专题16 基因工程-【好题汇编】2025年高考生物二模试题分类汇编（新高考通用）

专题16 基因工程 考点概览 考点01 重组DNA技术的基本工具 考点02 基因工程的基本操作程序和应用 重组DNA技术的基本工具考点01 一、单选题 1．（2025·山东·二模）在DNA提取过程中应尽量避免导致DNA断裂和降解的各种因素，以保证DNA的完整性。下列操作与保证DNA完整性无关的是（    ） A．将洋葱切碎加入研磨液后再充分研磨 B．在上清液中加入预冷的酒精溶液 C．滤液在4℃冰箱中放置几分钟后再取上清液 D．加入酒精后用玻璃棒沿一个方向轻轻搅拌 2．（2025·江西赣州·二模）科研人员利用PCR技术扩增人乳铁蛋白基因，并进行电泳鉴定。下列叙述正确的是（　　）      A．目的基因扩增时，应添加的引物组合为引物Ⅰ、Ⅳ或引物Ⅱ、Ⅲ B．PCR循环6次可得到5种DNA分子，其中等长的DNA分子共52个 C．电泳所需缓冲液和酶应分装成小份在-20℃储存，使用前在室温下解冻 D．鉴定DNA时，应向提取的DNA中加入二苯胺试剂并置于沸水中加热 3．（2025·内蒙古·二模）CRISPR/Cas9是一种基因编辑技术，作用机制如图。单链向导RNA能特异性识别并结合特定的DNA序列，从而引导Cas9蛋白到相应位置剪切DNA，最终实现对靶基因序列的编辑。下列有关分析错误的是（　　） A．该技术能精准识别相关基因的原理是碱基互补配对 B．Cas9蛋白可催化脱氧核苷酸链上特定氢键的水解 C．人工设计特异性向导RNA是基因编辑技术的关键 D．向导RNA过短可能因不能准确识别，造成错误编辑 4．（2025·山东德州·二模）关于“DNA片段的扩增及电泳鉴定”实验，下列说法正确的是（    ） A．PCR过程中预变性与最后一次循环时，变性时间较长可使DNA充分解聚 B．PCR过程中，复性温度过低会导致无法扩增出DNA片段 C．DNA的电泳速率与DNA分子的大小和构象有关，与凝胶浓度无关 D．将PCR产物、核酸染料和凝胶载样缓冲液混合后，用微量移液器加入加样孔 5．（2025·山东菏泽·二模）下列关于“DNA的粗提取与鉴定”和“DNA片段的扩增及电泳鉴定”实验的叙述，错误的是（    ） A．DNA不溶于95%的冷酒精，但可溶于2mol/LNaCl溶液 B．将洋葱切碎、研磨、过滤，滤液放置4℃冰箱中静置几分钟后，DNA存在于上清液中 C．在凝胶电泳中DNA分子的迁移速率与凝胶的浓度、DNA分子的大小和构象等有关 D．凝胶载样缓冲液中加入的核酸染料能与DNA分子的结合，便于在紫外灯下观察 6．（2025·广东佛山·二模）某兴趣小组以香蕉为原材料进行DNA粗提取、扩增及电泳鉴定系列实验。下列叙述正确的是（　　） A．提取DNA时，研磨后需用滤纸进行过滤 B．可利用DNA在酒精中溶解度大的特点来提取DNA C．琼脂糖熔化前需将适量的核酸染料加入并进行混匀 D．若DNA带负电，则凝胶加样孔应位于电泳槽负极侧 7．（2025·江西新余·二模）甲型流感病毒的抗原性与感染性与其表面的R蛋白（血凝素蛋白）密切相关，现利用基因工程的方法生产相关疫苗。图甲为构建R蛋白基因表达载体的过程，图乙为重组质粒被相关酶切后的电泳结果。下列相关叙述正确的是（　　） A．图甲过程中至少需要应用到逆转录酶、RNA聚合酶、DNA连接酶 B．电泳技术可以用于人类亲子鉴定、生物间亲缘关系的鉴定 C．构建好的重组质粒长度共2000bp，据图乙可推测BamHI在重组质粒上有2个酶切位点 D．PCR扩增R基因中，微量离心管、枪头和移液器等在使用前均须消毒处理 二、多选题 8．（2025·江苏·二模）与DNA相关的实验，下列叙述正确的有（    ） A．利用DNA在酒精中溶解度较大的特性提取DNA B．粗提取的DNA中可能含有蛋白质、脂质等杂质 C．用二苯胺试剂鉴定DNA时，沸水浴加热后呈蓝色 D．PCR扩增产物通常利用琼脂糖凝胶电泳技术进行鉴定 9．（2025·河北张家口·二模）下列关于“DNA粗提取和鉴定实验”与“DNA片段的扩增及电泳鉴定实验”的叙述，正确的是（　　） A．“DNA粗提取和鉴定实验”中可能进行两次离心 B．在一定温度下，DNA遇二苯胺试剂会呈现蓝色 C．在凝胶中DNA分子的迁移速率与其构象无关 D．根据DNA片段大小，用电泳缓冲液配制琼脂糖溶液进行鉴定 10．（2025·河北石家庄·二模）关于“DNA片段的扩增及电泳鉴定”的实验，下列叙述错误的是（　　） A．通过琼脂糖凝胶电泳可鉴定PCR产物 B．待指示剂前沿迁移到达凝胶加样孔边缘时，需停止电泳以防DNA跑出凝胶 C．PCR利用了DNA的热变性原理，一次PCR一般要经历30次循环 D．琼脂糖凝胶中的DNA分子可直接在波长为300nm的紫光灯下被检测出来 三、实验题 11．（2025·甘肃白银·二模）CRISPR/Cas9基因编辑技术可用于基因敲除，其主要包含两种成分——Cas9蛋白及小向导RNA（sgRNA），其作用原理如图1所示。某科研团队利用该技术对拟南芥的Sv14与Sv15基因进行敲除，探究Sv14、Sv15基因对拟南芥花粉育性的影响。请回答下列有关问题： (1)将Cas9蛋白及sgRNA导入拟南芥细胞，我国科学家独创的一种方法是 。据图1分析可知，Cas9蛋白的功能相当于 酶。 (2)①为了提高敲除拟南芥的Sv14、Sv15基因的成功率，一般先敲除其中一个基因获得单突变体，在此基础上继续敲除另一个基因获得双突变体。已知拟南芥的Sv14、Sv15基因模板链碱基序列如图2所示。 请根据Sv14、Sv15基因模板链碱基序列设计敲除Sv14、Sv15基因过程中所用到起向导作用的sgRNA（若sgRNA为10bp，且选取模板链NGG之前的序列设计，“N”表示任意核苷酸）。 Sv14—sgRNA：5′— —3'。 Sv15—sgRNA：5′— —3'。 ②为验证是否完全敲除，可提取待测拟南芥的总DNA，加入 种引物进行PCR扩增，PCR产物长度常采用 技术鉴定，理论上出现 种条带说明成功获得双突变体。 (3)对于成功转化的拟南芥植株还需进一步进行表型鉴定，研究人员选取不同转基因拟南芥采集花粉，观察并计算花粉萌发率，结果见下表。 组别 野生型 Sv14突变体 Sv15突变体 Sv14、Sv15双突变体 花粉萌发率 95.0% 39.8% 80.0% 30.0% 根据以上表格，可得出的结论是 。为进一步验证这一结论，请用基因工程手段以Sv14、Sv15双突变体为材料设计实验并预测结果： （基因工程具体操作不做要求）。 基因工程的基本操作程序和应用考点02 一、单选题 1．（2025·甘肃金昌·二模）反向PCR是一种通过已知序列设计引物对未知序列进行扩增的技术，其过程如下图所示。下列叙述正确的是（　　） A．应选择引物1和引物4进行PCR扩增 B．设计的引物中GC碱基含量越高，复性时需要的温度越低 C．PCR产物是包含所有已知序列和未知序列的环状DNA分子 D．整个过程需用到限制酶、DNA连接酶、耐高温的DNA聚合酶及逆转录酶 2．（2025·山东泰安·二模）双向启动子可同时结合两个RNA聚合酶来驱动下游基因的表达，研究人员构建了如图所示的表达载体，以检测双向启动子作用效果。下列分析正确的是（　　） A．表达载体中GUS基因和LUC基因转录时使用同一条DNA单链为模板 B．为连入GUS基因，需用SalⅠ和SphⅠ酶切已整合了双向启动子及LUC基因的质粒 C．在培养基中添加壮观霉素可筛选出成功导入表达载体的受体细胞 D．通过观察是否出现荧光和蓝色物质可检测双向启动子的作用效果 3．（2025·广东清远·二模）新一代人工智能模型ESM3首次实现了对蛋白质序列、结构和功能的统一推理，并成功“设计”出了一种全新的荧光蛋白，新荧光蛋白的生成相当于模拟了5亿年的进化过程。下列叙述错误的是（　　） A．人工智能模型ESM3与蛋白质工程一样可以设计自然界没有的蛋白质 B．生物进化中产生的基因突变可为基因工程改造生物提供更多的基因资源 C．基因工程能够阻止生物进化过程中有害基因的出现，因为可以精准编辑基因 D．人工智能模型ESM3可解码生物语言，因为自然界的生物体都有相同的遗传密码 4．（2025·广东清远·二模）某发光蘑菇可利用咖啡酸转化为荧光素，从而实现持续发光。科学家将蘑菇的发光基因导入矮牵牛中培育出能持续发荧光的矮牵牛，且发现细胞代谢越旺盛的部位发光强度越大。下列说法错误的是（　　） A．可使用农杆菌转化法将荧光素酶基因导入到矮牵牛细胞中 B．矮牵牛导入了荧光素酶基因可发荧光，推测矮牵牛含有咖啡酸 C．可根据植株在不同时间的发荧光强度监测植物的动态发育过程 D．通过基因工程技术获得的发荧光矮牵牛属于新物种 5．（2025·江西赣州·二模）科研人员利用PCR技术扩增人乳铁蛋白基因，并进行电泳鉴定。下列叙述正确的是（　　）      A．目的基因扩增时，应添加的引物组合为引物Ⅰ、Ⅳ或引物Ⅱ、Ⅲ B．PCR循环6次可得到5种DNA分子，其中等长的DNA分子共52个 C．电泳所需缓冲液和酶应分装成小份在-20℃储存，使用前在室温下解冻 D．鉴定DNA时，应向提取的DNA中加入二苯胺试剂并置于沸水中加热 6．（2025·山东泰安·二模）结肠癌是发病率高的癌症之一，患者血清中的M蛋白含量显著降低，据此推测M基因可能是一种抑癌基因。研究人员利用数据库筛选到一种可促进M基因转录的E蛋白。推测E蛋白通过与M基因启动子区域结合，促进M基因的表达。将相应质粒分别转入两组相同的细胞中，一段时间后收集细胞裂解液，检测荧光强度。结果显示甲组荧光强度明显高于乙组，从而证实推测。请从下列选项中选择转入甲组细胞和转入乙组．细胞的表达载体（    ） A．ac  af B．bc  bf C．bd  be D．ad  ae 7．（2025·江苏南京·二模）生物技术与工程学相结合，可研究、设计和加工生产各种生物工程产品。下列叙述错误的是（　　） A．二倍体植株的花药离体培养得到的单倍体植株可用于基因突变的研究 B．由iPS细胞产生的特定细胞，可以在新药的测试中发挥重要作用 C．将含指示剂的凝胶载样缓冲液与PCR产物混合后滴入加样孔指示电泳进程 D．大量制备一种单克隆抗体时需要用大量的B细胞和骨髓瘤细胞进行融合 8．（2025·山东泰安·二模）科学家利用动物乳腺生物反应器生产某病毒的N蛋白，用于制备该病毒的疫苗，基本流程如图。下列相关叙述错误的是（    ） A．精子获能后才可受精，卵细胞通过透明带反应和卵细胞膜反应来防止多精入卵 B．过程①在基因工程中为核心步骤，甲为基因表达载体，过程②需提供无菌无毒环境 C．过程③将囊胚移植入代孕羊驼之前，需用促性腺激素对代孕母羊驼进行同期发情处理 D．欲获得转基因母羊驼，需在胚胎移植前取滋养层细胞做DNA分析鉴定性别 9．（2025·北京海淀·二模）为合成出局部为双链的RNA用于沉默特定基因，先将目的基因X从重组质粒pHIBS切割出来，再巧妙地连接到质粒载体pUAST中，如下图，其中质粒只展示了局部。 下列叙述正确的是（　　） A．该操作过程中还需要DNA连接酶和耐高温的DNA聚合酶 B．利用B和Bg、S和Xh黏性末端相同，实现基因X与pUAST连接 C．基因X的DNA片段需要完整保留启动子和终止子区域 D．可以用E和Bg，或者Xh和K双酶切重组pUAST 10．（2025·山东青岛·二模）DNA足迹法是检测DNA序列中结合蛋白识别部位的一种方法。DNA与蛋白质结合后，由于蛋白质的保护，DNasel酶无法对这一部位进行切割，可以运用此方法来确定启动子在DNA序列中的具体位置。某DNA片段上具有一个启动子，为研究其位置，研究小组决定用DNA足迹法对其进行检测。DNA片段上的DNasel酶酶切位点及各部分的长度如图1所示。对照组和实验组均加入等量的待测DNA样液，然后加入等量的DNasel酶，通过控制酶的用量和作用时间使每个DNA分子只发生一次磷酸二酯键的断裂。酶解后将对照组和实验组分别进行电泳检测所得片段的大小，对照组得到大小分别为10bp、40bp、50bp、90bp、100bp、140bp、150bp、180bp的8个片段，实验组得到大小分别为10bp、50bp、90bp、100bp、140bp、180bp的6个片段。下列说法正确的是（　　）    A．构成启动子的基本单位是脱氧核苷酸，启动子的功能是与DNA聚合酶结合，启动转录 B．根据实验结果可以确定，启动子在DNA上的位置为A点附近 C．DNasel酶可作用于DNA的氢键和磷酸二酯键 D．为使结果更直观呈现，在DNA一端用12P进行标记，若标记在a端，则结果如图2所示 11．（2025·山东青岛·二模）普通水稻含铁量极低，研究人员通过改良相关基因，培育出了铁含量比普通水稻高60%的转基因水稻。图1为改良基因及Ti质粒的示意图，该质粒含有氨苄青霉素抗性基因、LacZ基因及一些酶切位点，图2为后续培养过程。下列说法正确的是（　　）      A．需用限制酶XmaI和NheI对Ti质粒进行切割 B．培养基2与培养基3加入的生长素和细胞分裂素比例不同 C．在含氨苄青霉素的培养基中能够生长的农杆菌细胞中一定含有改良基因 D．筛选含重组质粒的农杆菌时，应该在培养基中加入β-半乳糖苷，目标菌落为蓝色 12．（2025·山东泰安·二模）染色体上的端粒DNA由短的串联重复序列组成，同种生物的该序列相同。少数缺乏端粒酶活性的肿瘤细胞可通过端粒延长替代机制（ALT）维持端粒长度。ALT机制如下：第一条染色体端粒的末端①链结合到第二条染色体端粒的末端②链上并延伸；随后①链脱离，在RNA引物和DNA聚合酶的作用下，新延长的①链被转化成双链形式。这个过程可被重复数十次，使得序列信息从一个端粒传递到另一端粒上。下列说法错误的是（    ） A．①链的延伸过程以②链作为模板，该过程不需要合成引物 B．DNA聚合酶只能从核酸片段3′端延伸，这导致端粒DNA5′端比3′端短 C．进行ALT的肿瘤细胞中端粒酶基因甲基化程度可能较高 D．非同源染色体间通过ALT机制实现了基因重组，增加了遗传的多样性 13．（2025·山东泰安·二模）双向启动子可同时结合两个RNA聚合酶来驱动下游基因的表达，研究人员构建了如图所示的表达载体，以检测双向启动子作用效果。下列分析正确的是（    ）    A．表达载体中GUS基因和LUC基因转录时使用同一条DNA单链为模板 B．为连入GUS基因，需用Sal I和Sph I酶切已整合了双向启动子及LUC基因的质粒 C．在培养基中添加壮观霉素可筛选出成功导入表达载体的受体细胞 D．通过观察是否出现荧光和蓝色物质可检测双向启动子的作用效果 14．（2025·重庆·二模）β-半乳糖苷酶由lacZ基因编码，能将无色的X-gal分解为蓝色物质。将lacZ基因分成两段，分别放在质粒（如图）和受体菌中，表达出的两条肽-a肽和ω肽通过非共价键结合仍有相同的酶活性。在含有氨苄青霉素、X-gal、IPTG（诱导lacZ基因表达）的LB培养基上培养转化后的受体菌。下列说法正确的是（    ）    A．所有未转化菌株均能生长且呈白色，重组质粒转化的菌落呈蓝色 B．转化失败的菌落呈白色，空载体转化的菌落呈蓝色，重组质粒转化的菌落呈白色 C．转化失败的菌株无法生长，空载体转化的菌落呈蓝色，重组质粒转化的菌落呈白色 D．转化失败的菌株无法生长，空载体转化的菌落呈白色，重组质粒转化的菌落呈蓝色 15．（2025·山东聊城·二模）下列关于生物技术与工程的实验操作，错误的是（    ） A．将配制的酵母培养基高压蒸汽灭菌后，需要在酒精灯火焰旁倒平板 B．将接种环烧红，迅速蘸取酵母菌液在培养基上划线培养，获得单菌落 C．利用添加核酸染料的凝胶对PCR产物进行电泳后，在紫外灯下观察结果 D．配制PCR 反应体系时，加入等量的4种脱氧核糖核苷酸溶液作为扩增原料 16．（2025·山西太原·二模）反向PCR是一种用于扩增已知序列两侧的未知序列的技术，需要先将目标DNA进行环化，再以环化的DNA为模板进行扩增。现利用反向PCR技术来确定目的基因的插入位点，部分过程如下图所示，相关叙述正确的是（    ） A．过程②中根据目的基因两端的部分核苷酸序列设计引物2和3 B．过程③中复性是在72℃左右使两种引物与模板链结合 C．过程③所用的酶从引物的3'端开始连接脱氧核苷酸 D．PCR第二轮循环即可获得两条链等长的未知序列 17．（2025·河北邢台·二模）研究人员将胰岛素B链的第28位氨基酸替换为天冬氨酸，抑制了胰岛素聚合，从而获得速效胰岛素类似物。下列叙述正确的是（　　） A．胰岛素改造的基本思路与天然蛋白质合成过程相反 B．可通过定向诱导胰岛素基因碱基增添达到改造目的 C．改变氨基酸的种类不会影响胰岛素的空间结构 D．该产品是通过直接改造胰岛素来生产的 18．（2025·重庆·二模）下图为科研人员培育双抗性（抗虫和抗草甘膦）转基因烟草的部分过程示意图。下列说法错误的是（    ） 注：“Cry1Ac-2．5”表示人工合成杀虫基因，“GR79 EPSPS”表示草甘膦抗性基因，“Ω”表示增强基因表达的序列。 A．图中的①结构是 RNA 聚合酶识别和结合的部位 B．双抗性烟草培育过程中抗草甘膦基因作为标记基因筛选重组 DNA C．图中“转基因植株”一定具有抗草甘膦和抗虫的特性 D．构建植物表达载体的过程中需要使用限制酶和 DNA 连接酶 19．（2025·甘肃白银·二模）关于“DNA的粗提取与鉴定”和“DNA片段的扩增及电泳鉴定”的实验操作，下列说法错误的是（    ） A．取洋葱研磨液的上清液，加入体积相等的、预冷的酒精溶液（体积分数为 95%），离心后管底的沉淀物为粗提取的DNA B．将提取的白色丝状物溶于2mol/L的NaCl溶液中，再加二苯胺试剂并进行沸水浴，用于鉴定DNA C．电泳鉴定实验中，将温热的琼脂糖溶液迅速倒入模具后再加入核酸染料 D．电泳时，接通电源后，待指示剂前沿迁移接近凝胶边缘时，停止电泳 20．（2025·四川广安·二模）如图为人类胚胎发育到第6周和第12周时两种珠蛋白基因的表达情况。下列叙述正确的是（    ） A．DNA甲基化不会改变生物的基因型和表型 B．胚胎发育的过程中，DNA甲基化是可逆的 C．胚胎发育的不同阶段，基因表达情况是完全不同的 D．启动子甲基化可能导致DNA聚合酶不能识别和结合 21．（2025·甘肃·二模）基因工程在农牧业、医药卫生和食品工业等多方面的应用发展迅速。下图表示利用基因工程技术生产人血清白蛋白的两条途径。下列叙述错误的是（    ） A．扩增目的基因时，利用耐高温的DNA聚合酶从引物a、b的3端进行子链合成 B．目的基因要与能在绵羊乳腺细胞中特异性表达的基因的启动子等调控元件重组在一起 C．若目的基因是从人的细胞内提取mRNA经逆转录形成的，则该目的基因中不含启动子序列 D．可以利用农杆菌转化法将含有目的基因的重组质粒直接整合到受体植物细胞的染色体DNA上 22．（2025·浙江杭州·二模）同尾酶指识别位点不同但能切出相同黏性末端的限制酶；同裂酶指具有相同识别序列的限制酶(切割位点相同或不同均可)。几种基因工程中常用的限制酶如表所示。下列叙述错误的是（　　） 限制酶的名称 识别和切割位点 HinPⅡ 5-G↓CGC-3' GlaⅠ 5-GC↓GC-3' HhaⅠ 5-GCG↓C-3' HpaⅡ 5'-C↓CGG-3' NarⅠ 5'-GG↓CGCC-3' A．HinP1I和HhaI为同裂酶，切出的黏性末端不同 B．HinP1I和HpaII切割的产物连接后，其序列不能被GlaI切割 C．HinP1I和NarI为同尾酶，它们切割的产物连接后的序列不能被GlaI切割 D．某质粒仅含1个GlaI的识别位点，则该质粒能被NarI切割的概率为1/16 23．（2025·山西临汾·二模）目的基因A含有100对碱基，其中腺嘌呤占30%，现利用目的基因A片段两侧的特异性序列设计引物I、引物Ⅱ，用PCR技术扩增该目的基因，结构如下图所示。PCR扩增共循环50次。下列说法错误的是（　　）    A．PCR仪实质上是一台温度自动调控仪器，循环50次理论上复制50代 B．含目的基因A的DNA片段经PCR循环50次，需要两种引物共250个 C．PCR过程与体内DNA复制的方式相同，但是只需要一种酶的参与 D．若只考虑目的基因A，经PCR循环50次需要鸟嘌呤(250-1)×40个 24．（2025·安徽池州·二模）DREB1A 是克隆自拟南芥的逆境诱导转录因子，可以调控多个与植物干旱、高盐及低温耐性有关的功能基因表达。某科研小组通过实验研究以花生茎尖细胞作为 DREB1A 基因受体的可行性。下列叙述错误的是（    ） A．用 PCR 技术扩增DREB1A 基因,扩增n次需要引物2ⁿ⁺¹-2个 B．该实验是利用基因重组原理将DREB1A基因整合到花生基因组 C．该实验应选择合适的启动子以驱动DREB1A基因的复制和转录 D．该实验可以利用农杆菌转化法将DREB1A 基因导入花生茎尖细胞 25．（2025·四川宜宾·二模）如图是将目的基因导入大肠杆菌内制备“基因工程菌”的示意图，其中引物1-4在含有目的基因的DNA上的结合位置如甲图所示，限制酶BamHI、EcoRI、HindIII在质粒上的识别位点如乙图所示。以下叙述错误的是（    ）    A．PCR过程完成4轮循环，理论上至少需加入引物30个 B．过程①中不能同时使用限制酶EcoRI和BamHI切割质粒 C．在氨苄青霉素培养基上生长的大肠杆菌就是此过程制备的工程菌 D．若已经合成了图甲所示4种引物，应选择引物1和4扩增目的基因 26．（2025·贵州毕节·二模）某小组利用PCR扩增某目的基因，设计了引物A和引物B。下列相关叙述错误的是（    ） A．经过二轮循环后的产物中只含有引物A的DNA片段所占的比例为1/4 B．经过三轮循环后的产物中含有引物B的DNA片段所占的比例为1/2 C．经过四轮循环后的产物中同时含有两种引物的DNA片段所占的比例为7/8 D．耐高温的DNA聚合酶从引物的3'端延伸子链 二、多选题 27．（2025·山东·二模）Ti质粒的Vir基因表达产生的Vir蛋白能在T-DNA左右边界序列中产生切口，并复制出单链T-DNA从Ti质粒上释放后进入植物细胞。T-DNA利用左右边界序列与植物细胞DNA分子中某些序列有极强的同源性，插入植物细胞基因组中。T-DNA的生长素基因和细胞分裂素基因能使植物组织过度生长，形成瘤状组织（冠瘿），冠瘿碱合成基因使植物细胞合成并分泌冠瘿碱，为农杆菌的生长提供碳源和氮源。下列说法错误的是（    ） A．Ti质粒中的冠瘿碱合成基因与植物细胞染色体DNA整合后，其表达产物可将冠瘿碱分解 B．为保证转基因植物正常生长，Ti质粒作载体时需将生长素基因和细胞分裂素基因敲除 C．应将目的基因插入Ti质粒的T-DNA上，且不能破坏左右边界序列 D．Ti质粒作为基因工程载体时，需将Vir基因替换成标记基因，用于重组DNA分子的筛选 28．（2025·江西赣州·二模）2025年3月，我国科学家成功将利用CRISPR/Cas9基因编辑系统改造后的猪肝脏移植入人体。该基因编辑系统主要包括向导RNA（crRNA和tracrRNA组成的复合体）和Cas9蛋白。crRNA含有与靶基因片段配对的序列，与tracrRNA共同协助Cas9蛋白准确定位，进行如图所示的基因编辑。下列叙述正确的是（　　） A．为降低排异反应，需敲除猪抗原基因，并使用免疫抑制剂降低细胞免疫水平 B．crRNA特异性识别目标DNA分子，敲除猪抗原基因时至少要设计两种crRNA C．通过缩短crRNA来提高其特异性，可降低因错误结合而出现“脱靶”的概率 D．CRISPR/Cas9系统工作时，Cas9蛋白具有专一性，可作用于氢键和磷酸二酯键 29．（2025·江西鹰潭·二模）赖氨酸是人体不能合成的必需氨基酸，随着转基因技术与动物细胞工程结合和发展，我国首次利用转基因和体细胞核移植技术成功培育了高产赖氨酸转基因克隆奶牛。其基本流程为：①构建乳腺专一表达载体，②表达载体转入牛胚胎成纤维细胞（BEF），③核移植，④重组细胞的体外培养及胚胎移植，⑤检测。下列说法正确的有（    ） A．将获得的高产赖氨酸的目的基因与含有乳腺特异性启动子的相应载体连接，构建基因表达载体 B．将表达载体通过农杆菌转化将含有目的基因的T-DNA，整合到BEF细胞核的染色体的DNA上 C．将转基因的BEF与去核卵母细胞用灭活的病毒激活形成重构胚，使其完成细胞分裂和发育进程 D．重组细胞体外培养至早期胚胎，将胚胎移入代孕母牛子宫，最终生出高产赖氨酸转基因克隆奶牛 30．（2025·河北·二模）图甲表示限制酶切割某双链DNA分子的图示，其中Y为某种限制酶，X表示切割的DNA长度，限制酶对应切点一定能切开。图乙表示图甲相应酶切产物电泳分离结果。下列相关叙述错误的是（　　） A．若经电泳分离后图乙没有相应电泳条带，则是PCR中延伸温度太高所致 B．由图可知，限制酶A、限制酶B分别酶切产生的黏性末端的碱基能互补配对 C．根据图乙中酶切电泳分离结果可推测，Y为限制酶B，X长度为4500bp D．限制酶A酶切电泳结果与图乙中的①相符，限制酶B酶切电泳结果与图乙中的②相符 31．（2025·江西南昌·二模）传统抗蛇毒血清（抗体）生产成本很高，对蛇毒毒素的疗效有限。研究人员利用AI技术从头设计蛋白质以中和蛇毒毒素，成功设计出两种能够有效中和神经毒素的结合蛋白。下列说法正确的是（    ） A．传统抗蛇毒血清的制备依赖于动物免疫反应，产量低、纯度低且特异性差 B．利用AI技术设计的神经毒素结合蛋白与传统抗蛇毒血清的化学本质不同 C．AI技术可以模拟和计算结合蛋白与蛇毒毒素的结合位点，预测蛋白结构 D．AI技术的运用大幅度缩短传统实验设计的周期，减少试错实验的耗材 32．（2025·黑龙江哈尔滨·二模）端粒学说是细胞衰老的假说之一，研究发现，端粒缩短与DNA复制方式有关。人体细胞内DNA复制部分过程如图所示。下列叙述正确的是（    ） A．图示体现了边解旋边复制、DNA半保留复制的特点 B．图示引物为短单链核酸，复制过程中会被酶切除，形成“空白”区域 C．PCR过程中用到的A酶具有耐高温的特点 D．据图可推测端粒缩短的原因可能与新合成的子链5'端变短有关 33．（2025·江西九江·二模）下图A、B所示为Ti质粒和含S基因的DNA片段及一些酶切位点，图中所示的限制酶切割位点及其所产生的末端都不相同。下列说法正确的是（    ） A．最好选用XbaⅠ和Hind Ⅲ切割含S基因的DNA片段和Ti质粒 B．PCR扩增S基因时，引物结合在S基因两条链的5'末端 C．S基因应插入到Ti质粒T—DNA的启动子与终止子之间 D．基因工程中使用的各种限制酶切割DNA所形成的末端都不相同 34．（2025·黑龙江·二模）皂苷是分布广泛且结构复杂的天然产物，具有多种生物活性。乙酰化是皂苷最常见的修饰之一，对提高其生物活性起着重要作用。皂苷乙酰化最有可能由酰基转移酶（ATs）催化，天然的ATs催化效率较低，研究人员利用蛋白质工程技术改良了ATs，大大地提高了其催化效率。下列叙述正确的是（　　） A．该技术不能通过直接改造ATs的结构来提高其催化效率 B．根据ATs的氨基酸序列就能准确推出相应的脱氧核苷酸序列 C．该技术的实施需要限制酶、DNA连接酶以及载体等工具 D．该技术难度很大，因为蛋白质发挥功能必须依赖复杂的空间结构 35．（2025·江苏淮安·二模）关于“DNA 片段的扩增及电泳鉴定”实验，下列说法正确的是（　　） A．根据 DNA 片段大小配置一定质量分数的琼脂糖溶液以便分离 DNA 分子 B．琼脂糖凝胶电泳中的缓冲液中含指示剂，其可以在紫外灯下被检测出来 C．实验中使用的微量离心管、枪头和蒸馏水等在使用前必须进行高压灭菌处理 D．扩增得到的 PCR 产物与凝胶载样缓冲液混匀后需缓慢注入加样孔以防样品飘散 三、解答题 36．（2025·北京朝阳·二模）学习以下材料，回答（1）～（5）题。 小环大威力：ecDNA在癌症发生和进展中的作用 细胞中可能由于染色体断裂和重新连接，形成游离于染色体外的环状DNA分子，称为ecDNA。细胞周期中，ecDNA复制后随机分配给两个子细胞。 含原癌基因的ecDNA的产生概率极低，但临床调查发现约17.1%的癌症患者癌细胞中存在携带原癌基因的ecDNA。为构建与癌细胞中类似的ecDNA，研究者将两段含loxP位点和标记基因的外源DNA插入12号染色体，再用Cre酶处理．使染色体中的一个片段脱落并环化，形成含原癌基因MDM2的ecDNA（图1）。 处理后同时发出绿色和红色荧光的细胞即为含有/ecDNA的细胞，称为ec细胞。研究者对ec细胞进行传代培养，发现其后代中丢失绿色荧光的细胞比例逐渐增加。推测由于细胞分裂中ecDNA随机分配，产生不含ecDNA的子细胞，且这些子细胞在适宜环境中继续增殖；如果培养环境改变为ecDNA能为细胞带来更强适应能力的环境，则子代中ec细胞比例会增加，ec细胞中ecDNA的拷贝数也会增加。为检验假设，研究者将上述ec细胞分别放在含不同浓度潮霉素的培养基中培养，结果表明，潮霉素处理能够增加子代中ec细胞占比和ec细胞中ecDNA拷贝数。 为进一步研究ecDNA在体内的作用，研究者在小鼠肝细胞中诱导生成含有MDM2基因的ecDNA。小鼠肝脏中迅速出现癌细胞，形成肿瘤。 ecDNA的工程化构建为研究其致癌机制提供了新工具，未来有可能成为癌症精准治疗的靶点。 (1)eeDNA缺少着丝粒，因此复制后的ecDNA不能在 的作用下均分给两个子细胞。 (2)ecDNA的染色质状态更开放，其上的MDM2基因表达量 ，能促进细胞癌变和已癌变细胞的增殖。 (3)研究者进行外源DNA插入操作后，用含 的培养液筛选出成功插入的细胞。 (4)Cre酶可以将DNA上两个相同loxP位点之间的片段切割后环化（图2）。用Cre酶处理已插入片段1和片段2的12号染色体（图3），产生图1所示ecDNA。请写出片段2上各字母代表的表达元件。 (5)请根据潮霉素培养实验和小鼠肝细胞诱导实验推测携带原癌基因的ecDNA在癌细胞中广泛存在的原因 。 37．（2025·山东·二模）水稻中WRKY基因编码的WRKY是一种由60个氨基酸残基组成的转录因子，与水稻细胞的RABZ1基因启动子结合，调节RABZ1基因的表达，从而影响水稻的抗旱能力。科学家欲探究WRKY对RABZ1基因表达水平的影响，进行了相应实验。已知W-box是RABZ1基因启动子区域的一段DNA序列，是WRKY结合的位点。HA蛋白为标签蛋白，可通过抗HA抗体对目标基因的表达情况进行检测。请完成下列问题。    (1)若WRKY基因的b链为转录的模板链，结合图1分析，为使该基因与载体定向连接，需要使用的限制酶是 。 注：HPT基因是潮霉素磷酸转移酶基因。能解除潮霉素对细胞的毒性 (2)研究人员根据RABZ1基因上游的启动子序列设计了F1、F2、R1、R24种备选引物，用于扩增含有W-box的调控序列，如图2所示。为选出正确和有效的引物，以RABZ1基因上游的启动子序列为模板进行PCR扩增，将扩增产物进行电泳结果如图4所示。 利用PCR获取RABZ1基因上游的W-box序列应选择的引物组合是 。为将RABZ1基因上游的W-box序列定向接入载体中，两种引物还应做如何设计？ 。据图分析设计不成功的引物和特异性差的引物分别是 。 (3)欲检测WRKY对RABZ1基因表达水平的影响，应先在含 的培养基中培养受体细胞，再利用抗HA抗体检测细胞中相应蛋白的含量。仅据此依然无法得出WRKY对RABZ1基因表达水平的影响，原因是 。 (4)探究WRKY对RABZ1基因表达水平的影响时，是否能选择水稻细胞作为受体细胞？ （填“是”或“否”），原因是 。 38．（2025·江苏·二模）人类血液中的纤维蛋白原是血液凝固的主要蛋白质成分，由Aα、Bβ和γ三条肽链组成，重组人纤维蛋白原（rFib）的开发有望消除血源性感染的风险。某科研团队欲通过培育转基因蚕并利用蚕茧高效生产人纤维蛋白原，流程如下图。请回答下列问题。    (1)纤维蛋白原的Aα、Bβ和γ链首先在 上合成，然后Aα和γ链在内质网中与Bβ链结合形成的六聚体Aα2Bβ2γ2，最后在 中加工修饰并分泌到细胞外。 (2)选取从人类肝脏的cDNA文库扩增目的基因的原因是 ；步骤①PCR条件如下：94℃，5min→25个循环（变性、退火、延伸）→72℃，7min，其中退火温度设置需参考引物中碱基的 ，延伸阶段使用ExTaqDNA聚合酶，该酶的作用有 和在扩增产物的3'端额外添加上一个碱基“A”。 (3)步骤②中，将Fib-Bβ插入到 （填“3'”或“5'”）端含有碱基T的克隆载体中，将克隆后的Fib-Bβ用 限制酶处理后通过DNA连接酶连接到表达载体上完成载体1的构建。载体2采用类似方法构建。 (4)步骤③分别将载体1和载体2注入胚盘期蚕卵中，在荧光体视显微镜下观察 在眼部的表达，显示阳性表达的即为转基因Bβ-蚕和转基因Aα/γ-蚕。对转基因蚕进行DNA杂交分析表明，Bβ-蚕和Aα/γ-蚕均存在多个转基因品系，这可能与插入的目的基因数量和 有关。 (5)丝胶蛋白启动子将重组纤维蛋白原链的cDNA定向表达在丝腺细胞中，然后依靠吐丝分泌到蚕茧中。科研人员对丝腺细胞中的mRNA进行检测并对蚕茧中的蛋白质进行分析，结果如下表。 组别 mRNA 蛋白质电泳条带 Aα链mRNA Bβ链mRNA γ链mRNA Aα Bβ γ 非转基因蚕（对照组） - - - - - - 转基因Bβ-蚕 - + - - - - 转基因Aα/γ-蚕 + - + + - + 转基因Aα/Bβ/γ-蚕 + + + + + + 注：“+”表示有，“-”表示无 根据实验结果推测， 可能是Bβ链分泌到蚕茧中的必要条件之一。 39．（2025·山东泰安·二模）研究人员从麻疯树油中筛选出能产生脂肪酶（LA）的两种菌株。菌株1产生的LA1酶可耐高温，菌株2产生的LA2酶具有高催化效率，且LA1基因和LA2基因具有93%的同源性。研究人员采用交错延伸PCR技术获得了重组LA基因，生产出了更高效的酶。 (1)交错延伸PCR技术具体流程如上图（图中仅显示其中一条链延伸情况）。该技术采用LA1、LA2均做模板，起始所需引物相同，引物作用是 。已知过程①起始引物片段均为25个核苷酸，TaqDNA聚合酶延伸速度为1200个碱基/min，本实验的循环扩增条件为：变性30s、复性15s、延伸15s，经过80轮交错循环后，可获得PCR混合产物。第二轮循环后所得重组型子链长度为 个核苷酸。 (2)获得的重组LA基因中，同时只有LA1和LA2基因序列的原因是 。 (3)过程②用到的PM质粒中A为启动子、B为氯霉素抗性基因cat、C为终止子、D为asd-突变基因、E为复制原点，箭头处指不同限制酶的识别位点。asd基因是编码细菌细胞壁的主要成分DAP合成途径的关键酶，asd基因缺失时，将导致菌株生长对DAP依赖。为使目的基因定向插入PM质粒，交错延伸PCR过程中引物的5'端需引入 酶的识别序列。为便于目的基因的检测和鉴定，过程③中应采用asd基因 的受体菌。