2.2.2动物细胞融合技术与单克隆抗体教学设计-2024-2025学年高二下学期生物人教版选择性必修3

优秀教案系列 第2节　动物细胞工程 二　动物细胞融合技术与单克隆抗体 教学分析 · 教学目标 1.掌握动物细胞融合的原理和方法。 2.概述单克隆抗体的制备过程及单克隆抗体的特点及应用。 · 评价目标 1.生命观念:依据细胞膜的流动性特点,理解动物细胞融合。 2.科学思维:建立单克隆抗体制备的基本流程模型。 3.社会责任:通过单克隆抗体的特点及应用的实例,认同单克隆抗体在临床上有重要的应用价值。 · 教学重难点 重点:1.掌握动物细胞融合的原理和方法。 2.概述单克隆抗体的制备过程。 3.了解单克隆抗体的特点及应用的实例。 难点:概述单克隆抗体的制备过程。 · 教学方法 1.采取多媒体辅助教学,用动画的方式展示单克隆抗体制备的过程,变抽象为直观。 2.直观教学法、讲述法、启示法、讨论法等。 · 课时安排 2课时 · 教学准备 多媒体,白板,学案,PPT等。 教学设计 导入新课 预防疾病的主要措施之一就是接种疫苗。疫苗是怎样起作用的呢? 组织学生回顾免疫相关知识:抗体的本质是什么?抗体是如何产生的?用传统的方法如何获取抗体?此方法能否快速、大量地获取我们想要的某种抗体?为什么? 人们发现,在动物发生免疫反应的过程中,体内的B淋巴细胞可以产生多达百万种以上的特异性抗体,但是每个B淋巴细胞只分泌一种化学性质单一、特异性强的抗体。要想获得大量的单一抗体,必须克隆单一的B淋巴细胞,形成细胞群。通过动物细胞培养是否可以获得大量单一的B淋巴细胞? 讲授新课 一、动物细胞融合技术 【师】什么是动物细胞融合技术?诱导动物细胞融合的方法有哪些? 【生】动物细胞融合技术:使两个或多个动物细胞结合形成一个细胞的技术。 诱导动物细胞融合的方法有①物理法:电融合法; ②化学法:PEG融合法; ③生物法:灭活病毒诱导法。下图表示灭活病毒诱导法的过程:灭活的病毒颗粒黏附于细胞表面→细胞膜被灭活的病毒颗粒穿通→细胞膜连接→细胞核融合,形成杂交细胞。 【师】细胞能够融合的原理是什么?融合后细胞的类型有哪些? 【生】细胞融合的原理是细胞膜具有流动性。A、B两种细胞融合后,会出现三种融合类型:AA、AB、BB。 【师】我们前面学习了植物体细胞杂交技术,请大家对植物体细胞杂交与动物细胞融合从原理、细胞融合前的准备、诱导手段、用途方面进行比较,完成下表。 比较项目 原理 细胞融合前的准备 诱导手段 用途 植物体细胞杂交 细胞膜的流动性,植物细胞的全能性 纤维素酶、果胶酶去除细胞壁后诱导原生质体融合 电融合法、离心法、聚乙二醇(PEG)融合法、高Ca2+—高pH融合法等 打破生殖隔离,实现远缘杂交育种,获得杂种植株 动物细胞融合 细胞膜的流动性 用胰蛋白酶或胶原蛋白酶使细胞分散后诱导细胞融合 PEG融合法、电融合法和灭活病毒诱导法等 获得杂交细胞、制备单克隆抗体 【师】动物细胞融合技术的意义有哪些?请大家阅读教材后回答。 【生】动物细胞融合技术突破了有性杂交的局限,使远缘杂交成为可能。人们可以按照预先的设计使不同细胞融合,至今,种间、属间、科间,甚至动物与植物之间的细胞融合都已经获得了成功。目前,这一技术已成为研究细胞遗传、细胞免疫、肿瘤和培育生物新品种等的重要手段,特别是利用动物细胞融合技术发展起来的杂交瘤技术,为制造单克隆抗体开辟了新途径。 