究了50%~95%的脱乙酰度，50%以下的脱乙酰度没有研究，所以在描述时要强调在一定范围内，或者加上条件，在50%~95%的脱乙酰度的范围内。 54．（2025·黑龙江齐齐哈尔·三模）烟草是喜温植物，对温度较敏感，不同温度对烟草品质和产量的影响不同。温度低于13℃，烟草无法生长，所以在烟草植株生长的前期和中期，如遇低温天气，则会造成烟草减产。科学家将陆地棉抗寒基因（GhSAD2基因）导入烟草，提高烟草的低温防御能力，回答下列问题： （注：ori：复制原点；CaMV35S：启动子；GUS：报告基因，可将X-葡萄糖苷转化成蓝色物质） (1)基因工程中可用PCR技术获取和扩增目的基因，其原理是 ，反应体系中需加入：模板（烟草DNA或cDNA）、引物、原料、 、缓冲液和Mg2+等，Mg2+的作用是 (2)为保证GhSAD2基因正向插入载体，需要在引物1的 端加入限制酶 序列。扩增出的目的基因和pBI121载体经XbaI和SmaI双酶切后得到的片段，可用 连接。 (3)将导入GhSAD2基因和GUS基因的双基因表达载体pBI121-GhSAD2-GUS导入农杆菌，可向培养基中加入 物质，在恒温培养箱中培养直至菌落特征稳定，挑取 色（填“蓝色”或“白色”）菌落，经扩大化培养后侵染烟草。 (4)为检测GhSAD2基因是否成功导入并整合到烟草染色体DNA，提取12株长势较好的转基因烟草植株的叶肉细胞DNA，用引物1和引物2进行PCR扩增并电泳检测，结果如图2.根据电泳结果，含pBI121-GhSAD2-GUS基因表达载体的农杆菌侵染烟草植株的转化率约为 。 （注：M为分子大小参照物；1-12为转GhSAD2基因烟草PCR产物；13为pBI121-GhSAD2-GUS基因表达载体PCR产物；14为野生型烟草PCR产物） (5)低温对植物的伤害首先发生在细胞膜上，会破坏细胞膜的流动性，导致电解质渗出，影响外界溶液的电导率。为检测转基因烟草是否表现出抗寒性状，将野生型烟草和转GhSAD2基因烟草分别置于4℃环境中，48h后测定其导电率，结果如图3.结果显示转基因烟草具有抗寒性状，理由是 。 （注：CK为野生型植株；T1、T2为转GhSAD2基因植株） 【答案】(1) DNA半保留复制 TaqDNA聚合酶 (2) 5' XbaⅠ DNA连接酶 (3) X-葡萄糖苷 蓝色 (4)75% (5)T1和T2组转GhSAD2基因植株相对导电率低于对照组野生型植株，说明细胞膜较完整，电解质渗透率低，抗寒性较强 【分析】基因工程技术的基本步骤：（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法。（4）目的基因的检测与鉴定：分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA是否插入目的基因--DNA分子杂交技术；②检测目的基因是否转录出了mRNA--分子杂交技术；③检测目的基因是否翻译成蛋白质--抗原-抗体杂交技术。个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。 【详解】（1）PCR，又名聚合酶链式反应，本质是体外进行DNA复制，故其原理是DNA半保留复制。反应体系中除模板、引物、原料等物质外，还需要耐高温的DNA聚合酶，能够在高温条件下使DNA子链从5’到3’的方向延伸。反应体系中Mg2+的作用是激活DNA聚合酶。 （2）引物的3'端需要与DNA聚合酶结合，才能是子链延伸，故将XbaⅠ酶切序列加到引物1的5'端。目的基因和质粒经XbaⅠ和SmaⅠ双酶切后，分别得到黏性末端和平末端，故用T4DNA连接酶，既能连接粘性末端，又能连接平末端。 （3）GhSAD2基因和GUS基因一同导入表达载体，GUS可将X-葡萄糖苷转化成蓝色物质，故在加入X-葡萄糖苷的培养基中，若GUS基因表达产物能够将X-葡萄糖苷转化成蓝色物质，目的基因也一定导入并表达，故加入X-葡萄糖苷后，挑选蓝色菌落即为含有重组质粒的农杆菌，再将其导入烟草。 （4）1-12为转基因烟草，其中有条带的，即转基因成功的有9株，故转化率为75%。 （5）相对导电率能够反应低温条件对细胞膜流动性的损伤程度，由题意可知，低温对细胞膜损伤程度越大，电解质外渗越多，外界溶液导电率越大。对照组野生型植株导电率较高，而T1和T2转GhSAD2基因植株相对导电率下降，故转基因抗寒烟草构建成功。 55．（2025·陕西安康·三模）某萝卜品种是雌雄同花植物，其储藏根长形（R）对圆形（r）为显性，长形萝卜与圆形萝卜杂交，所得子代全为椭圆形。该萝卜品种在栽培过程中容易感染霜霉病菌，从而影响萝卜的产量和品质。实验人员从某种微生物细胞内提取到抗霜霉病基因T，并将该基因导入椭圆形萝卜中，获得了两种椭圆形抗病萝卜品系P1和P2（每种萝卜品系中只导入了一个抗霜霉病基因T）。为了确认抗霜霉病基因T插入的位置，通过PCR检测P1和P2自交后代F1每株个体的相关基因电泳条带组成，结果如图1、2所示（各种情况均在图中展示）。不考虑基因突变和互换，回答下列问题： (1)从微生物细胞中提取DNA时需要加入蛋白酶，其作用是 。以从微生物细胞中提取的mRNA为模板合成DNA，以DNA为模板进行PCR扩增得到抗霜霉病基因T，以上过程涉及的关键酶是 。 (2)通过PCR扩增基因R、r、T时，需要设计引物，一般来说，设计的引物长度越短，引物特异性越 （填“强”或“弱”）。PCR的缓冲液中一般都要加入Mg2+，目的是 。 (3)根据图1可知，抗病萝卜品系P1中基因T插入的染色体是 ，该品系自交所得F1①②③代表的植株表型及比例为 。 (4)抗病萝卜品系P2自交后代结果表明基因R/r与基因T位于 （填“同源染色体”或“非同源染色体”）上，图2中②代表的植株在F1中所占的比例为 。 【答案】(1) 水解提取液中的蛋白质，提高DNA的纯度和质量 逆转录酶和耐高温的DNA聚合酶 (2) 弱 激活DNA聚合酶 (3) 基因R所在的染色体 长形抗病：椭圆形抗病：圆形不抗病=1：2：1 (4) 非同源染色体 3/8 【分析】PCR技术原理：PCR技术是一种用于在体外快速扩增特定DNA片段的分子生物学技术。其基本原理是利用DNA聚合酶的酶促反应，通过循环加热和降温来扩增目标DNA。具体来说，PCR反应一般分为三步：退火、延伸和变性。在退火步骤中，引物与模板DNA结合；在延伸步骤中，DNA聚合酶以引物为起点，合成新的DNA链；在变性步骤中，DNA双链解离成单链，为下一轮PCR反应做准备。通过不断循环这三个步骤，可以实现DNA片段的指数级扩增。 【详解】（1）从微生物细胞中提取 DNA 时加入蛋白酶，是因为蛋白酶能水解提取液中的蛋白质，提高DNA的纯度和质量。以mRNA为模板合成DNA是逆转录过程，需要逆转录酶；以DNA为模板进行PCR扩增，需要耐高温的DNA聚合酶（Taq 酶）； （2）一般来说，设计的引物长度越短，引物与模板链结合的特异性就越弱，因为短引物更容易与其他非目标序列发生错配。PCR 的缓冲液中加入Mg2+，是因为Mg2+是DNA聚合酶的激活剂，能激活DNA聚合酶； （3）观察图1，P1自交后代中①只有R和T基因，②有R、r和T基因，③只有r基因，说明基因T插入含R基因的染色体上。