从含有PM质粒、重组PM质粒的受体菌中将含有重组PM质粒的受体菌筛选出来的思路为 。 40．（2025·山东德州·二模）水稻是二倍体植物，其雄性不育性状由隐性基因控制。科研人员利用图中3个目的基因和质粒构建重组质粒，并将其导入雄性不育水稻中，培育出仅一条染色体上含有目的基因的植株M。植株M自交能产生固定比例的雄性不育株。已知A基因可以恢复雄性不育水稻产生花粉的能力，B基因能阻断淀粉储藏使花粉失活，因而能有效阻止转基因花粉的传播。 (1)仅用一种限制酶切割会使A基因以两种不同的方向插入质粒，但A基因的表达产物相同，据图分析原因是 。 (2)据图分析，将A、B基因插入质粒时，应先插入 （填“A”或“B”）基因，理由是 。通过农杆菌转化法将重组质粒导入雄性不育水稻的细胞，应选择添加 的培养基筛选出转化成功的受体细胞。 (3)植株M产生的花粉中不含目的基因，原因是植株M形成花粉时，启动子b在 （填“减I”或“减II”）末期启动了B基因的表达。据此推测，植株M自交，后代的表型及比例为 。 (4)已知启动子c为胚乳细胞中特异性表达的基因的启动子，miRNA基因产生的miRNA可抑制淀粉酶基因的表达，影响种子的透明度。为便于在种子时期即可筛选出雄性不育株，在培育植株M时，科研人员将启动子c与miRNA基因连接，并使之随A、B基因一起导入水稻细胞。据此推测，引入启动子c及miRNA基因的作用分别是 。 41．（2025·内蒙古·二模）柿子的涩味程度与苯丙烷代谢关键酶基因（PAL）的表达情况有关。为筛选PAL基因调控蛋白，科研人员利用质粒B和质粒H（如图）进行了相关研究。请分析回答下列问题： (1)启动子区段除含有RNA聚合酶识别位点外，还存在调控蛋白结合位点，两者通过影响 过程决定基因的表达强度。 (2)由于PAL基因启动子序列未知，为扩增PAL基因启动子所在区段，需用限制酶切割基因组DNA后，通过 酶将已知序列信息的接头片段连接到PAL基因启动子上游，随后根据接头片段和PAL基因编码区序列设计引物进行PCR。扩增时使用的耐高温DNA聚合酶能催化脱氧核苷酸连接到引物的 端。 (3)利用质粒B构建含PAL启动子的重组质粒并导入亮氨酸缺陷型酵母菌，需用不含 的培养基筛选成功转化的酵母菌Y2。将柿子的不同cDNA片段分别插入质粒H的位点 （填编号1~5），理由是 ，从而获得重组质粒H1、H2……。 (4)将重组质粒H1、H2……分别导入酵母菌Y2，并将其分别接种到含 的培养基中培养。若Y2能生长，则说明该cDNA表达的蛋白与AD蛋白结合形成了融合蛋白，并与PAL启动子结合，激活 基因表达，赋予酵母菌抗性。 42．（2025·北京东城·二模）癌症是人类健康的重大威胁之一，传统治疗手段难以实现精准治疗。超声波具有非侵入、组织穿透性强、时空特异性等特点，科研人员拟开发“响应超声波的药物递送系统”细菌以实现癌症的精准治疗。 (1)用于培养药物递送细菌的液体培养基中包含水、酵母提取物、蛋白胨等成分，其中蛋白胨主要为细菌提供 和维生素。可利用 的方法快速直观地测定细菌数量，以便即时使用适量的细菌进行治疗。 (2)C蛋白有抗肿瘤作用，超声波可导致局部温度升高到42℃。科研人员制备了工程菌1，其中含有图1所示的基因表达载体。37℃培养的工程菌1接受超声波刺激后，可升温至42℃， 从而发挥抗肿瘤作用。 (3)T蛋白有T1、T2和T3三种亚型，具有相似的功能，制备分别含有这三种基因的工程菌1，并检测C蛋白表达量，结果如图2所示。科研人员最终选择T3基因进行后续研究，判断的依据是 。 (4)工程菌1只能在超声波刺激期间发挥作用，科研人员设计了含图3所示的基因表达载体的工程菌2，可以实现在短时间的超声波刺激后维持长时间的治疗。已知B基因编码的B酶可以作用于识别位点a和b，使a、b处的DNA发生断裂，最终导致a、b之间的DNA片段发生倒转。请根据以上信息，使用下列选项将表达载体补充完整。 ； ； ； ； 。 ①P1启动子    ②P3启动子（持续表达型启动子） ③T3基因    ④C基因    ⑤B基因 43．（2025·江西上饶·二模）反刍动物的瘤胃中含有分解纤维素的微生物，科研小组从瘤胃中分离培养分解纤维素的微生物的流程如图1所示。请回答下列问题： (1)筛选、培养纤维素分解菌需要以纤维素为唯一的碳源，同时还需要 （答3点）等营养物质，从功能上分析，该培养基属于 培养基。 (2)科学家筛选出某微生物的W基因可编码一种高效降解纤维素的酶，提取该微生物的基因组DNA，利用PCR技术将W基因特异性扩增出来的关键是 ，扩增时复性的温度如果过高可能出现的结果是 ，扩增出的W基因需要利用电泳进行鉴定，鉴定的结果发现有多条条带，从引物设计或温度控制的角度分析，可能的原因是 （答1点）。 (3)如图3所示，已知图中W基因转录方向是从左向右，W基因转录的模板链是 。结合图2及图3，解释KpnI酶不可用的原因： 。 44．（2025·广东汕头·二模）野生型水稻（WT）的OsJRL基因突变株具有更强的抗寒性。研究人员围绕OsJRL蛋白的分布、OsJRL基因对水稻表型的影响及其作用机制等方面开展研究。回答下列问题： (1)绿色荧光蛋白基因（gfp）表达的GFP蛋白对细胞无毒性，且不会干扰细胞的代谢和功能。将OsJRL基因与gfp基因连接在同一载体并导入水稻细胞，检测到水稻细胞 ，说明OsJRL蛋白分布在细胞核和细胞质。 (2)通过转基因技术培育OsJRL基因敲除水稻植株（KO）和OsJRL基因过表达植株（OE）。可通过替换OsJRL基因上游的 序列得到OE。若用PCR检测两种实验材料是否构建成功，所设计的这对引物需具备 的特点。三种水稻幼苗经5℃处理一段时间后，检测植株的存活率，结果见下表： 温度植株 存活率% 时间d 室温 5℃ WT KO OE WT KO OE 5 100 100 100 98 100 98 10 100 100 100 68 75 43 15 100 100 100 25 68 14 实验结果说明 可以提高水稻的抗寒性。 (3)寒冷使细胞活性氧（ROS）增多，加速细胞衰老。检测发现，KO植株具有最高的苯丙氨酸解氨酶（PAL）活性和最多的类黄酮积累，ROS水平最低。而OE植株的ROS最高，PAL活性和类黄酮含量最低。请在图的①~③选填“促进”或“抑制”，完善OsJRL基因调控水稻抗寒能力的机制。 ① ；② ；③ 。 45．（2025·山东泰安·二模）土壤盐渍化影响水稻生长发育，将水稻耐盐碱基因OsMYB56导入不耐盐碱水稻中，培育耐盐碱水稻新品种，其操作流程及可能用到的限制酶如图，其中Bar为抗除草剂基因，Tetr为四环素抗性基因，Ampr为氨苄青霉素抗性基因。①～⑦表示操作过程。 限制酶 BamH I BclI Sac I 识别位点及切割位点（5’→3’） -G↓GATCC- -T↓GATCA- -GAGCT↓C- (1)过程①利用反转录PCR以 为模板扩增获得cDNA，过程②利用cDNA为模板扩增OsMYB56基因时使用的两种引物的序列为（从5’端向3’端方向写出前10个碱基） 。 (2)根据基因表达载体的结构组成分析，Ti质粒中CaMV35S的功能是 。基因表达载体中，OsMYB56基因和bar基因编码链的方向 （填“相同”或“相反”），其中Bar基因转录的模板链为 （填“a链”或“b链”）。 (3)过程③应选用限制酶 切割质粒；过程④中筛选含有重组质粒的根瘤农杆菌时应先使用含 的培养基筛选，再使用含 的培养基；过程⑤应在含 的选择培养基上筛选；过程⑥ （填“需要”或“不需要”）给予光照；过程⑦若要检测OsMYB56基因是否转录，分子水平可采用的技术有 。（答出一种即可） 46．（2025·江西赣州·二模）水蛭是我国传统中药材，主要药理成分水蛭素（由65个氨基酸组成的单链多肽）为水蛭蛋白中的重要成分，具有良好的抗凝血作用。研究人员拟通过蛋白质工程改造水蛭素，提高其抗凝血活性。请回答下列问题： (1)蛋白质工程基本思路如下图所示，物质a是 ，物质b是 。要对水蛭素的结构进行设计改造，最终必须通过 来完成。 (2)若通过发酵工程利用大肠杆菌生产水蛭素，则一般先用Ca2+处理大肠杆菌细胞，目的是 ；若通过乳腺生物反应器生产水蛭素，请写出简要操作步骤： 。 (3)利用 （填“大肠杆菌”或“乳腺生物反应器”）生产的水蛭素活性更高，原因是 。 47．（2025·江苏南京·二模）研究显示Gata3基因是大量肿瘤细胞的潜在突变位点，Gata3蛋白由444个氨基酸构成。为研究Gata3蛋白在细胞中的定位，科研人员将GFP（绿色荧光蛋白）基因与Gata3基因融合，构建基因表达载体转入小鼠受精卵，并整合到受精卵的染色体上，每个受精卵只导入一个目的基因，获得能正常表达融合蛋白的杂合雌、雄小鼠各一只。荧光蛋白成像系统显示两只小鼠均为Gata3-GFP融合基因阳性转入小鼠。相关限制酶识别序列及限制酶识别位点如图所示，A、B、C、F、R为不同引物，回答相关问题： (1)Gata3 基因编码区的碱基数量为 个。 (2)为了使GFP基因能正确插入载体中，在利用PCR扩增GFP编码区序列的过程中，需要设计引物的F和R分别为 。 ①5'-CCCGTCGACTTCATGCTTGATATGCCAATC-3' ②5'-CCCGTCGACAAAAACACTTTTTGATATTCG-3 ③5'-CCCCTCGAGTTCATGCTTGATATGCCAATC-3' ④5'-CCCGAATTCTTCTAGTCGACCACAAGAAG-3' (3)在构建Gata3基因与GFP 基因的融合基因时，应将 基因中编码终止密码子的序列删除，目的是 。 (4)在GFP基因的扩增及重组载体的构建过程中，使用的酶有 ，将酶处理过的目的基因和载体连接时，需要在低温环境中操作，原因是 。 (5)将实验获得的两只雌、雄杂合子小鼠（P）进行杂交获得F1若干，将体细胞中都含有两个融合基因的雌雄个体杂交，则F2中出现有荧光小鼠理论上约占 。 (6)为了确定目的基因插入到小鼠细胞中染色体上的具体位置，科研人员常用DNA分子原位杂交技术，分子杂交需使用特定序列的单链DNA（ss-DNA）作为分子探针。为制备大量单链DNA片段，研究人员常采用不对称PCR技术。若反应体系中原有50个模板DNA，最初10个循环后限制性引物耗尽，再进行20个循环，理论上可制备ss-DNA （用科学计数法计数）个。 (7)研究人员从荧光小鼠中提取含融合基因的相关DNA片段，若用引物A和B进行PCR扩增，但没能扩增出GFP基因，从PCR操作过程中温度控制角度分析，可能的原因有 （至少写2点）。 (8)对荧光小鼠用荧光蛋白成像系统检测，相较于传统的物质提取、体外测量方式，引入荧光蛋白传感器测量荧光蛋白的优点是 。 48．（2025·福建龙岩·二模）人肺特异性X蛋白（LUNX）基因是某种肺癌诊断的标志物，增强子是基因转录的调控序列，对启动子具有促进作用。为了研究LUNX基因的增强子发挥作用的最佳位置是位于启动子的上游还是下游，科研人员从人类全基因组序列数据库中筛选并扩增了3个LUNX基因增强子片段（En，表示E1~E3），分别将每个En片段定向连接到pGL3载体中荧光素酶报告基因（luc+）启动子（SV40启动子）的上游或SV40终止序列的下游，通过检测荧光素酶的活性从而对增强子的功能进行判断。luc+的表达强度越强，荧光素酶的活性越高。相关信息见下图，回答下列问题。 (1)PCR每次循环一般可以分为 三步。在上述实验的PCR反应体系中共需要设计 种引物；为了定向连接到pGL3载体中，在引物5'端需要引入的限制性酶切位点有 种。 (2)将以上获得的En经酶切后分别定向连接到用对应限制酶处理的pGL3载体中，构建重组载体，利用相关实验技术对荧光素酶活性进行检测，结果如图所示。 ①根据结果得出的结论是 。 ②据图判断，对luc+表达促进作用最大的增强子的引物5'端需添加 限制酶的识别序列。 (3)半夏蛋白具有抗肿瘤等作用，科研人员提取半夏块根细胞中总RNA，纯化获得mRNA，后在逆转录酶的作用下获得不同大小片段的半夏蛋白cDNA。构建高效表达半夏蛋白的重组质粒是利用基因工程实现大规模生产半夏蛋白的核心工作，人员甲设想如下：根据实验室现有质粒A的限制酶识别位点，在E1增强子引物的5'端添加相应的限制酶识别序列，以此为引物，进行PCR扩增，得到足够数量的半夏蛋白cDNA，再与质粒A拼接，从而获得高效表达半夏蛋白的重组质粒，再进行后续实验。按此设想，甲进行了PCR、电泳操作，结果无相应条带出现，判断是扩增失败了。经检查，PCR所用的缓冲液、dNTP、Taq酶均正常，PCR操作程序正确，请分析扩增失败原因并提出改进措施： ①失败原因： 。 ②改进措施： 。 49．（2025·河北张家口·二模）抗菌肽指昆虫体内经诱导而产生的一类具有抗菌活性的碱性多肽物质，抗菌肽具有选择性免疫激活和调节功能，对败血症有良好的预防和保护作用。如图为培育转抗菌肽基因奶牛的示意图。回答下列问题： Xho I 5'-C↓TCGAG-3' Sal I 5'-G↓TCGAC-3' Mbo I 5'-↓GATC-3' Bam H I 5'-G↓GATCC-3'    (1)据图可知，用限制酶 切割质粒，用DNA连接酶连接质粒和被限制酶切割后的抗菌肽基因，目的基因能正常转录，由图可知，转录的模板链为 （填“a链”或“b链”）。 (2)图中②为PCR技术，PCR反应缓冲溶液中一般要加入Mg2+，其原因是 ，子链DNA的延伸方向为 （用5'和3'表示）。 (3)去核卵母细胞去核的实质是去除 ，图中过程⑥可用物理或化学方法如 激活重构胚，使其完成分裂和发育进程发育为早期胚胎。 50．（2025·山东日照·二模）研究人员利用纤维素生产菌(酪氨酸合成缺陷型)合成了黑色纤维素薄膜。蛋白T7RNAP是一种噬菌体RNA聚合酶(T7RNAP的N端或C端单独存在时不能发挥作用，二者结合可形成完整的T7RNAP)，nMag和pMag是在蓝光环境下能够相互结合的两种光敏蛋白。研究人员通过PCR技术获融合基因，并将不同类型的启动子与相关基因连接，构建成基因表达载体，然后将其导入受体菌，获得了所需的工程菌。 (1)研究人员利用PCR技术实现编码T7RNAPN端的基因下游序列与编码nMag的基因上游序列的无缝连接，获得编码T7RNAPN端-nMag的融合基因，由图1可知，引物2的5＇端9个碱基序列为5＇ 3＇，如此设计引物2的目的是 。用同样的方法获得编码pMag-T7RNAPC端的融合基因。    (2)通用型启动子能够被纤维素生产菌的RNA聚合酶识别，结构完整的T7RNAP对T7启动子表现出高度的特异性。为获得蓝光诱导着色的纤维素生产工程菌，构建了下图所示的基因表达载体，图中3个启动子中，表示通用型启动子的是 (填序号)，表示T7启动子的是 (填序号)。    (3)将构建好的载体导入纤维素生产菌前，通常用 处理受体细胞。为筛选出能够生产黑色纤维素薄膜的工程菌，培养基中应添加 。 51．（2025·河北石家庄·二模）农业生产中大量使用有机磷农药导致水体遭到了严重的污染。研究人员将源于施氏假单胞菌YC-YH1的降解酶基因mpd和ophc2插入苦草（一种沉水植物）染色体中，让转基因植物降解水体中的有机磷农药。下图是获得转基因苦草的基因工程操作程序，图1所示基因mpd和ophc2与引物结合位点及模板链分布情况。请回答下列问题： (1)现需将基因mpd和ophc2通过PCR技术进行扩增，在扩增基因时，需要根据 设计特异性引物序列，引物的作用是 。 (2)据图分析，将基因mpd和ophc2拼接成融合基因，基因mpd的a链的5端与基因ophc2的 （填“a链”或“b链”）的3端相连，理由是 。 (3)利用基因工程获得转基因植物的核心步骤为： ，据图2分析，该过程需要选择限制酶 切割融合基因。 (4)将受体细胞接种到添加卡那霉素的培养基中进行培养，卡那霉素的作用是 ，将筛选出的受体细胞经组织培养获得植株，但成功导入融合基因的植株不一定能降解有机磷农药，原因是 。 52．（2025·江西萍乡·二模）“中国辣都”萍乡，人人喜食辣椒，家家喜种辣椒。辣椒栽培过程中易受辣椒疫霉菌侵染导致减产，某科研团队发现其体内的 CaSBP08 基因是一个能被辣椒疫霉菌利用的感病基因，该团队欲通过 CRISPR/Cas9 技术实现对辣椒 CaSBP08 基因的特异性敲除，培育出抗疫霉辣椒。 CRISPR/Cas9 系统通过具有序列特异性的向导 RNA（sgRNA）引导 Cas9 蛋白靶向结合到目的基因的特定区域，并对其进行切割。回答下列问题： (1)Cas9 蛋白与基因工程中使用的 酶功能相似，二者的区别主要体现在 。 (2)该团队在 CaSBP08 基因中找到的靶序列为 5’ -ATGCCA……GTACCG-3’，则根据该靶序列设计的 sgRNA 序列应为：5’ - -3’。 (3)为保证 sgRNA 基因与下图中的 Ti 质粒准确连接，科研人员人工合成了 sgRNA 基因，sgRNA 基因两条链碱基序列应该是 （填字母）。 A．5’ -GAATTCCCCGTAC… TGGCATGGTACC-3’     B．5’ -GGTACCCCGTAC……TGGCATGAATTC-3’ C． 5’ -GGTACCATGCCA…. GTACGGGAATTC-3’     D．5’ -GAATTCATGCCA…… GTACGGGGTACC-3’    Ti 质粒中用到了 U6、CMV 两个启动子，而不共用一个启动子的目的是 。 (4)该团队利用辣椒植株花序直接浸没在含有重组质粒的农杆菌溶液中一段时间，然后培养植株并获得种子。与农杆菌直接侵染植物叶片相比，该技术可以不需要经过 过程即可获得转基因植株。 (5)播种收获的种子，一段时间后，可以使用 筛选成功转化的辣椒植株，并通过 的方法对其进行个体水平鉴定。 53．（2025·甘肃白银·二模）L-乳酸和D-乳酸是同分异构体，前者作为一种食品酸味剂，被广泛应用于食品加工中，后者却会导致人体中毒。为了去除廉价发酵原料中的D-乳酸，从而提高发酵最终产物L-乳酸的光学纯度，研究者通过构建带有不同厌氧诱导启动子（pflBp6、pnirB、pflBp6-pnirB）的D-乳酸脱氢酶基因（dld）的表达质粒（如图1所示），并将其分别转入产L-乳酸的大肠杆菌HBUT-L，以期加强其在发酵产L-乳酸的同时消除外源D-乳酸的能力。回答下列问题： (1)图1中各质粒的启动子可在 条件诱导下被激活，从而发挥 的作用。相比于普通启动子（无须诱导就有活性），使用诱导型启动子的优点是 。    (2)研究者构建的重组质粒pUC19-pflBp6-pnirB-dld包含2个启动子，其目的可能是 ；构建重组质粒后，为了确定重组质粒是否构建成功，需进行PCR检测。若每种重组质粒的PCR检测仅使用一对引物，则检测pUC19-pflBp6-dld、pUC19-pnirB-dld、pUC19-pflBp6-pnirB-dld三种质粒应分别选择图1中的引物 。 (3)将重组质粒pUC19-pflBp6-dld、pUC19-pnirB-dld、pUC19-pflBp6-pnirB-dld分别转化至出发菌株HBUT-L中得到工程菌株HBUT-L2、HBUT-L3、HBUT-L4.转化成功后，在一定条件下检测各组D-乳酸脱氢酶活性，结果如图2.该结果表明带有启动子pflBp6、pnirB、pflBp6-pnirB的dld基因表达质粒都能有效提高菌株的D-乳酸脱氢酶活性，其中带 的dld基因表达质粒的提升效果最好。    (4)根据（3）中结果，研究者拟对菌株HBUT-L4的相关能力进行发酵验证，请简要写出验证思路： 。 54．（2025·安徽滁州·二模）γ-干扰素是水溶性二聚体细胞因子，具有抗病毒、抗肿瘤特性，并能调节免疫系统的功能。研究人员成功利用毕赤酵母表达系统实现了猪γ-干扰素的高效表达。毕赤酵母基因组中含有的AOXl基因所携带的甲醇诱导型强启动子。回答下列问题。 (1)利用PCR技术扩增猪γ-干扰素基因时，所使用的引物PL和引物PR是根据 设计的，还需要模板、4种脱氧核苷酸和 。综合图示分析，PCR时相应的引物在猪γ-干扰素基因中结合位置正确是 。 A．①处：PL、④处：PR  B．①处：PR、④处：PL C．②处：PL、③处：PR  D．②处：PR、③处：PL (2)将重组质粒通过一定的技术手段导入组氨酸（组氨酸是毕赤酵母生长所必需的氨基酸）合成缺陷型毕赤酵母菌株中，再置于不含组氨酸的毕赤酵母培养基中培养，以筛选出成功导入重组质粒的毕赤酵母，其原理是 。 (3)将所选菌株置于液体培养基中连续培养若干天，需要每隔24小时在培养基中加入甲醇，其目的是 ，同时也为毕赤酵母提供能量。一段时间后，对培养基进行离心，然后收集上清液，再用抗原—抗体杂交方法对上清液中的产物进行检测、鉴定。收集上清液的原因是 。 55．（2025·山西晋城·二模）花青素是一种水溶性色素，属于黄酮类化合物，具有多种养生功效。如图是花青素合成酶基因（S）的cDNA（某种生物发育某个时期的mRNA经逆转录产生的互补DNA）和Ti质粒图，科学家欲利用二者构建基因表达载体，培育出花青素含量更高的蓝莓。回答下列问题: (1)利用PCR技术扩增S基因时，需要引物，引物是指 ，设计引物时引物的长度需要比计算出的长度长一些，原因是 。PCR扩增的产物进行电泳时，发现除了目标序列外还有很多非特异性条带，出现该现象的原因可能有 （答两点）。 (2)根据图1和图2分析，上述基因表达载体的构建中应选择限制酶 切割S基因的cDNA和Ti质粒，其目的是 。图2 Ti质粒中的抗生素抗性基因作为标记基因，可用于 。 (3)研究发现普通蓝莓细胞原有的花青素合成酶基因（ANS）与S基因存在同源区段，ANS基因的同源区段中除没有图3所示的靶点序列（长度为15 bp）外，其余序列均与S基因的同源区段相同，S基因的同源区段中只有一个靶点序列。为了筛选出花青素含量更高的蓝莓植株，科学家利用PCR技术进行检测，在S基因靶点序列前方距离100 bp长度选取一段序列合成上游引物A，靶点序列后方距离200 bp长度选取一段序列合成下游引物C，根据靶点序列合成上游引物B，如图3所示。利用上述三种引物对培育的转基因蓝莓和普通蓝莓的DNA进行PCR扩增及电泳分析，理论上讲，普通蓝莓的DNA扩增产物电泳后会形成长度为 bp的条带，符合要求的转基因蓝莓的DNA扩增产物电泳后会形成长度为 bp的条带。 56．（2025·江西·二模）生物燃料乙醇是重要的清洁能源。酿酒酵母是用作乙醇发酵的重要菌种,但因其本身跨膜转运木糖困难以及缺乏专一性的木糖代谢酶,故不能直接利用木糖进行乙醇发酵。我国研究人员对酿酒酵母进行改造,研究出木糖专用酵母。为了提高乙醇的产量,研究人员利用基因工程技术将基因与增强启动子相连,导入受体细胞中,观察工程菌的乙醇发酵情况,技术路线如下图所示,其中①~④代表PCR扩增引物,基因是亮氨酸合成基因,基因是尿嘧啶合成基因。回答下列问题: (1)酿酒酵母与果酒的制作密切相关,密闭瓶中的葡萄汁可发酵制作果酒,写出发酵过程的反应式 。葡萄酒制作完成后,对装有葡萄酒的瓶子的操作是 ,盖上一层纱布,控制温度条件,即可进行葡萄醋的发酵。 (2)酵母细胞质膜上的转运蛋白从合成到定位,与该过程密切相关的细胞器有 ,对酵母进行纯培养,配制的培养基通常采用 法灭菌。 (3)用于扩增基因的引物是 (选填图中编号),为了使基因与载体质粒有效连接,可以通过PCR技术在基因的上下游引入限制性核酸内切酶 的识别序列,再用对应酶切后通过DNA连接酶连接。 (4)制备工程菌b时,需要将重组质粒b导入尿嘧啶缺陷型酿酒酵母中,用以木糖为唯一碳源和缺少尿嘧啶的培养基进行筛选。据此,制备工程菌a时,需要将重组质粒a+重组质粒b导入 中,并用 的培养基进行筛选。 57．（2025·陕西汉中·二模）从正常人的血浆中提取的血清白蛋白（HSA）在临床上应用很广泛，有重要的医用价值。下图是通过相关技术获取重组HSA示意图，其中报告基因表达的产物能催化无色物质K呈现蓝色。据图回答下列问题： (1)若要体外获得大量的人血清白蛋白基因，采用PCR技术扩增目的基因时，在PCR反应体系中需加入引物，引物的作用是 ，若目的基因扩增3代，则共用引物 个。PCR完成以后，常采用 法来鉴定PCR的产物。 (2)过程①中需将植物细胞与农杆菌混合后共同培养，旨在让 进入植物细胞；除尽农杆菌后，还须转接到含 的培养基上筛选出转化的植物细胞。 (3)为检测HSA基因的表达情况，可提取受体细胞的蛋白质，用 进行抗原—抗体杂交实验。 (4)科学家培养出一种转基因山羊，其膀胱上皮细胞可以合成人血清白蛋白并分泌到尿液中。其培育方法中将重组质粒通过 法导入山羊的受体细胞时，常选用受精卵作为受体细胞的主要原因是 ，人血清白蛋白基因能在山羊膀胱上皮细胞中表达的原因是 。 58．（2025·辽宁·二模）（GLP-1（胰高血糖素样肽-1））是一种治疗2型糖尿病的药物，但是它在体内的半衰期很短。利用融合PCR技术通过将（GLP-1基因与人的血清白蛋白（HSA）基因融合并通过大肠杆菌表达，部分过程如下图所示，结果表明融合蛋白的半衰期显著延长，稳定性和疗效有所提高。请回答下列问题： (1)上述构建融合蛋白的技术属于 工程，其基础是了解GLP-1和HSA 及其与 的关系。 (2)融合PCR技术能够实现GLP-1基因和人的HSA基因能正确融合的主要原因是 。 (3)若融合基因的L链为转录的模板链，为保证融合基因和质粒正确连接，在设计引物 （填“P1”“P2”“P3”“P4”）时应分别在引物的 （填“5'”或“3'”）端加上限制酶 的识别序列。在PCR中，引物的作用是 。 (4)已知β—半乳糖苷酶可分解无色的X-gal产生蓝色物质，使菌落呈现蓝色，否则菌落为白色。将大肠杆菌接种到含 的选择培养基上，表现为 色菌落的即为目的菌。 59．（2025·山东聊城·二模）大豆中转录调控因子Y蛋白可以和某些基因启动子序列结合，促进其表达以增强大豆对干旱和盐胁迫的抗性。研究人员通过逆转录获得Y基因并将其下游终止密码子对应序列剔除，然后与载体上绿色荧光蛋白基因（GFP）进行拼接获得融合基因。成功 表达的Y-GFP融合蛋白可用于Y蛋白调控机理的研究。    (1)研究中首先要对Y基因进行PCR扩增。PCR反应要在一定的缓冲液中进行，缓冲液中一般需要加入Mg²+,其原因是 。图甲所示Y基因序列为转录的 （填“模板链”或“非模板链”）。已知EcoRI识别序列为5'-GAATTC-3'，BamHI识别序列为5'-GGATCC-3',这些限制酶识别序列不影响融合蛋白基因的表达。为使Y基因正确接入载体并成功表达出Y-GFP合蛋白，Y基因下游扩增引物应为5'- -3'（包括添加的限制酶识别序列，共写12个碱基）。 (2)将初步构建的Y-GFP基因表达载体转入大豆细胞后，对经潮霉素筛选得到的两个不同细胞系总蛋白进行抗体检测，电泳结果如图乙所示。其中细胞系 能成功表达出Y-GFP融合蛋白。 (3)为探究Y蛋白能否与S基因（大豆类固醇化合物合成的关键基因）启动子序列结合，用S基因启动子序列制作的探针进行相关实验，实验结果如图丙所示。已知Y蛋白与DNA序列结合后，可在凝胶电泳中产生阻滞条带。据图分析，Y蛋白 （填“能”或“不能”）与S基因启动子序列结合，相比于a条带， 条带放射性低的原因是 。 (4)过表达Y基因或施加外源大豆类固醇化合物均可显著增强大豆对干旱和盐胁迫的抗性。综上所述，Y蛋白增强大豆对干旱和盐胁迫抗性的机理是 。 60．（2025·宁夏银川·二模）酵母细胞表达系统是一种利用酵母菌作为宿主来生产重组蛋白的技术平台。土壤中存在产PG酶(增大蛋白质的溶解性)的金黄杆菌，研究人员设计了利用基因工程高效生产PG 酶的方案，流程如图1所示，相关限制性内切核酸酶的识别和切割位点如图2所示。回答下列问题：    (1)过程①应用了 PCR 技术，利用PCR 技术扩增时，需要 种引物，引物的作用是 。一般还需要往PCR反应缓冲液中加入Mg²⁺，其原因是 。PCR反应过程可在 PCR 扩增仪中自动完成，而后常用 来鉴定PCR 的产物。 (2)完成过程②需要先将PG酶基因与pPIC9K 质粒重组，据图分析，该过程中最好选择限制酶 切割。 (3)结合图中过程③分析，将重组质粒导入大肠杆菌内的目的是 。过程④中将重组质粒酶切后，整合在酵母菌染色体上。 61．（2025·天津河北·二模）东北酸菜是白菜经腌制而成的传统食品。发酵过程中若霉菌等微生物大量繁殖会导致酸菜腐败发臭。研究人员从酸菜中分离出具有抑菌活性的乳酸菌，该类乳酸菌因能分泌新型细菌素（多肽）而具有抑菌活性。为获得细菌素表达量更高的工程菌用于生产，进行了相关研究。回答下列问题。 (1)乳酸菌产生的乳酸能溶解碳酸钙而产生溶钙圈。研究人员为从市售多个品牌的酸菜中分离纯化乳酸菌，配制含有碳酸钙的固体培养基，利用 法对该培养基进行灭菌，并采用 法将酸菜液接种到培养基中，选择有溶钙圈的菌落并继续进行纯培养，选择对霉菌抑菌率高的菌株进行后续操作。 (2)研究人员从上述乳酸菌中提取细菌素基因，将其导入受体菌，再对受体菌做进一步的检测与鉴定。如图是细菌素基因及构建的基因表达载体的示意图。 ①利用PCR技术扩增细菌素基因时，应选择的一对引物是 ，PCR过程中，经过4轮循环，消耗引物的个数是 。 ②若以细菌素基因甲链为转录的模板链，为构建基因表达载体，应在与甲链结合的引物的5'端加入 （填“BamHI”或“NdeI”）的识别序列。 ③转化操作后提取受体细胞中的DNA，并利用选择的引物进行扩增，再对扩增产物进行电泳检测，结果如下图。 电泳结果表明 。 62．（2025·吉林·二模）低温是限制农作物产量的重要胁迫因子。科学家将寒带植物中的抗寒基因CBFs转移到拟南芥中构建拟南芥耐寒模型，用于植物低温胁迫机制的相关研究。回答下列问题：         限制酶 识别序列 EcoR I 5'G↓AATTC 3' BamH I 5'G↓GATCC 3' Sph I 5'CGTAC↓G 3 Sau3A 5'↓GATC3 Xma I 5'C↓CCGGG 3' Asc 1 5'G↓GCGCGGG 3' Mun I 5'C↓AATTG 3 (1)植物的生长发育的调控，是由基因表达调控、 和环境因素调节共同完成的。 (2)设计引物克隆目的基因。如图所示应选择引物 对CBFs基因进行克隆，为了后续能将目的基因正确连接到载体上，应在CBFs基因上游引物的5′端添加 （“SphⅠ”或”Sau3A”或“MunⅠ”）识别序列。 (3)根据图示Ti质粒的结构，应选用限制酶 切割Ti质粒，并通过 酶进行连接，连接后导入农杆菌，在培养基中添加 来筛选成功导入质粒的农杆菌。 (4)将拟南芥叶片浸泡在转基因农杆菌菌液中一段时间对其进行转化，然后提取叶片中的DNA，通过PCR对CBFs基因是否整合到拟南芥基因组中进行检测，结果如下图所示，该转基因叶片的基因组中可能已整合CBFs基因。PCR结果中显示出小分子非目标条带，产生的原因可能是 A．引物特异性不佳 B．复性温度太高 C．变性温度不够 (5)现已获取成功转入CBFs基因的拟南芥植株，利用 技术对其进行检测，结果表明转入CBFs基因的拟南芥植株没有表达出相应的mRNA。后续还应通过改变 ，以利于RNA聚合酶与之识别和结合，进而实现CBFs基因在拟南芥中的转录。 63．（2025·四川达州·二模）茄子的花为两性花，其花和果皮因富含花青素而呈紫色，花青素的合成由两对等位基因A/a、B/b控制。为揭示茄子花青素合成的遗传机制，科研人员用纯合白花白果甲与纯合白花白果乙杂交，结果如图。请据图回答下列问题： (1)根据F2中紫花与白花的比例为 ，可初步判定等位基因A/a、B/b位于 （填“一对”或“两对”）同源染色体上。 (2)由F2中紫果与白果的比例，可推测花青素的合成还与等位基因D/d有关，基因d不抑制花中花青素的合成， （填“抑制”或“不抑制”）果皮中花青素的合成。由此假设可推知F2的白花白果中纯合子所占的比例应为 。 (3)为验证上述假设是否成立，科研团队进行了以下实验： ①对图中的F1进行测交，发现子代表现型及比例始终为 ，说明假设成立。 ②选取图中F1植株和大量F2紫花白果植株，分别从2号、3号和6号染色体提取到A/a、B/b、D/d基因并进行凝胶电泳，出现如图所示的五类结果。 该电泳结果 （填“支持”或“不支持”）上述假设，其中基因 （选填电泳图谱中的数字1～6）代表基因d。 64．（2025·山西吕梁·二模）大豆是我国重要的油料作物和植物蛋白的主要来源，但盐胁迫会严重影响大豆植株的生长。研究人员欲将酵母菌细胞中的耐盐基因ENA1导入大豆体内以提高其耐盐性，如图为构建的基因表达载体的部分结构。回答下列问题：    (1)利用PCR方法从酵母菌基因组中扩增ENA1基因时需根据 设计引物，PCR反应体系中除加入ENA1基因、4种脱氧核苷酸等物质外，还需加入 酶。 (2)为了检测目的基因是否正向插入，可选用图中的引物 对其进行扩增，并对扩增产物进行电泳，若结果为 （填“获得扩增产物”或“未获得扩增产物"），则说明ENAI基因正向插入。 (3)将目的基因导入植物细胞常采用的方法为 ，得到转基因大豆植株后，研究人员对转基因大豆T2～T4代进行了PCR及电泳，实验结果如下图所示（1kb=1000bp）：    图中1组为标准对照组，2组为加水对照组，3组为加入野生型大豆DNA的PCR产物组，则4~7组为加入 组，已知ENA1基因扩增条带大小为550bp，Bar基因扩增条带大小为441bp，则图 表示扩增的基因为ENA1，连续三代PCR检测结果说明 。 (4)Bar基因为抗草甘膦基因，大豆在生长过程常喷洒草甘膦进行除草，推测该实验在转入ENA1基因的同时还转入Bar基因，目的是排除 。从分子水平检测转基因大豆体内目的基因是否完成了表达，可采用 方法。 65．（2025·四川达州·二模）为了提升猪瘟病毒疫苗的效果，科研人员构建了猪瘟病毒p30蛋白基因（p30）与白喉毒素无毒突变基因（CRM197A）的融合基因表达质粒，以生产融合蛋白疫苗。图1为质粒构建、疫苗生产以及效果测试示意图。请回答下列问题： (1)完成图1的过程②需要向反应体系中加入 酶。利用PCR技术扩增p30-CRM197A融合基因时，需要向反应体系中添加的引物是 （选填图中的F1~F4）。 (2)选用大肠杆菌作为受体细胞时，一般先用 处理大肠杆菌，使其处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态。图1中培养导入重组质粒的大肠杆菌时，采用的接种方法是 。 (3)筛选时，科研人员挑选了5个菌落，提取质粒后加入BamHI、HindⅢ酶切、电泳，结果如图2： ①可初步判断 号菌落的质粒中含有p30-CRM197A融合基因。 ②p30基因和CRM197A基因 （填“含”或“不含”）BamHI和HindⅢ酶切位点，理由是 。 (4)科研人员在检测上述菌落时发现某个菌落同时含有空载质粒和融合基因表达质粒，出现此现象的可能原因有： ①有些大肠杆菌同时导入了空载质粒和融合基因表达质粒： ②导入空载质粒的大肠杆菌和导入触合基因表达质粒的大肠杆菌在接种时未分散开，导致 。 (5)为检测融合蛋白疫苗的效果，科研人员将p30蛋白、p30-CRM197A融合蛋白分别注入小鼠体内，一段时间后检测抗体含量，结果如图3所示。据此可判定融合蛋白疫苗效果更好，依据是 。 66．（2025·黑龙江哈尔滨·二模）在2024年国际基因工程大赛全球总决赛中，中国农业大学代表队实现了在根瘤菌中生产高附加值的ω--3多不饱和脂肪酸 DHA 并因此荣获金牌，为全球可持续发展提供了新思路。已知 FADSI基因是控制ω--3多不饱和脂肪酸 DHA 合成的关键基因。下图1为质粒（大小3000bp）和 FADSI（大小300bp）示意图,  Tet'表示四环素抗性基因, Amp'表示氨苄青霉素抗性基因, BamHⅠ、 BclⅠ、 NotⅠ、Sau3AⅠ表示不同的限制酶，四种限制酶的识别序列及切割位点如下表所示（对应箭头指向位置为相应限制酶的切割位点，不考虑其他未知的酶切位点）。请回答下列问题：    限制酶 BamH Ⅰ Bcl Ⅰ Sau3A Ⅰ NotⅠ 识别序列及切割位点 (1)为了获取更多 FADSI 基因，可利用 PCR 技术对其进行扩增。为保证扩增效率，至少需加入 种引物。 (2)构建重组质粒时，技术人员仅使用了Sau3AⅠ一种限制酶以及 酶即实现了 FADSI基因与质粒的重新连接，原因是 。 (3)若 BamHⅠ酶切的 DNA 末端与 BclⅠ酶切的 DNA 末端连接起来,其连接部位的6个碱基对序列为 。 (4)为存储含 FADSI 基因的重组质粒，导入大肠杆菌，采用含有“氨苄青霉素”的培养基进行筛选，得到A、B两类菌落，则这两类菌落的质粒导入情况是 。研究者从两菌落中挑选出菌落1和2，提取质粒进行PCR扩增，利用Sau3AⅠ酶切后经电泳的结果如图2。推测图2中，菌株 可能就是目的菌株，理由 。    (5)相对于动植物，利用根瘤菌生产ω--3多不饱和脂肪酸 DHA 的优点 。（至少答出两点） 67．（2025·河南·二模）科研人员根据获得的红花转录因子基因（CtWRI1）的cDNA序列设计引物，通过PCR获得CtWRI1编码序列，并通过烟草遗传转化对其功能进行研究。图甲为实验过程中使用的Ti质粒图谱及T-DNA结构，其中Rifr代表利福平抗性基因，bar代表除草剂抗性基因，LB和RB分别代表T-DNA的左边界和右边界。图乙为不同限制酶的酶切序列和CtWRI1的结构及转录方向。 回答下列问题： (1)为了将CtWRI1编码序列与图甲中的Ti质粒正确连接，构建引物F和引物R时应在 端分别添加 的识别序列，通过酶切和连接后可获得连接产物。 (2)CtWRIl转录的模板链的序列为：5'-TTAGCCT……TACCGACAT-3'，请写出引物R的前10位碱基序列：：5'- -3'。 (3)通过 法将CtWRII编码序列导入烟草细胞，利用含 的培养基对烟草细胞进行初步筛选，再通过 技术获得转基因烟草。可以通过 等技术从分子水平上检测烟草细胞的染色体DNA上是否插入了CtWRI1编码序列。 (4)科研人员测定野生型烟草（WT）和转基因烟草中CtWRI1的相对表达量、脂肪酸合成基因的相对表达量和种子含油量，结果见图丙。据图丙分析，转基因烟草种子含油量增加的可能原因是 。 68．（2025·重庆·二模）隐花色素CRY是植物的蓝光受体。研究发现，其在蓝光作用下可与赤霉素信号转导通路中的关键蛋白GAI结合并提高其稳定性。为探究CRY蛋白的哪个部位可以与GAI蛋白发生相互作用，研究者分别构建了含CRY基因不同片段和GAI基因的表达载体。翻译过程中，肽链的合成方向是氨基端→羧基端(如图1)，GAI基因与载体结构信息如图2。      (1)PCR的每次循环一般可分为三步，其中理论温度最低一步的主要目的是 。 (2)研究发现，赤霉素通过对GAI蛋白的降解，来实现下游的信号调控，据此分析，蓝光照射下植物的株高将 (填“变高”或“变矮”)。 (3)为使表达出的GAI蛋白的氨基端带有一段标签短肽GST，在通过PCR技术扩增GAI基因时可采取的措施是 ，将所得修饰后的GAI基因和质粒构建基因表达载体(质粒1)导入大肠杆菌后，在含卡那霉素的培养基上筛选到多个抗性菌落，为检测菌落中是否携带GAI基因，将引物R₀、F₀、R₁、F₁共同加入反应体系后，分别以抗性菌落的DNA为模板进行PCR扩增后并电泳。理论上携带重组质粒的PCR产物电泳结果应出现的条带数目为 。若要确定GAI基因是否正确连入质粒，则可选用引物 进行PCR扩增，并电泳检验是否存在产物。 (4)分别扩增CRY蛋白的氨基端与羧基端基因，并利用上述的方法使其带有短肽标签His，获得重组质粒2和质粒3。将质粒1、2和3分别导入细胞，裂解细胞收集到三种蛋白，将不同蛋白分别通过带有His抗体的介质，洗脱丢弃未结合蛋白，利用抗原—抗体杂交的方法向介质中加入带荧光标记的抗 抗体，洗脱未结合抗体。若荧光检测结果如图3，则可确定与CRY蛋白可与GAI结合的区域是 。 69．（2025·四川广安·二模）干旱胁迫是限制作物产量和品质的一个重要影响因素。科研人员通过转基因技术将大肠杆菌的耐旱基因（mtlD）整合进玉米基因组，增强了玉米的抗旱性。据图回答问题。 限制酶 识别序列及切割位点（5'→3'） BamHI G↓GATCC BclI T↓GATCA SmaI CCC↓GGG (1)可采用PCR技术扩增目的基因，PCR扩增的原理是 。在反应体系中除加入模板、dNTP、含Mg2+的缓冲液外，还需要加入 。 (2)为了保证mtlD基因正确连接到质粒中以构建重组质粒，在设计mtlD基因的引物时，应在两种引物的5'端分别添加 限制酶的识别序列，请据此设计转录模板链的引物5'- -3'（含12个碱基序列）。酶切后的目的基因片段和质粒通过 （填“EcoliDNA连接酶”、“T4DNA连接酶”或“E-coliDNA连接酶或T4DNA连接酶”）进行连接。 (3)为检测mtlD基因是否成功插入质粒中，研究人员从受体菌中提取质粒，使用SmaI和 进行双酶切，通过电泳检测酶切结果，若电泳结果出现 个条带，则说明插入成功。 (4)从个体水平上检测耐旱基因是否在玉米体内正常表达，请写出鉴定方法 。 70．（2025·河南·二模）生长激素制剂是治疗垂体性侏儒症的特效药。人们从450升大肠杆菌培养液中提取的生长激素，相当于6万头动物的全部产量。图1是通过基因工程将人的生长激素基因导入大肠杆菌中生产生长激素的过程，图2是基因工程中所用到的质粒，图3是通过PCR获取和扩增目的基因。请回答下列问题：    (1)图1通过 过程得到目的基因A后，通过③过程进行PCR扩增。图1中基因工程的核心步骤是 （填序号）。 (2)若利用图3过程获取和扩增A基因，需要选择的一对引物是 。图3中的基因表达时， （填“a”或“b”）链作为转录的模板链。 (3)要使A基因能正确与图2中的质粒拼接在一起，需要在所选引物的 端分别增加相应的限制酶的酶切位点。分析图2和图3，为了防止目的基因的反向连接，可在目的基因的上、下游分别添加 （填限制酶名称）的识别序列。 (4)科学家将A基因与乳腺蛋白基因的启动子等重组在一起，导入性染色体组成为 的哺乳动物受精卵中，然后将其处理并输送入受体动物体内，使其生长发育成转基因动物，若该动物 ，则转基因动物培育成功。 71．（2025·黑龙江齐齐哈尔·二模）番茄不耐寒，低温易冻伤，难以储藏。我国科研人员从某种耐寒植物中提取了抗冻基因AtCOR15a，经过转基因技术获得转基因抗冻的番茄新品种，操作流程如图。回答下列问题： (1)与杂交育种相比，基因工程育种的优点有 （填序号）。 ①操作方法简便 ②目的性强，能定向改造生物性状 ③育种周期短 ④不受生殖隔离限制，能克服远缘杂交不亲和障碍 ⑤安全性高，对生态没有威胁 (2)获得图中①的过程称为 ，该过程使用的限制酶是 原因是： 。 (3)将①与用 处理的农杆菌混合，从而将目的基因导入农杆菌，最终整合到宿主胞的 上，该方法称为 。 (4)如果已知一小段DNA的序列，可采用PCR的方法，简捷地分析出已知序列两侧的序列，过程称为反向PCR，具体流程如下图（以EcoRI酶切为例） 若下表所列为已知的DNA序列和设计的一些PCR引物，选用的PCR引物序列必须是 引物①②③④中选择，填编号）。 DNA序列（虚线处省略了部分核苷酸序列） 已知序列 5'-AACTATGCGCTCATGA-GCAATGCGTAGCCTCT-3' 3'-TTGATACGCGAGTACT-CGITACGCAICGGAGA-5' PCR引物 ①5' -AACTATGCGCTCATGA-3'      ②5' -GCAATGCGTAGCCTCT-3' ③5' -AGAGGCTACGCATTGC-3'      ④5' -TCATGAGCGCATAGTT-3' (5)为了提高AtCOR15a基因在受体细胞的表达水平，可将AtCOR15a基因与外源强启动子连如下图所示。 利用PCR检测上述连接是否成功，可选择的引物组合是 （填序号组合）。（注：图中①、②、③、④表示引物） 72．（2025·河南郑州·二模）棉花是重要的经济作物，但其生长易受杂草和棉铃虫的侵害，从而造成减产。科学家成功构建了抗除草剂和抗虫双价植物表达载体pBI121-Bar/Bt（pBI121是Ti质粒，Bar是抗除草剂基因，Bt是抗虫基因），构建过程如下图所示，并通过农杆菌转化法获得了具有两种抗性的转基因棉花。请回答相关问题。 (1)Ti质粒pBI121中的35S序列属于 （填“启动子”或“终止子”），它的作用是 。据图分析，Bar基因插入MCS序列后，以 （填“α”或“β”）链为模板进行转录。 (2)请仿照图例在下图合适位置中标出MCS序列被酶切后产生的切口，以保证能成功构建重组质粒pBI121-Bar 。    (3)检测pBI121-Bar是否重组成功，通常要用到大肠杆菌，经Ca2+诱导后使其处于能 的状态，筛选时需向培养基中额外添加 （填物质名称），然后挑选平板上生长的单菌落，利用Bar基因两端序列制作的引物进行PCR，并采用 来鉴定PCR的产物。 (4)pBI121-Bar与Bt-4AB成功重组后，需导入农杆菌LBA4404中，该农杆菌含Vir基因，酚类物质可以诱导其表达。Vir基因表达的产物能识别Ti质粒的LB/RB序列，水解 （填化学键）将T-DNA剪切下来。 (5)农杆菌与棉花愈伤组织共培养时，T-DNA发生转移并整合到 。个体水平上检测时，可通过 来确定棉花是否具有抗性及抗性程度。 73．（2025·安徽合肥·二模）青岛假单胞菌P中存在的单加氧酶（alkB）基因是有效降解石油烃的关键酶基因。科研人员利用该基因按照如图1所示流程获得了优质大肠杆菌工程菌，进行石油污染物降解。回答下列问题。    (1)科研人员常从 的环境中获取青岛假单胞菌P。 (2)科研人员设计了一个PCR体系进行alkB基因的扩增，然后进行琼脂糖凝胶电泳技术分析，结果如图2所示。    ①为了便于alkB基因与pET-28载体有效拼接，PCR扩增时需要在alkB基因X、Y两侧分别添加BamHI和HindⅢ酶切位点。BamHI和HindⅢ酶的识别序列及alkB基因的部分序列如图2所示。写出结合在Y侧的引物的序列5' 3'。 ②研究人员初步判断该PCR体系成功扩增出了alkB基因，据图2分析，判断的依据是 。 (3)在摇床培养大肠杆菌时，需添加一些诱导物，诱导alkB基因表达，同时，还需要加入卡那霉素，添加卡那霉素的作用是 。 (4)经LB培养基活化诱导后，科研人员取菌液4mL接种到100mL的原油培养基中，设置阴性对照组，检测工程菌的降解能力，结果如图3所示。    ①阴性对照组应向原油培养液中加入 。 ②根据实验结果，得到的实验结论为 。 74．（2025·安徽安庆·二模）随着全球工业化的推进，环境雌激素来源于各种农药及其代谢物、防晒剂等，并通过污水排放和地表水径流进入水体环境，进入人体内的环境雌激素对人类健康产生了极大的危害。在环境雌激素的诱导下，斑马鱼表达卵黄蛋白原的水平与环境雌激素的浓度呈正相关。若向斑马鱼体内转入荧光蛋白基因，在特定条件下能发出荧光。科研人员欲利用基因工程技术，构建能够监测环境中雌激素污染物的转基因荧光斑马鱼，实验部分流程如图1所示。图2所示pEGFP-1是一种无启动子的绿色荧光蛋白（EGFP）载体，其中KanR为卡那霉素抗性基因，ori为复制起点，poly（A）为终止子序列，BamHⅠ、HindⅢ、StuⅠ、KasⅠ所指位置分别是4种限制酶的切割位点。回答下列问题： (1)基因工程的核心环节是 。已知卵黄蛋白原启动子序列中无上述四种酶的识别序列，扩增时应在引物的 端添加相应的碱基序列，不在另一端进行操作的原因是 。 (2)依据pEGFP-1的结构，应选择 两种酶对质粒进行切割，再利用DNA连接酶将其与卵黄蛋白原启动子序列缝合。不选用另外两种酶切割的理由是 （答出两点）。 (3)对重组质粒进行检测和鉴定后，通过 法导入斑马鱼的胚胎中，并从个体水平检测转基因斑马鱼是否表现出绿色荧光。为避免转基因斑马鱼逃逸带来生物安全问题，可考虑采取的措施是 （答1点）。 75．（2025·北京海淀·二模）大肠杆菌是基因工程中应用最广泛的受体细胞。研究者利用大肠杆菌开展转录起始和调控机制的研究。 (1)作为基因工程载体的质粒上一般含有启动子、 （至少填2个）等序列，其中启动子是RNA聚合酶识别和结合的部位。 (2)研究者利用大肠杆菌质粒进行体外单轮转录实验：用限制酶切割质粒，获得包含启动子序列的DNA模板，与足量RNA聚合酶混合并保温，使RNA聚合酶充分结合至启动子；依次加入足量的肝素（能与游离的RNA聚合酶结合，使其不能再结合启动子）和放射性标记的4种核糖核苷酸，一段时间后电泳检测转录产物，结果如图1。 ①电泳结果显示，除了正常长度的RNA外，转录还会产生 ，研究者称其为“无效转录物”。 ②对“无效转录物”的产生机制有两种假说： a．一个RNA聚合酶与启动子结合后，先反复转录出多个无效转录物，然后该聚合酶在DNA上延伸并只转录出一个正常长度的RNA，最后从DNA上脱离。 b．一个RNA聚合酶与启动子结合后，仅转录出一个RNA，该聚合酶就从DNA上脱离；转录出的RNA多数为无效转录物，少数为正常长度的RNA。 单轮转录实验中，若DNA模板的数目（m）、无效转录物的数目（p）、正常长度RNA的数目（q）之间存在数量关系 （用m、p、q表示），则支持假说a。 (3)阻遏蛋白R能与启动子附近下游序列结合，抑制转录。设计实验探究R的作用是抑制RNA聚合酶与启动子的结合，还是抑制RNA聚合酶在DNA上的延伸。 ①其中实验组的步骤如下。请将正确的试剂对应的字母填入横线上。 DNA模板与足量 混合并保温，再加入足量 混合并保温；依次加入足量的 和 反应一段时间，然后加入 再反应一段时间，电泳检测转录产物。 a．IPTG（使R脱离且不再与DNA结合） b．肝素 c．RNA聚合酶 d．放射性标记的4种核糖核苷酸 e．阻遏蛋白R ②电泳结果如图2，表明R 。 四、实验题 76．（2025·北京东城·二模）我国科研人员培育出复粒水稻（CL），与普通单粒水稻（NCL）相比，具有多粒簇生的特点。 (1)油菜素内酯（BR）是一种植物激素，是参与调节水稻籽粒生长发育的有机物，作用具有 的特点。 (2)如图1所示，幼穗中分生组织将发育形成不同部位。研究人员检测了CL和NCL幼穗不同部位中BRD3（BR降解酶）的表达量。结果显示：与NCL相比，CL中 。    (3)研究人员利用图2质粒转录得到两种RNA探针，通过RNA杂交技术检测幼穗组织相关基因转录情况，具体步骤如下表，请将实验材料补充完整（填选项）。    步骤 实验组（探针序列与BRD3的mRNA互补） 对照组（探针序列与BRD3的mRNA相同） 使用限制酶将图2质粒切成线形 ① ② 使用RNA聚合酶转录得到RNA，制备带标记的探针 ③ ④ 取NCL和CL幼穗的组织，制作成临时装片 将探针加入处理好的装片中，结合探针的部位会产生显色反应 a.Nco I    b.Sal I    c.T7RNA聚合酶    d.SP6RNA聚合酶 观察2种水稻幼穗组织显色情况，在答题卡的图中标出预期结果。 。 (4)蛋白GSK和MADS均为BR信号通路中的调控因子，在体外进行实验的处理和结果如图3，结果说明 。经过一系列的研究，科研人员阐明了水稻通过BR-GSK-MADS通路调控复粒性状。    (5)已有研究表明，BR缺陷水稻的籽粒通常会变小。请从基因选择性表达的角度解释“CL同时具有多粒簇生和籽粒不变小特点”的原因。 。 77．（2025·广东清远·二模）茶树具有重要的经济价值，春季茶芽的萌发情况与其产量和品质密切相关。脱落酸ABA通过整合环境和代谢信号，精准控制休眠的诱导与解除时机。研究表明茶树EXP基因上游启动子区存在脱落酸相关响应元件，PIF7基因在植物的萌发中也具有重要作用，研究人员就茶树中的EXP基因和PIF7基因参与萌发的分子机制进行了研究。回答下列问题： (1)提取茶树总RNA，通过 过程，获取PIF7基因，作为克隆PIF7基因的模板。以下是EXP启动子部分序列和设计的一些引物，扩增出EXP启动子序列需选择下列引物 （填序号）。 5'-CGAATCTCGGCCACCACTC……GTTGCACCGATAGATGGCC-3' 3'-GCTTAGAGCCGGTGGTGAG……CAACGTGGCTATCTACCGG-5' ①5'-CGAATCTCGGCCACCACTC-3' ②5'-GTTGCACCGATAGATGGCC-3' ③5'-GAGTGGTGGCCGAGATTCG-3' ④5'-GGCCATCTATCGGTGCAAC-3' (2)研究人员以某茶树品种为实验材料，采集不同部位，检测PIF7和EXP基因的相对表达量（图1），结果表明 ；使用100μmol/LABA喷施处理叶片，检测不同处理时间叶片中PIF7和EXP基因的相对表达量（图2），表明 。    (3)为了进一步探究基因PIF7和EXP的作用关系，构建了相关的基因表达载体1和载体2（图3），导入到模式植物烟草叶片中，并检测荧光强度（图4），已知PIF7基因的表达产物PIF7蛋白在细胞核内作用，结合图3和图4推测PIF7蛋白和EXP启动子的关系可能是 。      注：空载体指不含PIF7基因的载体1 (4)结合题干和上述研究结果，推测基因PIF7和EXP参与茶树萌发可能的分子机制： 。 78．（2025·山东德州·二模）小鼠毛色的黑色、灰色、白色与多对基因有关，从一个黑色显性纯合的野生型小鼠品系中选育出6个不同的单基因隐性突变纯合品系①～⑥。品系①与野生型小鼠杂交，F1均为黑色，F1自由交配，F2雌雄个体的表型均为黑色:白色=3:1。科研人员又进行了如表所示的杂交实验。 组别 亲本 F1表型 F1自由交配得F2表型及比例 I ①♀ ②♂ 白色 白色 II ①♀ ③♂ 黑色 黑色:白色=1:1 III ①♀ ④♂ 黑色 黑色:白色=1:1 IV ①♀ ⑤♂ 黑色 黑色:灰色:白色=9:3:4 V ①♀ ⑥♂ 黑色 黑色:灰色:白色=9:3:4 VI ⑤♀ ⑥♂ 黑色 黑色:灰色=9:7 (1)①、③品系的出现体现了基因突变具有 性。第II组F2表型及比例为黑色:白色=1:1的原因是 。若品系③和④杂交，F2表型及比例为 。 (2)由表中结果推测，控制小鼠毛色的基因至少为 对，这些基因至少位于 对同源染色体上。 (3)若品系⑤和⑥的突变基因分别为e和f，根据IV、V、VI组实验结果，对两种基因是位于常染色体、X染色体，还是位于X、Y染色体同源区段上可做出 种合理的假设。为了探究哪种假设成立，提取VI组⑤⑥及F2中所有雄性个体（包括理论上所有类型）体细胞中的相关基因进行PCR扩增，将产物经酶切后进行电泳，结果如图1所示。已知条带1和条带2分别表示E、F基因，推测f基因应是F基因发生碱基对的 形成的，进一步推断e和f基因所在的染色体分别是 。 (4)为进一步确定⑤品系的突变基因在某染色体上的具体位置，对来源于该染色体的5个DNA片段（A~E）进行分子标记检测，结果如图2所示。据图分析，6个分子标记在该染色体上的排序为 。仅有片段A和C检测到突变基因，据此判断突变基因应位于分子标记 （填数字编号）之间。 79．（2025·广东深圳·二模）噬菌体表面展示技术是一种基因工程技术，通过将外源基因插入噬菌体外壳蛋白基因中，使外源蛋白以融合蛋白形式表达在噬菌体表面，这种技术可用于筛选高亲和力抗体。丝状噬菌体呈细长管状，由衣壳蛋白和DNA组成，衣壳蛋白中有一类衣壳蛋白III（PIII）与噬菌体感染有关。回答下列问题： (1)研究人员将EcoRI基因和PIII基因融合进行表面展示，过程如图。首先将EcoRI基因插入PIII基因中；再将重组噬菌体DNA成功导入 进行培养，获得子代重组噬菌体；为检测EcoRI蛋白是否成功展示在重组噬菌体表面，可采用 对重组噬菌体进行检测。 (2)根据噬菌体表面展示技术的目的，推测展示在噬菌体表面的EcoRI蛋白 （填“会”或“不会”）影响重组噬菌体的感染过程。为证明该推测，研究人员设计如下表实验并检测感染能力。根据以上信息，完成下列表格。 对照组1 对照组2 对照组3 实验组 野生型噬菌体 - + + - 重组噬菌体 + - - + 过量游离的EcoRI蛋白 + - + - 的抗体 + + + + 感染能力 强 强 弱 注：“-”表示未添加，“+”表示添加 (3)抗体的结构包含VH和VL。研究人员从抗原phOx免疫的小鼠脾脏中提取mRNA，经 过程获得VH和VL的cDNA。将一系列VH和VL的cDNA随机两两组合后，插入PIII基因，构建出2×105种噬菌体克隆作为文库。从文库中选择568种噬菌体进行检测后发现，能与抗原phOx结合的噬菌体极少，若实验操作没有问题，则表明该噬菌体文库中 。 (4)研究人员将抗原phOx附着在特定基质上，将噬菌体文库中的噬菌体通过基质，并进行多次重复，每次重复时减少基质上抗原phOx的密度，推测多次重复的意义 。 80．（2025·山东菏泽·二模）抗菌肽以其快速杀菌活性、免疫调节特性和促进伤口愈合的潜力成为最有前景的抗菌药物。研究发现将抗菌肽第52位的脯氨酸（密码子为CCC）替换成苏氨酸（密码子为ACG）可增强抗菌肽的杀菌活性。科研人员利用大引物PCR定点诱变技术对抗菌肽基因进行改造的过程如图所示。请回答下列问题： (1)若将抗菌肽第52位的脯氨酸换成苏氨酸，则基因转录模板链对应碱基的变化是 ，据图分析，写出第51位氨基酸对应的密码子是 。 (2)据图分析，“大引物PCR定点诱变”技术中设计的“诱变引物”应选择________。 A．5'…ATAGCAGGC…3' B．5'…ATAACGGGC…3' C．5'…GCCTGCTAT…3' D．5'GCCCGTTAT3' (3)进行大引物PCR定点诱变获得改良的抗菌肽基因，需要进行两次PCR（PCR1和PCR2），产物1最早出现在PCR1的第 轮循环；PCR2的产物除改良的抗菌肽基因外，还有 ；若考虑1个改良的抗菌肽基因通过PCR3快速扩增，则第n次循环共需引物 个。 (4)PCR过程中温度的控制至关重要，若变性时温度偏低，则会导致反应效率降低，原因是 。在PCR扩增改良的抗菌肽基因时，研究人员尝试利用降落PCR技术提高扩增特异性。降落PCR的原理是：在PCR前几个循环先设置较高的复性温度，随后每个循环均降低一定温度，直至达到适宜复性温度。结合PCR原理分析，降落PCR能提高特异性的原因是 。 81．（2025·甘肃白银·二模）CRISPR/Cas9基因编辑技术可用于基因敲除，其主要包含两种成分——Cas9蛋白及小向导RNA（sgRNA），其作用原理如图1所示。某科研团队利用该技术对拟南芥的Sv14与Sv15基因进行敲除，探究Sv14、Sv15基因对拟南芥花粉育性的影响。请回答下列有关问题： (1)将Cas9蛋白及sgRNA导入拟南芥细胞，我国科学家独创的一种方法是 。据图1分析可知，Cas9蛋白的功能相当于 酶。 (2)①为了提高敲除拟南芥的Sv14、Sv15基因的成功率，一般先敲除其中一个基因获得单突变体，在此基础上继续敲除另一个基因获得双突变体。已知拟南芥的Sv14、Sv15基因模板链碱基序列如图2所示。 请根据Sv14、Sv15基因模板链碱基序列设计敲除Sv14、Sv15基因过程中所用到起向导作用的sgRNA（若sgRNA为10bp，且选取模板链NGG之前的序列设计，“N”表示任意核苷酸）。 Sv14—sgRNA：5′— —3'。 Sv15—sgRNA：5′— —3'。 ②为验证是否完全敲除，可提取待测拟南芥的总DNA，加入 种引物进行PCR扩增，PCR产物长度常采用 技术鉴定，理论上出现 种条带说明成功获得双突变体。 (3)对于成功转化的拟南芥植株还需进一步进行表型鉴定，研究人员选取不同转基因拟南芥采集花粉，观察并计算花粉萌发率，结果见下表。 组别 野生型 Sv14突变体 Sv15突变体 Sv14、Sv15双突变体 花粉萌发率 95.0% 39.8% 80.0% 30.0% 根据以上表格，可得出的结论是 。为进一步验证这一结论，请用基因工程手段以Sv14、Sv15双突变体为材料设计实验并预测结果： （基因工程具体操作不做要求）。 82．（2025·山东泰安·二模）研究人员从麻疯树油中筛选出能产生脂肪酶（LA）的两种菌株。菌株1产生的LA1酶可耐高温，菌株2产生的LA2酶具有高催化效率，且LA1基因和LA2基因具有93%的同源性。研究人员采用交错延伸PCR技术获得了重组LA基因，生产出了更高效的酶。 (1)交错延伸PCR技术具体流程如上图（图中仅显示其中一条链延伸情况）。该技术采用LA1、LA2均做模板，起始所需引物相同，引物作用是 。已知过程①起始引物片段均为25个核苷酸，TaqDNA聚合酶延伸速度为1200个碱基/min，本实验的循环扩增条件为：变性30s，复性15s，延伸15s，经过80轮交错循环后，可获得PCR混合产物。第二轮循环后所得重组型子链长度为 个核苷酸。 (2)获得的重组LA基因中，同时具有LA1和LA2基因序列的原因是 。 (3)过程②用到的PM质粒中A为启动子、B为氯霉素抗性基因cat、C为终止子、D为asd-突变基因、E为复制原点，箭头处指不同限制酶的识别位点。asd基因是编码细菌细胞壁的主要成分DAP合成途径的关键酶，asd基因缺失时，将导致菌株生长对DAP依赖。为使目的基因定向插入PM质粒，交错延伸PCR过程中引物的5′端需引入 酶的识别序列。为便于目的基因的检测和鉴定，过程③中应采用asd基因 的受体菌。从含有PM质粒、重组PM质粒的受体菌中将含有重组PM质粒的受体菌筛选出来的思路为 。 83．（2025·天津·二模）水杨酸是常见的水体污染物，科学家利用基因工程构建智能工程菌，通过向大肠杆菌体内导入含特殊DNA序列的重组质粒，制备水杨酸生物传感器(下图)，为环境污染治理提供新方法。    回答下列问题： (1)Pc和Ps启动子可被 酶识别并结合后,驱动沿基因的模板链 方向转录出mRNA。与mRNA相比，启动子特有的物质组成是 。分析图1可知，当环境中存在水杨酸时， 可激活PS启动子，最终使菌体发出红色荧光，据此可判定环境中的水杨酸浓度。 (2)研究人员改造重组质粒，选择激活能力更强的蛋白的基因nahR1替代nahR，实现在相同浓度的水杨酸条件下 ，提高传感器的灵敏度。该改造过程需要用到的工具酶是 。 (3)水杨酸羟化酶可催化水杨酸转化为龙胆酸，龙胆酸可被细胞利用。若将水杨酸羟化酶基因与mrfp基因连接成融合基因，则工程菌可同时实现对水杨酸的动态检测和清除。现欲通过PCR判定融合基因已准确连接，应选择图2中的引物组合是 。    (4)工程菌治理环境污染具有成本低、动态治理等优点，但菌株本身会造成水源安全隐患。科学家将ccdA、ccdВ两个基因插入原有序列中，使水杨酸被耗尽时菌株即启动“自毁”。已知ccdВ基因表达毒蛋白可使工程菌致死，ccdA基因表达抗毒素蛋白导致毒蛋白失效，则ccdA、ccdВ分别插入图3中的 、 位点。    84．（2025·云南曲靖·二模）CRISPR/Cas9系统可对植物基因组进行编辑，核酸酶Cas9需要识别并结合靶基因旁的特定短序列（PAM）才能对双链DNA进行切割。科学家发现了ScCas9酶，并做了相关研究。回答下列问题： (1)Cas9酶需要识别并结合靶基因旁的PAM序列才能发挥作用，体现了酶的 性，Cas9酶破坏了 键。 (2)科学家对ScCas9酶某位点氨基酸对应的密码子进行改造，使其更好地在水稻细胞中发挥作用，但没有改变ScCas9酶的氨基酸序列，这体现了密码子的 特点，对密码子进行改造，最终还必须通过 来完成。 (3)科学家利用农杆菌转化法把改造的ScCas9基因整合进水稻细胞的染色体DNA上，整合的机理是 。 (4)为了研究ScCas9酶在水稻细胞中识别的PAM序列及其偏好的PAM序列，科研人员利用ScCas9酶打靶水稻细胞中含NAG、NCG、NTG（N代表任意碱基）序列的若干基因，结果如下表所示。据表可得出的结论有① ；② 。 PAM序列 打靶基因 编辑效率 NAG OsMPK15 0.00% OsMPK16 91.18% OsCPK7 94.74% NCG OsMPK17 0.00% OsCPK5 0.00% OsCPK6 46.67% NTG OsMPK9 7.14% OsMPK15 0.00% OsCPK7 0.00% 注：编辑效率是指靶基因被成功修改的个体占总处理个体的比例。 (5)水稻OsMPK16基因的部分序列和CRISPR/ScCas9系统对OsMPK16基因编辑后的序列如下图所示，该变异类型属于 。 85．（2025·广东广州·二模）不同的启动子活性不同，可引起基因表达强度的差异。MCS是一段含多种限制酶切割位点的DNA序列，广泛用于插入不同外源启动子，但MCS自身序列也可能会启动下游基因的表达，对外源启动子活性检测造成干扰。为了构建能灵敏检测外源启动子活性的质粒，科研人员利用无启动子的lacZ基因和质粒p构建出质粒p-lacZ(如图甲)，并以此进行进一步研究。回答下列问题。    (1)为构建更为灵敏的外源启动子活性检测质粒，最好选择限制酶 切割质粒p-lacZ,然后将MCS与p-lacZ连接构建成质粒p01。在此基础上对MCS列进行不同改造分别得到质粒p02、p03、p04、p05、p06。 (2)将质粒p01~p06分别与lacZ基因缺失菌株混合后接种至含 的液体培养基中培养并筛选出成功转入质粒的菌株，然后分别于28℃和37℃条件下培养后进行β-半乳糖苷酶活性测定，结果（如图乙）表明，应选择质粒 并在 的温度下用于插入外源启动子进行活性检测最灵敏，理由是 。    (3)β-半乳糖苷酶可以分解X-gal产生蓝色物质，使菌落呈现蓝色。请利用(2)筛选得到的质粒（记为pR)为工具，用固体培养基初步比较外源启动子A和B的活性，试写出简要的实验思路 。 86．（2025·广东湛江·二模）研究人员利用基因工程的方法将油料作物紫苏的二酰甘油酰基转移酶（DGAT1）基因导入四尾栅藻（操作过程如图），获得转基因的高产油脂四尾栅藻。利用地热废水培养该藻，在生产生物柴油的同时，还能治理地热废水。请回答下列问题： 注：lacZ基因编码产物在X-gal和IPTG存在下，可以产生蓝色沉淀，使菌落呈现蓝色，否则菌落呈现白色。 (1)为保证从紫苏细胞中获得的DGAT1基因与pMD19克隆质粒相连，可在设计PCR所用引物时，在引物的 端加上特定限制酶的识别序列。第一次转化的受体细胞是大肠杆菌，结合该细胞的特点说明这样做的目的是 。 (2)经转化的大肠杆菌可通过 （方法）接种到培养基上继续培养。为筛选目标菌株，培养基应加入的成分有 。在该培养基中，目标菌株的菌落呈 色。 (3)启动子往往具有物种特异性，在载体pBI121质粒中插入紫苏DCAT1基因，其上游启动子应选择 （填“紫苏DGAT1基因”、“大肠杆菌”或“四尾栅藻”）的启动子。 (4)为检测转基因四尾栅藻对地热废水的治理能力，研究人员设计实验并得到相应实验结果如下表。该实验不能说明转DGAT1基因显著提高了四尾栅藻的去污能力。请进一步完善实验设计： 。 表培养转基因四尾栅蕴的地热废水培养基各项指标测定结果 各项指标 总氮//（mg·L-1） 总磷//（mg·L-1） 氟化物/（mg·L-1） 初始 23.2 4.32 4.56 培养转基因四尾栅藻11天后 1.9 0.45 0.84 87．（2025·山东聊城·二模）水稻花多且小，为两性花，育种工作量大。水稻雄性不育系为育种工作提供了新路径。雄性不育株的雌蕊发育正常，但雄蕊发育异常，可接受外来花粉而繁殖后代。研究发现雄性育性是由基因和环境共同控制的。杂交水稻的成功离不开雄性不育系的发现和应用。 (1)安农S-1是我国发现的第一个温敏雄性不育系籼稻。该品系在高温条件下表现为雄性不育，低温条件下可恢复育性。该温敏雄性不育系与多株野生型水稻进行正反交，得到的F₁均为雄性可育。F₁夏季炎热条件下连续繁殖两代，得到的F₃中雄性不育系理论上所占比例是 。 (2)对野生型水稻中正常基因和安农S-1突变体中的突变基因的非模板链碱基序列进行测序，结果如图。据图分析突变体雄性不育的原因是    (3)若水稻野生型为雄性可育，突变品系甲和突变品系乙均为雄性不育（均只有一对基因与野生型不同）。如表为3个不同水稻杂交组合及其子代的表型及比例。 组合 杂交组合类型 后代的表型及比例 一 野生型×甲 全为雄性可育（杂种1） 二 野生型×乙 全为雄性可育（杂种2） 三 杂种1×杂种2 全为雄性可育 ①根据杂交组合一和二可知，雄性不育性状是由 性基因控制。根据杂交组合三，推测控制两个突变体的相关基因为 （填“等位基因”或“非等位基因”）。 ②DNA分子标记可以用于突变基因的定位，甲的6号染色体上具有DNA分子标记a，野生型的6号染色体上具有DNA分子标记A。用A和a的特异性引物，对杂种1自交后代中全部雄性不育植株组织中的DNA进行PCR扩增及电泳，结果出现I、Ⅱ、Ⅲ三种类型，如图所示：    该实验结果能确定甲的雄性不育基因 （填“是”或“否”）位于6号染色体上，理由是 。 (4)现有另一水稻品种，其育性性状由细胞核基因（R/r）和细胞质基因（N/S）共同控制，其中R和N为可育基因，只要存在可育基因，雄配子就可育。雌配子的育性与上述基因无关，均是可育的。现有基因组成为S（rr）的雄性不育品系甲，基因组成分别是N（rr）、S（RR）和N（RR）的三种雄性可育水稻品系乙、丙、丁。 ①若以上述水稻为材料，应选择品系甲与 杂交，即可获得具有杂种优势的可育高产杂交种S（Rr）。 ②若要长期培育杂交种，利用上述水稻品系，试写出培育方案： 。 88．（2025·山西太原·二模）水稻的花非常小，人工去雄难，但其杂交种优势明显。