二、单克隆抗体及其应用 【师】什么是单克隆抗体? 【生】单克隆抗体:只识别一种抗原的抗体,来自单一B淋巴细胞的克隆或一个杂交瘤细胞的克隆。 【师】小组活动:设计杂交瘤细胞实验。 请学生阅读教材内容,根据下面的内容以及提供的实验材料,设计杂交瘤细胞实验。 1975年,英国科学家米尔斯坦和德国科学家科勒设计了一个极富创造性的实验方案,制备了单克隆抗体。他们所用的实验材料有小鼠、特定抗原、骨髓瘤细胞、培养基。 下面让我们追寻科学家的足迹,利用手中的模型来模拟单克隆抗体的制备过程,并简要描述。(必要时可写上文字或箭头) 【生】学生通过阅读和小组模拟实验活动,理解单克隆抗体的制备过程。 单克隆抗体的制备过程: 【师】单克隆抗体制备过程中,共有两次筛选,有何不同? 【生】第一次筛选出杂交瘤细胞,第二次筛选出能产生特异性抗体的杂交瘤细胞,两次筛选的原理和方法是不相同的。将杂交瘤细胞稀释后用多孔细胞培养板培养,使每孔细胞不超过一个,通过培养让其增殖。然后检测各孔上清液中细胞分泌的抗体,上清液可与特定抗原结合的培养孔为阳性孔。阳性孔中的细胞还不能保证是来自单个细胞,挑选阳性孔的细胞继续进行有限稀释,一般需进行3~4次,直至确信每个孔中增殖的细胞为单克隆细胞,该过程即为杂交瘤细胞的克隆化培养和抗体检测。 【师】单克隆抗体的优点是什么?杂交瘤细胞有何特点? 【生】单克隆抗体的优点:特异性强、灵敏度高、可大量制备;杂交瘤细胞的特点:既能迅速大量增殖又能产生足够多数量的特定抗体。 【师】在单克隆抗体的制备过程中,为什么给小鼠注射特定的抗原蛋白?是否所有的杂交瘤细胞都能产生单一抗体?如何大规模进行培养得到大量的单克隆抗体? 【生】刺激小鼠产生能分泌特定抗体的B淋巴细胞;不是,需要继续进行单一抗体检验;小鼠体内培养或体外培养基培养。 【师】说明单克隆抗体有哪些应用。 【生】主要应用:①用作诊断试剂;②运载药物——主要用于治疗癌症,例如细胞毒素作为抗癌药物,单克隆抗体作为载体,两者结合实现了选择性杀伤癌变细胞;③治疗疾病。 评价反馈 学生能够掌握动物细胞融合技术的原理和方法,概述单克隆抗体的制备过程及单克隆抗体的特点及应用。 课堂小结 布置作业 完成学案中的核心素养专练。 教学反思 学习动物细胞融合技术时,因为学生已经学过了植物体细胞杂交技术,教学时可以先引导学生回顾植物体细胞杂交技术的过程,再让学生分析动物细胞融合技术与植物体细胞杂交技术的异同点,进而掌握动物细胞融合技术。该部分的教学,也可以通过联系必修1“细胞膜的结构和功能”一节中荧光标记的小鼠细胞和人细胞融合的实验,帮助学生理解动物细胞融合技术的原理。 板书设计 二　动物细胞融合技术与单克隆抗体 一、动物细胞融合技术 1.概念 2.方法 3.过程 4.意义 二、单克隆抗体及其应用 1.概念 2.过程 3.特点 4.应用 备课资源 一、动物细胞融合 1.杂交瘤细胞的筛选 在制备单克隆抗体的过程中,诱导B淋巴细胞和骨髓瘤细胞融合后,在培养体系中会存在多种细胞:未融合的亲本细胞、融合的具有同种核的细胞以及所需要的杂交瘤细胞。B淋巴细胞在体外培养条件下只能存活几天,而且它不可能无限增殖,因此不会影响杂交细胞的生长;但骨髓瘤细胞生长能力极强,增殖速度快,所以要筛选出杂交瘤细胞,就必须及时清除骨髓瘤细胞及骨髓瘤细胞自身融合的同种核细胞。 筛选杂交瘤细胞要使用特殊的培养基,一般用选择培养基(HAT)。