P1的基因型可以看作是RrT（T与R连锁），其自交，产生的配子有RT、r，后代基因型及比例为RRTT（①）：RrT（②）：rr（③）=1:2:1，表现型及比例为长形抗病：椭圆形抗病：圆形不抗病=1:2:1； （4）从图2可以看出，P2自交后代的基因组合类型较多，符合自由组合定律，所以基因R/r与基因T位于非同源染色体上；由图2可知，P2的基因型为RrT，该植株产生的配子及比例为RT：r：rT：R=1:1:1:1，P2自交后代的基因型及比例（用棋盘法）为RRTT：RrT：RrTT：RRT：rrT：rrTT：Rr：RR：rr=1:4:2:2:2:1:2:1:1，因此②代表的植株（RrT-）在F1中所占的比例为4/16RRT+2/16RrTT=3/8。 56．（2025·安徽·三模）玉米是我国种植面积最大、总产量最高的作物，但在生产上，玉米常因感染禾谷镰孢菌患玉米茎腐病，使得产量大大减少。研究发现植物LOBI基因在响应病原侵染中具有重要作用，为探究玉米中的LOBI基因是否具有相同作用，某研究团队将玉米中的LOBI基因连接到强启动子上，并通过下列途径获得转基因玉米植株，回答下列问题:    (1)步骤③农杆菌转化法的原理是:农杆菌细胞内含有 质粒，当农杆菌侵染植物细胞后，该质粒上的 可以转移到被侵染的细胞，并且 。 (2)步骤①在构建基因表达载体时，应优先选用的限制酶是 和 ，使用双酶切的优点在于 。 (3)步骤④将浸泡过含有农杆菌溶液的玉米愈伤组织进行植物组织培养时，需要用到的植物激素有 ，除此之外培养基中需加入 ，筛选出的愈伤组织经再分化过程形成丛芽，最终获得转基因玉米植株。 【答案】(1) Ti T-DNA 将其整合到玉米细胞染色体上 (2) BamHⅠ SacⅠ 双酶切可防止载体和目的基因自身环化，保证目的基因与载体定向连接 (3) 生长素和细胞分裂素 卡那霉素 【分析】基因工程技术的基本步骤： （1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成； （2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等； （3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样； （4）目的基因的检测与鉴定。 【详解】（1）农杆菌细胞内含有Ti质粒，当农杆菌侵染植物细胞后，该质粒上的T-DNA可以转移到被侵染的细胞，并且整合到受体细胞染色体的DNA上，农杆菌转化法就是利用Ti 质粒上的T-DNA 可转移并整合到受体细胞染色体 DNA 这一特性，将目的基因导入植物细胞； （2）观察可知，要将目的基因（LOBI基因）和载体连接，且不破坏强启动子和目的基因，应优先选用的限制酶是BamH Ⅰ和Sac Ⅰ，因为Hind Ⅲ会破坏LOBI基因的强启动子，Kpn Ⅰ会破坏T-DNA。使用双酶切的优点在于可以防止质粒自身环化，也可以防止目的基因与质粒反向连接，保证目的基因与载体定向连接； （3）植物组织培养中，生长素和细胞分裂素的比例会影响细胞的脱分化和再分化，如生长素与细胞分裂素比值高时，利于根的分化；比值低时，利于芽的分化；因为要筛选出含有重组质粒的愈伤组织，而重组质粒含有卡那霉素抗性基因，所以除此之外培养基中需加入卡那霉素，因为基因表达载体中含有卡那霉素抗性基因，含有重组质粒的农杆菌侵染玉米愈伤组织后，只有成功导入重组质粒的愈伤组织才能在含卡那霉素的培养基上存活，从而筛选出含有目的基因的愈伤组织，筛选出的愈伤组织经再分化过程形成丛芽，最终获得转基因玉米植株。 57．（2025·重庆·三模）基因工程中的启动子实际包含了基本启动子和增强子两个基因元件，基本启动子本身不足以启动基因表达（图A），只有基本启动子上游或下游存在增强子时，才能开启转录（图B）。科学家想要捕获斑马鱼体内的增强子，制作了“增强子侦察元件”，包含了基本启动子、报告基因和终止子（图A），并把侦察元件转入受精卵，侦察元件会随机插入基因组中。 (1)增强子是 （有/没有）遗传效应的DNA片段。根据图C分析，为了捕获增强子，筛选后代的标准是 。 (2)筛选具有某种特征的后代后，将其基因组随机打断成较大的碎片，并纯化分离。为了将其中具有报告基因的碎片挑选出来，可以采用PCR技术检测，应选用的引物组合（图D中挑选）是 。电泳结果若有条带，则说明电泳结果所对应的DNA碎片含有 。 (3)为了对增强子测序，需要大量的含增强子的DNA序列。将选出的碎片环化处理，并选择引物组合（图D中挑选） 进行PCR。再对扩增产物进一步测序，即可获得增强子DNA序列。 (4)人类已经完成斑马鱼全基因组测序，实验方法可以改进。研究者对图A所示侦察元件进行了改造，期望改造后的元件随机插入基因组后，在“侦察”增强子的同时，也造成该增强子原本所调控的基因发生突变，失去功能。研究者找到能表达报告基因的个体，分析突变基因，对照全基因组序列，即可快速定位增强子位置获取增强子序列。请画图表示改造后的载体，并标出各部分名称 。 【答案】(1) 有 生物体内表达报告基因 (2) P2和P3 报告基因 （和增强子） (3)P1 和P4 (4) 【分析】启动子是RNA聚合酶识别和结合的位点，驱动转录。基因工程中，目的基因需要插入启动子和终止子之间。 【详解】（1）增强子位于基因的上游，可以调控基因的表达，是具有遗传效应的DNA片段。由于报告基因只有基本启动子，不足以启动基因表达，只有基本启动子上游或下游存在增强子时，才能开启转录，只有当插入位置有增强子时，报告基因才能进行转录，故为了捕获增强子，筛选后代的标准应该是生物体内能表达报告基因。 （2）由图可知，引物P2和P3可以扩增出完整的报告基因片段，所以筛选出能表达报告基因的个体后，要将其中具有报告基因的碎片选出，可以选择引物P2和P3进行扩增。若对应的DNA碎片含有报告基因，则电泳结果有条带。 （3）根据D图可知，要扩增报告基因两侧的未知序列，可以选择两种反向引物即P1和P4进行扩增。由于增强子位于目的基因的上游，要扩增出大量的含增强子的DNA序列，应该采用反向PCR，先将选出的DNA碎片环化处理，用两种反向引物即P1 和P4进行扩增，可以扩增出含增强子的序列，通过测序即可获得增强子的DNA序列。 （4）增强子位于基因上游或下游，与基本启动子共同组成基因表达的调控序列。基因工程所用表达载体中的启动子，实际上包含增强子和基本启动子。增强子捕获载体的插入位点位于基因外部，不会造成基因突变。而当增强子捕获载体的插入位点位于基因内部，会引起造成该增强子所调控的基因发生突变，为研究某目的基因的功能，可将图B所示载体去掉基本启动子，则该载体插入基因内部后才会发挥作用，如图所示：。 58．（2025·河北沧州·三模）作物抗性的提高和产量的提高往往难以兼顾，在不损失作物产量的前提下，提高其抗逆性是一个长期性的挑战。我国科学家利用逆境诱导型启动子OsNAC6调控水稻锌指蛋白在高盐胁迫下的表达，实现了作物在干旱条件下的产量提升。回答下列问题： (1)高盐胁迫下， 才可以与OsNAC6结合，进而合成锌指蛋白。