在生产中，科研人员偶然发现了雄性不育水稻，已知雄性育性由等位基因F/f控制，ff为雄性不育。为了保留该雄性不育水稻，科研人员构建含育性基因F、花粉致死基因P和红色荧光标记基因M的融合基因，并将其转入雄性不育植株的与基因f不同的染色体上，不仅使育性恢复，还能结合花粉致死基因与荧光标记基因精准控制杂交过程，过程如图所示。请回答下列问题：    (1)构建该融合基因时，使用的工具酶有 。其中红色荧光标记基因M的作用是 。 (2)将该融合基因转入雄性不育水稻细胞时，需要先 才能使其稳定存在并表达后发挥作用。 (3)该转基因植株产生的雌配子种类及比例为 。 (4)已知该水稻的高茎（D）对矮茎（d）为显性，且D/d基因与F/f基因、FPM基因位于非同源染色体上。欲在杂交过程中保留ddff的雄性不育植株，甲同学设计了如图1所示实验方案，乙同学评价该方案不可行，请说明理由 。    (5)若将融合基因（FPM）导入基因型为Ddff的水稻细胞中（如图2），培育成转基因植株。让该植株自交，后代出现矮茎雄性不育植株的概率为 。 89．（2025·云南红河·二模）麦角硫因（EGT）是一种具有抗衰老、抗癌等多种生理功能的天然氨基酸。科研人员从杏鲍菇中获取到了EGT合成酶基因，通过基因同源重组的方法使基因在尿嘧啶营养缺陷型酿酒酵母中进行高效表达，具体过程如下图所示。据图回答下列问题： 注：同源臂是用于引导外源DNA片段与目标基因组发生同源重组的DNA序列，这些序列与目标基因组的两端具有高度同源性，从而促进外源DNA片段的插入或替换。含有基因的酿酒酵母能在Sc-Ura营养缺陷培养基（缺少尿嘧啶）中正常生长。 (1)图中①过程为 ，①过程与②过程所需原料 （填“相同”或“不相同”）。 (2)图中③过程是利用重叠延伸PCR将各元件连接在一起形成同源修复模板。下图是利用重叠延伸PCR将启动子和基因串联在一起的过程示意图，图中引物1结合的部位是a链的 端。由图可知，将启动子和基因串联在一起的关键是 ，在将启动子和基因分别进行扩增时，不能将启动子和基因放在同一PCR体系中反应，因为 。 (3)图中④过程是利用电击法将同源修复模板和质粒导入酿酒酵母中，在导入前应将酿酒酵母细胞处理为 的生理状态。 (4)同源修复模板进入酿酒酵母后会通过同源重组的方式插入到酿酒酵母基因组的Ⅵ-5位点中，从碱基序列的角度分析，此过程能准确进行的关键是同源臂1与同源臂3，以及同源臂2与同源臂4均具有 的特点。 (5)图中⑤过程是使用Sc-Ura营养缺陷培养基对酿酒酵母进行培养筛选，能在培养基中生长的酿酒酵母不一定成功插入了基因，从细胞对外源DNA分子进行转化的结果分析，原因是 。 90．（2025·山西·二模）马铃薯块茎在储存中极易受损褐变发黑，导致其外观、味道、安全性下降。多酚氧化酶PPO可催化酚类物质形成褐色物质，是导致褐变的关键酶。为培育抗褐化能力强，并符合基因安全的新品种，研究者构建了目的基因StPPOi，表达产生与PPO基因转录产物互补的RNAi。将目的基因搭载在Gene—Deletor载体上（重组载体如图1所示），通过农杆菌介导，获得PPO基因沉默的马铃薯植株。经检测鉴定，发现褐变指数下降了80.78%。提取马铃薯器官中的外源基因，经PCR扩增后电泳分离（结果如图2所示）。请回答下列问题。 (1)在构建的重组载体中，FLP基因的表达产物与 酶的作用相似，均可以对DNA进行切割；抗卡那霉素基因的作用是 。 (2)转基因马铃薯植株块茎在25℃、3天处理条件下，启动子 可以启动基因的转录，表达的产物可阻断PPO基因的 （填“转录”或“翻译”），从而抑制PPO的合成。 (3)转基因食品相对于传统食品，其有成本较低，农药使用量小，生产效率高等显著优势，但是转基因食品的安全性始终受到人们的质疑。上述研究中可采用2℃、3天处理此新品种，获得符合转基因安全的马铃薯，理由是 。 91．（2025·陕西咸阳·二模）我国玉米的生产一直受到玉米螟虫害的严重影响，为提高玉米对玉米螟的抗性，科学家通过基因工程将抗虫基因crylAb13转入玉米，过程如图1所示。回答下列问题： (1)为了减少限制酶识别序列的影响，研究人员采用了新型的无缝克隆In-Fusion技术实现重组载体的构建。该技术首先要将表达载体线性化，需使用限制酶 ，其次要保证在目的基因两端构建出与线性化载体末端相同的DNA序列（即同源序列，通常15-20bp）。因此引物1和引物2要依据 序列设计。 (2)将线性化的表达载体和基因crylAb13混合进行In-Fusion反应，In-Fusion酶能够识别线性化DNA片段5'→3末端任意16个碱基，使其形成黏性末端，依靠同源序列碱基间的配对获得重组表达载体，其中同源序列1、2中碱基序列不同，这样设计的好处除了防止线性化载体自身环化自连外，还有 （答两点）。 (3)过程⑤利用构建好的重组表达载体转化农杆菌，然后侵染玉米愈伤组织，进而获得转基因玉米植株。研究人员探究农杆菌浓度对基因转化效率的影响，结果如图2所示。实验结果表明，转化效率较高的农杆菌浓度范围为 OD600。为了进一步对侵染条件进行优化，可进行实验探究的课题是 。 92．（2025·河南安阳·二模）科研人员常利用λ-Red同源重组酶系统进行基因敲除、敲入等操作，其原理是λ-Red 同源重组酶系统将一段携带同源序列的标记基因与特定靶序列进行同源重组，使靶基因被标记基因置换下来，如图所示。回答下列问题： (1)将pKD46 载体导入大肠杆菌时需用 Ca2+处理大肠杆菌，目的是 。检测大肠杆菌是否含有pKD46 载体时，可依据pKD46 载体中的 的特性。 (2)PCR 时，HA1 和HA2 是依据 （填“靶基因”或“NPTⅡ”）两侧的碱基序列而设计的。 (3)与构建基因表达载体相似，λ-Red同源重组酶系统可将标记基因插入特定 DNA 片段中。据图分析，二者的不同之处是 。 (4)检测靶基因是否敲除成功时，科研人员采取了以下两种方法： ①PCR。提取过程Ⅱ处理后大肠杆菌中的 DNA 分子，依据靶基因的序列设计引物进行PCR，用 方法检测 PCR 结果，若 ，则说明基因敲除成功。 ②培养基培养。从培养基成分角度，简要描述检测思路： 。 93．（2025·甘肃白银·二模）CRISPR-Cas9技术在基因编辑中运用较多。该技术是以Cas9基因和能转录出与目标DNA互补的向导RNA的基因作为目的基因，通过载体将其导入受体细胞中。表达出来的Cas9蛋白和向导RNA会形成复合物，向导RNA识别并结合目标DNA，Cas9蛋白切断双链DNA形成两个末端。这两个末端通过“断裂修复”重新连接，实现对目标DNA进行特定基因的敲除或插入，从而修复或改良机体功能，其过程如图1。 (1)基因工程中可用PCR技术获取目的基因，PCR过程除了需要模板和引物外还需要的条件有 （答出2点即可）。若将一个Cas9蛋白基因经PCR扩增8轮，获得的DNA片段中仅含有1种引物的DNA片段有 个。 (2)利用CRISPR-Cas9技术在Gata基因序列的一端插入绿色荧光蛋白（GFP）基因，Cas9蛋白和向导RNA复合物相当于限制酶，会破坏Gata基因序列上的 键，插入GFP基因后，构建了图2中的重组质粒，其中终止子的作用是 。为了检测GFP基因是否准确插入图2中的位置，最好选择引物 （填序号）进行PCR扩增，然后利用电泳技术进行检测。 (3)实验得到能正常表达两种蛋白质的杂合子雌雄小鼠各1只，交配以期获得Gata3-GFP基因纯合子小鼠。对小鼠体细胞DNA进行PCR和电泳分析，得到如图3的1～3种条带结果，其中第 种条带的结果为Gata3-GFP基因纯合子的小鼠，理论上子代中Gata3-GFP基因纯合子的比例为 。 94．（2025·北京海淀·二模）为监测、调控和利用细菌的葡萄糖代谢途径，优化目标产物的生产过程，研究者尝试通过基因工程技术构建生物传感器。 (1)将GFP（绿色荧光蛋白）基因作为报告基因，构建出基因表达载体（R），将其导入大肠杆菌时，应先用 处理大肠杆菌。 (2)PE基因编码的PE酶催化E蛋白磷酸化，磷酸化的E蛋白可转运葡萄糖进入大肠杆菌细胞，转运葡萄糖后E蛋白去磷酸化。M蛋白是一种转录抑制因子。R作为生物传感器，包括启动子（P）、GFP基因和PE基因等元件，工作过程如图1、图2。    ①据图1、图2可知，存在葡萄糖时，葡萄糖通过E蛋白转运进入细胞中后被磷酸化，推测M蛋白 ，PE表达产物可使E蛋白重新磷酸化。 ②在周围环境中葡萄糖存在状态不同时，R均可监测大肠杆菌的葡萄糖摄取状态，请阐释其工作原理 。 ③在含有葡萄糖的培养基中培养转入R的大肠杆菌，分别在不同培养时间检测 和荧光强度。若结果显示二者呈正相关，则可确定该生物传感器具有检测可靠性。 (3)在工业发酵生产色氨酸过程中，研究者利用R监测大肠杆菌对葡萄糖的摄取，发现菌体摄入的葡萄糖偏多，因为代谢过程中形成了一些副产品，导致生产成本偏高。已知大肠杆菌C基因编码的蛋白C可结合启动子Pc，促进RNA聚合酶也结合Pc；当胞内葡萄糖含量较高时，C蛋白无法结合Pec，Pc无法启动下游基因转录。研究者将R的启动子Р更换为启动子Pc，解决葡萄糖摄取偏多导致浪费的问题。请在表格中补充不同条件下，2个调控元件对R的精准调控过程。“+”表示相应蛋白结合、“-”表示相应蛋白脱离。 条件 Pc中C蛋白的结合序列 M蛋白的结合序列 无葡萄糖 + + 低浓度葡萄糖 ⅰ． ⅱ． 高浓度葡萄糖 ⅲ． ⅳ． 95．（2025·江西九江·二模）小鼠中编码类胰岛素生长因子的Igf2基因，位于7号常染色体上，对个体生长发育具有重要的作用。当Igf2突变为Igf2m后会失去原有功能，产生矮小型小鼠。科研人员进行了如下表的杂交实验。回答下列问题。 杂交实验 父本基因型 母本基因型 子代表现型 实验一 Igf2/Ifg2 Igf2m/Igf2m 正常型小鼠 实验二 Igf2m/Igf2m Igf2/Igf2 矮小型小鼠 (1)产生矮小型小鼠的变异类型是 ，在遗传和进化方面，该变异类型的意义是 （回答1点即可）。 (2)研究表明，上述杂交实验的遗传现象与基因的甲基化修饰有关。已知甲基化的基因在体细胞有丝分裂中终生保持，但在减数分裂中，配子形成之前会先被去甲基化，再根据相应的性别，在生殖细胞中重新被甲基化修饰。据此推测实验二中子代表现为矮小的原因可能是 。若将实验一子代中的正常型雌雄小鼠自由交配，理论上其子代表现型及比例为 。 (3)进一步研究发现，Igf2基因的表达还与7号染色体的H19基因及两个基因之间的绝缘子（由500个碱基对组成，碱基对单位：bp有关。正常型纯合小鼠杂交后代中，只有来自父本的Igf2基因表达，而来自母本的Igf2基因不表达，调控机制如下图所示。在母本染色体上，未甲基化的绝缘子与CTCF蛋白特异性结合，从而 （填“促进”或“抑制”）增强子激活Igf2的表达。在父本染色体上， 被甲基化修饰，进而促进Igf2基因的表达。 备注：绝缘子和增强子均为一段调控基因表达的DNA序列，Me—指的是甲基化修饰。 (4)在正常型纯合小鼠杂交实验中，偶然发现在后代的体细胞中，来自父本和母本的Igf2基因都有相同的表达活性，推测这是由母本染色体上的绝缘子序列部分缺失所致。请利用基因工程中的相关技术，设计实验加以验证（简要写出实验思路和预期结果）。 实验思路： 。 预期结果： 。 96．（2025·江苏南通·二模）红斑丹毒丝菌是猪的病原性细菌（引起猪丹毒），其表面抗原A蛋白（SpaA）和胆碱结合蛋白B（CbpB）能诱导猪等产生特异性抗体。枯草芽孢杆菌是一种益生菌，为猪丹毒口服活载体疫苗的研发奠定基础。研究人员构建重组质粒（过程如图1）导入枯草芽孢杆菌，一段时间后分别收集菌体和芽孢（抗逆性强，适宜条件下能萌发形成菌体），制备在菌体表面表达SpaA的重组菌体活载体疫苗、芽孢表面表达CbpB的重组芽孢活载体疫苗，并通过小鼠免疫实验评价免疫效果。请回答下列问题： (1)已知引物R1与引物F2部分序列互补配对，以便合成融合基因spoⅢJ-spaA。其中R1的序列为5'-GCTGCCGCCACCGCCGCTTCCGCCACCGCCGCTTCCACCGCCACCCTTTTTCT-3'，则PCR2过程中构建的引物F2的序列为 。 ①5'-GAGGAGCGAAAACCGAGAGACTTAGGGCCTACGCTATATATCG-3' ②5'-CGCTGGCGGAACCGGCGGTGGCGGCAGCGATTCGAC-3' ③5'-GCCACCGCCTTCCCCCCCACCGCCGTCGCTAAGCTG-3' ④5'-TTGGCTATGTTTTACGATTAGGCAGCGATTCGAC-3' (2)已知过程⑦、⑧都用双酶切构建重组质粒，则设计PCR1时在引物F1的 端添加的限制酶识别序列是 。质粒pDC中BamHⅠ和EcoRⅠ之间的长度 （填“大于”、“小于”或“等于”）MfeⅠ和BelⅠ之间的长度。过程⑦、⑧不能同时在同一体系中进行的主要原因是 ，若同时进行，酶切后的连接产物多。 (3)将重组质粒pDG-CBJA导入枯草芽孢杆菌，将发生如图2所示的同源重组过程，pDG中的序列A、序列B的设计依据是 。 (4)对转化的枯草芽孢杆菌进行筛选时，应将菌种接种在含壮观霉素和 的平板上，37℃培养24h，加碘液，3min后弃去碘液，观察菌落周围有无透明圈产生，选择 的菌落来制备疫苗。 (5)科研人员研究了不同疫苗体液免疫应答的效果，结果如图3，A组为磷酸缓冲液，B组为野生型枯草芽孢杆菌菌体，C组为野生型枯草芽孢杆菌芽孢，D组为重组枯草芽孢杆菌菌体活载体疫苗，E组为重组枯草芽孢杆菌芽孢活载体疫苗。 ①五组实验中， 组为对照组。 ②小鼠口服菌体活载体疫苗（表达SpaA）后，血清抗SpaA抗体低；芽孢活载体疫苗不表达SpaA，但小鼠口服芽孢活载体疫苗后血清抗SpaA抗体较高，其原因是 。 97．（2025·内蒙古赤峰·二模）NOV基因过量表达可促进神经干细胞向神经元分化，并为中枢神经系统再生修复提供适宜的微环境。为探究NOV基因过量表达诱导皮肤干细胞向神经元细胞分化，研究者构建了NOV基因表达载体并进行了相关研究。 (1)在构建NOV基因克隆载体时，要根据 设计引物，若引物中GC含量高，长度较长时，PCR时应 （填“提高”或“降低”）复性温度，有利于 。 (2)大部分PCR产物的3′末端有一个“A”，而M质粒经EcoRV酶切后，再在两端的3′末端添加“T”而成为T载体。PCR产物A末端与T载体的T末端连接，此过程称为TA克隆。与传统的酶切法构建重组质粒相比，TA克隆具备的优势有 ，从DNA分子连接方向的角度分析，TA克隆的局限是易出现 。 (3)将大肠杆菌培养在含 的培养基上生长，导入含NOV基因的M重组质粒的大肠杆菌呈白色菌落，原因是 。 (4)构建NOV基因真核表达载体时，用限制酶分别切割含NOV基因的M重组质粒和真核表达载体N质粒，实现N质粒与NOV基因的连接。N质粒上的启动子连接有绿色荧光蛋白基因，外源基因插入后，表达的最终产物为目的蛋白与荧光蛋白的融合体。若要观察目的蛋白在细胞中的定位，利用N载体的优势是 。 (5)根据以上信息，写出检测NOV基因表达能否诱导皮肤干细胞向神经元细胞分化的实验思路： 。 试卷第1页，共3页 2 / 2 学科网（北京）股份有限公司 学科网（北京）股份有限公司 学科网（北京）股份有限公司 $$ 专题16 基因工程 考点概览 考点01 重组DNA技术的基本工具 考点02 基因工程的基本操作程序和应用 重组DNA技术的基本工具考点01 一、单选题 1．（2025·山东·二模）在DNA提取过程中应尽量避免导致DNA断裂和降解的各种因素，以保证DNA的完整性。下列操作与保证DNA完整性无关的是（    ） A．将洋葱切碎加入研磨液后再充分研磨 B．在上清液中加入预冷的酒精溶液 C．滤液在4℃冰箱中放置几分钟后再取上清液 D．加入酒精后用玻璃棒沿一个方向轻轻搅拌 【答案】A 【分析】DNA粗提取和鉴定的原理：1、DNA的溶解性：DNA和蛋白质等其他成分在不同浓度NaCl溶液中溶解度不同；DNA不溶于酒精溶液，但细胞中的某些蛋白质溶于酒精。2、DNA的鉴定：在沸水浴的条件下，DNA遇二苯胺会被染成蓝色。 【详解】A、将洋葱切碎后加研磨液充分研磨，目的是破碎细胞，使 DNA 释放，与避免 DNA 断裂降解无直接关联，A错误； B、预冷酒精溶液利于 DNA 析出，且低温可减少 DNA 降解（低温抑制相关酶活性），与保证完整性有关，B正确； C、4℃放置，低温抑制 DNA 酶活性，减少 DNA 降解，与保证完整性有关，C正确； D、沿一个方向轻轻搅拌，避免剧烈操作导致 DNA 长链断裂，与保证完整性有关，D正确。 故选A。 2．（2025·江西赣州·二模）科研人员利用PCR技术扩增人乳铁蛋白基因，并进行电泳鉴定。下列叙述正确的是（　　）      A．目的基因扩增时，应添加的引物组合为引物Ⅰ、Ⅳ或引物Ⅱ、Ⅲ B．PCR循环6次可得到5种DNA分子，其中等长的DNA分子共52个 C．电泳所需缓冲液和酶应分装成小份在-20℃储存，使用前在室温下解冻 D．鉴定DNA时，应向提取的DNA中加入二苯胺试剂并置于沸水中加热 【答案】B 【分析】PCR是聚合酶链式反应的缩写。它是一项根据DNA半保留复制的原理，在体外提供参与DNA复制的各种组分与反应条件，对目的基因的核苷酸序列进行大量复制的技术。PCR每个循环包括变性、复性、延伸三个步骤，每一次循环后目的基因的量可以增加一倍，即成指数形式扩增。 【详解】A、PCR技术扩增目的基因时，引物应与模板链的3'端互补配对，且两条引物分别结合在两条模板链上，这样才能使子链从5'端向3'端延伸。观察可知，应添加的引物组合为引物Ⅱ、Ⅲ，A错误； B、图示中的 PCR 循环 6 次，可以得到 2 种“长链/中链”DNA 分子，2 种“中链/短链”DNA 分子，1 种“短链/短链”DNA 分子，共 5 种；其中等长 DNA 分子共 26-2×6=52 个，B正确； C、电泳所需缓冲液应分装成小份，并在-20℃储存，使用前从冰箱拿出放在冰块上缓慢融化，C错误； D、鉴定 DNA 时，应先将提取的 DNA 部分溶于装有 NaCl 溶液的试管中，然后向试管内加入二苯胺试剂，再将试管置于沸水中加热，D错误。 故选B。 3．（2025·内蒙古·二模）CRISPR/Cas9是一种基因编辑技术，作用机制如图。单链向导RNA能特异性识别并结合特定的DNA序列，从而引导Cas9蛋白到相应位置剪切DNA，最终实现对靶基因序列的编辑。下列有关分析错误的是（　　） A．该技术能精准识别相关基因的原理是碱基互补配对 B．Cas9蛋白可催化脱氧核苷酸链上特定氢键的水解 C．人工设计特异性向导RNA是基因编辑技术的关键 D．向导RNA过短可能因不能准确识别，造成错误编辑 【答案】B 【分析】通过分析基因编辑的原理，可以发现是sgRNA的作用是引导Cas9蛋白到达特定的DNA位点，所以sgRNA与特定位点的DNA序列能够按照碱基互补配对原则准确配对。再结合图画，可以发现Cas9蛋白的作用可以切割DNA。 【详解】A、单链向导RNA能特异性识别并结合特定的DNA序列，所以该技术能精准识别相关基因的原理是碱基互补配对，A正确； B、Cas9蛋白可催化脱氧核苷酸链上磷酸二酯键的水解，B错误； C、该技术依赖于单链向导RNA能特异性识别并结合特定的DNA序列，从而引导Cas9蛋白到相应位置剪切DNA，最终实现对靶基因序列的编辑，所以人工设计特异性向导RNA是基因编辑技术的关键，C正确； D、向导RNA过短会影响碱基的特异性配对，可能因不能准确识别，造成错误编辑，D正确。 故选B。 4．（2025·山东德州·二模）关于“DNA片段的扩增及电泳鉴定”实验，下列说法正确的是（    ） A．PCR过程中预变性与最后一次循环时，变性时间较长可使DNA充分解聚 B．PCR过程中，复性温度过低会导致无法扩增出DNA片段 C．DNA的电泳速率与DNA分子的大小和构象有关，与凝胶浓度无关 D．将PCR产物、核酸染料和凝胶载样缓冲液混合后，用微量移液器加入加样孔 【答案】A 【分析】（1）PCR是聚合酶链式反应的缩写。它是一项根据DNA半保留复制的原理，在体外提供参与DNA复制的各种组分与反应条件，对目的基因的核苷酸序列进行大量复制的技术。（2）DNA分子具有可解离的基团，在一定的pH下，这些基团可以带上正电荷或负电荷。在电场的作用下，这些带电分子会向着与它所带电荷相反的电极移动，这个过程就是电泳。PCR的产物一般通过琼脂糖凝胶电泳来鉴定。在凝胶中DNA分子的迁移速率与凝胶的浓度、DNA分子的大小和构象等有关。 【详解】A、在PCR过程中，预变性的目的是使模板DNA完全解旋为单链，最后一次循环时变性时间较长，能确保所有的DNA双链充分解聚，为后续可能的反应提供足够的单链模板，A正确； B、PCR过程中，复性温度过低会导致引物与模板错配，但一般不会导致无法扩增出DNA片段，只是可能会出现非特异性扩增等问题，B错误； C、DNA的电泳速率与DNA分子的大小、构象有关，同时也与凝胶浓度有关。凝胶浓度越大，孔隙越小，DNA分子迁移受到的阻力越大，C错误； D、进行电泳鉴定时，应先将PCR产物与凝胶载样缓冲液混合，然后加入加样孔，核酸染料一般是在制胶时加入到琼脂糖凝胶中，而不是与PCR产物、凝胶载样缓冲液一起混合，D错误。 故选A。 5．（2025·山东菏泽·二模）下列关于“DNA的粗提取与鉴定”和“DNA片段的扩增及电泳鉴定”实验的叙述，错误的是（    ） A．DNA不溶于95%的冷酒精，但可溶于2mol/LNaCl溶液 B．将洋葱切碎、研磨、过滤，滤液放置4℃冰箱中静置几分钟后，DNA存在于上清液中 C．在凝胶电泳中DNA分子的迁移速率与凝胶的浓度、DNA分子的大小和构象等有关 D．凝胶载样缓冲液中加入的核酸染料能与DNA分子的结合，便于在紫外灯下观察 【答案】D 【分析】DNA不溶于酒精溶液，细胞中的某些蛋白质可以溶解于酒精，利用这一原理可以将蛋白质和DNA进一步分离。 【详解】A、DNA 不溶于 95%的冷酒精，这一特性可用于 DNA 的进一步提纯；而 DNA 在 2mol/L NaCl 溶液中的溶解度较高，可溶于该溶液，A正确； B、将洋葱切碎、研磨、过滤后，滤液放置 4°C 冰箱中静置几分钟，此时 DNA 存在于上清液中，因为 DNA 溶解在研磨液经过处理后的上清液体系中，B正确； C、在凝胶电泳中，DNA 分子的迁移速率确实与凝胶的浓度、DNA 分子的大小和构象等有关。凝胶浓度影响 DNA 分子在凝胶中的移动阻力，DNA 分子大小决定其移动的难易程度，构象不同也会导致迁移速率不同，C正确； D、核酸染料是在凝胶制备时加入到凝胶中，而不是在凝胶载样缓冲液中加入，通过核酸染料与 DNA 分子结合，便于在紫外灯下观察，D错误。 故选D。 6．（2025·广东佛山·二模）某兴趣小组以香蕉为原材料进行DNA粗提取、扩增及电泳鉴定系列实验。下列叙述正确的是（　　） A．提取DNA时，研磨后需用滤纸进行过滤 B．可利用DNA在酒精中溶解度大的特点来提取DNA C．琼脂糖熔化前需将适量的核酸染料加入并进行混匀 D．若DNA带负电，则凝胶加样孔应位于电泳槽负极侧 【答案】D 【分析】在鉴定DNA 时，可使用二苯胺试剂。将提取的DNA与二苯胺试剂混合，在沸水浴的条件下，DNA会与二苯胺反应呈现蓝色，从而证明提取到的物质是DNA。加入冷却的酒精，DNA不溶于酒精，而某些蛋白质等杂质可溶于酒精，从而使DNA沉淀析出，达到进一步纯化的目的。 【详解】A、研磨液需用纱布进行过滤，而不是用滤纸，以保证提取到更多的DNA，A错误； B、蛋白质可溶于酒精，而DNA在冷酒精在溶解度很低，所以在提取DNA时加入酒精，使溶于酒精的蛋白质等物质溶解，而让DNA析出，B错误； C、在沸水浴或微波炉内加热至琼脂糖熔化，稍冷却后加入适量核酸染料混匀，C错误； D、靠近加样孔的一端为负极，接通电源，带负电的DNA分子向正极移动而使DNA逐渐分离，D正确。 故选D。 7．（2025·江西新余·二模）甲型流感病毒的抗原性与感染性与其表面的R蛋白（血凝素蛋白）密切相关，现利用基因工程的方法生产相关疫苗。图甲为构建R蛋白基因表达载体的过程，图乙为重组质粒被相关酶切后的电泳结果。下列相关叙述正确的是（　　） A．图甲过程中至少需要应用到逆转录酶、RNA聚合酶、DNA连接酶 B．电泳技术可以用于人类亲子鉴定、生物间亲缘关系的鉴定 C．构建好的重组质粒长度共2000bp，据图乙可推测BamHI在重组质粒上有2个酶切位点 D．PCR扩增R基因中，微量离心管、枪头和移液器等在使用前均须消毒处理 【答案】B 【分析】1、图甲中①是逆转录过程，②是经过复制形成双链cDNA，③是将R蛋白基因和质粒结合形成基因表达载体，图乙是用限制酶切割后形成的电泳图。 2、PCR原理：在高温作用下，打开DNA双链，每条DNA单链作为母链，以4种游离脱氧核苷酸为原料，合成子链，在引物作用下，DNA聚合酶从引物3'端开始延伸DNA链，即DNA的合成方向是从子链的5'端自3端延伸的。实际上就是在体外模拟细胞内DNA的复制过程。DNA的复制需要引物，其主要原因是DNA聚合酶只能从3'端延伸DNA链。 3、PCR反应过程是：变性→复性→延伸。 【详解】A、图甲获得重组质粒过程，需要逆转录、形成双链cDNA分子以及R蛋白基因与质粒的重组，所以至少需要应用到逆转录酶、DNA聚合酶、限制酶、DNA连接酶，不需要RNA聚合酶，A错误； B、不同生物的DNA切割后长度不同，切割后再进行电泳，可以用于人类亲子鉴定、生物间亲缘关系的鉴定，B正确； C、用HindIII将质粒2000bp切割后形成了200bp、400bp和1400bp共3个片段，说明HindIII在重组质粒上有3个酶切位点，而用HindIII和BamHl将质粒切割后形成了200bp、420bp、560bp的片段，2000=420×2+560+200×3，所以一共形成了6个片段，因此共有6个酶切位点，因此BamHI在重组质粒上有6-3=3个酶切位点，C错误； D、PCR扩增R基因中，微量离心管、枪头和移液器等在使用前均须高压蒸汽灭菌，D错误。 故选B。 二、多选题 8．（2025·江苏·二模）与DNA相关的实验，下列叙述正确的有（    ） A．利用DNA在酒精中溶解度较大的特性提取DNA B．粗提取的DNA中可能含有蛋白质、脂质等杂质 C．用二苯胺试剂鉴定DNA时，沸水浴加热后呈蓝色 D．PCR扩增产物通常利用琼脂糖凝胶电泳技术进行鉴定 【答案】BCD 【分析】DNA粗提取和鉴定的原理：（1）DNA的溶解性:DNA和蛋白质等其他成分在不同浓度NaC溶液中溶解度不同；DNA不溶于酒精溶液，但细胞中的某些蛋白质溶于酒精；DNA对酶、高温和洗涤剂的耐受性。（2）DNA的鉴定：在沸水浴的条件下，DNA遇二苯胺会被染成蓝色。 【详解】A、DNA在酒精（尤其是体积分数为95%的冷酒精）中的溶解度较低，实验中通过加入酒精使DNA析出，而蛋白质等杂质溶解，A错误； B、粗提取的DNA可能残留细胞破碎后的杂质，如蛋白质（未完全被酶分解或盐析去除）、脂质（细胞膜成分）等，B正确； C、二苯胺试剂与DNA在沸水浴条件下反应生成蓝色产物，C正确； D、PCR扩增产物通过琼脂糖凝胶电泳分离，DNA片段因大小不同呈现不同迁移速率。凝胶经核酸染料染料染色，在紫外灯照射下DNA会发出荧光，据此可判断产物是否存在及分子量大小，D正确。 故选BCD。 9．（2025·河北张家口·二模）下列关于“DNA粗提取和鉴定实验”与“DNA片段的扩增及电泳鉴定实验”的叙述，正确的是（　　） A．“DNA粗提取和鉴定实验”中可能进行两次离心 B．在一定温度下，DNA遇二苯胺试剂会呈现蓝色 C．在凝胶中DNA分子的迁移速率与其构象无关 D．根据DNA片段大小，用电泳缓冲液配制琼脂糖溶液进行鉴定 【答案】ABD 【分析】DNA不溶于酒精，而某些蛋白质溶于酒精；鉴定DNA时，需要先将DNA溶解在NaCl溶液中，再与二苯胺试剂溶液混合，并在水浴加热条件下呈现蓝色；耐高温的DNA聚合酶在延伸环节时进行子链的合成。 【详解】A、“DNA粗提取和鉴定实验”中可能进行两次离心，第一次是将洋葱研磨液倒入塑料离心管中低速离心，收集上清液，第二次是将上清液倒入塑料离心管中高速离心，分离沉淀物，A正确； B、在沸水浴加热条件下，DNA遇二苯胺试剂会呈现蓝色，B正确； C、在凝胶中DNA分子的迁移速率与DNA分子的大小、构象均有关，C错误； D、PCR的产物一般通过琼脂糖凝胶电泳来鉴定。在凝胶中DNA分子的迁移速率与凝胶的浓度、DNA分子的大小和构象等有关，因此根据DNA片段大小，用电泳缓冲液配制琼脂糖溶液进行鉴定，D正确。 故选ABD。 10．（2025·河北石家庄·二模）关于“DNA片段的扩增及电泳鉴定”的实验，下列叙述错误的是（　　） A．通过琼脂糖凝胶电泳可鉴定PCR产物 B．待指示剂前沿迁移到达凝胶加样孔边缘时，需停止电泳以防DNA跑出凝胶 C．PCR利用了DNA的热变性原理，一次PCR一般要经历30次循环 D．琼脂糖凝胶中的DNA分子可直接在波长为300nm的紫光灯下被检测出来 【答案】BD 【分析】PCR的产物一般通过琼脂糖凝胶电泳来鉴定。电泳的原理：待分离样品中各种分子带电性质的差异以及分子本身的大小、性状不同，使带电分子产生不同的迁移速度，从而实现样品中各种分子的分离。 【详解】A、PCR的产物一般通过琼脂糖凝胶电泳来鉴定。在凝胶中DNA分子的迁移速率与凝胶的浓度、DNA分子的大小和构象等有关，A正确； B、待指示剂前沿迁移至凝胶边缘时停止电泳，以防止样品流失到缓冲液中，B错误； C、PCR是一种体外扩增DNA片段的技术，利用了DNA热变性原理，通过调节温度来控制DNA双链的解聚与结合。一次PCR一般要经历30次循环，每次循环可分为变性、复性、延伸，C正确； D、琼脂糖凝胶中的DNA分子需染色后，才可在波长为300nm的紫外灯下被检测出来，D错误。 故选BD。 三、实验题 11．（2025·甘肃白银·二模）CRISPR/Cas9基因编辑技术可用于基因敲除，其主要包含两种成分——Cas9蛋白及小向导RNA（sgRNA），其作用原理如图1所示。某科研团队利用该技术对拟南芥的Sv14与Sv15基因进行敲除，探究Sv14、Sv15基因对拟南芥花粉育性的影响。请回答下列有关问题： (1)将Cas9蛋白及sgRNA导入拟南芥细胞，我国科学家独创的一种方法是 。据图1分析可知，Cas9蛋白的功能相当于 酶。 (2)①为了提高敲除拟南芥的Sv14、Sv15基因的成功率，一般先敲除其中一个基因获得单突变体，在此基础上继续敲除另一个基因获得双突变体。已知拟南芥的Sv14、Sv15基因模板链碱基序列如图2所示。 请根据Sv14、Sv15基因模板链碱基序列设计敲除Sv14、Sv15基因过程中所用到起向导作用的sgRNA（若sgRNA为10bp，且选取模板链NGG之前的序列设计，“N”表示任意核苷酸）。 Sv14—sgRNA：5′— —3'。 Sv15—sgRNA：5′— —3'。 ②为验证是否完全敲除，可提取待测拟南芥的总DNA，加入 种引物进行PCR扩增，PCR产物长度常采用 技术鉴定，理论上出现 种条带说明成功获得双突变体。 (3)对于成功转化的拟南芥植株还需进一步进行表型鉴定，研究人员选取不同转基因拟南芥采集花粉，观察并计算花粉萌发率，结果见下表。 组别 野生型 Sv14突变体 Sv15突变体 Sv14、Sv15双突变体 花粉萌发率 95.0% 39.8% 80.0% 30.0% 根据以上表格，可得出的结论是 。为进一步验证这一结论，请用基因工程手段以Sv14、Sv15双突变体为材料设计实验并预测结果： （基因工程具体操作不做要求）。 【答案】(1) 花粉管通道法 限制/限制性内切核酸 (2) UCUCUAGUUA AGAGGGCAGU 4/四 琼脂糖凝胶电泳 0 (3) So14、So15基因可以促进拟南芥花粉萌发，并且So14基因起主要作用 在Sv14、Sv15双突变体中导入Sv14基因，观察花粉萌发率是否与Sv15突变体一致，若花粉萌发率恢复至80．0%，则结论正确 【分析】基因工程技术的基本步骤包括目的基因的筛选和获取；基因表达载体的构建；将目的基因导入受体细胞；目的基因的检测与鉴定。 【详解】（1）将目的基因导入植物细胞，我国科学家独创的一种方法是花粉管通道法。据图1分析可知，Cas9蛋白能识别并剪切DNA序列，相当于限制酶。 （2）①题目给出了拟南芥的Sv14、Sv15基因模板链碱基序列，因此，设计的sgRNA应当是与给出的序列互补配对的。题目特别强调sgRNA为10bp，且选取模板链NGG之前的序列设计，“N”表示任意核苷酸，所以先找出Sv14与Sv15基因模板链碱基序列NGG之前包含10个碱基的序列，与之互补的RNA序列即为相应的sgRNA序列，如下图方框部分所示。 特别需要注意的是，写出互补序列以后，注意方向调整为5′→3'，所以Svl4—sgRNA为5′—UCUCUAGUUA—3'，Sv15—sgRNA为5′—AGAGGGCAGU—3'。 ②为验证是否完全敲除，可提取待测拟南芥的总DNA，加入4种引物（2对引物），利用PCR扩增2种基因，PCR产物长度常采用琼脂糖凝胶电泳技术鉴定，若成功获得双突变体，则待测个体的总DNA无相应的目的基因，所以理论上无法扩增出条带，即出现0种条带。 （3）根据表格，可得出结论为Sv14、Sv15基因可以促进拟南芥花粉萌发，并且Sv14基因起主要作用。为进一步验证这一结论，可以在Sv14、Sv15双突变体中导入Sv14基因，观察花粉萌发率是否与Sv15突变体一致，若花粉萌发率恢复至80.0%，则结论正确。 基因工程的基本操作程序和应用考点02 一、单选题 1．（2025·甘肃金昌·二模）反向PCR是一种通过已知序列设计引物对未知序列进行扩增的技术，其过程如下图所示。下列叙述正确的是（　　） A．应选择引物1和引物4进行PCR扩增 B．设计的引物中GC碱基含量越高，复性时需要的温度越低 C．PCR产物是包含所有已知序列和未知序列的环状DNA分子 D．整个过程需用到限制酶、DNA连接酶、耐高温的DNA聚合酶及逆转录酶 【答案】A 【分析】PCR只能扩增两端序列已知的基因片段，反向PCR可扩增一段已知序列的两端未知序列。反向PCR的目的在于扩增一段已知序列旁侧的DNA，也就是说这一反应体系不是在一对引物之间而是在引物外侧合成DNA。 【详解】A、DNA子链合成的方向为5'端到3'端，因此要通过已知序列设计引物对未知序列进行扩增，应选择引物1和引物4，A正确； B、GC碱基含量越高，碱基对间氢键的含量越多，复性时需要的温度越高，B错误； C、PCR产物是包含所有已知序列和未知序列的链状DNA分子，扩增产物还需要经过限制酶切割后再用DNA连接酶连接才能形成环状DNA，C错误； D、整个过程需用到限制酶、DNA连接酶和耐高温的DNA聚合酶，不需要逆转录酶，D错误。 故选A。 2．