HAT培养基根据细胞内次黄嘌呤核苷酸和嘧啶核苷酸的生物合成途径设计。 哺乳动物细胞中合成DNA的途径有两条。一条是从头合成途径,简称D途径,该途径是指从氨基酸和其他小分子化合物合成核苷酸开始合成DNA的过程。在D途径中,叶酸及其衍生物是必不可少的,它们参与嘌呤环和嘧啶甲基的合成。HAT培养基中加入的氨基蝶呤是叶酸的拮抗剂,因此它可以阻断细胞利用D途径合成DNA。另一条是补救途径,经次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(HGPRT)和胸腺嘧啶核苷激酶(TK)的参与,这两种酶可以催化次黄嘌呤和胸腺嘧啶核苷分别产生肌苷酸和胸腺嘧啶脱氧核苷酸,它们可以用来合成DNA,简称S途径。 骨髓瘤细胞是经过人工筛选的基因缺陷型细胞,缺乏 HGPRT和TK。当它处于HAT培养基中时,它合成DNA的D途径被氨基蝶呤阻断;同时,它由于缺乏 HGPRT和TK,所以不能利用S途径合成DNA,会很快死亡。而杂交瘤细胞从B淋巴细胞中获得了 HGPRT和TK,可以利用补充在培养基中的次黄嘌呤和胸腺嘧啶核苷经过S途径来合成DNA,这样在HAT培养基中它可以生存并增殖。 2.杂交瘤细胞的抗体检测及克隆化培养 用选择培养基(HAT)筛选出的杂交瘤细胞,大多数不能分泌抗体,仅有少数细胞能分泌所需的特异性抗体,因此需要将这些杂交瘤细胞挑选出来。如何挑选呢?可以根据抗原与抗体特异性结合的原理,运用酶免疫测定法(如常用的酶联免疫吸附试验)、免疫荧光技术、放射免疫测定法等检测各孔上清液中细胞分泌的抗体。一般在杂交细胞布满孔底1/10面积时进行检测。另外,新融合的杂交瘤细胞不稳定,容易失去分泌抗体的性质,所以一般需要进行多次检测以确保其稳定性。 当经过2~3次检测证实在培养孔中存在特异性抗体时,就可以开始对杂交瘤细胞进行连续克隆化培养。克隆化培养是指由单个细胞分裂增殖获得细胞群的培养过程。常用的克隆化培养方法包括有限稀释法、软琼脂培养法等。下面以有限稀释法为例进行简要说明。 将处于对数生长期的杂交瘤细胞用培养液充分稀释,使分配到96孔细胞培养板每个孔中的细胞数不超过1,通过培养让其大量增殖。一般培养4~5天后,如果在倒置显微镜下见到紧密生长的细胞,可认为这是单一克隆。经过一次克隆化培养的细胞不能保证其来自单个细胞,一般经过3~4次培养才可以获得稳定的单克隆抗体。这时候,如果再次检测抗体为阳性,就可以进行大规模生产。 二、历年高考荟萃 1.为研制抗病毒A的单克隆抗体,某同学以小鼠甲为实验材料设计了以下实验流程。 回答下列问题。 (1)上述实验前必须给小鼠甲注射病毒A,该处理的目的是　 。  (2)写出以小鼠甲的脾脏为材料制备单细胞悬液的主要实验步骤:  　 。 (3)为了得到能产生抗病毒A的单克隆抗体的杂交瘤细胞,需要进行筛选。图中筛选1所采用的培养基属于　　　　　　　　,使用该培养基进行细胞培养的结果是　　　　　　　。图中筛选2含多次筛选,筛选所依据的基本原理是　 。  (4)若要使能产生抗病毒A的单克隆抗体的杂交瘤细胞大量增殖,可采用的方法有    　　　 　　　(答出2点即可)。  2.新型冠状病毒可通过表面的纤突蛋白(S蛋白)与人体呼吸道黏膜上皮细胞的ACE2受体结合,侵入人体。图1为病毒侵入后,人体内发生的部分免疫反应示意图。单克隆抗体可阻断病毒的黏附或入侵。