下图为OsNAC6与锌指蛋白基因融合后的结构及相应限制酶切割位点示意图，其转录的模板链为a链，则在体外扩增融合序列时，应选用的引物是 ，1个融合序列在体外扩增n次需要 个引物。 (2)利用图2所示质粒构建基因表达载体，欲通过荧光定量分析锌指蛋白基因的表达情况，则需在图1融合序列上游和下游引物的 （填“3'”或“5'”）端分别添加限制酶 对应的序列，并选用XhoI和MunI切割质粒来得到所需黏性末端，这样做的目的是 （答出2点）。 限制酶 识别序列 XhoI 5'-C↓TCGAG-3' 3'-GAGCT↑C-5' MunI 5'-C↓AATTG-3' 3'-GTTAA↑C-5' SalI 5'-G↓TCGAC-3' 3'-CAGCT↑G-5' EcoRI 5'-G↓AATTC-3' 3'-CTTAA↑G-5' NheI 5'-G↓CTAGC-3' 3'-CGATC↑G-5' (3)将重组质粒导入水稻体细胞常用的方法是 。为检测重组质粒是否导入水稻细胞，研究人员进行了如下实验： 组别 项目 A B C D 细胞类型 非转基因细胞 转基因细胞 非转基因细胞 转基因细胞 培养液 正常培养液 ① 荧光检测 ①的处理应为 。若检测结果为 ，则说明导入成功。 【答案】(1) RNA聚合酶 引物2和引物3 2n+1-2 (2) 5' SalI和EcoRI 防止质粒自身环化；去掉质粒上两个原有的启动子，让锌指蛋白与荧光蛋白共用诱导型启动子，从而实现同步表达 (3) 农杆菌转化法 高盐培养液 只有D组细胞检测到荧光 【分析】基因工程是指按照人们的愿望，进行严格的设计，通过体外DNA重组和转基因技术，赋予生物以新的遗传特性，创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。基因工程是在DNA分子水平上进行设计和施工的，又叫做DNA重组技术。 【详解】（1）启动子是RNA聚合酶的结合位点。a链为转录的模板链，且转录的方向向右，所以a链左端为3'端，右端为5'端，与a链互补的引物应位于a链的3'端，即引物3，与b链（右边为3'端）互补的引物同理，其引物为引物2。1个DNA序列复制n次以后共得到2n个DNA，共有脱氧核苷酸链2n+1个，新合成的子链都需要1个引物，其中a链和b链不需要引物，所以扩增n次需要（2n+1-2）个引物。 （2）限制酶序列只能添加在引物的5'端，因为3'端是耐高温的DNA聚合酶结合并延伸子链的位点。构建基因表达载体时需去掉质粒上两个原有的启动子，让锌指蛋白与荧光蛋白共用诱导型启动子，从而实现同步表达，故质粒用XhoI和MunI进行酶切，但融合序列中有XhoI和MunI的识别位点，所以不能用这两种酶进行切割，应该用能切出相同黏性末端的SalI和EcoRI，同时，双酶切能防止质粒自身环化。 （3）将目的基因导入植物细胞的常用方法是农杆菌转化法。诱导型启动子必须在高盐胁迫下才会启动基因表达，所以要对转化细胞的基因表达情况进行正常条件下与高盐胁迫下的对比，同时要与没有进行转化的细胞进行对照。非转基因细胞在正常培养与高盐胁迫条件下都不会出现荧光，而转化细胞只有在高盐胁迫下，相应基因才会表达而发出荧光，故若检测结果为只有D组细胞检测到荧光，则说明导入成功。 59．（2025·黑龙江大庆·三模）胶原蛋白广泛应用于食品、医疗、美容等领域。利用基因工程生产的胶原蛋白组织相容性极好，对细胞生长及伤口愈合等都有显著效果，是现代生物医药材料的开发重点。科学家将编码胶原蛋白的基因SUMO-hCOL1A 1导入大肠杆菌中构建基因工程菌，过程如图。请回答以下问题： (1)从组织细胞中提取胶原蛋白mRNA，通过 过程获得cDNA，该cDNA中 （填“含有”或“不含有”）终止子。 (2)为了能对基因SUMO-hCOL1A 1与质粒pET21a（+）进行双酶切，以构建重组质粒pET21a（+）-SUMO-hCOLIA 1，采用PCR技术扩增基因SUMO-hCOL1A 1时，应将 （填限制酶）识别序列加在引物的 （填“5'”或“3'”）端。 (3)构建重组质粒pET21a（+）-SUMO-hCOL1A 1时，目的基因会与质粒上长度为150bp的片段发生置换。质粒pET21a（+）和重组质粒pET21a（+）-SUMO-hCOL1A 1在HindⅢ酶切后获得的片段如下表所示（每种片段各1个）： 质粒类型 pET21a（+） pET21a（+）-SUMO-hCOL1A1 酶切获得片段 1800bp、3750bp 550bp、2200bp、4050bp 则基因SUMO-hCOL1A 1上有 个HindⅢ的酶切位点，该基因长度为 bp。 (4)将重组质粒导入先用 处理的大肠杆菌中，并接种在含氨苄青霉素的培养基中培养。 (5)为验证基因工程菌是否构建成功，提取上述基因工程菌质粒，利用（2）中的限制酶对其进行双酶切，产物进行电泳，结果如下图。初步分析可知，基因工程菌的构建 （选填“成功”或“不成功”），理由是 。 【答案】(1) 逆转录 不含有 (2) Nde Ⅰ和Xho Ⅰ 5' (3) 2 1400 (4)Ca2+ (5) 成功 质粒双酶切可获得大小约1400bp的目的基因片段（质粒双酶切可获得大小在1000至2000bp间的DNA片段 【分析】限制酶能够识别双链DNA分子的特定核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的磷酸二酯键断开。选择合适的限制酶对目的基因和质粒进行切割的原则：①不能破坏目的基因；②不能破坏所有的抗性基因（至少保留一个）；③最好选择两种限制酶分别切割质粒和目的基因，防止目的基因和质粒反向连接，同时要防止目的基因自身环化和质粒的自身环化。 【详解】（1）从组织细胞中提取胶原蛋白mRNA，通过逆转录过程获得cDNA，由于该cDNA是mRNA逆转录得到的，因此不含启动子核终止子。 （2）由于逆转录的到的cDNA没有启动子和终止子，为使胶原蛋白的基因SUMO-hCOL1A 1成功表达，需将其插入到质粒的启动子和终止子之间，且不能破坏质粒和目的基因，因此选用的限制酶为NdeⅠ和XhoⅠ，由于目的基因两端无相关限制酶，因此需将NdeⅠ和XhoⅠ添加在引物的5'端。 （3）由图可知，在构建重组质粒时需选用限制酶NdeⅠ和XhoⅠ，质粒pET21a（+）中限制酶NdeⅠ和XhoⅠ识别位点之间存在一个HindⅢ酶识别序列，构建重组质粒时会被切掉，因此重组质粒pET21a（+）-SUMO-hCOL1A 1除基因SUMO-hCOL1A 1包含HindⅢ酶识别位点之外，质粒上其余部位存在一个HindⅢ酶识别位点。而重组质粒pET21a（+）-SUMO-hCOL1A 1经HindⅢ酶切后获得三个DNA片段，因此可说明基因SUMO-hCOL1A 1上有2个HindⅢ的酶切位点。质粒pET21a（+）的长度为1800+3750=5550bp，重组质粒pET21a（+）-SUMO-hCOL1A 1的长度为550+2200+4050=6800bp，由于构建重组质粒pET21a（+）-SUMO-hCOL1A 1时，目的基因会与质粒上长度为150bp的片段发生置换，因此存在的数量关系为5550+目的基因-150=6800，因此目的基因的长度为1400bp。 （4）将重组质粒导入先用Ca2+处理的大肠杆菌中，使其处于一种易于吸收环境中DNA分子的状态，并接种在含氨苄青霉素的培养基中培养。 （5）基因SUMO-hCOL1A 1的长度为1400bp，重组质粒pET21a（+）-SUMO-hCOL1A 1的长度为6800bp，若用（2）中的限制酶NdeⅠ和XhoⅠ对其进行双酶切，则应得到目的基因1400bp，和剩余片段5400bp，由电泳结果可知，菌株1的酶切电泳结果有这两种大小的片段，符合重组质粒酶切后的预期，因此基因工程菌的构建成功。 60．（2025·青海海东·三模）小白鼠的红眼对黑眼为显性，分别由等位基因R/r控制，其长尾和短尾由另一对等位基因M/m控制。现用一只红眼长尾雄鼠和一只黑眼短尾雌鼠作亲本杂交，F1中红眼长尾：黑眼短尾：红眼短尾：黑眼长尾约为1：1：1：1。不考虑X、Y同源区段，回答下列问题： (1)F1的实验结果能否说明R/r、M/m的遗传遵循自由组合定律？说明理由： 。 (2)若长尾对短尾为显性，则两对等位基因位于染色体中的情况可能为 。 (3)经检测，现已确定短尾对长尾为显性，兴趣小组将F1红眼短尾雌雄鼠相互交配，若子代出现 ，则两对等位基因位于两对常染色体上。 (4)平滑肌细胞（SMC）是哺乳动物血管壁的重要组成部分，其功能产生障碍会导致主动脉瘤的发生。研究人员为开发特异性标记血管SMC的方法，开展了相关研究。为获得血管SMC被特异性标记的工具鼠并用于研究，研究人员进行了下列实验，利用转基因技术分别获得含一个CE基因的转基因A鼠、含一个Stop基因和一个tdT基因的转基因B鼠（CE基因所在染色体和Stop、tdT基因所在染色体为非同源染色体），将A鼠和B鼠杂交，如图所示。 ①A鼠和B鼠杂交后获得同时含有以上三种基因的CE杂合小鼠C，其所占比例为 。 ②在外源药物T的诱导下，定位于细胞质中的雌激素受体进入细胞核中，Cre重组酶能导致loxP位点间的序列丢失。根据题意，用药物T饲喂小鼠C后，可观察到SMC 。 【答案】(1)不能，根据题意和杂交结果无法对长尾和短尾性状的显隐关系做出判断，因此，亲本的基因型可能是Rrmm和rrMm或RrMm和rrmm，因而F1的实验结果不能说明R/r、M/m的遗传遵循自由组合定律 (2)R/r和M/m分别位于两对不同的常染色体上，也可能是是M/m位于常染色体上，R/r位于X染色体上，也可能是R/r位于常染色体上，M/m位于X染色体上 (3)无论雌雄均出现红眼短尾∶黑眼短尾∶红眼长尾∶黑眼长尾=9∶3∶3∶1 (4) 1/4/25% 发出红色荧光 【分析】自由组合定律是指控制不同性状的遗传因子的分离和组合是互不干扰的,在形成配子时，决定同一性状的成对的遗传因子彼此分离，决定不同性状的遗传因子自由组合。 【详解】（1）无论R/r、M/m是否连锁，F1中红眼长尾：黑眼短尾：红眼短尾：黑眼长尾均约为1：1：1：1，所以不能说明R/r、M/m的遗传遵循自由组合定律。 （2）若长尾对短尾为显性，则亲本的基因型可以是RrMm×rrmm或MmXRY×mmXrY或RrXMY×rrXmXm，即两对等位基因位于染色体中的情况可能为R/r和M/m分别位于两对不同的常染色体上，也可能是是M/m位于常染色体上，R/r位于X染色体上，也可能是R/r位于常染色体上，M/m位于X染色体上。 （3）经检测，现已确定短尾对长尾为显性，若两对等位基因均位于常染色体上，则亲本的基因型为Rrmm×rrMm，兴趣小组将F1红眼短尾雌雄鼠(RrMm)相互交配，则子代中无论雌雄均出现红眼短尾∶黑眼短尾∶红眼长尾∶黑眼长尾=9∶3∶3∶1。 （4）①根据题意可知，A鼠的基因型可表示为Aabb，B鼠的基因型可表示为aaBb,二者杂交后获得同时含有以上三种基因的CE杂合小鼠C（AaBb），由于两对等位基因分别位于两对同源染色体上，根据自由组合定律可知，子代中小鼠C所占比例为1/4。②在外源药物T的诱导下，定位于细胞质中的雌激素受体进入细胞核中，Cre重组酶能导致loxP位点间的序列丢失。根据题意，用药物T饲喂小鼠C后，药物T激活Cre重组酶后，SMC中的loxP位点间的Stop序列被切除，tdT基因得以转录，表达红色荧光蛋白，可观察到小鼠C的SMC发出红色荧光。 61．（2025·四川成都·三模）酵母细胞中的转录因子GAL4，含有与DNA结合的BD蛋白和激活DNA转录的AD蛋白，二者在空间上接近时，才能激活相关基因的转录。利用该原理(如图甲)，可以研究两种蛋白质(“诱饵”蛋白和“猎物”蛋白)是否具有相互作用。通过构建基因表达载体将“诱饵”蛋白与BD融合、“猎物”蛋白与AD融合，如果“猎物”蛋白与“诱饵”蛋白能相互作用，在酵母菌细胞中形成“诱饵蛋白—猎物蛋白”复合物时，AD与BD在空间上接近，就可以激活相关基因(这个被激活的、能显示“诱饵”和“猎物”相互作用的基因称之为“报告基因”)的转录。为了探究植物细胞中钙调蛋白(CaM)是否与激酶(CDPK1)相互作用，科研人员利用图乙所示的质粒和目的基因构建基因表达载体，图乙中限制酶的识别序列依次为Ⅲ、Ⅰ、Ⅰ、Ⅴ。回答下列问题： (1)研究人员采用PCR扩增CaM基因，PCR是根据DNA 的原理在体外大量扩增目的基因的技术。为了使扩增后的CaM基因经相关限制酶切割后能够准确插入图乙的AD质粒中，所用引物的5'端需要分别添加序列为5' - - 3'和5' - - 3'。 (2)该研究除了构建CaM - AD重组质粒外，还需要构建另一种重组质粒(简称X重组质粒)，该重组质粒需要保证插入的 基因与BD质粒中的 基因能正确表达出所需要的融合蛋白。两种重组质粒构建好后，需要将它们导入 (填“1”或“2”)个酵母菌细胞中进行表达。 (3)组氨酸、色氨酸、亮氨酸、腺嘌呤是酵母菌生存必需的营养物质，该实验用的酵母菌由于基因异常不能合成上述营养物质。研究人员将AD质粒、BD质粒、CaM - AD重组质粒、X重组质粒按照不同组合导入这种缺陷酵母菌(“＋”代表“导入”“－”代表“未导入”)，再接种到相应的平板上培养，一段时间后观察到的菌落情况如图丙所示。 已知BD质粒中含有控制亮氨酸合成的基因，根据图丙中菌落情况推测，报告基因为控制营养物质 合成的基因。实验结果显示CaM与CDPK1 (填“能”或“不能”)相互作用，理由是 。该实验设置第二组和第三组的作用是 。 【答案】(1) 半保留复制 ACTAGT GATATC (2) CDPK1 BD 1 (3) 组氨酸、腺嘌呤 能 只有第四组酵母菌能在缺乏组氨酸、色氨酸、亮氨酸和腺嘌呤的培养基上生长，说明 CaM 与 CDPK1 相互作用让 AD 与 BD 在空间上接近，进而激活了报告基因的表达 排除 AD 与 CDPK1、BD 与 CaM 的相互作用 【分析】基因工程中，在构建基因表达载体时，需使用同种限制酶切割目的基因与载体，使其形成相同末端以便使用DNA连接酶进行连接。可通过标记基因的作用来检测受体细胞是否含有目的基因。 【详解】（1）PCR 是利用 DNA 半保留复制的特性，通过高温变性（解开双链）、低温退火（引物结合模板）、适温延伸（Taq 酶合成子链）的循环，在体外大量扩增目的基因。将 CaM 基因插入图乙的 AD 质粒中，需匹配质粒上的限制酶切割位点。 