（2025·山东泰安·二模）双向启动子可同时结合两个RNA聚合酶来驱动下游基因的表达，研究人员构建了如图所示的表达载体，以检测双向启动子作用效果。下列分析正确的是（　　） A．表达载体中GUS基因和LUC基因转录时使用同一条DNA单链为模板 B．为连入GUS基因，需用SalⅠ和SphⅠ酶切已整合了双向启动子及LUC基因的质粒 C．在培养基中添加壮观霉素可筛选出成功导入表达载体的受体细胞 D．通过观察是否出现荧光和蓝色物质可检测双向启动子的作用效果 【答案】D 【分析】基因工程技术的基本步骤：（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成；（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等；（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法；（4）目的基因的检测与鉴定：分子水平上的检测：个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。 【详解】A、转录是从子链（mRNA）5'→3'方向进行的，由图可知，双向启动子位于GUS基因和LUC基因之间，所以GUS基因和LUC基因转录时的模板链不是DNA分子的同一条链，A错误； B、如果用SphI 酶切已整合了双向启动子及LUC基因的质粒时就会破坏LUC基因，B错误； C、T-DNA中含有潮霉素抗性基因，而不包含壮观霉素抗性基因，因此可以通过在培养基中添加潮霉素来筛选成功导入表达载体的受体细胞，C错误； D、双向启动子如果正常表达，就会合成荧光素酶和β-葡萄糖苷酶，催化底物分别产生荧光或生成蓝色物质，从而确定双向启动子的作用，D正确。 故选D。 3．（2025·广东清远·二模）新一代人工智能模型ESM3首次实现了对蛋白质序列、结构和功能的统一推理，并成功“设计”出了一种全新的荧光蛋白，新荧光蛋白的生成相当于模拟了5亿年的进化过程。下列叙述错误的是（　　） A．人工智能模型ESM3与蛋白质工程一样可以设计自然界没有的蛋白质 B．生物进化中产生的基因突变可为基因工程改造生物提供更多的基因资源 C．基因工程能够阻止生物进化过程中有害基因的出现，因为可以精准编辑基因 D．人工智能模型ESM3可解码生物语言，因为自然界的生物体都有相同的遗传密码 【答案】C 【分析】蛋白质的结构：蛋白质的多样性与氨基酸的种类、数目、排序、肽链的盘曲折叠方式、形成的空间结构有关。氨基酸通过脱水缩合的方式连接形成肽链，脱水缩合的过程中，每形成一个肽键就脱去一分子的水。脱去的水分子数=肽键数=氨基酸数-肽链数。 【详解】A、蛋白质工程是通过对基因进行改造或合成，来设计自然界没有的蛋白质。由题干可知人工智能模型ESM3能成功“设计”出一种全新的荧光蛋白，所以人工智能模型ESM3与蛋白质工程一样可以设计自然界没有的蛋白质，A正确； B、基因突变能产生新的基因，生物进化过程中产生的基因突变可为基因工程改造生物提供更多的基因资源，基因工程可以利用这些基因资源实现对生物的定向改造，B正确； C、基因工程是按照人们的意愿，对生物的基因进行定向改造，但它不能阻止生物进化过程中有害基因的出现。生物进化过程中基因突变具有不定向性，有害基因的产生是随机发生的，基因工程无法对其进行阻止，C错误； D、自然界的生物体都有相同的遗传密码，这是生物界的共性之一。人工智能模型ESM3可解码生物语言，正是基于这种统一的遗传密码，D正确。 故选C。 4．（2025·广东清远·二模）某发光蘑菇可利用咖啡酸转化为荧光素，从而实现持续发光。科学家将蘑菇的发光基因导入矮牵牛中培育出能持续发荧光的矮牵牛，且发现细胞代谢越旺盛的部位发光强度越大。下列说法错误的是（　　） A．可使用农杆菌转化法将荧光素酶基因导入到矮牵牛细胞中 B．矮牵牛导入了荧光素酶基因可发荧光，推测矮牵牛含有咖啡酸 C．可根据植株在不同时间的发荧光强度监测植物的动态发育过程 D．通过基因工程技术获得的发荧光矮牵牛属于新物种 【答案】D 【分析】基因工程技术的基本步骤: (1)目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。 (2)基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。 (3)将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样，将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法。(4)目的基因的检测与鉴定：分子水平上的检测和个体水平上的鉴定。 【详解】A、杆菌转化法是将目的基因导入植物细胞的常用方法。将荧光素酶基因导入到矮牵牛细胞中，可使用农杆菌转化法，A正确； B、已知某发光蘑菇可利用咖啡酸转化为荧光素从而实现持续发光，矮牵牛导入了荧光素酶基因后可发光，说明矮牵牛具备将相关物质转化为荧光素的条件，由此可推测矮牵牛含有咖啡酸，B正确； C、因为细胞代谢越旺盛的部位发光强度越大，而植物在不同的发育阶段，细胞代谢情况不同，所以可根据植株在不同时间的发光强度监测植物的动态发育过程，C正确； D、新物种形成的标志是产生生殖隔离。通过基因工程技术获得的发光矮牵牛，与原矮牵牛之间并没有产生生殖隔离，所以不属于新物种，D错误。 故选D。 5．（2025·江西赣州·二模）科研人员利用PCR技术扩增人乳铁蛋白基因，并进行电泳鉴定。下列叙述正确的是（　　）      A．目的基因扩增时，应添加的引物组合为引物Ⅰ、Ⅳ或引物Ⅱ、Ⅲ B．PCR循环6次可得到5种DNA分子，其中等长的DNA分子共52个 C．电泳所需缓冲液和酶应分装成小份在-20℃储存，使用前在室温下解冻 D．鉴定DNA时，应向提取的DNA中加入二苯胺试剂并置于沸水中加热 【答案】B 【分析】PCR是聚合酶链式反应的缩写。它是一项根据DNA半保留复制的原理，在体外提供参与DNA复制的各种组分与反应条件，对目的基因的核苷酸序列进行大量复制的技术。PCR每个循环包括变性、复性、延伸三个步骤，每一次循环后目的基因的量可以增加一倍，即成指数形式扩增。 【详解】A、PCR技术扩增目的基因时，引物应与模板链的3'端互补配对，且两条引物分别结合在两条模板链上，这样才能使子链从5'端向3'端延伸。观察可知，应添加的引物组合为引物Ⅱ、Ⅲ，A错误； B、图示中的 PCR 循环 6 次，可以得到 2 种“长链/中链”DNA 分子，2 种“中链/短链”DNA 分子，1 种“短链/短链”DNA 分子，共 5 种；其中等长 DNA 分子共 26-2×6=52 个，B正确； C、电泳所需缓冲液应分装成小份，并在-20℃储存，使用前从冰箱拿出放在冰块上缓慢融化，C错误； D、鉴定 DNA 时，应先将提取的 DNA 部分溶于装有 NaCl 溶液的试管中，然后向试管内加入二苯胺试剂，再将试管置于沸水中加热，D错误。 故选B。 6．（2025·山东泰安·二模）结肠癌是发病率高的癌症之一，患者血清中的M蛋白含量显著降低，据此推测M基因可能是一种抑癌基因。研究人员利用数据库筛选到一种可促进M基因转录的E蛋白。推测E蛋白通过与M基因启动子区域结合，促进M基因的表达。将相应质粒分别转入两组相同的细胞中，一段时间后收集细胞裂解液，检测荧光强度。结果显示甲组荧光强度明显高于乙组，从而证实推测。请从下列选项中选择转入甲组细胞和转入乙组．细胞的表达载体（    ） A．ac  af B．bc  bf C．bd  be D．ad  ae 【答案】A 【分析】胰岛素是唯一能降低血糖的激素，其作用分为两个方面：促进血糖氧化分解、合成糖原、转化成非糖类物质；抑制肝糖原的分解和非糖类物质转化。当胰岛素和其受体结合后，一方面促进葡萄糖的氧化分解、合成糖原和转化形成非糖类物质，另一方面使细胞膜上的葡萄糖转运蛋白增加，促进葡萄糖进入细胞，从而使血糖浓度降低。 【详解】验证E蛋白通过与M基因启动子区域结合，促进M基因的表达，是通过荧光强度体现的，所以实验中组成型启动子与E基因结合，M基因启动子和突变的M基因启动子是与荧光素酶基因结合，因此转入甲组细胞的表达载体有ac，而转入乙组细胞的表达载体有af，A正确，BCD错误。 故选A。 7．（2025·江苏南京·二模）生物技术与工程学相结合，可研究、设计和加工生产各种生物工程产品。下列叙述错误的是（　　） A．二倍体植株的花药离体培养得到的单倍体植株可用于基因突变的研究 B．由iPS细胞产生的特定细胞，可以在新药的测试中发挥重要作用 C．将含指示剂的凝胶载样缓冲液与PCR产物混合后滴入加样孔指示电泳进程 D．大量制备一种单克隆抗体时需要用大量的B细胞和骨髓瘤细胞进行融合 【答案】D 【分析】现在，用iPS细胞治疗阿尔茨海默病、心血管疾病等领域的研究也取得了新进展。因为诱导过程无须破坏胚胎，而且iPS细胞可以来源于病人自身的体细胞，将它移植回病人体内后，理论上可以避免免疫排斥反应，所以科学家普遍认为iPS细胞的应用前景优于胚胎干细胞。 【详解】A、二倍体花药离体培养的单倍体植株只有一个染色体组，控制每种性状的基因只有一个，该基因的突变会直接影响生物的性状，因此二倍体植株的花药离体培养得到的单倍体植株可用于基因突变的研究，A正确； B、iPS细胞为多功能干细胞，能分裂分化产生的特定细胞，可以在新药的测试中发挥重要作用，B正确； C、电泳指示剂迁移速度较PCR产物快，因此将含指示剂的凝胶载样缓冲液与PCR产物混合后滴入加样孔指示电泳进程，C正确； D、单克隆抗体是由一个能产生特定抗体的杂交瘤细胞经分裂、分泌而来的，因此大量制备一种单克隆抗体时并不需要用大量的B细胞和骨髓瘤细胞进行融合，D错误。 故选D。 8．（2025·山东泰安·二模）科学家利用动物乳腺生物反应器生产某病毒的N蛋白，用于制备该病毒的疫苗，基本流程如图。下列相关叙述错误的是（    ） A．精子获能后才可受精，卵细胞通过透明带反应和卵细胞膜反应来防止多精入卵 B．过程①在基因工程中为核心步骤，甲为基因表达载体，过程②需提供无菌无毒环境 C．过程③将囊胚移植入代孕羊驼之前，需用促性腺激素对代孕母羊驼进行同期发情处理 D．欲获得转基因母羊驼，需在胚胎移植前取滋养层细胞做DNA分析鉴定性别 【答案】C 【分析】胚胎工程是指对动物早期胚胎或配子所进行的多种显微操作和处理技术。包括体外受精、胚胎移植、胚胎分割移植、胚胎干细胞培养等技术。胚胎工程的许多技术，实际是在体外条件下，对动物自然受精和早期胚胎发育条件进行的模拟操作。 【详解】A、精子获能后才可受精，卵细胞通过透明带反应和卵细胞膜反应来防止多精入卵，卵细胞通过透明带反应（第一道屏障）和卵细胞膜反应（第二道屏障）阻止多精受精，A正确； B、基因工程的核心步骤是基因表达载体的构建（对应过程①），甲为基因表达载体。过程②涉及早期胚胎发育，需无菌无毒环境以避免污染和细胞死亡，B正确； C、同期发情处理的目的是使供体（提供胚胎的个体）和受体（代孕母体）的生理状态同步，通常使用孕激素而非促性腺激素。促性腺激素用于超数排卵，促进供体排出更多卵子，C错误； D、滋养层细胞是囊胚的外层细胞，可发育为胎膜和胎盘，取样不会影响胚胎发育。通过检测性染色体（如Y染色体特异性序列）可确定胚胎性别，从而选择雌性胚胎进行移植，D正确。 故选C。 9．（2025·北京海淀·二模）为合成出局部为双链的RNA用于沉默特定基因，先将目的基因X从重组质粒pHIBS切割出来，再巧妙地连接到质粒载体pUAST中，如下图，其中质粒只展示了局部。 下列叙述正确的是（　　） A．该操作过程中还需要DNA连接酶和耐高温的DNA聚合酶 B．利用B和Bg、S和Xh黏性末端相同，实现基因X与pUAST连接 C．基因X的DNA片段需要完整保留启动子和终止子区域 D．可以用E和Bg，或者Xh和K双酶切重组pUAST 【答案】B 【分析】基因工程的基本操作步骤 1、目的基因的获取：从基因组文库或 cDNA 文库筛选、PCR 扩增：设计引物扩增特定基因片段、人工合成：已知序列的短基因（如胰岛素基因）。 2、基因表达载体的构建：将目的基因与载体用限制酶切割后，通过DNA连接酶连接。 3、将重组DNA导入受体细胞 原核细胞（如大肠杆菌）：用Ca²⁺处理使其成为感受态细胞，吸收重组质粒。 真核细胞：显微注射法、农杆菌转化法、基因枪法。 4、筛选与鉴定：抗性筛选、PCR鉴定、核酸杂交、表达产物检测。 【详解】A、基因工程中，切割目的基因和载体需限制酶，连接二者需DNA连接酶；耐高温的DNA聚合酶用于PCR技术，而本题操作是切割和连接，无需PCR，A错误； B、B和Bg均产生-GATC-黏性末端（同尾酶），可互补连接。S 和Xh为另一对同尾酶，均产生-TCGA-黏性末端，切割后也能连接，利用B和Bg、S和Xh黏性末端相同，实现基因X与pUAST反向连接，B正确； C、启动子和终止子是驱动基因表达的调控序列，应存在于载体（pUAST）中，而非目的基因片段中，C错误； D、重组质粒（pUAST-基因 X）中，已不存在Bg和S酶切位点，D错误。 故选B。 10．（2025·山东青岛·二模）DNA足迹法是检测DNA序列中结合蛋白识别部位的一种方法。DNA与蛋白质结合后，由于蛋白质的保护，DNasel酶无法对这一部位进行切割，可以运用此方法来确定启动子在DNA序列中的具体位置。某DNA片段上具有一个启动子，为研究其位置，研究小组决定用DNA足迹法对其进行检测。DNA片段上的DNasel酶酶切位点及各部分的长度如图1所示。对照组和实验组均加入等量的待测DNA样液，然后加入等量的DNasel酶，通过控制酶的用量和作用时间使每个DNA分子只发生一次磷酸二酯键的断裂。酶解后将对照组和实验组分别进行电泳检测所得片段的大小，对照组得到大小分别为10bp、40bp、50bp、90bp、100bp、140bp、150bp、180bp的8个片段，实验组得到大小分别为10bp、50bp、90bp、100bp、140bp、180bp的6个片段。下列说法正确的是（　　）    A．构成启动子的基本单位是脱氧核苷酸，启动子的功能是与DNA聚合酶结合，启动转录 B．根据实验结果可以确定，启动子在DNA上的位置为A点附近 C．DNasel酶可作用于DNA的氢键和磷酸二酯键 D．为使结果更直观呈现，在DNA一端用12P进行标记，若标记在a端，则结果如图2所示 【答案】D 【分析】基因工程的工具：（1）限制酶：能够识别双链DNA分子的某种特定核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断裂；（2）DNA连接酶：连接的是两个核苷酸之间的磷酸二酯键；（3）运载体：常用的运载体：质粒、噬菌体的衍生物、动植物病毒。 【详解】A、启动子是DNA上的一部分，基本单位是脱氧核苷酸；启动子是RNA聚合酶识别并结合的部位，可以启动转录，A错误； B、结合题干信息和题图1，实验组中存在10bp、180bp的片段，说明D点能被切开；存在90bp、100bp的片段，说明B点能被切开；存在50bp、140bp的片段，说明A点能被切开；若C点能被切开，则应有40bp、150bp的片段，因此启动子在DNA上的位置为C点附近，B错误； C、DNasel酶作用于DNA的磷酸二酯键，C错误； D、A点被切开，存在50bp、140bp的片段，分析题图2，现只观察到50bp的条带而没有观察到140bp的片段，因此放射性应该标记在a端，D正确。 故选D。 11．（2025·山东青岛·二模）普通水稻含铁量极低，研究人员通过改良相关基因，培育出了铁含量比普通水稻高60%的转基因水稻。图1为改良基因及Ti质粒的示意图，该质粒含有氨苄青霉素抗性基因、LacZ基因及一些酶切位点，图2为后续培养过程。下列说法正确的是（　　）      A．需用限制酶XmaI和NheI对Ti质粒进行切割 B．培养基2与培养基3加入的生长素和细胞分裂素比例不同 C．在含氨苄青霉素的培养基中能够生长的农杆菌细胞中一定含有改良基因 D．筛选含重组质粒的农杆菌时，应该在培养基中加入β-半乳糖苷，目标菌落为蓝色 【答案】B 【分析】基因工程的基本操作程序是：目的基因的筛选与获取、基因表达载体的构建、将目的基因导入受体细胞、目的基因的检测与鉴定。 【详解】A、由图1可知：改良基因的左侧和右侧是分别用限制酶XmaⅠ和BglⅡ切割后产生的黏性末端，因此将改良基因和Ti质粒连接时，需用限制酶XmaⅠ和BglⅡ对Ti质粒进行切割，以便产生与改良基因两端相同的黏性末端，A错误； B、图2中愈伤组织经再分化过程形成转基因水稻苗，培养基2与培养基3的区别是加入的生长素和细胞分裂素比例不同，B正确； C、在含氨苄青霉素的培养基中能够生长的农杆菌细胞中不一定含有改良基因，原因是若农杆菌细胞中导入的是未携带改良基因的质粒，其只要含氨苄青霉素抗性基因，也能在含氨苄青霉素的培养基中生长，C错误； D、Lacz基因编码产生的酶能分解β-半乳糖苷，产生蓝色物质，使菌落呈现蓝色，否则菌落为白色。构建重组质粒时，Lacz基因的结构被破坏，含重组质粒的农杆菌不能分解β-半乳糖苷，菌落为白色。可见，筛选含重组质粒的农杆菌时，应该在培养基中加入β-半乳糖苷，目标菌落为白色，D错误。 故选B。 12．（2025·山东泰安·二模）染色体上的端粒DNA由短的串联重复序列组成，同种生物的该序列相同。少数缺乏端粒酶活性的肿瘤细胞可通过端粒延长替代机制（ALT）维持端粒长度。ALT机制如下：第一条染色体端粒的末端①链结合到第二条染色体端粒的末端②链上并延伸；随后①链脱离，在RNA引物和DNA聚合酶的作用下，新延长的①链被转化成双链形式。这个过程可被重复数十次，使得序列信息从一个端粒传递到另一端粒上。下列说法错误的是（    ） A．①链的延伸过程以②链作为模板，该过程不需要合成引物 B．DNA聚合酶只能从核酸片段3′端延伸，这导致端粒DNA5′端比3′端短 C．进行ALT的肿瘤细胞中端粒酶基因甲基化程度可能较高 D．非同源染色体间通过ALT机制实现了基因重组，增加了遗传的多样性 【答案】D 【分析】端粒是线状染色体末端的DNA重复序列。 端粒是线状染色体末端的一种特殊结构,在正常人体细胞中，可随着细胞分裂而逐渐缩短。 【详解】A、根据题意，第一条染色体端粒的末端①链结合到第二条染色体端粒的末端②链上并延伸，这个延伸过程以②链为模板，并且文中提到随后在RNA引物和DNA聚合酶的作用下，新延长的①链被转化成双链形式，说明延伸过程不需要引物，A正确； B、DNA聚合酶只能使子链从已有的核酸片段3'端延伸，这会导致端粒DNA在复制过程中5'端比3'端短，B正确； C、端粒酶活性缺乏的肿瘤细胞可通过ALT机制维持端粒长度，端粒酶基因甲基化程度高会抑制端粒酶活性，所以进行ALT的肿瘤细胞中端粒酶基因甲基化程度可能较高，C正确； D、非同源染色体间通过ALT机制能增加遗传的多样性，但并没有实现非同源染色体间基因的重新组合，而是染色体结构变异，D错误。 故选D。 13．（2025·山东泰安·二模）双向启动子可同时结合两个RNA聚合酶来驱动下游基因的表达，研究人员构建了如图所示的表达载体，以检测双向启动子作用效果。下列分析正确的是（    ）    A．表达载体中GUS基因和LUC基因转录时使用同一条DNA单链为模板 B．为连入GUS基因，需用Sal I和Sph I酶切已整合了双向启动子及LUC基因的质粒 C．在培养基中添加壮观霉素可筛选出成功导入表达载体的受体细胞 D．通过观察是否出现荧光和蓝色物质可检测双向启动子的作用效果 【答案】D 【分析】基因工程技术的基本步骤：（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成；（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等；（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法；（4）目的基因的检测与鉴定：分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA是否插入目的基因--DNA分子杂交技术；②检测目的基因是否转录出了mRNA--分子杂交技术；③检测目的基因是否翻译成蛋白质--抗原-抗体杂交技术；个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。 【详解】A、转录是从子链（mRNA）5'→3'方向进行的，由图可知，双向启动子位于GUS基因和LUC基因之间，所以GUS基因和LUC基因转录时的模板链不是DNA分子的同一条链，A错误； B、如果用SphI 酶切已整合了双向启动子及LUC基因的质粒时就会破坏LUC基因，B错误； C、T-DNA中含有潮霉素抗性基因，而不包含壮观霉素抗性基因，因此可以通过在培养基中添加潮霉素来筛选成功导入表达载体的受体细胞，C错误； D、双向启动子如果正常表达，就会合成荧光素酶和β-葡萄糖苷酶，催化底物分别产生荧光或生成蓝色物质，从而确定双向启动子的作用，D正确。 故选D。 14．（2025·重庆·二模）β-半乳糖苷酶由lacZ基因编码，能将无色的X-gal分解为蓝色物质。将lacZ基因分成两段，分别放在质粒（如图）和受体菌中，表达出的两条肽-a肽和ω肽通过非共价键结合仍有相同的酶活性。在含有氨苄青霉素、X-gal、IPTG（诱导lacZ基因表达）的LB培养基上培养转化后的受体菌。下列说法正确的是（    ）    A．所有未转化菌株均能生长且呈白色，重组质粒转化的菌落呈蓝色 B．转化失败的菌落呈白色，空载体转化的菌落呈蓝色，重组质粒转化的菌落呈白色 C．转化失败的菌株无法生长，空载体转化的菌落呈蓝色，重组质粒转化的菌落呈白色 D．转化失败的菌株无法生长，空载体转化的菌落呈白色，重组质粒转化的菌落呈蓝色 【答案】C 【分析】基因工程技术的基本步骤：（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。（4）目的基因的检测与鉴定。 【详解】转化失败的菌株，即没有获得空载体，也没有获得重组质粒的菌株，该类菌株没有氨苄青霉素抗性基因，因此在含氨苄青霉素的培养基中无法生长；空载体转化的菌落含有氨苄青霉素抗性基因和完整的lacZ基因，可以在含氨苄青霉素的培养基中生长，且lacZ基因表达形成的β-半乳糖苷酶能将无色的X-gal分解为蓝色物质，从而使得菌落呈蓝色；重组质粒转化的菌落由于目的基因插入在lacZ基因内部导致该基因失去功能，因此菌落呈白色，C正确。 故选C。 15．（2025·山东聊城·二模）下列关于生物技术与工程的实验操作，错误的是（    ） A．将配制的酵母培养基高压蒸汽灭菌后，需要在酒精灯火焰旁倒平板 B．将接种环烧红，迅速蘸取酵母菌液在培养基上划线培养，获得单菌落 C．利用添加核酸染料的凝胶对PCR产物进行电泳后，在紫外灯下观察结果 D．配制PCR 反应体系时，加入等量的4种脱氧核糖核苷酸溶液作为扩增原料 【答案】B 【分析】PCR技术反应的条件：①稳定的缓冲溶液环境；②DNA模板；③2种引物；④四种脱氧核苷酸；⑤耐高温的DNA聚合酶等。 【详解】A、将配制的酵母培养基高温灭菌并冷却到不烫手（50℃左右）后，在酒精灯火焰旁倒平板，A正确； B、将接种环烧红，待冷却后（避免菌种被烫死)，蘸取酵母菌液在培养基上划线培养，获得单菌落，B错误； C、琼脂糖凝胶制备中加入的核酸染料能与DNA分子结合，凝胶中的DNA分子通过染色，可以在波长为300nm的紫外灯下被检测出来，C正确； D、PCR的原理是DNA复制，DNA的单体是脱氧核糖核苷酸，配制PCR反应体系时，加入4种脱氧核糖核苷酸的等量混合液作为扩增原料，D正确。 故选B。 16．（2025·山西太原·二模）反向PCR是一种用于扩增已知序列两侧的未知序列的技术，需要先将目标DNA进行环化，再以环化的DNA为模板进行扩增。现利用反向PCR技术来确定目的基因的插入位点，部分过程如下图所示，相关叙述正确的是（    ） A．过程②中根据目的基因两端的部分核苷酸序列设计引物2和3 B．过程③中复性是在72℃左右使两种引物与模板链结合 C．过程③所用的酶从引物的3'端开始连接脱氧核苷酸 D．PCR第二轮循环即可获得两条链等长的未知序列 【答案】C 【分析】PCR只能扩增两端序列已知的基因片段，反向PCR可扩增一段已知序列的两端未知序列。反向PCR的目的在于扩增一段已知序列旁侧的DNA，也就是说这一反应体系不是在一对引物之间而是在引物外侧合成DNA。 【详解】A、反向PCR是扩增已知序列两侧的未知序列，过程②设计引物时，应根据已知序列(目的基因两侧的部分核苷酸序列)来设计引物1和4，而不是引物2和3，A错误； B、PCR过程中，复性的温度一般在55-60℃左右，而72℃左右是延伸的温度，所以过程③中复性不是在72℃左右，B错误； C、DNA聚合酶只能从引物的3'端开始连接脱氧核苷酸，过程③PCR所用的酶也是从引物的3'端开始连接脱氧核苷酸，C正确； D、PCR第一轮循环得到的两条DNA链长度不同，第二轮循环得到的DNA片段也都不等长，至少要到第三轮循环才可获得两条链等长的DNA片段，所以PCR第二轮循环不能获得两条链等长的未知序列，D错误。 故选C。 17．（2025·河北邢台·二模）研究人员将胰岛素B链的第28位氨基酸替换为天冬氨酸，抑制了胰岛素聚合，从而获得速效胰岛素类似物。下列叙述正确的是（　　） A．胰岛素改造的基本思路与天然蛋白质合成过程相反 B．可通过定向诱导胰岛素基因碱基增添达到改造目的 C．改变氨基酸的种类不会影响胰岛素的空间结构 D．该产品是通过直接改造胰岛素来生产的 【答案】A 【分析】蛋白质工程是指以蛋白质分子的结构规律及其生物功能的关系作为基础，通过基因修饰或基因合成，对现有蛋白质进行改造，或制造一种新的蛋白质，以满足人类的生产和生活的需求。 【详解】A、蛋白质工程的基本途径是预期蛋白质功能→设计预期的蛋白质结构→推测应有氨基酸序列→找到对应的脱氧核苷酸序列（基因），胰岛素改造的基本思路与天然蛋白质合成过程（基因→蛋白质合成）相反，A正确； B、可通过定向诱导胰岛素基因碱基替换达到第28位氨基酸替换为天冬氨酸的目的，B错误； C、氨基酸的种类及排列顺序影响蛋白质的空间结构，C错误； D、蛋白质工程最终还是回到基因工程上来解决蛋白质的合成，即改造胰岛素的过程实际是改造胰岛素基因的过程，D错误。 故选A。 18．（2025·重庆·二模）下图为科研人员培育双抗性（抗虫和抗草甘膦）转基因烟草的部分过程示意图。下列说法错误的是（    ） 注：“Cry1Ac-2．5”表示人工合成杀虫基因，“GR79 EPSPS”表示草甘膦抗性基因，“Ω”表示增强基因表达的序列。 A．图中的①结构是 RNA 聚合酶识别和结合的部位 B．双抗性烟草培育过程中抗草甘膦基因作为标记基因筛选重组 DNA C．图中“转基因植株”一定具有抗草甘膦和抗虫的特性 D．构建植物表达载体的过程中需要使用限制酶和 DNA 连接酶 【答案】C 【分析】基因工程的基本操作步骤主要包括四步：①目的基因的获取；②基因表达载体的构建；③将目的基因导入受体细胞；④目的基因的检测与表达。其中，基因表达载体的构建是基因工程的核心。 【详解】A、在基因表达载体中，启动子是 RNA 聚合酶识别和结合的部位，图中的①结构位于基因的上游，应为启动子，A正确； B、在双抗性烟草培育过程中，可用抗草甘膦基因作为标记基因筛选重组 DNA，在含草甘膦的培养基上能存活的重组 DNA均含有抗草甘膦基因，B正确； C、虽然将含有抗虫基因和抗草甘膦基因的表达载体转入了烟草细胞并培育成植株，但目的基因可能存在不表达或表达量不足等情况，所以图中 “转基因植株” 不一定具有抗草甘膦和抗虫的特性，C错误； D、构建植物表达载体时，需要用限制酶切割含有目的基因的 DNA 片段和载体，然后用 DNA 连接酶将目的基因和载体连接起来，形成重组 DNA 分子，D正确。 故选C。 19．（2025·甘肃白银·二模）关于“DNA的粗提取与鉴定”和“DNA片段的扩增及电泳鉴定”的实验操作，下列说法错误的是（    ） A．取洋葱研磨液的上清液，加入体积相等的、预冷的酒精溶液（体积分数为 95%），离心后管底的沉淀物为粗提取的DNA B．将提取的白色丝状物溶于2mol/L的NaCl溶液中，再加二苯胺试剂并进行沸水浴，用于鉴定DNA C．电泳鉴定实验中，将温热的琼脂糖溶液迅速倒入模具后再加入核酸染料 D．电泳时，接通电源后，待指示剂前沿迁移接近凝胶边缘时，停止电泳 【答案】C 【分析】DNA粗提取和鉴定的原理：（1）DNA的溶解性：DNA和蛋白质等其他成分在不同浓度NaCl溶液中溶解度不同；DNA不溶于酒精溶液，但细胞中的某些蛋白质溶于酒精。（2）DNA的鉴定：在沸水浴的条件下，DNA遇二苯胺会被染成蓝色。 【详解】A、取洋葱研磨液的上清液，加入体积相等的、预冷的酒精溶液（体积分数为 95%），离心后管底的沉淀物为粗提取的DNA，A正确； B、将提取的白色丝状物溶于2mol/L的NaCl溶液中，再加二苯胺试剂并进行沸水浴，与DNA反应呈蓝色，用于鉴定DNA，B正确； C、电泳鉴定实验中，应该在微波炉中融化琼脂糖，稍冷却后加入核酸染料混匀，然后再将温热的琼脂糖溶液迅速倒入模具，C错误； D、电泳时，接通电源后，待指示剂溴酚蓝前沿迁移接近凝胶边缘时，停止电泳，D正确。 故选C。 20．（2025·四川广安·二模）如图为人类胚胎发育到第6周和第12周时两种珠蛋白基因的表达情况。下列叙述正确的是（    ） A．DNA甲基化不会改变生物的基因型和表型 B．胚胎发育的过程中，DNA甲基化是可逆的 C．胚胎发育的不同阶段，基因表达情况是完全不同的 D．启动子甲基化可能导致DNA聚合酶不能识别和结合 【答案】B 【分析】生物体基因的碱基序列保持不变，但基因表达和表型发生可遗传变化的现象，叫做表观遗传。 【详解】A、DNA甲基化不会改变生物的基因型，但会改变生物的表型，A错误； B、据图可知，在胚胎发育的过程中，DNA的甲基化是可逆的，B正确； C、胚胎发育的不同阶段，基因的表达情况不完全相同，C错误； D、启动子的作用是启动转录，启动子是RNA聚合酶识别和结合的部位，所以启动子甲基化可能导致RNA聚合酶不能识别和结合，D错误。 故选B。 21．（2025·甘肃·二模）基因工程在农牧业、医药卫生和食品工业等多方面的应用发展迅速。下图表示利用基因工程技术生产人血清白蛋白的两条途径。下列叙述错误的是（    ） A．扩增目的基因时，利用耐高温的DNA聚合酶从引物a、b的3端进行子链合成 B．目的基因要与能在绵羊乳腺细胞中特异性表达的基因的启动子等调控元件重组在一起 C．若目的基因是从人的细胞内提取mRNA经逆转录形成的，则该目的基因中不含启动子序列 D．可以利用农杆菌转化法将含有目的基因的重组质粒直接整合到受体植物细胞的染色体DNA上 【答案】D 【分析】将目的基因导入植物细胞常用农杆菌转化法，农杆菌中的Ti质粒上的T-DNA可整合到受体细胞的染色体DNA上。基因表达载体常包括目的基因、启动子、终止子、标记基因。标记基因是为了鉴别受体细胞中是否含有目的基因，从而将含有目的基因的细胞筛选出来。 【详解】A、扩增目的基因时，利用耐高温的DNA聚合酶从引物a、b的3'-端进行子链合成，A错误； B、为了让目的基因在乳腺细胞中特异性表达，目的基因要与能在绵羊乳腺细胞中特异性表达的基因的启动子等调控元件重组在一起，B正确； C、mRNA是由基因启动子后面的序列编码而来的，若某基因是从人的细胞内提取 mRNA 经逆转录形成的，则该基因中不含启动子序列，C正确； D、农杆菌中的Ti质粒上的T-DNA可转移至受体细胞，并且整合到受体细胞染色体的DNA上，根据农杆菌的这一特点，将目的基因插入到Ti质粒的T-DNA上，通过农杆菌的转化作用，就可以把目的基因整合到植物细胞中染色体的DNA上，D错误。 故选D。 22．（2025·浙江杭州·二模）同尾酶指识别位点不同但能切出相同黏性末端的限制酶；同裂酶指具有相同识别序列的限制酶(切割位点相同或不同均可)。几种基因工程中常用的限制酶如表所示。下列叙述错误的是（　　） 限制酶的名称 识别和切割位点 HinPⅡ 5-G↓CGC-3' GlaⅠ 5-GC↓GC-3' HhaⅠ 5-GCG↓C-3' HpaⅡ 5'-C↓CGG-3' NarⅠ 5'-GG↓CGCC-3' A．HinP1I和HhaI为同裂酶，切出的黏性末端不同 B．HinP1I和HpaII切割的产物连接后，其序列不能被GlaI切割 C．HinP1I和NarI为同尾酶，它们切割的产物连接后的序列不能被GlaI切割 D．某质粒仅含1个GlaI的识别位点，则该质粒能被NarI切割的概率为1/16 【答案】C 【分析】限制酶能够识别双链DNA分子的某种特定核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断裂，形成黏性末端或平末端。 【详解】A、同裂酶是指具有相同识别序列的限制酶。HinPⅡ识别和切割位点是5'-G↓CGC-3'，HhaⅠ识别和切割位点是5'-GCG↓C-3'，二者识别序列均为GCGC，所以HinPⅡ和HhaⅠ为同裂酶。 判断黏性末端是否不同：HinPⅡ切割后产生的黏性末端是 -G和CGC- ，HhaⅠ切割后产生的黏性末端是 -GCG和C- ，二者黏性末端不同，A正确； B、HinPⅡ识别和切割位点是5'-G↓CGC-3'，HpaⅡ识别和切割位点是5'-C↓CGG-3'，二者切割产物连接后的序列为 -GCGG- 。GlaⅠ识别和切割位点是5'-GC↓GC-3'，连接后的 -GCGG- 序列不能被GlaⅠ识别和切割，B正确； C、同尾酶是指识别位点不同但能切出相同黏性末端的限制酶。HinPⅡ识别和切割位点是5'-G↓CGC-3'，NarⅠ识别和切割位点是5'-GG↓CGCC-3'，二者切割后产生的黏性末端均为 -GCG和C- ，所以HinPⅡ和NarⅠ为同尾酶。 分析连接后的序列能否被GlaⅠ切割：HinPⅡ和NarⅠ切割产物连接后的序列为 -GCGC- ，GlaⅠ识别和切割位点是5'-GC↓GC-3'，该序列能被GlaⅠ识别和切割，C错误； D、GlaⅠ识别和切割位点是5'-GC↓GC-3'，NarⅠ识别和切割位点是5'-GG↓CGCC-3'，可以看出NarⅠ识别位点包含了GlaⅠ的识别位点。某质粒仅含1个GlaⅠ的识别位点，由于DNA是双链结构，从概率角度看，随机出现GlaⅠ识别位点（GC↓GC）的概率为 (1/4)  4 =1/256，而NarⅠ识别位点（GG↓CGCC）包含GlaⅠ识别位点，在仅含1个GlaⅠ识别位点的情况下，该质粒能被NarⅠ切割的概率为1/16（因为在GlaⅠ识别位点基础上，前后各增加一个碱基，共16种可能情况，其中有一种是NarⅠ的识别位点），D正确。 