图2为筛选、制备抗S蛋白单克隆抗体的示意图。请据图回答下列问题。 图1 图2 (1)图1中人体内抗原呈递细胞吞噬病毒,并将病毒的抗原暴露在细胞表面,被　　　　细胞表面的受体识别后激活该细胞。  (2)B细胞识别入侵的病毒后,在淋巴因子作用下,经过细胞的　　　　　　,形成　　　　　　　细胞。  (3)为判断疑似患者是否为新型冠状病毒感染者,采集鼻咽拭子主要用于病原学检查,检测病毒的　　　　　;采集血液样本主要用于血清学检查,检测　 。  (4)据图2所示,研制抗S蛋白单克隆抗体,需先注射　　　　　免疫小鼠以激活小鼠的免疫细胞,再提取激活的B细胞与骨髓瘤细胞融合,用HAT培养基筛选获得　　　　　细胞。因为同一种抗原可能激活　　　　　细胞,还需继续筛选才能获得分泌单克隆抗体的细胞株。  3.(多选)下图为杂交瘤细胞制备示意图。骨髓瘤细胞由于缺乏次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(HGPRT),在HAT筛选培养液中不能正常合成DNA,无法生长。下列叙述正确的是(　　) A.可用灭活的病毒诱导细胞融合 B.两两融合的细胞都能在HAT培养液中生长 C.杂交瘤细胞需进一步筛选才能用于生产 D.细胞膜的流动性是细胞融合的基础 4.某研究者用抗原(A)分别免疫3只同种小鼠(X、Y和Z),每只小鼠免疫五次,每次免疫一周后测定各小鼠血清抗体的效价(能检测出抗原—抗体反应的血清最大稀释倍数),结果如下图所示。 若要制备杂交瘤细胞,需取免疫后小鼠的B淋巴细胞(染色体数目40条),并将该细胞与体外培养的小鼠骨髓瘤细胞(染色体数目60条)按一定比例加入试管中,再加入聚乙二醇诱导细胞融合,经筛选培养及抗体检测,得到不断分泌抗A抗体的杂交瘤细胞。回答下列问题。 (1)制备融合所需的B淋巴细胞时,所用免疫小鼠的血清抗体效价需达到16 000以上,则小鼠最少需要经过　　　　次免疫后才能有符合要求的。达到要求后的X、Y、Z这3只免疫小鼠中,最适合用于制备B淋巴细胞的是　　　　小鼠,理由是　　　　　　　　　　　。  (2)细胞融合实验完成后,融合体系中除含有未融合的细胞和杂交瘤细胞外,可能还有  　 , 体系中出现多种类型细胞的原因是  　。  (3)杂交瘤细胞中有　　　　个细胞核,染色体数目最多是　　　　条。  (4)未融合的B淋巴细胞经多次传代培养后都不能存活,原因是　　　　　　　　　　。  参考答案 1.(1)诱导小鼠甲产生能够分泌抗病毒A抗体的B淋巴细胞　(2)取小鼠甲脾脏剪碎,用胰蛋白酶或胶原蛋白酶处理使其分散成单个细胞,加入培养液制成单细胞悬液　(3)选择培养基　只有杂交瘤细胞能够生存　抗原与抗体的反应具有特异性　(4)将杂交瘤细胞注射到小鼠腹腔内增殖;将杂交瘤细胞在体外培养 【解析】由题图可知,筛选1指用选择培养基筛选出杂交瘤细胞,筛选2指进行克隆化培养和单一抗体检测,筛选出能产生特定抗体的杂交瘤细胞。(1)实验前给小鼠甲注射病毒A,是为了诱导小鼠甲产生能够分泌抗病毒A抗体的B淋巴细胞。(2)取小鼠甲的脾脏,剪碎组织,用胰蛋白酶或胶原蛋白酶处理获得单个细胞,加入培养液可以制成单细胞悬液。(3)题图中筛选1需要用到选择培养基,只有杂交瘤细胞可以存活。筛选2是为了获得能产生特定抗体的杂交瘤细胞,该过程要用到抗原—抗体杂交,故筛选所依据的原理是抗原-抗体反应具有特异性。