质粒酶切位点分析：图乙中 AD 质粒的结构（从 GAL4 启动子下游开始）显示，限制酶识别序列依次为 Xba I、EcoR V，Xba I 的识别序列为 5'-ACTAGT-3' EcoR V 的识别序列为 5'-GATATC-3'。PCR 扩增的目的基因需在两端添加与质粒相同的酶切位点序列，以便酶切后产生互补黏性末端（或平末端）。由于引物在 PCR 中结合到模板链的 3' 端，新合成的 DNA 链 5' 端会带上引物的 5' 端序列，因此需在引物的5' 端添加酶切位点序列（不影响 3' 端与模板结合）。为了将 CaM 基因插入 AD 质粒，需在引物 5' 端分别添加 Xba I 识别序列（ACTAGT） 和 EcoR V 识别序列（GATATC）。 （2）酵母双杂交系统原理：需要两种融合蛋白 ——“诱饵蛋白 - BD” 和 “猎物蛋白 - AD”，二者相互作用才能使 BD 与 AD 接近，激活报告基因。 题目中 “猎物” 蛋白是 CaM（构建了 CaM-AD 重组质粒），则 “诱饵” 蛋白应为激酶 CDPK1，因此 X 重组质粒需将 CDPK1 基因 与 BD 质粒中的 BD 基因 融合，形成 “CDPK1-BD” 融合蛋白。实验需要验证 CaM（猎物）与 CDPK1（诱饵）是否相互作用，因此必须同时构建两者的融合质粒，缺一不可。 重组质粒导入酵母菌的数量细胞内相互作用的前提：两种融合蛋白（CDPK1-BD 和 CaM-AD）需在同一细胞内表达，才能检测是否结合。因此，需将两种重组质粒导入 1 个酵母菌细胞。 （3）缺陷酵母菌无法合成组氨酸、色氨酸、亮氨酸、腺嘌呤。 BD 质粒含亮氨酸合成基因（第二组、第四组含 BD 质粒，可合成亮氨酸），但第二组（BD+AD 质粒）和第三组（BD+CaM-AD）未激活报告基因，无法生长。 第四组（CDPK1-BD+CaM-AD）能在缺乏组氨酸、色氨酸、腺嘌呤的平板上生长（亮氨酸由 BD 质粒提供），说明报告基因控制组氨酸和腺嘌呤的合成（色氨酸可能由 AD 质粒或其他途径提供，此处通过对比确定报告基因产物为组氨酸和腺嘌呤）。 相互作用结论： 能相互作用。理由：只有第四组（同时导入 CDPK1-BD 和 CaM-AD）的酵母菌在缺陷培养基上生长，表明 CaM 与 CDPK1 结合使 AD 与 BD 接近，激活报告基因，合成必需营养物质。 对照作用： 第二组（BD+AD 质粒）：排除 “BD 与 AD 直接结合激活报告基因” 的可能（无目的基因时不激活）。 第三组（BD 质粒 + CaM-AD）：排除 “CaM 单独与 BD 结合” 的可能（仅 CaM-AD 无法激活报告基因）。 两者作为对照，确保实验结果由 “CDPK1-BD” 与 “CaM-AD” 的特异性相互作用引起。 62．（2025·湖北·三模）磷脂酸（PA）是调节植物生长发育和逆境响应的重要信使物质。为了解植物细胞中PA的动态变化，研究人员用无缝克隆技术将高度专一的PA结合蛋白（PABD）基因与绿色荧光蛋白（GFP）基因融合，构建有效监测细胞PA变化的荧光探针，并测定拟南芥细胞内PA含量。无缝克隆技术连接DNA片段的机理和构建荧光探针表达载体的过程如图所示，请回答下列问题。 注：bar为草胺膦抗性基因；Kanr为卡那霉素抗性基因。 (1)无缝克隆时，T5核酸外切酶沿 （填“5′→3′或“3′→5′”）的方向水解DNA形成黏性末端。 (2)过程②两个片段复性后存在一段“缺口”的原因是过程①形成的黏性末端 （填“大于”“等于”或“小于”）互补配对的区段（同源序列），过程③所需的酶有 。 (3)与传统的酶切再连法相比无缝克隆技术构建重组质粒的优点有____。 A．不受限制酶酶切位点的限制 B．不会引入多余碱基，不会出现移码突变 C．操作相对简单，成功率高 D．不需要使用PCR技术扩增目的基因 (4)PCR扩增PABD基因时需依据 的核苷酸序列设计引物R1。据图分析扩增目的片段的所用的引物F1和R2可对应下表中的 （填序号）。 ① 5′-TCCGGACTCAGATCTCGAGC-3′ ② 5′-AGCTATAGTTCTAGATCTAGATTAACTAGTCTTAGTGGCGTC-3′ ③ 5′-TATCGATGGCGCCAGCTGAGGATGGTGAGCAAGGGCGA-3′ ④ 5′-GCTCGAGATCTGAGTCCGGACTTGTACAGCTCGTCCA-3′ (5)利用农杆菌花序侵染法转化拟南芥，将获得的种子进行表面消毒，均匀铺在含有 的MS培养基上进行筛选和鉴定，将筛选得到的种子种植可得到转基因拟南芥，通过观测转基因拟南芥根尖细胞中 ，了解PA的分布和含量。 【答案】(1)5′→3′ (2) 大于 DNA聚合酶和DNA连接酶 (3)ABC (4) PABD基因一端的核苷酸序列和载体一端 ①、④ (5) 草胺膦 绿色荧光点的分布 【分析】PCR由变性-复性（退火）-延伸三个基本反应步骤构成：（1）模板DNA的变性：模板DNA经加热至93℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备。（2）模板DNA与引物的退火（复性）：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合。（3）延伸：DNA聚合酶由降温时结合上的引物开始沿着DNA链合成互补链。此阶段的温度依赖于DNA聚合酶。该步骤时间依赖于聚合酶以及需要合成的DNA片段长度。 【详解】（1）由图可知，无缝克隆时，过程①中T5核酸外切酶沿5'→3'的方向水解DNA，以形成黏性末端。 （2）过程②在退火的过程中，两个片段的黏性末端可根据互补序列进行配对结合，但由于过程①形成的黏性末端大于互补配对的区段（同源序列），因此在过程②退火后存在“缺口”。过程③缺口处DNA链的补齐，可以看作DNA分子的复制过程，所需的酶有DNA 聚合酶（DNA聚合酶将游离的单个脱氧核苷酸加到子链3′末端）和DNA连接酶（将两个DNA片段进行连接）。 （3）传统的酶切再连法需要用特定的限制酶将目的基因和质粒先进行切割，再用DNA连接酶对目的基因和质粒进行连接，在该过程会形成多个小片段，操作复杂，而无缝克隆技术构建重组质粒是不受限制酶切位点的限制，不会引入多余碱基，不会出现移码突变，操作时间短，成功率高，ABC正确，D错误。 故选ABC。 （4）用于PCR扩增的引物是根据一段已知目的基因（PABD基因）的核苷酸序列来设计的，由图可知，PABD基因（目的基因）需要用载体进行连接，因此PCR扩增PABD基因时需依据PABD基因一端的核苷酸序列和载体一端的核苷酸序列设计引物R1。由重组DNA图可知，GFP基因和PABD基因进行连接，PCR扩增GFP基因时需根据GFP基因一端的核苷酸序列和PABD基因一端的核苷酸序列设计引物R2，而设计引物F1仅需根据PABD基因一端的核苷酸序列，因此引物F1的碱基序列比引物R2的碱基序列短，因此扩增目的片段的引物F1对应于下表中的①。PCR扩增GFP基因时需根据GFP基因一端的核苷酸序列和PABD基因一端的核苷酸序列引物R2，即引物R2的一部分能与引物F1进行碱基互补配对，综上所述，R2对应于下表中的④。 （5）由图可知，bar（草胺膦抗性基因）为标记基因，位于T-DNA上，农杆菌中的Ti质粒上的T-DNA可转移至受体细胞，并且整合到受体细胞染色体的DNA上，因此利用农杆菌花序侵染法转化拟南芥，将获得的种子进行表面消毒，均匀铺在含有草胺膦的MS培养基上进行筛选和鉴定。由题意“将高度专一的PA结合蛋白（PABD）基因与绿色荧光蛋白（GFP）基因融合，构建有效监测细胞PA变化的荧光探针，并测定拟南芥细胞内PA含量”可知，通过观测转基因拟南芥根尖细胞中绿色荧光点的分布，了解PA的动态变化。 63．（2025·江苏常州·三模）水稻是全球最重要的粮食作物之一，提高其光合作用效率对于保障粮食安全具有重要意义。近年来，科学家们通过基因工程技术将蓝藻中的相关基因导入水稻，以提高其光合效率和产量。回答下列问题： (1)扩增目的基因。研究人员需要根据 序列设计引物；在PCR反应前，在微量离心管中加入原料、酶等成分后离心，其目的是 ；适当提高退火温度可以提高PCR扩增的特异性，原因是 。 (2)构建并鉴定重组质粒。表达载体与含目的基因的DNA片段如图1所示，据图分析，用一种限制酶与DNA连接酶构建重组质粒时，应选择的限制酶是 。完成构建后，取样、鉴定质粒时，选用限制酶 （填“E”或“B”或“H”或“X”）进行完全酶切并电泳，电泳时需要根据 的移动掌控电泳进程，电泳结果如图2所示：图2中出现结果Ⅰ的原因是 ，出现结果Ⅱ、Ⅲ的原因是 。最后，根据电泳结果，筛选出正确的重组质粒。 【答案】(1) 目的基因(两端) 使反应液集中于微量离心管底部 退火温度越高，引物与模板链的结合越精准，非特异性扩增减少 (2) B E 指示剂 有质粒未接入目的基因 目的基因接入质粒时，有正接与反接两种情况 【分析】基因表达载体的构建是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。 【详解】（1）研究人员需要根据目的基因(两端)的核苷酸序列设计引物，因为引物要与目的基因特定区域互补配对，引导DNA聚合酶延伸合成新的DNA链。在PCR反应前，在微量离心管中加入原料、酶等成分后离心，其目的是使反应液集中在离心管底部，提高反应效率。如果反应液不集中，可能会导致反应不均匀，影响PCR扩增效果。适当提高退火温度可以提高PCR扩增的特异性，原因是较高的退火温度使引物与模板结合的特异性增强，减少引物与非目的基因序列的错配结合。 （2）据图分析，用一种限制酶与DNA连接酶构建重组质粒时，应选择的限制酶是B，因为在目的基因的两端有限制酶B的识别序列，质粒也有酶B的识别序列，且酶B的识别序列在质粒的启动子和终止子之间，而选用酶E会破坏潮霉素抗性基因，酶H在质粒上有两个酶切位点，选用酶H，可能会导致目的基因接在启动子和终止子之外。完成构建后，取样、鉴定质粒时，选用限制酶E进行完全酶切并电泳，因为质粒上有两个酶E的切割位点，若导入的是空质粒，则用酶E完全切割后会得到两个电泳条带，而导入的重组质粒上含有三个酶E（导入的目的基因上含有一个酶E识别序列）的切割位点，若用酶E完全切割后会得到三个电泳条带，且目的基因中E与两端的B位点距离不同，用酶E完全切割还可以判断目的基因是否正确连接，而若用酶B完全切割，虽然能判断目的基因是否接入，但不能判断目的基因是否正确连接。电泳时需要根据指示剂的移动掌控电泳是因为指示剂可以帮助观察样品的迁移过程，预测核酸电泳的速度和位置。图2中出现结果Ⅰ的原因是有质粒未接入目的基因，电泳结果只出现质粒被切割的两个条带。出现结果Ⅱ、Ⅲ的原因是目的基因接入质粒时，有正接与反接两种情况，导致出现大小不同的条带。 64．（2025·江苏盐城·三模）持续和大量施用有机磷化合物会严重威胁人畜健康及生态环境，科研人员从邻单胞菌中发现甲基对硫磷水解酶基因mpd，其表达产物MPD能够高效水解无色的甲基对硫磷并且生成亮黄色的对硝基苯酚。将mpd导入枯草芽孢杆菌制备优质菌种，构建表达载体的主要过程如下图所示，请回答下列问题: (1)过程①采用重叠延伸PCR的方法获得启动子PytkA与信号肽SPnprB的融合基因，除了图示的条件外，扩增PytkA时还需要的条件还有 ，设计引物R2的依据有 。P2、R1对应于下面的4个引物中的 。最终要获得大量PytkA＋SPnprB融合片段，需要用图中引物 进行PCR。 a.5′GCGGGATCCTTTTTTGTGACG—3′ b.5′－GAAAGGTGATGGCATGCGCAACTTGACCAAG－3′ c.5′－CTTGGTCAAGTTGCGCATGCCATCACCCTTTC－3′ d.5′－GCGCTGCAGCTGAGGCCATG－3′ (2)过程③构建表达载体时，需要用 酶切PytkA＋SPnprB＋mpd融合片段与载体1，再用DNA连接酶连接，将重组表达载体导入处于感受态的大肠杆菌，接种于含有 的培养基中37℃培养。 (3)提取构建成功的表达载体，导入枯草芽孢杆菌，需要接种于含有 的培养基，出现 ，说明得到能成功表达的细胞。 (4)研究人员进一步用A、B两种不同的启动子构建表达载体，探究它们对菌体增殖和mpd基因表达的影响，结果如图2，实际生产中应采用 ，理由是 。 【答案】(1) 脱氧核苷酸（dNTP）、缓冲液、Taq酶 SPnprB一侧的核苷酸序列和Pst I酶识别序列 c、b P1、R2 (2) BamHⅠ和 HindⅢ 卡那霉素 (3) 甲基对硫磷 亮黄色降解圈 (4) 启动子B 菌体增长数量较多，酶产量高，MPD 活性高，且后期较稳定 【分析】聚合酶链式反应（PCR）是一种用于放大扩增特定的DNA片段的分子生物学技术，它可看作是生物体外的特殊DNA复制，PCR的最大特点是能将微量的DNA大幅增加。 【详解】（1）重叠延伸PCR技术，是采用具有互补末端的引物，使 PCR 产物形成了重叠链，从而在随后的扩增反应中通过重叠链的延伸，将不同来源的扩增片段重叠拼接起来的技术，PCR是体外DNA复制，因此需要原料脱氧核苷酸（dNTP）、缓冲液、TaqDNA聚合酶；引物R2是为了扩增SPnprB，且需要在外侧加入Pst I酶识别序列，因此引物R2设计的依据为SPnprB一侧的核苷酸序列和Pst I酶识别序列；重叠延伸需要有一段能互补配对，P2、R1对应于下面的4个引物中的c、b能完全配对，故选b、c。最终要获得大量PytkA＋SPnprB融合片段，需要用图中引物P1、R2 进行PCR。 （2）结合图1可知，过程③构建表达载体时，需要用BamHⅠ和HindⅢ酶切PytkA＋SPnprB＋mpd融合片段与载体1，Pst Ⅰ位于融合基因内部，会破坏融合基因，而EcoR Ⅰ位于卡那霉素抗性基因内部，会破坏抗性基因，故选用BamHI和 HindⅢ来进行酶切，以形成不同的黏性末端，防止载体、目的基因的自连，保证目的基因正向接入载体；由于载体上有卡那霉素抗性基因，因此接入含卡那霉素的培养基中，进行筛选。 （3）提取构建成功的表达载体，导入枯草芽孢杆菌，由于含有mpd基因，其表达产物MPD能够高效水解无色的甲基对硫磷并且生成亮黄色的对硝基苯酚，因此接入含有甲基对硫磷的培养基，出现亮黄色降解圈，即表明含有能成功表达的细胞。 （4）含启动子B的重组细胞，菌体增长数量较多，酶产量高，MPD 活性高，且后期较稳定，构建表达载体应采用启动子B。 