故选C。 23．（2025·山西临汾·二模）目的基因A含有100对碱基，其中腺嘌呤占30%，现利用目的基因A片段两侧的特异性序列设计引物I、引物Ⅱ，用PCR技术扩增该目的基因，结构如下图所示。PCR扩增共循环50次。下列说法错误的是（　　）    A．PCR仪实质上是一台温度自动调控仪器，循环50次理论上复制50代 B．含目的基因A的DNA片段经PCR循环50次，需要两种引物共250个 C．PCR过程与体内DNA复制的方式相同，但是只需要一种酶的参与 D．若只考虑目的基因A，经PCR循环50次需要鸟嘌呤(250-1)×40个 【答案】B 【分析】PCR技术：（1）概念：PCR全称为聚合酶链式反应，是一项在生物体外复制特定DNA的核酸合成技术。（2）原理：DNA复制。（3）前提条件：要有一段已知目的基因的核苷酸序以便合成一对引物。（4）条件：模板DNA、四种脱氧核苷酸、一对引物、热稳定DNA聚合酶（Taq酶）。（5）过程：①高温变性：DNA解旋过程（PCR扩增中双链DNA解开不需要解旋酶，高温条件下氢键可自动解开）；②低温复性：引物结合到互补链DNA上；③中温延伸：合成子链。 【详解】A、PCR的实质是DNA的半保留复制，该过程需经过高温变性、低温复性、中温延伸，PCR仪实质上是一台温度自动调控仪器，循环50次理论上复制50代，A正确； B、含目的基因A的DNA片段经PCR循环50次，产生250个子代DNA，每个DNA分子需要2个引物，亲本DNA除外，故需要两种引物共251-2个，B错误； C、PCR过程与体内DNA复制的方式相同，都是半保留复制，但是只需要耐高温聚合酶的参与，C正确； D、由题意可知，目的基因A含有100对碱基，其中腺嘌呤占30%，则G占20%，为40个，若只考虑目的基因A，经PCR循环50次需要鸟嘌呤(250-1)×40个，D正确。 故选B。 24．（2025·安徽池州·二模）DREB1A 是克隆自拟南芥的逆境诱导转录因子，可以调控多个与植物干旱、高盐及低温耐性有关的功能基因表达。某科研小组通过实验研究以花生茎尖细胞作为 DREB1A 基因受体的可行性。下列叙述错误的是（    ） A．用 PCR 技术扩增DREB1A 基因,扩增n次需要引物2ⁿ⁺¹-2个 B．该实验是利用基因重组原理将DREB1A基因整合到花生基因组 C．该实验应选择合适的启动子以驱动DREB1A基因的复制和转录 D．该实验可以利用农杆菌转化法将DREB1A 基因导入花生茎尖细胞 【答案】C 【分析】基因工程育种原理：DNA重组技术（属于基因重组范畴）方法，按照人们的意愿，把一种生物的个别基因复制出来，加以修饰改造，放到另一种生物的细胞里，定向地改造生物的遗传性状。操作步骤包括：提取目的基因、目的基因与运载体结合、将目的基因导入受体细胞、目的基因的检测与表达等。 【详解】A、PCR扩增n次所需的引物数量为2n+1−2，因为新合成的子链均需要引物，A正确； B、将外源基因（DREB1A）整合到花生基因组中，属于基因工程范畴，其原理是基因重组，B正确； C、启动子的功能是启动基因的转录，而非驱动基因的复制。基因复制依赖载体上的复制原点（origin），而非启动子，C错误； D、农杆菌转化法适用于双子叶植物（如花生）的基因转化，茎尖细胞可作为受体，D正确。 故选C。 25．（2025·四川宜宾·二模）如图是将目的基因导入大肠杆菌内制备“基因工程菌”的示意图，其中引物1-4在含有目的基因的DNA上的结合位置如甲图所示，限制酶BamHI、EcoRI、HindIII在质粒上的识别位点如乙图所示。以下叙述错误的是（    ）    A．PCR过程完成4轮循环，理论上至少需加入引物30个 B．过程①中不能同时使用限制酶EcoRI和BamHI切割质粒 C．在氨苄青霉素培养基上生长的大肠杆菌就是此过程制备的工程菌 D．若已经合成了图甲所示4种引物，应选择引物1和4扩增目的基因 【答案】C 【分析】基因工程技术的基本步骤：（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法。（4）目的基因的检测与鉴定：分子水平上的检测。 【详解】A、PCR 技术大量扩增目的基因时，新合成的子链上都有一个引物，原模板链不含有引物，故缓冲液中需要加入的引物个数计算公式为2n+1-2，因此PCR过程完成4轮循环，理论上至少需加入引物24+1-2=30个，A正确； B、①是基因表达载体的构建过程；若使用EcoRⅠ切割质粒会将目的基因掐入启动子上游，目的基因不能正确表达；使用HamdⅢ切割质粒将破坏标记基因，不利于目的基因的鉴定和筛选，因此该过程中应使用限制酶 BamHⅠ切割质粒，B正确； C、在氨苄青霉素培养基上生长的大肠杆菌不一定是此过程制备的工程菌，也可能是没有导入目的基因的质粒，C错误； D、由于DNA聚合酶只能从5′→3′延伸子链，从引物的3′开始连接脱氧核苷酸，因此扩增目的基因时应选择引物1和4，D正确。 故选C。 26．（2025·贵州毕节·二模）某小组利用PCR扩增某目的基因，设计了引物A和引物B。下列相关叙述错误的是（    ） A．经过二轮循环后的产物中只含有引物A的DNA片段所占的比例为1/4 B．经过三轮循环后的产物中含有引物B的DNA片段所占的比例为1/2 C．经过四轮循环后的产物中同时含有两种引物的DNA片段所占的比例为7/8 D．耐高温的DNA聚合酶从引物的3'端延伸子链 【答案】B 【分析】PCR原理：在解旋酶作用下，打开DNA双链，每条DNA单链作为母链，以4种游离脱氧核苷酸为原料，合成子链，在引物作用下，DNA聚合酶从引物3'端开始延伸DNA链，即DNA的合成方向是从子链的5'端自3'端延伸的。实际上就是在体外模拟细胞内DNA的复制过程。DNA的复制需要引物，其主要原因是DNA聚合酶只能从3′端延伸DNA链。 【详解】A、DNA半保留复制，经过二轮循环后的产物一共有4个DNA，其中只含有引物A的DNA片段1个，只含引物B的DNA片段1个，既含引物A又含引物B的DNA片段2个，因此只含有引物A的DNA片段所占的比例为1/4，A正确； B、经过三轮循环后的产物中一共有含有8个DNA，其中1个DNA只含有引物A，一个只含有引物B，6个DNA既含有引物A又含有引物B，引物B的DNA片段所占的比例为7/8，B错误； C、经过四轮循环后的产物中一共有含有16个DNA，同时含有两种引物的DNA片段有14个，所占的比例为14÷16=7/8，C正确； D、引物是子链合成延伸基础，即DNA聚合酶从引物3'端开始延伸DNA链，也可以说子链沿着模板链的3’→5’方向延伸，D正确。 故选B。 二、多选题 27．（2025·山东·二模）Ti质粒的Vir基因表达产生的Vir蛋白能在T-DNA左右边界序列中产生切口，并复制出单链T-DNA从Ti质粒上释放后进入植物细胞。T-DNA利用左右边界序列与植物细胞DNA分子中某些序列有极强的同源性，插入植物细胞基因组中。T-DNA的生长素基因和细胞分裂素基因能使植物组织过度生长，形成瘤状组织（冠瘿），冠瘿碱合成基因使植物细胞合成并分泌冠瘿碱，为农杆菌的生长提供碳源和氮源。下列说法错误的是（    ） A．Ti质粒中的冠瘿碱合成基因与植物细胞染色体DNA整合后，其表达产物可将冠瘿碱分解 B．为保证转基因植物正常生长，Ti质粒作载体时需将生长素基因和细胞分裂素基因敲除 C．应将目的基因插入Ti质粒的T-DNA上，且不能破坏左右边界序列 D．Ti质粒作为基因工程载体时，需将Vir基因替换成标记基因，用于重组DNA分子的筛选 【答案】AD 【分析】农杆菌Ti质粒的基因被剪切后整合到植物的染色体上，因为其质粒上的细胞分裂素和生长素基因，诱发细胞异常生长和分裂，产生了过量的细胞分裂素和生长素，导致细胞过度增殖形成植物肿瘤。 【详解】A、Ti质粒中的冠瘿碱合成基因与植物细胞染色体DNA整合后，可以形成瘤状组织（冠瘿），冠瘿碱合成基因使植物细胞合成并分泌冠瘿碱，A错误； B、Ti质粒上的T-DNA的生长素基因和细胞分裂素基因能使植物组织过度生长，所以Ti质粒作载体时需将生长素基因和细胞分裂素基因敲除，B正确； C、目的基因插入Ti质粒的T-DNA，可以随T-DNA整合到受体细胞的染色体DNA上，C正确； D、Ti质粒的Vir基因表达产生的Vir蛋白能在T-DNA左右边界序列中产生切口，并复制出单链T-DNA从Ti质粒上释放后进入植物细胞。所以Vir基因不能替换成标记基因，D错误。 故选AD。 28．（2025·江西赣州·二模）2025年3月，我国科学家成功将利用CRISPR/Cas9基因编辑系统改造后的猪肝脏移植入人体。该基因编辑系统主要包括向导RNA（crRNA和tracrRNA组成的复合体）和Cas9蛋白。crRNA含有与靶基因片段配对的序列，与tracrRNA共同协助Cas9蛋白准确定位，进行如图所示的基因编辑。下列叙述正确的是（　　） A．为降低排异反应，需敲除猪抗原基因，并使用免疫抑制剂降低细胞免疫水平 B．crRNA特异性识别目标DNA分子，敲除猪抗原基因时至少要设计两种crRNA C．通过缩短crRNA来提高其特异性，可降低因错误结合而出现“脱靶”的概率 D．CRISPR/Cas9系统工作时，Cas9蛋白具有专一性，可作用于氢键和磷酸二酯键 【答案】AB 【分析】基因工程中的操作工具及其作用：①“分子手术刀”——限制酶，能够识别双链DNA分子的某种特定的核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开，因此具有专一性。②“分子缝合针”——DNA连接酶：E•coliDNA连接酶，T4DNA连接酶。③“分子运输车”——载体。 【详解】A、器官移植成功的难题之一是免疫排斥，可通过敲除猪抗原基因，同时使用免疫抑制剂降低细胞免疫水平，使接受者的白细胞不能识别移植的器官，A正确； B、根据题意，crRNA含有与靶基因片段配对的序列，可以特异性地识别目标DNA分子；要敲除一段抗原基因，需要从基因的两端分别剪切，故需要设计两种crRNA，B正确； C、提高crRNA的特异性，应适当延长序列，这样可以降低错误结合的概率，C错误； D、Cas9蛋白作用于磷酸二酯键进而可以将目标基因剪切下来，不作用于氢键，D错误。 故选AB。 29．（2025·江西鹰潭·二模）赖氨酸是人体不能合成的必需氨基酸，随着转基因技术与动物细胞工程结合和发展，我国首次利用转基因和体细胞核移植技术成功培育了高产赖氨酸转基因克隆奶牛。其基本流程为：①构建乳腺专一表达载体，②表达载体转入牛胚胎成纤维细胞（BEF），③核移植，④重组细胞的体外培养及胚胎移植，⑤检测。下列说法正确的有（    ） A．将获得的高产赖氨酸的目的基因与含有乳腺特异性启动子的相应载体连接，构建基因表达载体 B．将表达载体通过农杆菌转化将含有目的基因的T-DNA，整合到BEF细胞核的染色体的DNA上 C．将转基因的BEF与去核卵母细胞用灭活的病毒激活形成重构胚，使其完成细胞分裂和发育进程 D．重组细胞体外培养至早期胚胎，将胚胎移入代孕母牛子宫，最终生出高产赖氨酸转基因克隆奶牛 【答案】AD 【分析】基因工程技术的基本步骤： (1)目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成； (2)基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等； (3)将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样.将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法； (4)目的基因的检测与鉴定： 分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA是否插入目的基因-DNA分子杂交技术；②检测目的基因是否转录出了mRNA-分子杂交技术；③检测目的基因是否翻译成蛋白质抗原抗体杂交技术； 个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。 【详解】A、要构建乳腺专一表达载体，需将获得的高产赖氨酸的目的基因与含有乳腺特异性启动子的相应载体连接，这样才能使目的基因在乳腺细胞中特异性表达，A正确； B、农杆菌转化法一般用于将目的基因导入植物细胞，而此处是将表达载体转入牛胚胎成纤维细胞（动物细胞），常用显微注射法，B错误； C、通常用物理或化学方法（如电刺激、钙离子载体等）激活重组细胞，使其完成细胞分裂和发育进程，而不是用灭活的病毒，灭活的病毒常用于诱导动物细胞融合，C错误； D、重组细胞体外培养至早期胚胎，将胚胎移入代孕母牛子宫，经过胚胎发育，最终生出高产赖氨酸转基因克隆奶牛，这符合转基因克隆动物的培育流程，D正确。 故选AD。 30．（2025·河北·二模）图甲表示限制酶切割某双链DNA分子的图示，其中Y为某种限制酶，X表示切割的DNA长度，限制酶对应切点一定能切开。图乙表示图甲相应酶切产物电泳分离结果。下列相关叙述错误的是（　　） A．若经电泳分离后图乙没有相应电泳条带，则是PCR中延伸温度太高所致 B．由图可知，限制酶A、限制酶B分别酶切产生的黏性末端的碱基能互补配对 C．根据图乙中酶切电泳分离结果可推测，Y为限制酶B，X长度为4500bp D．限制酶A酶切电泳结果与图乙中的①相符，限制酶B酶切电泳结果与图乙中的②相符 【答案】ABC 【分析】限制性核酸内切酶酶切，是一项基于DNA限制性核酸内切酶的基因工程技术，其基本原理是利用限制性核酸内切酶对DNA上特定序列的识别，来确定切割位点并实现切割，从而获得所需的特定序列。 【详解】A、若PCR反应没有扩增出任何产物，则可能的原因是复性、延伸温度太高，也可能是引物设计出现问题等，A错误； B、酶具有专一性，不同的限制酶识别并切割不同的核苷酸序列，故限制酶A与限制酶B产生的黏性末端不一定能互补配对，B错误； C、从图乙的A+B酶一组结果可知，限制酶A和B切完后总共有4个片段，长度分别为500、1500、3500、4500，再结合①②电泳结果，可推测Y是限制酶A，X代表的碱基对数为4500，C错误； D、根据以上结论，图甲中有两个限制酶A的酶切位点，切割完后得到三个长度的片段：3500、（4500+1500）、500，正好与图乙中的①结果相符，故推测图乙中①是限制酶A处理得到的酶切产物，②是限制酶B酶切电泳结果，D正确。 故选ABC。 31．（2025·江西南昌·二模）传统抗蛇毒血清（抗体）生产成本很高，对蛇毒毒素的疗效有限。研究人员利用AI技术从头设计蛋白质以中和蛇毒毒素，成功设计出两种能够有效中和神经毒素的结合蛋白。下列说法正确的是（    ） A．传统抗蛇毒血清的制备依赖于动物免疫反应，产量低、纯度低且特异性差 B．利用AI技术设计的神经毒素结合蛋白与传统抗蛇毒血清的化学本质不同 C．AI技术可以模拟和计算结合蛋白与蛇毒毒素的结合位点，预测蛋白结构 D．AI技术的运用大幅度缩短传统实验设计的周期，减少试错实验的耗材 【答案】ACD 【分析】蛋白质工程是指以蛋白质分子的结构规律及其与生物功能的关系作为基础，通过改造或合成基因，来改造现有蛋白质，或制造一种新的蛋白质，以满足人类生产和生活的需求。 【详解】A、早期人们为了获得抗体，就向动物体内反复注射某种抗原，使动物产生抗体，然后从动物血清中分离所需抗体。用这种方法制备的抗体不仅产量低、纯度低，而且特异性差，A正确； B、利用AI技术设计的神经毒素结合蛋白与传统抗蛇毒血清的化学本质相同，都是蛋白质，B错误； C、AI技术能够模拟蛋白质与毒素的相互作用，计算结合位点，并预测蛋白质的三维结构，从而优化蛋白质结构设计，C正确； D、AI技术通过计算机模拟快速筛选有效结构，减少了传统实验中反复试错的时间和资源消耗，显著缩短研发周期并降低耗材成本，D正确。 故选ACD。 32．（2025·黑龙江哈尔滨·二模）端粒学说是细胞衰老的假说之一，研究发现，端粒缩短与DNA复制方式有关。人体细胞内DNA复制部分过程如图所示。下列叙述正确的是（    ） A．图示体现了边解旋边复制、DNA半保留复制的特点 B．图示引物为短单链核酸，复制过程中会被酶切除，形成“空白”区域 C．PCR过程中用到的A酶具有耐高温的特点 D．据图可推测端粒缩短的原因可能与新合成的子链5'端变短有关 【答案】ABD 【分析】DNA复制过程为：（1）解旋：需要细胞提供能量，在解旋酶的作用下，两条螺旋的双链解开；（2）合成子链：以解开的每一段母链为模板，在DNA聚合酶等酶的作用下，利用游离的4种脱氧核苷酸为原料，按照碱基互补配对原则，合成与母链互补的子链；（3）形成子代DNA分子：延伸子链，母链和相应子链盘绕成双螺旋结构。 【详解】A、图示过程可体现DNA边解旋边复制、半保留复制（每个新合成的DNA分子包含一条亲代链和一条新合成的子链）的特点，A正确； B、图示引物为短单链核酸，能够与模板DNA碱基互补配对，据图可知，复制过程中会被酶切除，形成“空白”区域，B正确； C、PCR过程中用到的耐高温的酶是DNA聚合酶，图示A酶属于解旋酶，C错误； D、结合图示可知，由于有冈崎片段等存在，新合成的子链5'端变短，从而导致端粒缩短，D正确。 故选ABD。 33．（2025·江西九江·二模）下图A、B所示为Ti质粒和含S基因的DNA片段及一些酶切位点，图中所示的限制酶切割位点及其所产生的末端都不相同。下列说法正确的是（    ） A．最好选用XbaⅠ和Hind Ⅲ切割含S基因的DNA片段和Ti质粒 B．PCR扩增S基因时，引物结合在S基因两条链的5'末端 C．S基因应插入到Ti质粒T—DNA的启动子与终止子之间 D．基因工程中使用的各种限制酶切割DNA所形成的末端都不相同 【答案】AC 【分析】基因工程技术的基本步骤：目的基因的获取；基因表达载体的构建；将目的基因导入受体细胞；目的基因的检测与鉴定。 【详解】A、结合图示可知，最好选用XbaⅠ和Hind Ⅲ切割含S基因的DNA片段和Ti质粒，这样可以在目的基因的两端形成不同的黏性末端，同时这两个限制酶在质粒的T-DNA中有这两个限制酶的序列各一个，进而可以保证目的基因的正向连接，A正确； B、PCR扩增S基因时，引物结合在S基因两条链的3'末端，因为引物上子链的延伸方向是5’→3’，且引物和模板链是反向平行的，B错误； C、S基因应插入到Ti质粒T—DNA的启动子与终止子之间，这样可以保证目的基因的转移和表达，C正确； D、基因工程中使用的各种限制酶切割DNA所形成的末端可能相同，即存在同尾酶，D错误。 故选AC。 34．（2025·黑龙江·二模）皂苷是分布广泛且结构复杂的天然产物，具有多种生物活性。乙酰化是皂苷最常见的修饰之一，对提高其生物活性起着重要作用。皂苷乙酰化最有可能由酰基转移酶（ATs）催化，天然的ATs催化效率较低，研究人员利用蛋白质工程技术改良了ATs，大大地提高了其催化效率。下列叙述正确的是（　　） A．该技术不能通过直接改造ATs的结构来提高其催化效率 B．根据ATs的氨基酸序列就能准确推出相应的脱氧核苷酸序列 C．该技术的实施需要限制酶、DNA连接酶以及载体等工具 D．该技术难度很大，因为蛋白质发挥功能必须依赖复杂的空间结构 【答案】ACD 【分析】基因工程过程包括目的基因的获取、基因表达载体的构建、将目的基因导入受体细胞和目的基因的检测与鉴定。一个完整的基因表达载体包括：目的基因、启动子、终止子、标记基因。蛋白质工程指以蛋白质的结构规律及其与生物功能的关系作为基础，通过基因修饰或基因合成，对现有蛋白质进行基因改造，或制造一种新的蛋白质，以满足人类的生产和生活的需要。蛋白质工程是在基因工程的基础上，延伸出来的第二代基因工程。 【详解】A、蛋白质工程是指以蛋白质分子的结构规律及其与生物功能的关系作为基础，通过基因修饰或基因合成，对现有蛋白质进行改造，或制造一种新的蛋白质，以满足人类的生产和生活的需求。所以可以通过改造编码ATs的基因，进而改造ATs的结构来提高其催化效率，A正确； B、由于密码子的简并性，一种氨基酸可能由多种密码子编码，所以根据ATs的氨基酸序列不能准确推出相应的脱氧核苷酸序列，B错误； C、蛋白质工程的实施过程中，需要对基因进行修饰或合成，这就需要限制酶、DNA连接酶以及载体等工具，C正确； D、B、蛋白质结构复杂，功能多样，蛋白质工程难度很大的主要原因是蛋白质的功能必须依赖其复杂的空间结构，D正确。 故选ACD。 35．（2025·江苏淮安·二模）关于“DNA 片段的扩增及电泳鉴定”实验，下列说法正确的是（　　） A．根据 DNA 片段大小配置一定质量分数的琼脂糖溶液以便分离 DNA 分子 B．琼脂糖凝胶电泳中的缓冲液中含指示剂，其可以在紫外灯下被检测出来 C．实验中使用的微量离心管、枪头和蒸馏水等在使用前必须进行高压灭菌处理 D．扩增得到的 PCR 产物与凝胶载样缓冲液混匀后需缓慢注入加样孔以防样品飘散 【答案】ACD 【分析】PCR的产物一般通过琼脂糖凝胶电泳来鉴定。在凝胶中DNA分子的迁移速率与凝胶的浓度、DNA分子的大小和构象等有关，凝胶中的DNA分子通过染色，可以在波长为300nm的紫外灯下被检测出来。 【详解】A、高浓度凝胶孔径小，适合分离小片段；低浓度凝胶孔径大，适合大片段。因此需根根据 DNA 片段大小配置一定质量分数的琼脂糖溶液以便分离 DNA 分子，A正确； B、琼脂糖凝胶电泳中的缓冲液中不含指示剂，与PCR产物混合的凝胶载样缓冲液中含有指示剂，B错误； C、PCR实验对污染极为敏感，微量离心管、枪头等需高压灭菌以去除外源DNA或核酸酶。蒸馏水也需灭菌确保无核酸酶污染，C正确； D、载样缓冲液含甘油或蔗糖以增加样品密度，使其沉入加样孔。操作时应缓慢注入，避免因冲击力导致样品溢出孔外或飘散至周围缓冲液中，D正确。 故选ACD。 三、解答题 36．（2025·北京朝阳·二模）学习以下材料，回答（1）～（5）题。 小环大威力：ecDNA在癌症发生和进展中的作用 细胞中可能由于染色体断裂和重新连接，形成游离于染色体外的环状DNA分子，称为ecDNA。细胞周期中，ecDNA复制后随机分配给两个子细胞。 含原癌基因的ecDNA的产生概率极低，但临床调查发现约17.1%的癌症患者癌细胞中存在携带原癌基因的ecDNA。为构建与癌细胞中类似的ecDNA，研究者将两段含loxP位点和标记基因的外源DNA插入12号染色体，再用Cre酶处理．使染色体中的一个片段脱落并环化，形成含原癌基因MDM2的ecDNA（图1）。 处理后同时发出绿色和红色荧光的细胞即为含有/ecDNA的细胞，称为ec细胞。研究者对ec细胞进行传代培养，发现其后代中丢失绿色荧光的细胞比例逐渐增加。推测由于细胞分裂中ecDNA随机分配，产生不含ecDNA的子细胞，且这些子细胞在适宜环境中继续增殖；如果培养环境改变为ecDNA能为细胞带来更强适应能力的环境，则子代中ec细胞比例会增加，ec细胞中ecDNA的拷贝数也会增加。为检验假设，研究者将上述ec细胞分别放在含不同浓度潮霉素的培养基中培养，结果表明，潮霉素处理能够增加子代中ec细胞占比和ec细胞中ecDNA拷贝数。 为进一步研究ecDNA在体内的作用，研究者在小鼠肝细胞中诱导生成含有MDM2基因的ecDNA。小鼠肝脏中迅速出现癌细胞，形成肿瘤。 ecDNA的工程化构建为研究其致癌机制提供了新工具，未来有可能成为癌症精准治疗的靶点。 (1)eeDNA缺少着丝粒，因此复制后的ecDNA不能在 的作用下均分给两个子细胞。 (2)ecDNA的染色质状态更开放，其上的MDM2基因表达量 ，能促进细胞癌变和已癌变细胞的增殖。 (3)研究者进行外源DNA插入操作后，用含 的培养液筛选出成功插入的细胞。 (4)Cre酶可以将DNA上两个相同loxP位点之间的片段切割后环化（图2）。用Cre酶处理已插入片段1和片段2的12号染色体（图3），产生图1所示ecDNA。请写出片段2上各字母代表的表达元件。 (5)请根据潮霉素培养实验和小鼠肝细胞诱导实验推测携带原癌基因的ecDNA在癌细胞中广泛存在的原因 。 【答案】(1)纺锤体 (2)较高 (3)潮霉素和嘌呤霉素 (4)a．潮霉素抗性基因、b．GFP基因上游序列、c．红色荧光蛋白基因 (5)若含原癌基因的ecDNA产生于正常细胞中，会促进细胞癌变，是部分癌症的发生原因；若含原癌基因的ecDNA产生于已癌变细胞中，会促进细胞增殖，使这些细胞占据竞争优势。 【分析】1、基因工程至少需要三种工具：限制性核酸内切酶（限制酶）、DNA连接酶、运载体。 2、基因工程的基本操作步骤主要包括四步：①目的基因的获取；②基因表达载体的构建；③将目的基因导入受体细胞；④目的基因的检测与表达。 【详解】（1）染色体的着丝粒两侧都有纺锤丝附着在上面，纺锤丝牵引着染色体的运动，eeDNA缺少着丝粒，因此复制后的ecDNA不能在纺锤体的作用下均分给两个子细胞。 （2）ecDNA的染色质状态更开放，有利于基因的表达，其上的MDM2基因表达量较高，能促进细胞癌变和已癌变细胞的增殖。 （3）分析题图1可知，插入外源DNA片段后，12号染色体上含有嘌呤霉素抗性基因和潮霉素抗性基因，可以用含有嘌呤霉素和潮霉素的培养液筛选出成功插入的细胞。 （4）结合题图1、2、3可知，图3的位点1已含有嘌呤霉素抗性基因和GFP基因下游序列，则位点2的a应为潮霉素抗性基因，b为GFP基因上游序列，c为红色荧光蛋白基因。 （5）结合题干信息可知：潮霉素处理能够增加子代中ec细胞占比和ec细胞中ecDNA拷贝数；研究者在小鼠肝细胞中诱导生成含有MDM2基因的ecDNA。小鼠肝脏中迅速出现癌细胞，形成肿瘤，由此推测：若含原癌基因的ecDNA产生于正常细胞中，会促进细胞癌变，是部分癌症的发生原因；若含原癌基因的ecDNA产生于已癌变细胞中，会促进细胞增殖，使这些细胞占据竞争优势。 37．（2025·山东·二模）水稻中WRKY基因编码的WRKY是一种由60个氨基酸残基组成的转录因子，与水稻细胞的RABZ1基因启动子结合，调节RABZ1基因的表达，从而影响水稻的抗旱能力。科学家欲探究WRKY对RABZ1基因表达水平的影响，进行了相应实验。已知W-box是RABZ1基因启动子区域的一段DNA序列，是WRKY结合的位点。HA蛋白为标签蛋白，可通过抗HA抗体对目标基因的表达情况进行检测。请完成下列问题。    (1)若WRKY基因的b链为转录的模板链，结合图1分析，为使该基因与载体定向连接，需要使用的限制酶是 。 注：HPT基因是潮霉素磷酸转移酶基因。能解除潮霉素对细胞的毒性 (2)研究人员根据RABZ1基因上游的启动子序列设计了F1、F2、R1、R24种备选引物，用于扩增含有W-box的调控序列，如图2所示。为选出正确和有效的引物，以RABZ1基因上游的启动子序列为模板进行PCR扩增，将扩增产物进行电泳结果如图4所示。 利用PCR获取RABZ1基因上游的W-box序列应选择的引物组合是 。为将RABZ1基因上游的W-box序列定向接入载体中，两种引物还应做如何设计？ 。据图分析设计不成功的引物和特异性差的引物分别是 。 (3)欲检测WRKY对RABZ1基因表达水平的影响，应先在含 的培养基中培养受体细胞，再利用抗HA抗体检测细胞中相应蛋白的含量。仅据此依然无法得出WRKY对RABZ1基因表达水平的影响，原因是 。 (4)探究WRKY对RABZ1基因表达水平的影响时，是否能选择水稻细胞作为受体细胞？ （填“是”或“否”），原因是 。 【答案】(1)XmaI、NheI (2) F1、R2 在引物F1的5’端添加GAATTC序列（或EcoR Ⅰ识别序列），引物R2的5’端添加CTCGAG序列（或XhoⅠ识别序列） R1、F2 (3) 潮霉素 还缺少导入不含WRKY基因但含RABZ1基因启动子的重组载体的受体细胞作为对照 (4) 否 水稻细胞中本身存在WRKY基因，其编码的WRKY会对实验结果产生干扰 【分析】基因工程的基本操作步骤主要包括四步：①目的基因的获取；②基因表达载体的构建；③将目的基因导入受体细胞；④目的基因的检测与表达。其中，基因表达载体的构建是基因工程的核心。 【详解】（1）目的是使 WRKY 基因与载体定向连接，若 WRKY 基因的β链为转录的模板链，那么从图中可知，基因两端需分别保留限制酶 XmaI 和 NheI 切割位点（防止限制酶切割破坏基因，且确保能定向连接），所以需要使用的限制酶是 XmaI、NheI 。 （2）选择引物：利用 PCR 获得 RABZ1 基因上游的 W - box 序列，需根据引物与模板链碱基互补配对，且能沿 5' - 3' 方向延伸的原则，结合图可知应选择的引物组合是 F1、R2 。引物设计：为将 RABZ1 基因上游的 W - box 序列定向插入载体中，在引物 F1 的 5' 端添加 GAATTC 序列（EcoR I 识别序列），引物 R2 的 5' 端添加 CTCGAG 序列（Xho I 识别序列） 。判断不成功引物：根据分析，设计不成功的引物和特异性差的引物分别是 R3、F2 。比如 R3 可能因引物位置、序列等问题无法有效扩增出目标序列，F2 可能存在特异性不好，不能准确扩增目标区域等情况。 （3）培养基选择：欲检测 WRKY 对 RABZ1 基因表达水平的影响，应先在含潮霉素的培养基中培养受体细胞，因为载体上有 HPT 基因（潮霉素磷酸转移酶基因，能解除潮霉素对细胞的毒性），用含潮霉素的培养基可筛选出导入载体的受体细胞 。 原因分析：仅据此依然无法得出 WRKY 对 RABZ1 基因表达水平的影响，原因是受体细胞中可能原本就含有相关蛋白干扰检测结果。在没有对照（如缺乏无 WRKY 基因时细胞内该蛋白情况对比）等条件下，仅检测含载体细胞中蛋白含量，不能确定是 WRKY 作用导致的表达变化。 （4）探究 WRKY 对 RABZ1 基因表达水平的影响时，不能选择水稻细胞作为受体细胞。因为水稻中本身就存在 WRKY 基因和 RABZ1 基因，无法排除水稻内源基因对实验结果的干扰，即无法确定检测到的表达变化是导入的 WRKY 基因引起还是水稻自身基因作用的结果。 38．（2025·江苏·二模）人类血液中的纤维蛋白原是血液凝固的主要蛋白质成分，由Aα、Bβ和γ三条肽链组成，重组人纤维蛋白原（rFib）的开发有望消除血源性感染的风险。某科研团队欲通过培育转基因蚕并利用蚕茧高效生产人纤维蛋白原，流程如下图。请回答下列问题。    (1)纤维蛋白原的Aα、Bβ和γ链首先在 上合成，然后Aα和γ链在内质网中与Bβ链结合形成的六聚体Aα2Bβ2γ2，最后在 中加工修饰并分泌到细胞外。 (2)选取从人类肝脏的cDNA文库扩增目的基因的原因是 ；步骤①PCR条件如下：94℃，5min→25个循环（变性、退火、延伸）→72℃，7min，其中退火温度设置需参考引物中碱基的 ，延伸阶段使用ExTaqDNA聚合酶，该酶的作用有 和在扩增产物的3'端额外添加上一个碱基“A”。 (3)步骤②中，将Fib-Bβ插入到 （填“3'”或“5'”）端含有碱基T的克隆载体中，将克隆后的Fib-Bβ用 限制酶处理后通过DNA连接酶连接到表达载体上完成载体1的构建。载体2采用类似方法构建。 (4)步骤③分别将载体1和载体2注入胚盘期蚕卵中，在荧光体视显微镜下观察 在眼部的表达，显示阳性表达的即为转基因Bβ-蚕和转基因Aα/γ-蚕。对转基因蚕进行DNA杂交分析表明，Bβ-蚕和Aα/γ-蚕均存在多个转基因品系，这可能与插入的目的基因数量和 有关。 (5)丝胶蛋白启动子将重组纤维蛋白原链的cDNA定向表达在丝腺细胞中，然后依靠吐丝分泌到蚕茧中。科研人员对丝腺细胞中的mRNA进行检测并对蚕茧中的蛋白质进行分析，结果如下表。 组别 mRNA 蛋白质电泳条带 Aα链mRNA Bβ链mRNA γ链mRNA Aα Bβ γ 非转基因蚕（对照组） - - - - - - 转基因Bβ-蚕 - + - - - - 转基因Aα/γ-蚕 + - + + - + 转基因Aα/Bβ/γ-蚕 + + + + + + 注：“+”表示有，“-”表示无 根据实验结果推测， 可能是Bβ链分泌到蚕茧中的必要条件之一。 【答案】(1) （游离的）核糖体 高尔基体 (2) 相关基因只在肝细胞中表达 组成和数量 从引物的3'端开始连接脱氧核糖核苷酸 (3) 3' BamH I、xho Ⅰ (4) 红色荧光蛋白和绿色荧光蛋白 插入位置 (5)Aα链、γ链和Bβ链共表达 【分析】基因工程技术的基本步骤：（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。（4）目的基因的检测与鉴定。 【详解】（1）由题意知，三种肽链构成的纤维蛋白原上血液中的成分，即需要分泌到细胞外。根据人教版必修一内容，分泌蛋白首先在游离核糖体上合成，然后游离的核糖体附着在内质网继续合成，在内质网中对蛋白质初步加工，在高尔基体进一步加工。 （2）细胞分化的实质是基因的选择性表达。血浆蛋白由肝脏合成，肝脏细胞中有血浆蛋白基因表达，因此肝脏细胞含有目的基因的mRNA。退火温度与两条链之间的氢键数目有关。引物的CG含量、碱基数量都会影响氢键数。DNA聚合酶的作用是从引物的3'端连接脱氧核苷酸。 （3）因为扩增产物的3'端有一个游离碱基A，形成黏性末端，根据碱基互补配对原则，将扩增产物插入载体需要载体3'端加一个碱基T，两种黏性末端互补配对。从图中可看出，载体1Fib-Bβ的上下游分别有限制酶XhoI和BamHI的识别序列。 （4）载体1、2都含有眼部特异性启动子3xP3，载体1中该启动子启动红色荧光蛋白基因的转录，载体2中该启动子启动绿色荧光蛋白基因的转录，因此通过观察在眼部是否有相应的荧光蛋白产生，即可判断载体是否导入。目的基因插入的数量和位置影响基因表达产物的量。 （5）从表中看出，使Bβ能够分泌到蚕茧中的只有第4组，即只有Aα、Bβ、γ同时导入并表达时，Bβ能够分泌到蚕茧中。 39．（2025·山东泰安·二模）研究人员从麻疯树油中筛选出能产生脂肪酶（LA）的两种菌株。菌株1产生的LA1酶可耐高温，菌株2产生的LA2酶具有高催化效率，且LA1基因和LA2基因具有93%的同源性。研究人员采用交错延伸PCR技术获得了重组LA基因，生产出了更高效的酶。 (1)交错延伸PCR技术具体流程如上图（图中仅显示其中一条链延伸情况）。该技术采用LA1、LA2均做模板，起始所需引物相同，引物作用是 。已知过程①起始引物片段均为25个核苷酸，TaqDNA聚合酶延伸速度为1200个碱基/min，本实验的循环扩增条件为：变性30s、复性15s、延伸15s，经过80轮交错循环后，可获得PCR混合产物。第二轮循环后所得重组型子链长度为 个核苷酸。 (2)获得的重组LA基因中，同时只有LA1和LA2基因序列的原因是 。 (3)过程②用到的PM质粒中A为启动子、B为氯霉素抗性基因cat、C为终止子、D为asd-突变基因、E为复制原点，箭头处指不同限制酶的识别位点。