(4)获得能产生抗病毒A的单克隆抗体的杂交瘤细胞后,可以在体外培养液中进行培养,或在小鼠的腹腔中进行培养,使杂交瘤细胞大量增殖。 2.(1)T　(2)增殖、分化　浆细胞和记忆B　(3)核酸　抗新型冠状病毒抗体　(4)S蛋白(或纤突蛋白)　杂交瘤　多种B 【解析】(1)据题图1可知,人体内抗原呈递细胞吞噬新型冠状病毒,并将新型冠状病毒的抗原暴露,呈递给T细胞,被T细胞表面的受体识别后激活T细胞。(2)激活的T细胞释放细胞因子,并将抗原呈递给B细胞,B细胞识别入侵的病毒后,迅速增殖、分化成浆细胞和记忆B细胞。(3)临床上为判断疑似患者是否为新型冠状病毒感染者,采集鼻咽拭子主要用于病原学检查,检测疑似患者的呼吸道是否有新型冠状病毒的核酸,采集血液样本主要用于血清学检查,检测血清中是否产生抗新型冠状病毒的抗体。(4)据题中图2所示,结合单克隆抗体制备方法,要研制抗S蛋白(或纤突蛋白)单克隆抗体,需先注射新型冠状病毒的S蛋白(或纤突蛋白),以激活小鼠的免疫细胞,再提取激活的B细胞与骨髓瘤细胞融合,获得融合的、未融合的细胞,用HAT培养基筛选,未融合的B细胞不能长期生存而死亡,未融合的骨髓瘤细胞不能合成DNA而死亡,只有杂交瘤细胞能成活;由于同一种抗原可能激活多种B细胞,筛选出的融合的骨髓瘤细胞就可能分泌多种抗体,还需继续筛选才能获得分泌单克隆抗体的细胞。 3.ACD　【解析】诱导动物细胞融合的方法有电融合法、PEG融合法、灭活病毒诱导法等,A项正确;两两融合的细胞包括免疫B细胞与免疫B细胞融合的具有同种核的细胞、骨髓瘤细胞与骨髓瘤细胞融合的具有同种核的细胞、免疫B细胞与骨髓瘤细胞融合的杂交瘤细胞,骨髓瘤细胞虽然能无限增殖,但缺乏次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶,免疫B细胞虽然有次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶,但不具有无限增殖的本领,所以在HAT筛选培养液中,两两融合的具有同种核的细胞都无法生长,只有杂交瘤细胞才能生长,B项错误;因每个免疫B细胞只分泌一种特异性抗体,因此在HAT筛选培养液中筛选出来的众多的杂交瘤细胞所分泌的抗体,不一定都是人类所需要的,还需要进一步把能分泌人类所需要抗体的杂交瘤细胞筛选出来,C项正确;动物细胞融合是以细胞膜的流动性为基础的,D项正确。 4.(1)四　Y　Y小鼠的血清抗体效价最高　(2)B淋巴细胞相互融合形成的细胞、骨髓瘤细胞相互融合形成的细胞　细胞融合是随机的,且融合率达不到100%　(3)1　100　(4)不能无限增殖 【解析】(1)据题图分析,第四次免疫后小鼠Y的血清抗体效价达到16 000以上。达到要求后的X、Y、Z这3只小鼠中,Y小鼠的B淋巴细胞产生的血清抗体效价最高,最适合用于制备单克隆抗体。(2)融合体系中除了未融合的细胞和杂交瘤细胞之外,还有骨髓瘤细胞和B淋巴细胞的自身融合产物,由于细胞融合是随机的,且融合率达不到100%,故体系中会出现多种类型的细胞。(3)杂交瘤细胞形成后,由于核膜具有流动性,故小鼠的B淋巴细胞细胞核与骨髓瘤细胞的细胞核会融合形成一个杂交的细胞核,因此染色体数目最多是100条。(4)未融合的B淋巴细胞经多次传代培养后,仍然是不能无限增殖的细胞。 第 1 页 共 1 页 学科网（北京）股份有限公司 $$