65．（2025·陕西安康·三模）疫霉菌感染会造成辣椒严重减产，水杨酸（SA）可以抵御疫霉菌感染。科研人员测定了辣椒叶片中的SA含量，结果如图1所示。P酶催化合成SA，H蛋白能促进P基因表达P酶。回答下列问题： (1)红光可作为一种 作用于光敏色素，进而调控植物的生长发育。据图5分析，两种不同光处理后，辣椒感染程度低的是 （填“白光”或“红光”）处理组，理由是 。 (2)科研人员推测H蛋白通过特异性结合P基因的启动子来促进P基因表达，为验证上述推测，科研人员开展相关研究，实验组部分过程如图2所示。结果显示，与对照组相比，实验组转基因植株荧光强度更高。质粒1上的甲、质粒2上的乙分别是 （填“H”或“P”）基因的启动子、 （填“H”或“P”）基因。 (3)结合以上研究，请提出一种减少疫霉菌感染造成的减产的措施： 。 【答案】(1) 信号 红光 感染和未感染时,红光处理组的SA含量均高于白光处理组，SA能有效抵御疫霉菌感染 (2) P H (3)给辣椒植株适当增加红光照射；向辣椒植株适时适量喷施SA溶液；培育H基因或P基因过表达的辣椒品种 【分析】植物激素是由植物体内产生，能从产生部位运送到作用部位，对植物的生长发育有显著影响的微量有机物。 【详解】（1）红光作为一种信号，可以激活光敏色素，引起光敏色素空间结构的改变，进而促进相关蛋白(如H蛋白)的合成，调节植物体对病原菌的响应。已知水杨酸(SA)可以抵御疫霉菌侵染，科研人员测定辣椒叶片中的SA含量，图中结果显示，感染和未感染时，红光处理组的SA含量均高于白光处理组，据此推测两种不同光处理后，辣椒感染程度不同的原因是红光处理组的SA含量高，因而有效抵御疫霉菌感染，所以辣椒感染程度低的是红光处理组。 （2）基因表达载体应该有的结构有启动子、终止子、目的基因、标记基因等；题意显示，P酶催化合成SA，正常辣椒叶片几乎不表达H蛋白，若发生感染，4天后叶片中的H蛋白含量显著升高，H蛋白可能作用于P基因的启动子，调控P基因表达P酶，为了验证上述推测，需要通过质粒2将H基因转入辣椒叶片，同时需要通过质粒1转入P基因启动子和荧光素酶基因以便用于检测，因此，质粒1上的甲、质粒2上的乙分别是P基因启动子、H基因。 （3）上述研究表明，细胞中SA含量的增加可以抵御疫霉菌侵染，因此需要设法促进辣椒细胞中SA的合成，SA的合成受红光调控；又有研究表明，与SA合成相关的基因有P基因和H基因，且H基因的表达产物能促进P基因的表达，据此设计的减轻疫霉菌感染造成减产的措施如下：给辣椒植株适当增加红光照射（可增加SA的含量）；向辣椒植株适时适量喷施SA溶液；培育H基因或P基因过表达的辣椒品种。 66．（2025·甘肃白银·三模）抗菌肽（AMPs）作为抗生素替代物，具有广谱抗菌活性及不易使细菌产生耐药性等优点。研究者欲利用改造后的大肠杆菌（工程菌）生产AMPs。回答下列问题： (1)用PCR扩增目的基因M时，设计的特异性引物有 种。 (2)AMPs也会抑制大肠杆菌，造成组成型表达（持续表达）目的基因M的大肠杆菌最大种群数量偏低，限制了AMPs产量。研究者在大肠杆菌基因组DNA中插入N和C基因，使质粒上目的基因M的表达受到红光控制。红光调控目的基因M表达的原理如图所示。 N和C基因表达应为 （填“组成型表达”或“红光诱导型表达”）。据图阐述红光调控目的基因M的表达过程： 。 (3)为避免工程菌泄漏污染环境，研究者利用阻遏蛋白基因和调控元件，使工程菌在红光和蓝光同时照射时，激活致死基因G表达，从而诱导工程菌死亡。完善工程菌生产AMPs步骤。 ①在黑暗条件下培养工程菌至种群数量达到最适值（K值）。 ② 照射至AMPs浓度在培养液中达到适宜浓度（生产需求量）。 ③ ，避免工程菌泄漏。 【答案】(1)2/两 (2) 组成型表达 C基因指导合成的C蛋白直接与启动子As结合，N基因指导合成的N蛋白在红光调控下与结合在启动子上的C蛋白结合，启动目的基因M的表达（转录）过程 (3) 红光 红光和蓝光同时照射，诱导工程菌死亡 【分析】基因工程技术的基本步骤：（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等，标记基因可便于目的基因的鉴定和筛选。（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法。（4）目的基因的检测与鉴定。 【详解】（1）用PCR扩增目的基因M时，设计的特异性引物有2种（1条链1种）。 （2）据图可知，N和C基因的表达不需要其他条件诱导，故属于组成型表达，目的基因M的表达属于红光诱导型表达。据图可知，在没有红光诱导时，C基因指导合成的C蛋白直接与启动子As结合，红光调控下，N基因指导合成的N蛋白与结合在启动子上的C蛋白结合，启动目的基因M的表达（转录）过程。 （3）据题干信息可知，黑暗条件下培养工程菌时，由于没有红光照射，目的基因M的表达量偏低，故将工程菌培养至种群数量达到最适值（K值）后需要用红光照射，以提高目的基因M的表达量，从而提高AMPs的产量，之后为避免工程菌泄漏引发环境问题，需要将工程菌杀死，操作为用红光和蓝光同时照射，启动致死基因表达，从而杀死工程菌。 67．（2025·四川成都·三模）“生物钢”是一种蛛丝蛋白，其强度是钢的45倍，且有蚕丝般的柔软和光泽，在纺织、医疗等多领域具有广阔的应用前景。科学家从蜘蛛中获取蛛丝蛋白基因并将其植入山羊体内，使得羊奶中含有蛛丝蛋白，再利用特殊的纺丝技术，将羊奶中的蛛丝蛋白纺成丝。回答以下问题：    注：①图1为蛛丝蛋白基因DNA片段结构示意图；②图2是基因工程中所使用的载体示意图，图中KpnⅠ、XbaⅠ、EcoRⅠ均表示相应限制酶识别位点；③蛛丝蛋白基因转录的模板链位于b链（图3中标识b链碱基序列）。 (1)为使目的基因与载体正确连接，利用PCR技术获取和扩增蛛丝蛋白基因时所需要的两种引物的序列分别为 、 （注意标明端和端）。 (2)若要构建A山羊乳腺生物反应器，则受体细胞常选择 ，同时结合基因表达载体结构组成分析，载体中P应为 ，其功能是 。 (3)研究人员发现，若将蛛丝蛋白31号位的色氨酸替换为酪氨酸（注：色氨酸的密码子为UGG：酪氨酸的密码子为UAC和UAU）；蛛丝韧性可提高50%。研究人员欲利用大引物PCR技术对蛛丝蛋白基因进行定点诱变（过程见图3），则拟突变位点对应的基因结构为 （标明端和端）。第一次PCR的产物DNA中碱基序列与b链 （填“相同”或“互补”）的链作为第二次PCR所用的引物。与X射线诱变相比，该突变技术的优点是 （答出一点即可）。 (4)培育转基因山羊涉及的生物工程技术包括 （答出两种），为检测转基因山羊是否成功表达蛛丝蛋白基因，请写出检测思路： 。 【答案】(1) (2) 受精卵 乳腺中特异表达的基因的启动子（乳腺特异性启动子） 作为RNA聚合酶识别和结合部位，驱动（蛛丝蛋白）基因（在乳腺细胞中）转录出mRNA，最终表达出人类需要的蛋白质 (3) 相同 目的性强（定向突变）、突变概率高 (4) 基因工程、早期胚胎培养、胚胎移植、动物细胞培养 思路一：利用抗原—抗体杂交技术，使用蛛丝蛋白抗体与转基因山羊的乳蛋白进行杂交，若呈阳性则说明转基因山羊的乳腺细胞成功表达了蛛丝蛋白基因；思路二：对转基因山羊的乳蛋白进行凝胶电泳，并用蛛丝蛋白作为电泳的对照组，若出现相同条带，则说明转基因山羊的乳腺细胞成功表达了蛛丝蛋白基因 【分析】聚合酶链式反应（PCR）是一种用于放大扩增特定的DNA片段的分子生物学技术，它可看作是生物体外的特殊DNA复制，PCR的最大特点是能将微量的DNA大幅增加。PCR是利用DNA在体外摄氏95℃高温时变性会变成单链，低温（经常是60°C左右）时引物与单链按碱基互补配对的原则结合，再调温度至DNA聚合酶最适反应温度（72°C左右），DNA聚合酶沿着磷酸到五碳糖(5'-3')的方向合成互补链。基于聚合酶制造的PCR仪实际就是一个温控设备，能在变性温度，复性温度，延伸温度之间很好地进行控制。 【详解】（1） 结合DNA结构可知-OH所在一端为端，所在一端为端，再根据引物结合位置可判断a链对应引物为，而b链对应引物为。 （2）乳腺生物反应器的受体细胞常选择受精卵，为保障蛛丝蛋白基因在乳腺细胞中表达，需要在基因表达载体中添加乳腺中特异表达的基因的启动子，该启动子是RNA聚合酶识别和结合的部位，驱动蛛丝蛋白基因在乳腺细胞中转录出mRNA。 （3）科研人员欲将蛛丝蛋白31号位的色氨酸替换为酪氨酸，以达到提高蛛丝蛋白韧性的目的，由于色氨酸的密码子为UGG，酪氨酸的密码子为UAC和UAU，因此拟突变位点对应的基因结构为；引物碱基序列与母链端碱基序列互补，即大引物的碱基序列与a链碱基b链序列互补，a链碱基序列又与b链碱基序列互补，故大引物与b链端碱基序列相同。大引物PCR技术对蛛丝蛋白基因的诱变属于定点诱变，具有目的性强、突变概率高等特点。 （4）成功培育转基因山羊主要涉及基因工程和胚胎工程，主要包括的生物工程技术有基因工程、早期胚胎培养、胚胎移植等。转基因山羊是否成功表达蛛丝蛋白基因，还需要通过检测与鉴定才能知道，分析可知有多种检测思路。如在分子水平上，从转基因山羊中提取乳蛋白，用相应的抗体进行抗原-抗体杂交，或对转基因山羊的乳蛋白进行凝胶电泳，并用蛛丝蛋白作为电泳的对照组。 68．（2025·陕西·三模）同源重组基因敲除技术是将同源DNA 片段导入受体细胞，利用同源 DNA 片段的互换，用其他DNA 片段在原有位置替代靶基因，从而实现基因的敲除。米曲霉产生的曲酸具有抗菌性、抗氧化性等抗逆能力，具有重要的应用价值。为提高米曲霉产曲酸能力，科研人员用同源重组基因敲除技术成功敲除了米曲霉3.042 菌株中的msn2基因，获得高产的g-5菌株。其部分机理如图1所示（bp表示碱基对）。 (1)构建基因敲除框需要的工具酶有 ，将基因敲除框导入米曲霉细胞常用的方法是 。 (2)科研人员选取进行基因敲除操作后的3个菌落，分别提取其DNA，选择图中引物 进行PCR扩增，电泳结果如图2 所示。根据1号菌落电泳结果可得出的结论是 。为进一步验证3号菌落为目的菌落，需要选择图中引物 重复上述操作。 (3)米曲霉的曲酸产量与其对逆境的敏感性有关，tpsⅠ基因表达产物可以降低米曲霉对逆境的敏感性。推测tpsⅠ基因表达产物与曲酸合成的关系是 。为验证该推测，可采用的实验方法是 ，预期实验结果是 。 【答案】(1) 限制酶、DNA连接酶 钙离子转化法 (2) A和B 1号菌落没有实现基因敲除，含有米曲霉3.042基因组原始序列 C和D (3) msn2基因表达产物的缺乏，抑制了tpsI基因的表达，提高了米曲霉对逆境的敏感性，从而导致米曲霉产生更多的曲酸 敲除米曲霉的msn2基因，检测米曲霉的曲酸产量 曲酸产量增多 【分析】基因敲除主要是应用DNA同源重组原理，用同源DNA片段替代靶基因片段，从而达到基因敲除的目的，由此可见，基因敲除可定向改变生物体的某一基因。基因敲除既可以是用突变基因或其它基因敲除相应的正常基因，也可以用正常基因敲除相应的突变基因。 【详解】（1）从图中可以看出在msn2两侧存在msn2L和msn2R基因，所以欲实现msn2基因的敲除，需要在pyrG基因两侧分别插入msn2L和msn2R片段，在这个过程中，需要用限制酶将基因切割，再用DNA连接酶将三个基因片段连接；米曲霉是微生物，常用钙离子转化法将外源基因转入微生物细胞。 （2） 从图中可以看出，引物C和引物D都不能将g-5基因组扩增完，所以为进行PCR扩增，需要选择引物A和B；1号菌落碱基对接近3000bp≈1024+1024+909，所以没有实现基因敲除，含有米曲霉3.042基因组原始序列；3号菌落大约含有3700bp的碱基对，引物C和D可以扩增pyrG，所以可以选择引物C和D重新扩增并电泳。 （3） tpsI基因表达产物可以降低米曲霉对逆境的敏感性，g-5菌落tpsI基因表达量明显降低，所以可以推测msn2基因敲除能使米曲霉产曲酸增多的机理是msn2基因表达产物的缺乏，抑制了tpsI基因的表达，提高了米曲霉对逆境的敏感性，从而导致米曲霉产生更多的曲酸；为验证该推测，可采用的实验方法是将米曲霉的msn2基因敲除，检测米曲霉的曲酸产量。预期msn2基因敲除，米曲霉的曲酸产量增多。 69．（2025·辽宁·三模）蛋白酶抑制剂基因转化是作物抗虫育种的新途径。某研究小组拟将胰凝乳蛋白酶抑制剂（StPinlA）的基因插入胰蛋白酶抑制剂（NaPI）基因的表达载体中，并对棉花进行共同转化，使其在棉花细胞中表达NaPI-StPinlA融合蛋白，从而获得转基因植株，过程如图1所示。回答下列问题： 限制酶 识别序列及切割位点 BamHI 5'-G↓GATCC-3' EcoRI 5'-G↓AATTC-3' HindIII 5'-A↓AGCTT-3' DraIII 5'-CAC↓GTG-3' StuI 5'-AGG↑CCT-3' (1)扩增StPinlA基因时，可选择图1中的一对引物是 ，StPinlA基因上无限制酶的识别序列，为了使扩增后的StPinlA基因能够与Ti质粒上的NaPI基因正确连接，用PCR技术扩增StPinlA基因时，需要设计合适的加端引物，依据图1及表的信息推测，引物E-F包含的碱基序列为5'- （写出12个碱基序列）-3'。 (2)为了使连接后的重组基因NaPI-StPinlA能够表达出融合蛋白，设计时应考虑剔除NaPI基因中的终止子序列、 及NaPI基因中终止密码子对应的碱基序列，剔除NaPI基因中终止密码子对应的碱基序列的目的是 。 (3)将构建好的重组Ti质粒导入农杆菌中进行转化，并将农杆菌涂布在含有 的固体培养基上，从而选择出生长正常的菌落中的农杆菌与棉花的叶肉细胞共培养。在愈伤组织阶段取部分细胞提取总DNA进行PCR和凝胶电泳，此操作的目的是 ，取细胞A、 B、C、D中的DNA扩增后的电泳结果如图2所示，其中成功导入重组基因NaPI-StPinlA的细胞是 。 【答案】(1) E-F和E--R GAATTCTCTCCG (2) SrPinlA基因中的启动子序列 使拼接在一起的NaPI基因转录形成的mRNA 中不出现终止密码子，避免StPinlA基因转录形成的mRNA不能进行翻译，从而无法合成 NaPI-StPinlA融合蛋白 (3) 卡那霉素 从分子水平上检测重组基因NaPI-StPinlA是否成功导入棉花细胞 细胞C 【分析】分析题意可知，实验目的时为了将胰凝乳蛋白酶抑制剂（StPinlA）的基因插入胰蛋白酶抑制$$