asd基因是编码细菌细胞壁的主要成分DAP合成途径的关键酶，asd基因缺失时，将导致菌株生长对DAP依赖。为使目的基因定向插入PM质粒，交错延伸PCR过程中引物的5'端需引入 酶的识别序列。为便于目的基因的检测和鉴定，过程③中应采用asd基因 的受体菌。从含有PM质粒、重组PM质粒的受体菌中将含有重组PM质粒的受体菌筛选出来的思路为 。 【答案】(1) 使DNA聚合酶从引物的3'端开始连接脱氧核苷酸 625 (2)第一轮以LA1为模板合成子链，该片段在第二轮复制时作为引物，结合到LA2（LA1）的模板上继续合成子链，经多轮交错循环扩增，可以使产物同时含有两种基因的序列 (3) XhoⅠ 正常表达 将正常培养基上分离出的受体菌单菌落，平移印制到含氯霉素的培养基上，在含氯霉素的培养基上无法生长的菌落对应的原菌落即为含有重组PM质粒的受体菌 【分析】基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤。基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。 【详解】（1）引物是一小段能与DNA母链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸。引物的作用使DNA聚合酶从引物的3'端开始连接脱氧核苷酸。TaqDNA聚合酶延伸速度为1200个碱基/min，延伸15s，即子链合成了300个碱基，第二轮循环后合成了600个碱基，起始引物片段为25个核苷酸，因此第二轮循环后所得重组型子链长度为300+300+25=625个。 （2）第一轮以LA1（LA2）为模板合成子链，该片段在第二轮复制时作为引物，结合到LA2（LA1）的模板上继续合成子链，经多轮交错循环扩增，可以使产物同时含有两种基因的序列。 （3）由于Sal和Pvit2有两个识别位点，若选用则会破坏标记基因或复制原点，因此要选用Xho Ⅰ和BamH I进行切割，为使目的基因定向插入PM质粒，交错延伸的PCR过程引物的5'端需引入Xho Ⅰ和BamH I的识别序列。PM质粒中带有asd基因为了筛选含有PM质粒或重组PM质粒的受体菌，需要选用asd基因缺失的受体菌，在含DAP的培养基上能生长的应为导入了载体或重组载体的受体菌，即过程③中应采用asd基因缺失的受体菌。PM质粒有完整的氯霉素抗性基因cat，重组PM质粒没有完整的氯霉素抗性基因cat，可以将正常培养基上分离出的受体菌单菌落，平移印制到含氯霉素的培养基上，在含氯霉素的培养基上无法生长的菌落对应的原菌落即为含有重组PM质粒的受体菌。 40．（2025·山东德州·二模）水稻是二倍体植物，其雄性不育性状由隐性基因控制。科研人员利用图中3个目的基因和质粒构建重组质粒，并将其导入雄性不育水稻中，培育出仅一条染色体上含有目的基因的植株M。植株M自交能产生固定比例的雄性不育株。已知A基因可以恢复雄性不育水稻产生花粉的能力，B基因能阻断淀粉储藏使花粉失活，因而能有效阻止转基因花粉的传播。 (1)仅用一种限制酶切割会使A基因以两种不同的方向插入质粒，但A基因的表达产物相同，据图分析原因是 。 (2)据图分析，将A、B基因插入质粒时，应先插入 （填“A”或“B”）基因，理由是 。通过农杆菌转化法将重组质粒导入雄性不育水稻的细胞，应选择添加 的培养基筛选出转化成功的受体细胞。 (3)植株M产生的花粉中不含目的基因，原因是植株M形成花粉时，启动子b在 （填“减I”或“减II”）末期启动了B基因的表达。据此推测，植株M自交，后代的表型及比例为 。 (4)已知启动子c为胚乳细胞中特异性表达的基因的启动子，miRNA基因产生的miRNA可抑制淀粉酶基因的表达，影响种子的透明度。为便于在种子时期即可筛选出雄性不育株，在培育植株M时，科研人员将启动子c与miRNA基因连接，并使之随A、B基因一起导入水稻细胞。据此推测，引入启动子c及miRNA基因的作用分别是 。 【答案】(1)A基因自带启动子和终止子 (2) B 插入B基因时需要利用限制酶1和2切割质粒，而基因A中含有限制酶2的切割位点 卡那霉素 (3) 减II 雄性可育:雄性不育=1:1 (4)避免miRNA基因在其他器官中表达；使植株M产生的种子透明度不同，易于区分 【分析】基因工程的操作步骤有：目的基因的获取、构建基因表达载体、将目的基因导入受体细胞、目的基因的检测和鉴定。检测目的基因是否导入受体细胞可采用PCR技术，检测目的基因是否表达可采用抗原抗体杂交或个体水平检测。 【详解】（1）仅用一种限制酶切割会使A基因以两种不同的方向插入质粒，但A基因的表达产物相同，据图分析原因是A基因自带启动子和终止子。 （2）据图分析，将A、B基因插入质粒时，应先插入B基因，理由是插入B基因时需要利用限制酶1和2切割质粒，而基因A中含有限制酶2的切割位点。卡那霉素抗性基因位于可转移的T-DNA片段中，通过农杆菌转化法将重组质粒导入雄性不育水稻的细胞，应选择添加卡那霉素的培养基筛选出转化成功的受体细胞。 （3）植株M产生的花粉中不含目的基因，原因是植株M形成花粉时，启动子b在减II末期启动了B基因的表达。据此推测，植株M自交，后代的表型及比例为雄性可育:雄性不育=1:1。 （4）已知启动子c为胚乳细胞中特异性表达的基因的启动子，miRNA基因产生的miRNA可抑制淀粉酶基因的表达，影响种子的透明度。为便于在种子时期即可筛选出雄性不育株，在培育植株M时，科研人员将启动子c与miRNA基因连接，并使之随A、B基因一起导入水稻细胞。据此推测，引入启动子c及miRNA基因的作用分别是避免miRNA基因在其他器官中表达；使植株M产生的种子透明度不同，易于区分。 41．（2025·内蒙古·二模）柿子的涩味程度与苯丙烷代谢关键酶基因（PAL）的表达情况有关。为筛选PAL基因调控蛋白，科研人员利用质粒B和质粒H（如图）进行了相关研究。请分析回答下列问题： (1)启动子区段除含有RNA聚合酶识别位点外，还存在调控蛋白结合位点，两者通过影响 过程决定基因的表达强度。 (2)由于PAL基因启动子序列未知，为扩增PAL基因启动子所在区段，需用限制酶切割基因组DNA后，通过 酶将已知序列信息的接头片段连接到PAL基因启动子上游，随后根据接头片段和PAL基因编码区序列设计引物进行PCR。扩增时使用的耐高温DNA聚合酶能催化脱氧核苷酸连接到引物的 端。 (3)利用质粒B构建含PAL启动子的重组质粒并导入亮氨酸缺陷型酵母菌，需用不含 的培养基筛选成功转化的酵母菌Y2。将柿子的不同cDNA片段分别插入质粒H的位点 （填编号1~5），理由是 ，从而获得重组质粒H1、H2……。 (4)将重组质粒H1、H2……分别导入酵母菌Y2，并将其分别接种到含 的培养基中培养。若Y2能生长，则说明该cDNA表达的蛋白与AD蛋白结合形成了融合蛋白，并与PAL启动子结合，激活 基因表达，赋予酵母菌抗性。 【答案】(1)转录 (2) DNA连接酶 3' (3) 亮氨酸 2 插入位点需位于AD基因的启动子与终止子之间，且AD基因不被破坏 (4) 潮霉素 潮霉素抗性 【分析】1、基因工程的工具：限制酶、DNA连接酶。 2、基因工程的步骤：目的基因的提取、目的基因与运载体结合、目的基因导入受体细胞、目的基因的检测与鉴定。 【详解】（1）RNA聚合酶参与基因的转录，启动子的作用是位于基因的上游，是RNA聚合酶的识别和结合部位，驱动基因转录出mRNA，所以启动子区段除含有RNA聚合酶识别位点外，还存在调控蛋白结合位点，两者通过影响转录过程决定基因的表达强度。 （2）该PCR的过程的目的是扩增PAL基因启动子所在区段，所以用限制酶切割基因组DNA后，通过DNA连接酶将已知序列信息的接头片段连接到PAL基因启动子上游，随后根据接头片段和PAL基因编码区序列设计引物进行PCR。扩增时使用的耐高温DNA聚合酶能催化脱氧核苷酸连接到引物的3'端。 （3）利用质粒B构建含PAL启动子的重组质粒并导入亮氨酸缺陷型酵母菌，需用不含亮氨酸的培养基筛选成功转化的酵母菌Y2。将柿子的不同cDNA片段分别插入质粒H时，不应破坏启动子和终止子，AD基因等，同时需将该片段插入到启动子和终止子之间，所以结合图示，应将柿子的不同cDNA片段分别插入质粒H的位点2。 （4）潮霉素是一种抗生素，可杀死酵母菌，所以将重组质粒H1、H2……分别导入酵母菌Y2，并将其分别接种到含潮霉素的培养基中培养。若Y2能生长，则说明该cDNA表达的蛋白与AD蛋白结合形成了融合蛋白，并与PAL启动子结合，激活潮霉素抗性基因表达，赋予酵母菌抗性。 42．（2025·北京东城·二模）癌症是人类健康的重大威胁之一，传统治疗手段难以实现精准治疗。超声波具有非侵入、组织穿透性强、时空特异性等特点，科研人员拟开发“响应超声波的药物递送系统”细菌以实现癌症的精准治疗。 (1)用于培养药物递送细菌的液体培养基中包含水、酵母提取物、蛋白胨等成分，其中蛋白胨主要为细菌提供 和维生素。可利用 的方法快速直观地测定细菌数量，以便即时使用适量的细菌进行治疗。 (2)C蛋白有抗肿瘤作用，超声波可导致局部温度升高到42℃。科研人员制备了工程菌1，其中含有图1所示的基因表达载体。37℃培养的工程菌1接受超声波刺激后，可升温至42℃， 从而发挥抗肿瘤作用。 (3)T蛋白有T1、T2和T3三种亚型，具有相似的功能，制备分别含有这三种基因的工程菌1，并检测C蛋白表达量，结果如图2所示。科研人员最终选择T3基因进行后续研究，判断的依据是 。 (4)工程菌1只能在超声波刺激期间发挥作用，科研人员设计了含图3所示的基因表达载体的工程菌2，可以实现在短时间的超声波刺激后维持长时间的治疗。已知B基因编码的B酶可以作用于识别位点a和b，使a、b处的DNA发生断裂，最终导致a、b之间的DNA片段发生倒转。请根据以上信息，使用下列选项将表达载体补充完整。 ； ； ； ； 。 ①P1启动子    ②P3启动子（持续表达型启动子） ③T3基因    ④C基因    ⑤B基因 【答案】(1) 碳源、氮源 显微镜直接计数 (2)T蛋白形成的二聚体解聚，解除对P1启动子抑制作用，表达C蛋白 (3)含有T3基因的工程菌在37℃时C蛋白表达强度低，且升温至42℃，C蛋白表达强度上升幅度最大 (4) ②P3启动子 ④C 基因 ①P1启动子 ⑤B 基因 ③T3 基因 【分析】基因工程技术的基本步骤：（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成；（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等，标记基因可便于目的基因的鉴定和筛选。（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是钙离子处理法；（4）目的基因的检测与鉴定。 【详解】（1）蛋白胨的作用：蛋白胨是由蛋白质水解得到的产物，含有多种氨基酸、多肽等，可为细菌生长提供碳源、氮源（合成蛋白质、核酸等的原料），同时也可提供部分碳源和维生素。 细菌计数方法：题目要求 “快速直观” 测定细菌数量，常用方法为显微镜直接计数法（如血球计数板法），通过显微镜直接观察并计数菌体，无需培养，适合即时检测。 （2）根据图 1，工程菌 1 的基因表达载体中，C 基因由 P1 启动子驱动，且 T 基因（编码 T 蛋白）由持续表达型启动子 P2 驱动。 37℃时，T 蛋白可能抑制 P1 启动子活性，导致 C 基因不表达；当超声波刺激升温至 42℃，温度变化可能使 T 蛋白的抑制作用解除（或 P1 启动子在高温下激活），从而启动 C 基因转录，产生具有抗肿瘤作用的 C 蛋白。 （3）图 2 纵坐标为 C 蛋白表达量，横坐标为温度。观察不同 T 蛋白亚型（T1、T2、T3）对应的曲线，T3 亚型在 37℃时表达量最低，42℃时表达量最高，即温度响应最显著（表达量变化幅度最大）。 选择 T3 基因的原因是：在超声波升温（37℃→42℃）后，其驱动的 C 基因表达量激增最明显，能更高效地发挥抗肿瘤作用。 （4）目标：工程菌 2 需在短时间超声波刺激后维持长时间治疗，即通过一次刺激启动持续表达。 B 酶的作用：B 酶可识别位点 a 和 b，使中间 DNA 片段倒转。倒转后，启动子方向需与转录方向一致。 载体设计逻辑：P2启动子之后应连接T3基因；a、b之间应为持续表达型启动子，即P3启动子，其后应连接的是④C 基因；中间应为P1 启动子和B 基因，超声刺激升温后，P1启动子的抑制解除，启动B基因转录，表达的B酶使a、b之间DNA片段逆转，进而启动C基因的持续表达。 43．（2025·江西上饶·二模）反刍动物的瘤胃中含有分解纤维素的微生物，科研小组从瘤胃中分离培养分解纤维素的微生物的流程如图1所示。请回答下列问题： (1)筛选、培养纤维素分解菌需要以纤维素为唯一的碳源，同时还需要 （答3点）等营养物质，从功能上分析，该培养基属于 培养基。 (2)科学家筛选出某微生物的W基因可编码一种高效降解纤维素的酶，提取该微生物的基因组DNA，利用PCR技术将W基因特异性扩增出来的关键是 ，扩增时复性的温度如果过高可能出现的结果是 ，扩增出的W基因需要利用电泳进行鉴定，鉴定的结果发现有多条条带，从引物设计或温度控制的角度分析，可能的原因是 （答1点）。 (3)如图3所示，已知图中W基因转录方向是从左向右，W基因转录的模板链是 。结合图2及图3，解释KpnI酶不可用的原因： 。 【答案】(1) 水、无机盐、氮源（答全给分） 选择 (2) 根据已知W基因两端的一小段序列设计合成引物 两种引物无法通过碱基互补配对与两条单链DNA结合，可能无法扩增出W基因 引物特异性差；引物过短；复性温度过低等 (3) 乙链 在质粒中KpnI酶的识别序列在HindIII识别序列的终止子方向，若用该酶切割，会导致目的基因反向连接 【分析】一个基因表达载体的组成，除目的基因、标记基因外，还必须有启动子、终止子等。启动子是一段有特殊序列结构的DNA片段，位于基因的上游紧挨转录的起始位点，它是RNA聚合酶识别和结合的部位。有了它才能驱动基因转录出mRNA，最终表达出人类需要的蛋白质。 【详解】（1）上图是科研小组从瘤胃中分离培养分解纤维素的微生物的流程，因此得到瘤胃提取物后，将其放入以纤维素为唯一碳源的选择培养基进行I过程。培养基中除了以纤维素为唯一的碳源，同时还需要水、无机盐、氮源等营养物质。 （2）利用PCR技术将W基因特异性扩增出来的关键是根据已知W基因两端的一小段序列设计合成引物；扩增时复性的温度如果过高，氢键不容易形成，可能导致两种引物无法通过碱基互补配对与两条单链DNA结合，可能无法扩增出W基因；扩增出的W基因需要利用电泳进行鉴定，鉴定的结果发现有多条条带，说明PCR特异性差，从引物设计或温度控制的角度分析，可能的原因是引物特异性差；引物过短；复性温度过低等。 （3）已知图中W基因转录方向是从右向左，mRNA链的合成方向为5'→3'，与乙链从右向左3'→5'互补，故W基因转录的模板链是乙链。结合图2及图3可知，在质粒中KpnI酶的识别序列在HindIII识别序列的终止子方向，若用该酶切割，会导致目的基因反向连接，故KpnI酶不可用。 44．（2025·广东汕头·二模）野生型水稻（WT）的OsJRL基因突变株具有更强的抗寒性。研究人员围绕OsJRL蛋白的分布、OsJRL基因对水稻表型的影响及其作用机制等方面开展研究。回答下列问题： (1)绿色荧光蛋白基因（gfp）表达的GFP蛋白对细胞无毒性，且不会干扰细胞的代谢和功能。将OsJRL基因与gfp基因连接在同一载体并导入水稻细胞，检测到水稻细胞 ，说明OsJRL蛋白分布在细胞核和细胞质。 (2)通过转基因技术培育OsJRL基因敲除水稻植株（KO）和OsJRL基因过表达植株（OE）。可通过替换OsJRL基因上游的 序列得到OE。若用PCR检测两种实验材料是否构建成功，所设计的这对引物需具备 的特点。三种水稻幼苗经5℃处理一段时间后，检测植株的存活率，结果见下表： 温度植株 存活率% 时间d 室温 5℃ WT KO OE WT KO OE 5 100 100 100 98 100 98 10 100 100 100 68 75 43 15 100 100 100 25 68 14 实验结果说明 可以提高水稻的抗寒性。 (3)寒冷使细胞活性氧（ROS）增多，加速细胞衰老。检测发现，KO植株具有最高的苯丙氨酸解氨酶（PAL）活性和最多的类黄酮积累，ROS水平最低。而OE植株的ROS最高，PAL活性和类黄酮含量最低。请在图的①~③选填“促进”或“抑制”，完善OsJRL基因调控水稻抗寒能力的机制。 ① ；② ；③ 。 【答案】(1)细胞核和细胞质发出绿色荧光 (2) 启动子 与OsJRL基因互补配对 OsJRL基因表达量降低/OsJRL基因缺失/敲除sJRL基因/抑制OsJRL基因表达 (3) 促进 抑制 抑制 【分析】基因工程技术的基本步骤： （1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成； （2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等； （3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样； （4）目的基因的检测与鉴定。 【详解】（1）因为绿色荧光蛋白基因（gfp）表达的GFP蛋白可作为标记，当OsJRL基因与gfp基因连接导入水稻细胞后，若在细胞核和细胞质都能发出绿色荧光，就表明与之相连的OsJRL蛋白分布在细胞核和细胞质； （2）启动子是RNA聚合酶识别、结合和开始转录的一段DNA序列，替换OsJRL基因上游的启动子序列，可能增强其表达，从而获得基因过表达植株（OE）；PCR 检测构建是否成功时，引物需能与目标基因（敲除或过表达相关区域）两端特异性结合，才能扩增出相应片段，以此判断是否构建成功，即引物需具备与OsJRL基因互补配对的特点；从表格数据看，在5℃处理下，随着时间推移，KO植株存活率相对较高，OE植株存活率较低，WT植株居中，说明OsJRL基因表达量降低（或OsJRL基因缺失或敲除OsJRL基因或抑制OsJRL基因表达）后水稻抗寒性提高； （3）寒冷使细胞活性氧（ROS）增多，说明低温胁迫促进ROS产生；KO 植株（无OsJRL基因）PAL活性最高，说明OsJRL基因存在时会抑制PAL活性；KO植株 ROS水平最低、类黄酮积累最多，OE植株ROS最高、类黄酮含量最低，说明类黄酮抑制ROS的产生。 45．（2025·山东泰安·二模）土壤盐渍化影响水稻生长发育，将水稻耐盐碱基因OsMYB56导入不耐盐碱水稻中，培育耐盐碱水稻新品种，其操作流程及可能用到的限制酶如图，其中Bar为抗除草剂基因，Tetr为四环素抗性基因，Ampr为氨苄青霉素抗性基因。①～⑦表示操作过程。 限制酶 BamH I BclI Sac I 识别位点及切割位点（5’→3’） -G↓GATCC- -T↓GATCA- -GAGCT↓C- (1)过程①利用反转录PCR以 为模板扩增获得cDNA，过程②利用cDNA为模板扩增OsMYB56基因时使用的两种引物的序列为（从5’端向3’端方向写出前10个碱基） 。 (2)根据基因表达载体的结构组成分析，Ti质粒中CaMV35S的功能是 。基因表达载体中，OsMYB56基因和bar基因编码链的方向 （填“相同”或“相反”），其中Bar基因转录的模板链为 （填“a链”或“b链”）。 (3)过程③应选用限制酶 切割质粒；过程④中筛选含有重组质粒的根瘤农杆菌时应先使用含 的培养基筛选，再使用含 的培养基；过程⑤应在含 的选择培养基上筛选；过程⑥ （填“需要”或“不需要”）给予光照；过程⑦若要检测OsMYB56基因是否转录，分子水平可采用的技术有 。（答出一种即可） 【答案】(1) 总RNA 5'-GAGCTCATGA-3'、5'-TGATCACTAT-3' (2) RNA聚合酶识别和结合的部位，启动转录过程 相反 a链 (3) SacI和BcII 四环素 氨苄青霉素 除草剂 需要 PCR（RT-PCR）、核酸分子杂交 【分析】PCR技术可特异性的扩增DNA片段，关键在于引物可以和特定DNA片段的3'端特异性结合，使耐高温的DNA聚合酶沿引物的3'端延伸子链。基因表达载体一般包括启动子、终止子、目的基因、标记基因、复制原点等元件。 【详解】（1）过程①是反转录 PCR，反转录是以 RNA 为模板合成 DNA 的过程，即过程①利用反转录PCR以总RNA为模板扩增获得cDNA。据图可知，质粒中的两个标记基因Tetr和Ampr中都含有限制酶BamHⅠ识别序列，如果用限制酶BamHⅠ，会破坏质粒中的两个标记基因，为防止质粒自身环化，保证OsMYB56和酶切后的质粒定向连接，需要用双酶切，因此过程③可以选择限制酶Sac I和BclⅠ，在进行PCR操作时，引物分别要与基因两条链的3'端碱基序列互补配对结合，因此过程②利用cDNA为模板扩增OsMYB56基因时使用的两种引物的序列为5'-GAGCTCATGA-3'、5'-TGATCACTAT-3'。 （2）基因表达载体的结构应该包括启动子、终止子、复制原点、限制酶切割位点、标记基因等，由图可知CaMV35S是启动子，功能是RNA聚合酶识别和结合的位点。RNA聚合酶的移动方向是从启动子移向终止子，故两个基因编码链方向相反。RNA聚合酶的移动方向代表转录的方向，具体来说，RNA聚合酶沿DNA的3′端向5′端移行，因此Bar基因转录的模板链为a链。 （3）据图可知，质粒中的两个标记基因Tetr和Ampr中都含有限制酶BamHⅠ识别序列，如果用限制酶BamHⅠ，会破坏质粒中的两个标记基因，为防止质粒自身环化，保证OsMYB56和酶切后的质粒定向连接，需要用双酶切，因此过程③可以选择限制酶SacI和BcII。据图可知，限制酶SacI和BcII破坏了Ampr（氨苄青霉素抗性基因），只保留了四环素抗性基因（Tetr），为了筛选出含重组质粒的受体细胞，应在添加四环素的选择培养基上培养，再使用含氨苄青霉素的培养基；过程⑤是将含有重组质粒的农杆菌感染水稻愈伤组织，应在含除草剂的选择培养基上筛选出成功导入含 Bar 基因（抗除草剂基因）重组质粒的愈伤组织。过程⑥是愈伤组织再分化形成幼苗的过程，需要给予光照，以利于叶绿素的合成等。过程⑦若要检测 OsMYB56 基因是否转录，分子水平可采用的技术是分子杂交技术，如 PCR（RT-PCR）、核酸分子杂交。 46．（2025·江西赣州·二模）水蛭是我国传统中药材，主要药理成分水蛭素（由65个氨基酸组成的单链多肽）为水蛭蛋白中的重要成分，具有良好的抗凝血作用。研究人员拟通过蛋白质工程改造水蛭素，提高其抗凝血活性。请回答下列问题： (1)蛋白质工程基本思路如下图所示，物质a是 ，物质b是 。要对水蛭素的结构进行设计改造，最终必须通过 来完成。 (2)若通过发酵工程利用大肠杆菌生产水蛭素，则一般先用Ca2+处理大肠杆菌细胞，目的是 ；若通过乳腺生物反应器生产水蛭素，请写出简要操作步骤： 。 (3)利用 （填“大肠杆菌”或“乳腺生物反应器”）生产的水蛭素活性更高，原因是 。 【答案】(1) 多肽链 mRNA 改造（改造或合成）水蛭素基因 (2) 使大肠杆菌细胞处于一种能吸收周围环境中 DNA 分子的生理状态 将改造后的水蛭素基 因与乳腺中特异表达的基因的启动子重组在一起，通过显微注射导入哺乳动物的受精卵中，并通过 胚胎移植等技术培养成个体 (3) 乳腺生物反应器 与大肠杆菌细胞相比，动物细胞中含有多种细胞器（或生物膜系统），可以对蛋白质进行加工修饰 【分析】蛋白质工程是指以蛋白质分子的结构规律及其与生物功能的关系作为基础，通过基因修饰或基因合成，对现有蛋白质进行改造，或制造一种新的蛋白质，以满足人类的生产和生活的需求。也就是说，蛋白质工程是在基因工程的基础上，延伸出来的第二代基因工程，是包含多学科的综合科技工程领域。 【详解】（1）蛋白质工程的基本思路是从预期的蛋白质功能出发，设计预期的蛋白质结构，推测应有的氨基酸序列，找到并改变相对应的脱氧核苷酸序列（基因）或合成新的基因。根据这个流程，物质a是多肽链，它是根据预期蛋白质结构推测出的氨基酸序列连接而成的，物质b是mRNA，基因转录形成mRNA，再由mRNA翻译形成蛋白质。因水蛭素基因在自然界中已经存在，所以要对水蛭素的结构进行设计改造，最终通过改造水蛭素基因来完成. （2）若通过发酵工程利用大肠杆菌生产水蛭素，用Ca2+处理大肠杆菌细胞，目的是使大肠杆菌细胞成为感受态细胞，这样可以提高细胞吸收外源DNA的能力，便于重组DNA分子的导入。若通过乳腺生物反应器生产水蛭素，简要步骤是将改造后的水蛭素基因与乳腺中特异表达的基因的启动子重组在一起，通过显微注射导入哺乳动物的受精卵中，并通过胚胎移植等技术培养成个体。 （3）利用乳腺生物反应器生产的水蛭素活性更高。原因是大肠杆菌是原核生物，没有内质网和高尔基体等细胞器，无法对水蛭素进行加工修饰；而乳腺生物反应器是真核生物细胞，有内质网和高尔基体等细胞器，能够对水蛭素进行加工修饰，使其空间结构更接近天然水蛭素，从而具有更高的活性。 47．（2025·江苏南京·二模）研究显示Gata3基因是大量肿瘤细胞的潜在突变位点，Gata3蛋白由444个氨基酸构成。为研究Gata3蛋白在细胞中的定位，科研人员将GFP（绿色荧光蛋白）基因与Gata3基因融合，构建基因表达载体转入小鼠受精卵，并整合到受精卵的染色体上，每个受精卵只导入一个目的基因，获得能正常表达融合蛋白的杂合雌、雄小鼠各一只。荧光蛋白成像系统显示两只小鼠均为Gata3-GFP融合基因阳性转入小鼠。相关限制酶识别序列及限制酶识别位点如图所示，A、B、C、F、R为不同引物，回答相关问题： (1)Gata3 基因编码区的碱基数量为 个。 (2)为了使GFP基因能正确插入载体中，在利用PCR扩增GFP编码区序列的过程中，需要设计引物的F和R分别为 。 ①5'-CCCGTCGACTTCATGCTTGATATGCCAATC-3' ②5'-CCCGTCGACAAAAACACTTTTTGATATTCG-3 ③5'-CCCCTCGAGTTCATGCTTGATATGCCAATC-3' ④5'-CCCGAATTCTTCTAGTCGACCACAAGAAG-3' (3)在构建Gata3基因与GFP 基因的融合基因时，应将 基因中编码终止密码子的序列删除，目的是 。 (4)在GFP基因的扩增及重组载体的构建过程中，使用的酶有 ，将酶处理过的目的基因和载体连接时，需要在低温环境中操作，原因是 。 (5)将实验获得的两只雌、雄杂合子小鼠（P）进行杂交获得F1若干，将体细胞中都含有两个融合基因的雌雄个体杂交，则F2中出现有荧光小鼠理论上约占 。 (6)为了确定目的基因插入到小鼠细胞中染色体上的具体位置，科研人员常用DNA分子原位杂交技术，分子杂交需使用特定序列的单链DNA（ss-DNA）作为分子探针。为制备大量单链DNA片段，研究人员常采用不对称PCR技术。若反应体系中原有50个模板DNA，最初10个循环后限制性引物耗尽，再进行20个循环，理论上可制备ss-DNA （用科学计数法计数）个。 (7)研究人员从荧光小鼠中提取含融合基因的相关DNA片段，若用引物A和B进行PCR扩增，但没能扩增出GFP基因，从PCR操作过程中温度控制角度分析，可能的原因有 （至少写2点）。 (8)对荧光小鼠用荧光蛋白成像系统检测，相较于传统的物质提取、体外测量方式，引入荧光蛋白传感器测量荧光蛋白的优点是 。 【答案】(1)大于2664 (2)①④ (3) GFP 避免融合基因只表达出GFP蛋白 (4) Taq酶、DNA 连接酶、限制酶 低温有利于黏性末端碱基之间形成氢键 (5)100%或15/16 (6)1.024×106 (7)变性温度低、退火温度太高 (8)可研究活的生物体;获得实时直接、连续监测结果等（答对1点即可） 【分析】选择合适的限制酶对目的基因和质粒进行切割的原则：①不能破坏目的基因；②不能破坏所有的抗性基因（至少保留一个）；③最好选择两种限制酶分别切割质粒和目的基因，防止目的基因和质粒反向连接，同时要防止目的基因自身环化和质粒的自身环化。 【详解】（1）已知Gata3蛋白由444个氨基酸构成，一个密码子决定一种氨基酸，DNA基因是双链，mRNA是单链，DNA上的碱基数量至少是氨基酸数量的6倍，即444×6=2664，且真核生物基因编码区包括了外显子和内含子，因此Gata3 基因编码区的碱基数量为大于2664个。 （2）根据基因插入前后对比可知，将GFP（绿色荧光蛋白）基因与Gata3基因融合，需要两种DNA片段具有相同的黏性末端，GFP基因的终止子在右侧（即转录方向为从左到右），故插入的调控序列应颠倒进行插入，即设计的时候：R引物末端插入对应下方载体的Xho Ⅰ酶切位点，F引物末端插入对应下方载体的Mun Ⅰ酶切位点，又因为RFP基因中含有的Xho Ⅰ位点，因此不能用Xho Ⅰ酶来切，否则会破坏基因序列。结合题干当中所给的5种限制酶的识别序列，Xho Ⅰ和Sal Ⅰ互为同尾酶；Mun Ⅰ和EcoR Ⅰ互为同尾酶（即切割不同的DNA片段但产生相同的黏性末端的一类限制性内切酶）。因此可通过使用同尾酶进行替代，即剪切扩增产物时，F末端添加的序列所对应的限制酶应选择Sal Ⅰ，这样可以与下方载体中Xho Ⅰ的酶切位点结合；同理R末端应选用与Mun Ⅰ同尾的EcoR Ⅰ剪切。这样利用产生相同黏性末端的同尾酶对扩增产物和载体进行酶切，可以保证既能得到有效片段，又能使之正确转录。 （3）结合图示可知，GFP基因插入在Gata3的前方，两个基因需要共用同一个启动子和终止子，而原先两个基因具有独立的启动子和终止子，为了为了避免融合基因只表达出GFP蛋白，在构建Gata3基因与GFP 基因的融合基因时，应将GFP基因中编码终止密码子的序列删除。 （4）GFP基因的扩增需要利用PCR技术，该技术需要的酶是Taq酶。在GFP基因的扩增及重组载体的构建过程中，需要使用限制酶进行酶切获得相同的黏性末端，需要用DNA连接酶将两个基因连接形成Gata3-GFP融合基因。高温条件下氢键会发生断裂，将酶处理过的目的基因和载体连接时，这个过程有氢键的形成，而低温有利于黏性末端碱基之间形成氢键。 （5）若两只雌、雄杂合子小鼠（P）融合基因导入的是同一对同源染色体上，则体细胞中都含有两个融合基因的雌雄个体杂交，产生的子代100%为有荧光小鼠；若两只雌、雄杂合子小鼠（P）融合基因导入的是在两对同源染色体上，则雌雄个体产生的配子有1/4不含融合基因，不含融合基因的雌雄配子完成受精作用形成的个体没有荧光，不含荧光的小鼠理论上约占1/4×1/4=1/16，即F2中出现有荧光小鼠理论上约占15/16。 （6）用DNA分子杂交技术检测目的基因是否整合到受体细胞的染色体DNA上时，常使用放射性同位素（或荧光分子）标记的目的基因单链片段作为探针，该技术利用的原理是碱基互补配对。50个模板DNA，最初10个循环后限制性引物耗尽，再进行20个循环，理论上可制备ss-DNA：50×20×210=1.024×106。 （7）PCR扩增时，引物和模板链之间形成双链才能开始扩增，两者之间的氢键数量和PCR扩增时变性的温度和退火的温度有直接关系，若用引物A和B进行PCR扩增，但没能扩增出GFP基因，从PCR操作过程中温度控制角度分析，可能的原因有变性温度低、退火温度太高。 （8）对荧光小鼠用荧光蛋白成像系统检测，相较于传统的物质提取、体外测量方式，引入荧光蛋白传感器测量荧光蛋白的优点是可研究活的生物体;获得实时直接、连续监测结果等。 48．（2025·福建龙岩·二模）人肺特异性X蛋白（LUNX）基因是某种肺癌诊断的标志物，增强子是基因转录的调控序列，对启动子具有促进作用。为了研究LUNX基因的增强子发挥作用的最佳位置是位于启动子的上游还是下游，科研人员从人类全基因组序列数据库中筛选并扩增了3个LUNX基因增强子片段（En，表示E1~E3），分别将每个En片段定向连接到pGL3载体中荧光素酶报告基因（luc+）启动子（SV40启动子）的上游或SV40终止序列的下游，通过检测荧光素酶的活性从而对增强子的功能进行判断。luc+的表达强度越强，荧光素酶的活性越高。相关信息见下图，回答下列问题。 (1)PCR每次循环一般可以分为 三步。在上述实验的PCR反应体系中共需要设计 种引物；为了定向连接到pGL3载体中，在引物5'端需要引入的限制性酶切位点有 种。 (2)将以上获得的En经酶切后分别定向连接到用对应限制酶处理的pGL3载体中，构建重组载体，利用相关实验技术对荧光素酶活性进行检测，结果如图所示。 ①根据结果得出的结论是 。 ②据图判断，对luc+表达促进作用最大的增强子的引物5'端需添加 限制酶的识别序列。 (3)半夏蛋白具有抗肿瘤等作用，科研人员提取半夏块根细胞中总RNA，纯化获得mRNA，后在逆转录酶的作用下获得不同大小片段的半夏蛋白cDNA。构建高效表达半夏蛋白的重组质粒是利用基因工程实现大规模生产半夏蛋白的核心工作，人员甲设想如下：根据实验室现有质粒A的限制酶识别位点，在E1增强子引物的5'端添加相应的限制酶识别序列，以此为引物，进行PCR扩增，得到足够数量的半夏蛋白cDNA，再与质粒A拼接，从而获得高效表达半夏蛋白的重组质粒，再进行后续实验。按此设想，甲进行了PCR、电泳操作，结果无相应条带出现，判断是扩增失败了。经检查，PCR所用的缓冲液、dNTP、Taq酶均正常，PCR操作程序正确，请分析扩增失败原因并提出改进措施： ①失败原因： 。 ②改进措施： 。 【答案】(1) 变性、复性和延伸 12 4 (2) 增强子E1、E2和E3在启动子（或SV40终止序列）的下游都能增强基因表达，其中E1的作用最为显著；E3在启动子的上游和下游都能增强基因表达 BamH I、Sal I (3) 原扩增E1增强子的引物无法与半夏蛋白cDNA片段的两条模板链充分配对，实现复性 对半夏蛋白cDNA两端进行测序，重新设计引物 【分析】PCR是利用DNA在体外摄氏95°高温时变性会变成单链，低温（经常是60°C左右）时引物与单链按碱基互补配对的原则结合，再调温度至DNA聚合酶最适反应温度（72°C左右），DNA聚合酶沿着磷酸到五碳糖(5'-3')的方向合成互补链。基于聚合酶制造的PCR仪实际就是一个温控设备，能在变性温度，复性温度，延伸温度之间很好地进行控制。 【详解】（1）PCR每次循环一般可以分为变性、复性和延伸。图中上游和下游的限制酶识别序列不同，当E1、E2、E3分别插入上游和下游时有6种情况，故共有12种引物用于PCR反应体系；目的基因与载体结合前需要用限制酶对两者进行切割，延伸是在引物的3'端延伸，为了保证目的基因的完整性，因此需在引物的5'端加上限制性酶切位点，且为了使DNA片段能定向插入表达载体，减少自连，常在两条引物上设计加入不同的限制性酶切位点，即在引物5'端需要引入的限制性酶切位点为4种。 （2）①比较图中荧光素酶活性，与只导入pGL3载体相比，增强子E1、E2和E3在启动子（或SV40终止序列）的下游都能增强基因表达，其中E1的作用最为显著；E3在启动子的上游和下游都能增强基因表达。②由于E1在SV40终止序列的下游增强作用最大，SV40终止序列下游的酶切位点是BamH I、Sal I，故需添加BamH I、Sal I的酶切序列。 （3）PCR反应的条件是缓冲液、原料（dNTP）、两种引物、Taq酶、温度等，其中最关键的是引物设计，在其他程序均正常的情况下，失败原因是引物设计不合理，原扩增E1增强子的引物无法与半夏蛋白cDNA片段的两条模板链充分配对，实现复性。改进措施是对半夏蛋白cDNA两端进行测序，重新设计引物。 49．（2025·河北张家口·二模）抗菌肽指昆虫体内经诱导而产生的一类具有抗菌活性的碱性多肽物质，抗菌肽具有选择性免疫激活和调节功能，对败血症有良好的预防和保护作用。如图为培育转抗菌肽基因奶牛的示意图。回答下列问题： Xho I 5'-C↓TCGAG-3' Sal I 5'-G↓TCGAC-3' Mbo I 5'-↓GATC-3' Bam H I 5'-G↓GATCC-3'    (1)据图可知，用限制酶 切割质粒，用DNA连接酶连接质粒和被限制酶切割后的抗菌肽基因，目的基因能正常转录，由图可知，转录的模板链为 （填“a链”或“b链”）。 (2)图中②为PCR技术，PCR反应缓冲溶液中一般要加入Mg2+，其原因是 ，子链DNA的延伸方向为 （用5'和3'表示）。 (3)去核卵母细胞去核的实质是去除 ，图中过程⑥可用物理或化学方法如 激活重构胚，使其完成分裂和发育进程发育为早期胚胎。 【答案】(1) XhoⅠ、SalⅠ b链 (2) 真核细胞的DNA聚合酶需要Mg2+激活 5'→3' (3) 纺锤体—染色体复合物 电刺激、Ca2+载体、乙醇、蛋白酶合成抑制剂 【分析】基因工程技术的基本步骤：（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。（4）目的基因的检测与鉴定：分子水平上的检测和个体水平上的鉴定。 【详解】（1）根据限制酶切割后的抗菌肽基因暴露出的黏性末端，可以判断抗菌肽基因的左端用限制酶XhoⅠ(识别序列5'-CTCGA-3')进行了切割，抗菌肽基因的右端用限制酶SalⅠ（识别序列5'-GTCGA-3'）进行了切割，据此推知应用限制酶XhoⅠ、SalⅠ切割质粒；质粒上的转录方向是从启动子向终止子，用DNA连接酶连接质粒和被限制酶切割后的抗菌肽基因，目的基因能正常转录，由图可知，转录的模板链为b链（b链左边为3'端）。 （2）PCR反应缓冲溶液中一般要加入Mg2+，其原因是真核细胞的DNA聚合酶需要Mg2+激活，子链DNA的延伸方向为5'→3'。 （3）去核的实质是去除纺锤体-染色体复合物，可用物理或化学方法如电刺激、Ca2+载体、乙醇、蛋白酶合成抑制剂激活重构胚，使其完成分裂和发育进程。 50．（2025·山东日照·二模）研究人员利用纤维素生产菌(酪氨酸合成缺陷型)合成了黑色纤维素薄膜。蛋白T7RNAP是一种噬菌体RNA聚合酶(T7RNAP的N端或C端单独存在时不能发挥作用，二者结合可形成完整的T7RNAP)，nMag和pMag是在蓝光环境下能够相互结合的两种光敏蛋白。研究人员通过PCR技术获融合基因，并将不同类型的启动子与相关基因连接，构建成基因表达载体，然后将其导入受体菌，获得了所需的工程菌。 (1)研究人员利用PCR技术实现编码T7RNAPN端的基因下游序列与编码nMag的基因上游序列的无缝连接，获得编码T7RNAPN端-nMag的融合基因，由图1可知，引物2的5＇端9个碱基序列为5＇ 3＇，如此设计引物2的目的是 。用同样的方法获得编码pMag-T7RNAPC端的融合基因。    (2)通用型启动子能够被纤维素生产菌的RNA聚合酶识别，结构完整的T7RNAP对T7启动子表现出高度的特异性。为获得蓝光诱导着色的纤维素生产工程菌，构建了下图所示的基因表达载体，图中3个启动子中，表示通用型启动子的是 (填序号)，表示T7启动子的是 (填序号)。    (3)将构建好的载体导入纤维素生产菌前，通常用 处理受体细胞。为筛选出能够生产黑色纤维素薄膜的工程菌，培养基中应添加 。 【答案】(1) CCTGCACCT 使T7RNAPN端基因的下游添加与nMag基因的上游相同的序列 (2) ②③ ① (3) Ca2+ 氯霉素、酪氨酸 【分析】PCR全称为聚合酶链式反应，是一项在生物体外复制特定的DNA片段的核酸合成技术，利用的原理是DNA复制。 【详解】（1）观察图 1，要实现编码 T7RNAP N 端的基因下游序列与编码 nMag 的基因上游序列的无缝连接，引物 2 的5′端 9 个碱基序列应与 nMag 基因的上游序列（从图中可知）相同，所以为5′CCTGCACCT3′。如此设计引物 2 的目的是使T7RNAPN端基因的下游添加与nMag基因的上游相同的序列，从而获得融合基因。 （2）蓝光照射条件下，T7RNAP的N端-nMag与T7RNAP的C端结合，导致无活性的T7RNAP变成有活性的T7RNAP；蓝光处理后，RNA聚合酶（T7RNAP）识别启动子①使基因1转录获得相应的mRNA，再以其为模板通过翻译过程获得酪氨酸酶，可见基因2和3正常表达无活性产物，被蓝光激活后再启动基因1表达，综合上述分析可知，启动子②和启动子③是通用型启动子，启动子①是 T7 启动子。 （3）将构建好的载体导入微生物（纤维素生产菌）前，通常用Ca2+处理受体细胞，使其成为感受态细胞，易于吸收外源 DNA 分子。由于纤维素生产菌是酪氨酸合成缺陷型，所以为筛选出能够生产黑色纤维素薄膜的工程菌，培养基中应添加酪氨酸，同时由于载体中有氯霉素抗性基因，还应添加氯霉素，这样含有重组质粒的工程菌才能在该培养基上生长。 51．（2025·河北石家庄·二模）农业生产中大量使用有机磷农药导致水体遭到了严重的污染。研究人员将源于施氏假单胞菌YC-YH1的降解酶基因mpd和ophc2插入苦草（一种沉水植物）染色体中，让转基因植物降解水体中的有机磷农药。下图是获得转基因苦草的基因工程操作程序，图1所示基因mpd和ophc2与引物结合位点及模板链分布情况。请回答下列问题： (1)现需将基因mpd和ophc2通过PCR技术进行扩增，在扩增基因时，需要根据 设计特异性引物序列，引物的作用是 。 (2)据图分析，将基因mpd和ophc2拼接成融合基因，基因mpd的a链的5端与基因ophc2的 （填“a链”或“b链”）的3端相连，理由是 。 (3)利用基因工程获得转基因植物的核心步骤为： ，据图2分析，该过程需要选择限制酶 切割融合基因。 (4)将受体细胞接种到添加卡那霉素的培养基中进行培养，卡那霉素的作用是 ，将筛选出的受体细胞经组织培养获得植株，但成功导入融合基因的植株不一定能降解有机磷农药，原因是 。 【答案】(1) mpd和ophc2基因两端的核苷酸序列 使DNA聚合酶能够从引物的3'端开始连接脱氧核苷酸 (2) b链 由于融合基因共用启动子和终止子，因此基因mpd和ophc2的转录模板链应在DNA的一条链上 (3) 基因表达载体的构建 XbaI和HindII (4) 筛选得到含重组DNA分子的受体细胞 导入的融合基因不一定能够成功表达 【分析】基因工程技术的基本步骤： （1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成； （2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等，标记基因可便于目的基因的鉴定和筛选。启动子是驱动基因转录的元件，而终止子是指示转录终止的位置； （3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法； （4）目的基因的检测与鉴定：分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA是否插入目的基因——PCR技术；②检测目的基因是否转录出了mRNA——PCR技术；③检测目的基因是否翻译成蛋白质——抗原-抗体杂交技术。个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。 【详解】（1）将基因mpd和ophc2通过PCR技术进行扩增，在扩增基因时，需要根据mpd和ophc2基因两端的核苷酸序列设计特异性引物序列，引物的作用是使引物的作用是使Taq酶能够从引物的3'端开始连接脱氧核苷酸。 （2）由于融合基因共用启动子和终止子，因此基因mpd和ophc2的转录模板链应在DNA的一条链上，因此将基因mpd和ophc2拼接成融合基因时，基因mpd的a链的5′端与基因ophc2的b链的3'端相连。 （3）利用基因工程获得转基因植物的核心步骤为基因表达载体的构建，据图2分析，根据转录方向和融合基因两侧的限制酶识别位点，可知BamHI会破坏融合记忆，且使用EcoRI或导致目的基因反向连接，因此该过程需要选择限制酶XbaI和HindII。 （4）卡那霉素抗性基因为标记基因，将受体细胞接种到添加卡那霉素的培养基中进行培养，卡那霉素的作用可筛选得到含重组DNA分子的受体细胞，将筛选出的受体细胞经组织培养获得植株，由于导入的融合基因不一定能够成功表达，因此但成功导入融合基因的植株不一定能降解有机磷农药。 52．（2025·江西萍乡·二模）“中国辣都”萍乡，人人喜食辣椒，家家喜种辣椒。辣椒栽培过程中易受辣椒疫霉菌侵染导致减产，某科研团队发现其体内的 CaSBP08 基因是一个能被辣椒疫霉菌利用的感病基因，该团队欲通过 CRISPR/Cas9 技术实现对辣椒 CaSBP08 基因的特异性敲除，培育出抗疫霉辣椒。 CRISPR/Cas9 系统通过具有序列特异性的向导 RNA（sgRNA）引导 Cas9 蛋白靶向结合到目的基因的特定区域，并对其进行切割。回答下列问题： (1)Cas9 蛋白与基因工程中使用的 酶功能相似，二者的区别主要体现在 。 (2)该团队在 CaSBP08 基因中找到的靶序列为 5’ -ATGCCA……GTACCG-3’，则根据该靶序列设计的 sgRNA 序列应为：5’ - -3’。 (3)为保证 sgRNA 基因与下图中的 Ti 质粒准确连接，科研人员人工合成了 sgRNA 基因，sgRNA 基因两条链碱基序列应该是 （填字母）。 A．5’ -GAATTCCCCGTAC… TGGCATGGTACC-3’     B．5’ -GGTACCCCGTAC……TGGCATGAATTC-3’ C． 5’ -GGTACCATGCCA…. GTACGGGAATTC-3’     D．5’ -GAATTCATGCCA…… GTACGGGGTACC-3’    Ti 质粒中用到了 U6、CMV 两个启动子，而不共用一个启动子的目的是 。 (4)该团队利用辣椒植株花序直接浸没在含有重组质粒的农杆菌溶液中一段时间，然后培养植株并获得种子。与农杆菌直接侵染植物叶片相比，该技术可以不需要经过 过程即可获得转基因植株。 (5)播种收获的种子，一段时间后，可以使用 筛选成功转化的辣椒植株，并通过 的方法对其进行个体水平鉴定。 【答案】(1) 限制/限制性内切核酸 cas9需要sgRNA引导才能肥向结合到特定区域进行切割，而限制酶不需要引导，自己能识别双链DNA分子的特定核苷酸序列 (2)CGGUAC--···UGGCAU (3) BD 确保sgRNA基因和cas9基因能分送表达并各自发挥作用 (4)植物组织培养 (5) 草铵膦 辣椒疫霉菌 【分析】1、基因工程的基本操作程序有四步：①目的基因的获取，②基因表达载体的构建，③将目的基因导入受体细胞，④目的基因的检测与鉴定。 2、基因工程的三种工具：限制性核酸内切酶（限制酶）、DNA连接酶、运载体。 3、标记基因的作用是为了鉴别受体细胞中是否含有目的基因，从而将含有目的基因的细胞筛选出来。 【详解】（1）Cas9 蛋白与基因工程中使用的限制（限制性内切核酸）酶功能相似，限制酶在基因工程中能识别双链DNA分子的特定核苷酸序列并切割，Cas9蛋白在sgRNA引导下能靶向结合并切割目的基因特定区域，二者功能相似，主要区别在于Cas9需要sgRNA引导，限制酶可自主识别。 （2）根据碱基互补配对原则，已知靶序列为5'-ATGCCA……GTACCG - 3'，RNA中U与DNA中A配对，所以sgRNA序列为5'-CGGUAC……UGGCAU - 3'。 （3）为保证准确连接，sgRNA基因两条链碱基序列应与Ti质粒相应酶切位点互补。图中Ti质粒用EcoRⅠ和KpnⅠ酶切，EcoRⅠ识别序列GAATTC，KpnⅠ识别序列GGTACC，所以sgRNA基因两条链碱基序列应为B（5’ -GGTACCCCGTAC……TGGCATGAATTC-3’）和D（5’ -GAATTCATGCCA…… GTACGGGGTACC-3’）。 Ti质粒用U6、CMV两个启动子而不共用一个，是为确保sgRNA基因和cas9基因能分别表达并各自发挥作用。 （4）农杆菌直接侵染植物叶片需经植物组织培养过程获得转基因植株，而用辣椒植株花序直接浸没含重组质粒农杆菌菌液的方法不需要经过植物组织培养过程。 （5）种植收获种子后，用卡那霉素筛选成功转化的辣椒植株（因为重组Ti质粒含卡那霉素抗性基因）。 在个体水平上，用辣椒疫霉菌接种辣椒植株，观察植株是否患病来鉴定其是否具有抗性。 53．（2025·甘肃白银·二模）L-乳酸和D-乳酸是同分异构体，前者作为一种食品酸味剂，被广泛应用于食品加工中，后者却会导致人体中毒。为了去除廉价发酵原料中的D-乳酸，从而提高发酵最终产物L-乳酸的光学纯度，研究者通过构建带有不同厌氧诱导启动子（pflBp6、pnirB、pflBp6-pnirB）的D-乳酸脱氢酶基因（dld）的表达质粒（如图1所示），并将其分别转入产L-乳酸的大肠杆菌HBUT-L，以期加强其在发酵产L-乳酸的同时消除外源D-乳酸的能力。回答下列问题： (1)图1中各质粒的启动子可在 条件诱导下被激活，从而发挥 的作用。相比于普通启动子（无须诱导就有活性），使用诱导型启动子的优点是 。    (2)研究者构建的重组质粒pUC19-pflBp6-pnirB-dld包含2个启动子，其目的可能是 ；构建重组质粒后，为了确定重组质粒是否构建成功，需进行PCR检测。若每种重组质粒的PCR检测仅使用一对引物，则检测pUC19-pflBp6-dld、pUC19-pnirB-dld、pUC19-pflBp6-pnirB-dld三种质粒应分别选择图1中的引物 。 (3)将重组质粒pUC19-pflBp6-dld、pUC19-pnirB-dld、pUC19-pflBp6-pnirB-dld分别转化至出发菌株HBUT-L中得到工程菌株HBUT-L2、HBUT-L3、HBUT-L4.转化成功后，在一定条件下检测各组D-乳酸脱氢酶活性，结果如图2.该结果表明带有启动子pflBp6、pnirB、pflBp6-pnirB的dld基因表达质粒都能有效提高菌株的D-乳酸脱氢酶活性，其中带 的dld基因表达质粒的提升效果最好。    (4)根据（3）中结果，研究者拟对菌株HBUT-L4的相关能力进行发酵验证，请简要写出验证思路： 。 【答案】(1) 无氧 驱动基因转录出mRNA 可通过控制诱导条件调控目的基因的表达 (2) 增强dld基因的表达或使dld基因过表达 R1和F3、R2和F3、R1和F3 (3)pflBp6-pnirB (4)将HBUT-L、HBUT-L4分别接种到相同且适宜的培养基中发酵一段时间，测定并比较发酵前和发酵后的L-乳酸含量及D-乳酸含量 【分析】基因工程技术的基本步骤：（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。（4）目的基因的检测与鉴定。 【详解】（1）本研究中的启动子是厌氧诱导启动子，故诱导其激活的条件应为无氧；启动子的作用是与RNA聚合酶识别并结合，驱动基因转录出mRNA；普通启动子无须诱导就有活性，随时可以发挥作用转录出mRNA，而诱导型启动子可通过控制诱导条件调控目的基因适时、适量表达，这是其优势。 （2）构建的重组质粒pUC19-pflBp6-pnirB-dld包含2个启动子，其目的可能是增强dld基因的表达或使dld基因过表达；要用PCR检测重组质粒是否构建成功，关键要看三种质粒加入合适的PCR反应体系后能否分别扩增出pflBp6-dld、pnirB-dld及pflBp6-pnirB-dld三种片段。据图分析，引物应分别选择R1和F3、R2和F3、R1和F3.其中第一种和第三种虽然选了相同的引物，但可通过电泳区别扩增出片段的长短达到检测目的。 （3）据图可知，三种重组质粒都使菌株的D-乳酸脱氢酶活性显著高于对照组，说明带有启动子pflBp6、pnirB、pflBp6-pnirB的dld基因表达质粒都能有效提高菌株的D-乳酸脱氢酶活性；对比同一时间情况下HBUT-L4、HBUT-L3、HBUT-L2的D-乳酸脱氢酶活性为HBUT-L4＞HBUT-L2＞HBUT-L3，说明带双启动子pflBp6-pnirB的dld基因表达质粒的提升效果最好，带pflBp6和带pnirB的dld基因表达质粒的提升效果依次次之。 （4）本研究的目的是加强产L-乳酸的大肠杆菌在发酵产L-乳酸的同时消除外源D-乳酸的能力，故需要测定目标菌株HBUT-L4发酵时产L-乳酸的能力和消除D-乳酸的能力，并与HBUT-L菌株的相关能力作对比。因此，实验思路应为将HBUT-L、HBUT-L4分别接种到相同且适宜的培养基中发酵一段时间，测定并比较发酵前和发酵后的L-乳酸含量及D-乳酸含量。 54．（2025·安徽滁州·二模）γ-干扰素是水溶性二聚体细胞因子，具有抗病毒、抗肿瘤特性，并能调节免疫系统的功能。研究人员成功利用毕赤酵母表达系统实现了猪γ-干扰素的高效表达。毕赤酵母基因组中含有的AOXl基因所携带的甲醇诱导型强启动子。回答下列问题。 (1)利用PCR技术扩增猪γ-干扰素基因时，所使用的引物PL和引物PR是根据 设计的，还需要模板、4种脱氧核苷酸和 。综合图示分析，PCR时相应的引物在猪γ-干扰素基因中结合位置正确是 。 A．①处：PL、④处：PR  B．①处：PR、④处：PL C．②处：PL、③处：PR  D．②处：PR、③处：PL (2)将重组质粒通过一定的技术手段导入组氨酸（组氨酸是毕赤酵母生长所必需的氨基酸）合成缺陷型毕赤酵母菌株中，再置于不含组氨酸的毕赤酵母培养基中培养，以筛选出成功导入重组质粒的毕赤酵母，其原理是 。 (3)将所选菌株置于液体培养基中连续培养若干天，需要每隔24小时在培养基中加入甲醇，其目的是 ，同时也为毕赤酵母提供能量。一段时间后，对培养基进行离心，然后收集上清液，再用抗原—抗体杂交方法对上清液中的产物进行检测、鉴定。收集上清液的原因是 。 【答案】(1) 一段已知的猪γ-干扰素基因的核苷酸序列 耐高温的DNA聚合酶 C (2)组氨酸合成缺陷型毕赤酵母无法合成组氨酸，重组质粒含组氨酸合成基因His4，其转入酵母细胞中表达可帮助酵母细胞合成组氨酸，从而在该培养基中获得成功导入重组质粒的毕赤酵母 (3) 诱导猪γ-干扰素基因表达 毕赤酵母会将猪γ-干扰素分泌到细胞外的液体培养基中，由于猪γ-干扰素溶于水，经过离心，会存在于上清液中 【分析】1、PCR技术是对体内DNA复制过程的模仿，也需要模板、原料、酶和引物等。待扩增的DNA分子是模板，原料是4种脱氧核苷三磷酸，即dNTP，N代表A、T、G、C四种碱基。2、培育转基因抗虫棉主要需要四个步骤：目的基因的筛选与获取、基因表达载体的构建、将目的基因导入受体细胞、目的基因的检测与鉴定。 【详解】（1）利用PCR技术扩增目的基因（猪γ - 干扰素基因）时，引物是根据目的基因（猪γ - 干扰素基因）的一段已知序列设计的。PCR技术需要的条件有模板（猪γ - 干扰素基因）、4种脱氧核苷酸、热稳定DNA聚合酶（Taq酶）。由于DNA聚合酶只能从5'到3'方向延伸子链，结合pPIC9K质粒上的限制酶切割位点以及目的基因的转录方向可知，②处应位于质粒上的启动子右侧，故应该在②处结合引物PL（其内含有EcoRⅠ的碱基识别序列），在③处结合引物PR（其内含有NotⅠ的碱基识别序列），这样才能按照正确的方向扩增目的基因，并保证扩增后的目的基因能正向连接到质粒上，所以答案是C。 （2）重组质粒中含有促进组氨酸合成的基因（标记基因），导入重组质粒的毕赤酵母菌株因为有组氨酸合成基因（His4），能够在不含组氨酸的培养基中合成组氨酸从而生长，而未导入重组质粒的毕赤酵母菌株由于是组氨酸合成缺陷型，不能在不含组氨酸的培养基中合成组氨酸，无法生长，所以可以通过这种方式筛选出成功导入重组质粒的毕赤酵母。 （3）毕赤酵母基因组中含有的AOX1基因所携带的是甲醇诱导型强启动子，加入甲醇的目的是诱导AOX1基因所携带的强启动子启动，从而启动猪γ - 干扰素基因的表达。因为γ - 干扰素是水溶性的，会分泌到培养液中，所以离心后收集上清液可以获得表达的γ - 干扰素。 55．（2025·山西晋城·二模）花青素是一种水溶性色素，属于黄酮类化合物，具有多种养生功效。如图是花青素合成酶基因（S）的cDNA（某种生物发育某个时期的mRNA经逆转录产生的互补DNA）和Ti质粒图，科学家欲利用二者构建基因表达载体，培育出花青素含量更高的蓝莓。回答下列问题: (1)利用PCR技术扩增S基因时，需要引物，引物是指 ，设计引物时引物的长度需要比计算出的长度长一些，原因是 。PCR扩增的产物进行电泳时，发现除了目标序列外还有很多非特异性条带，出现该现象的原因可能有 （答两点）。 (2)根据图1和图2分析，上述基因表达载体的构建中应选择限制酶 切割S基因的cDNA和Ti质粒，其目的是 。图2 Ti质粒中的抗生素抗性基因作为标记基因，可用于 。 (3)研究发现普通蓝莓细胞原有的花青素合成酶基因（ANS）与S基因存在同源区段，ANS基因的同源区段中除没有图3所示的靶点序列（长度为15 bp）外，其余序列均与S基因的同源区段相同，S基因的同源区段中只有一个靶点序列。为了筛选出花青素含量更高的蓝莓植株，科学家利用PCR技术进行检测，在S基因靶点序列前方距离100 bp长度选取一段序列合成上游引物A，靶点序列后方距离200 bp长度选取一段序列合成下游引物C，根据靶点序列合成上游引物B，如图3所示。利用上述三种引物对培育的转基因蓝莓和普通蓝莓的DNA进行PCR扩增及电泳分析，理论上讲，普通蓝莓的DNA扩增产物电泳后会形成长度为 bp的条带，符合要求的转基因蓝莓的DNA扩增产物电泳后会形成长度为 bp的条带。 【答案】(1) 一小段能与DNA母链的部分碱基序列互补配对的短单链核酸 为了降低非特异性结合 引物设计太短（或引物特异性不强，即与非目的序列有同源性）、两引物之间碱基互补配对（形成引物二聚体）、复性温度过低、Mg2+浓度过高、DNA模板出现污染等 (2) XbaⅠ、HindⅢ 以保证目的基因（S基因）与载体正向连接，从而提高重组效率 筛选含有基因表达载体的受体细胞 (3) 300 215、300、315 【分析】基因工程技术的基本步骤：（1）目的基因的筛选和获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成；（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等；（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法；（4）目的基因的检测与鉴定：分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA是否插入目的基因——DNA分子杂交技术；②检测目的基因是否转录出了mRNA——分子杂交技术；③检测目的基因是否翻译成蛋白质——抗原—抗体杂交技术；个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。 【详解】（1）利用PCR技术扩增基因时，引物是一段能与DNA母链的部分碱基序列互补配对的短单链核酸。 设计引物时引物的长度要比计算出的长一些，是为了降低非特异性结合，因为引物过短，特异性差，容易与其他部位结合。 PCR产物进行电泳时，出现非目标条带，原因可能有引物设计太短（特异性不强，与非目的序列有同源性）、两引物之间碱基互补配对（形成引物二聚体）、复性温度过低、Mg²⁺浓度过高、DNA模板出现污染等。 （2）构建基因表达载体时选择限制酶，要保证不破坏目的基因（花青素合成酶基因）和标记基因，所以图中应选择限制酶XhoⅠ、HindⅢ，目的是保证目的基因（基因S）与运载体正确连接，从而提高重组效率。 Ti质粒中的抗生素抗性基因作为标记基因，可用于筛选含基因表达载体的受体细胞，通过在含有相应抗生素的培养基上培养受体细胞，能存活的就是含有重组质粒（含标记基因）的细胞。 （3）普通蓝莓DNA扩增产物：从图中可知，普通蓝莓基因S的同源区段只有一个酶切点，若用引物扩增，扩增产物长度就是从上游引物到下游引物的距离，即200 + 100 = 300bp。 普通蓝莓细胞原有的花青素合成酶基因（ANS）与S基因存在同源区段，则用A和C扩增时会出现300bpd的片段，对S基因，用A和C扩增时，包含靶点15bp，长度为100+15+200=315bp；用上游引物B（靶点序列）和下游引物C扩增时，长度为15+200=215bp。因此，转基因蓝莓的扩增产物有215bp、300bp、315bp三种条带。 56．（2025·江西·二模）生物燃料乙醇是重要的清洁能源。酿酒酵母是用作乙醇发酵的重要菌种,但因其本身跨膜转运木糖困难以及缺乏专一性的木糖代谢酶,故不能直接利用木糖进行乙醇发酵。我国研究人员对酿酒酵母进行改造,研究出木糖专用酵母。为了提高乙醇的产量,研究人员利用基因工程技术将基因与增强启动子相连,导入受体细胞中,观察工程菌的乙醇发酵情况,技术路线如下图所示,其中①~④代表PCR扩增引物,基因是亮氨酸合成基因,基因是尿嘧啶合成基因。回答下列问题: (1)酿酒酵母与果酒的制作密切相关,密闭瓶中的葡萄汁可发酵制作果酒,写出发酵过程的反应式 。葡萄酒制作完成后,对装有葡萄酒的瓶子的操作是 ,盖上一层纱布,控制温度条件,即可进行葡萄醋的发酵。 (2)酵母细胞质膜上的转运蛋白从合成到定位,与该过程密切相关的细胞器有 ,对酵母进行纯培养,配制的培养基通常采用 法灭菌。 (3)用于扩增基因的引物是 (选填图中编号),为了使基因与载体质粒有效连接,可以通过PCR技术在基因的上下游引入限制性核酸内切酶 的识别序列,再用对应酶切后通过DNA连接酶连接。 (4)制备工程菌b时,需要将重组质粒b导入尿嘧啶缺陷型酿酒酵母中,用以木糖为唯一碳源和缺少尿嘧啶的培养基进行筛选。据此,制备工程菌a时,需要将重组质粒a+重组质粒b导入 中,并用 的培养基进行筛选。 【答案】(1) 打开瓶盖 (2) 核糖体、内质网、高尔基体、线粒体 高压蒸汽（湿热灭菌） (3) ②③ Bcl Ⅱ (4) 亮氨酸缺陷型酿酒酵母和尿嘧啶缺陷型酿酒酵母 以木糖为唯一碳源、缺少亮氨酸和缺少尿嘧啶 【分析】基因工程的基本操作程序是：目的基因的筛选与获取、基因表达载体的构建、将目的基因导入受体细胞、目的基因的检测与鉴定。蛋白质工程是在基因工程的基础上，延伸出来的第二代基因工程。 【详解】（1）果酒发酵是酵母菌无氧呼吸产生酒精和二氧化碳的过程，反应式为 C6H12O6 ​ 2C2H5OH+2CO2+少量能量。 葡萄酒制作完成后，制作葡萄醋需要醋酸菌，醋酸菌是好氧菌，所以要打开瓶盖提供氧气。 （2）转运蛋白属于分泌蛋白，其合成与定位过程中，核糖体合成蛋白质，内质网进行初步加工，高尔基体进行进一步加工和运输，线粒体提供能量，所以相关细胞器有核糖体、内质网、高尔基体、线粒体。 对培养基灭菌通常采用高压蒸汽（湿热灭菌）法。 （3）由于引物的作用是在DNA聚合酶的催化下，在引物的3’端连接上脱氧核苷酸，因此，设计的扩增引物位置是图中的②③。为了使XK基因与载体质粒有效连接，可以通过PCR技术在XK基因的上下游引入限制性核酸内切酶Bcl Ⅱ的识别序列，这样设计是因为在质粒的启动子和终止子之间只有该限制酶的识别序列，因此为了实现目的基因和载体的连接，需要在引物的5’端添加上该限制酶的识别序列，再用对应酶切后通过DNA连接酶连接。 （4）制备工程菌a导入的是质粒a和质粒b，其中含有的是亮氨酸合成酶基因和尿嘧啶合成酶基因，因此所用的受体细胞是亮氨酸缺陷型酿酒酵母和尿嘧啶缺陷型酿酒酵母；由于受体菌中导入了重组质粒a和b，因而成功导入的工程菌应该具有合成亮氨酸和尿嘧啶的能力，同时也可利用木糖，因此可在加入木糖为唯一碳源、缺少亮氨酸、缺少尿嘧啶的培养基中将工程菌a筛选出来。 57．（2025·陕西汉中·二模）从正常人的血浆中提取的血清白蛋白（HSA）在临床上应用很广泛，有重要的医用价值。下图是通过相关技术获取重组HSA示意图，其中报告基因表达的产物能催化无色物质K呈现蓝色。据图回答下列问题： (1)若要体外获得大量的人血清白蛋白基因，采用PCR技术扩增目的基因时，在PCR反应体系中需加入引物，引物的作用是 ，若目的基因扩增3代，则共用引物 个。PCR完成以后，常采用 法来鉴定PCR的产物。 (2)过程①中需将植物细胞与农杆菌混合后共同培养，旨在让 进入植物细胞；除尽农杆菌后，还须转接到含 的培养基上筛选出转化的植物细胞。 (3)为检测HSA基因的表达情况，可提取受体细胞的蛋白质，用 进行抗原—抗体杂交实验。 (4)科学家培养出一种转基因山羊，其膀胱上皮细胞可以合成人血清白蛋白并分泌到尿液中。其培育方法中将重组质粒通过 法导入山羊的受体细胞时，常选用受精卵作为受体细胞的主要原因是 ，人血清白蛋白基因能在山羊膀胱上皮细胞中表达的原因是 。 【答案】(1) 使DNA聚合酶能够从引物的 3'端开始连接脱氧核苷酸 14 琼脂糖凝胶电泳 (2) T—DNA 无色物质K (3)抗人血清白蛋白的抗体 (4) 显微注射 受精卵具有发育的全能性 生物界共用一套遗传密码子 【分析】1、基因工程技术的基本步骤是：（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法。（4）目的基因的检测与鉴定：分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA是否插入目的基因--DNA分子杂交技术；②检测目的基因是否转录出了mRNA--分子杂交技术；③检测目的基因是否翻译成蛋白质--抗原-抗体杂交技术。个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。 2、利用PCR技术扩增DNA时所需的条件：引物、模板DNA（目的基因）、原料（4种脱氧核糖核苷酸）和耐热性的DNA聚合酶等。 【详解】（1）在PCR反应体系中需加入引物，引物的作用是使DNA聚合酶能够从引物的3'端开始连接脱氧核苷酸，若目的基因扩增3代，DNA有23=8个，DNA单链有8×2=16个，去除两条模板链，则共用引物14个。PCR完成以后，常采用琼脂糖凝胶电泳法来鉴定PCR的产物。 （2）该方法为农杆菌转化法，过程①中需将植物细胞与农杆菌混合后共同培养，旨在通过农杆菌的转化作用，让T-DNA进入植物细胞；由于报告基因表达的产物能催化无色物质K呈现蓝色，所以除尽农杆菌后，还须转接到含无色物质K的培养基上筛选出转化的植物细胞。 （3）为检测HSA基因是否成功表达，可提取受体细胞的蛋白质（相当于抗原，能与特定的抗体结合），用抗人血清白蛋白的抗体进行杂交实验，若呈阳性，则说明HSA基因成功表达。 （4）将重组质粒通过显微注射法导入动物的受体细胞时，常选用受精卵作为受体细胞，主要原因是动物受精卵具有发育的全能性，由于生物界共用一套遗传密码子，所以人血清白蛋白基因能在山羊膀胱上皮细胞中表达出相应的蛋白质。 58．（2025·辽宁·二模）（GLP-1（胰高血糖素样肽-1））是一种治疗2型糖尿病的药物，但是它在体内的半衰期很短。利用融合PCR技术通过将（GLP-1基因与人的血清白蛋白（HSA）基因融合并通过大肠杆菌表达，部分过程如下图所示，结果表明融合蛋白的半衰期显著延长，稳定性和疗效有所提高。请回答下列问题： (1)上述构建融合蛋白的技术属于 工程，其基础是了解GLP-1和HSA 及其与 的关系。 (2)融合PCR技术能够实现GLP-1基因和人的HSA基因能正确融合的主要原因是 。 (3)若融合基因的L链为转录的模板链，为保证融合基因和质粒正确连接，在设计引物 （填“P1”“P2”“P3”“P4”）时应分别在引物的 （填“5'”或“3'”）端加上限制酶 的识别序列。在PCR中，引物的作用是 。 (4)已知β—半乳糖苷酶可分解无色的X-gal产生蓝色物质，使菌落呈现蓝色，否则菌落为白色。将大肠杆菌接种到含 的选择培养基上，表现为 色菌落的即为目的菌。 【答案】(1) 蛋白质 结构规律 生物功能 (2)引物和引物存在互补配对的片段 (3) ， 5' BglⅡ和XmaⅠ 使DNA聚合酶能够从引物的3'端开始连接脱氧核苷酸 (4) 新霉素和X-gal 白 【分析】基因工程技术的基本步骤：（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。（4）目的基因的检测与鉴定。 【详解】（1）上述构建融合蛋白的技术通过改造基因最终实现蛋白质的改造过程，属于蛋白质工程；蛋白质工程是指以蛋白质分子的结构规律及其与生物功能的关系作为基础，故基础是了解GLP-1和HSA结构规律和生物功能。 （2）结合图示可知，融合PCR技术能够实现GLP―1基因和人的血清白蛋白（HSA）基因融合的原因是引物P2和引物P3存在互补配对的片段。 （3）引物需要与模板的3'端结合，结合图示可知，要扩增目的基因，需要用引物P1和P4，质粒中含有两个标记基因，目的基因需要插入到其中一个标记基因内且保证在启动子下游，因此需要插入到LacZ基因内，需要在目的基因两侧加上BglⅡ和XmaⅠ限制酶切位点，子链延伸时从引物的3′端向后延伸，限制酶切位点需要加在引物的5′端，由转录时产物mRNA延伸时沿模板的3′端向5′端延伸，因此引物P1的5′端需要引入BglⅡ限制酶切位点，引物P4的5′端需要引入XmaⅠ限制酶切位点。 （4）已知β―半乳糖甘酶可以分解无色的X―gal产生蓝色物质使菌落呈现蓝色，否则菌落为白色，结合题图，目的基因的插入破坏了LacZ基因，使其不能正常表达无法产生β―半乳糖苷酶，底物X―gal不会被分解，但重组质粒含有新霉素抗性基因，故筛选工程菌的过程为：将导入目的基因的大肠杆菌接种到含新霉素和X―gal的培养基上，表现为白色菌落的即为目的菌。 59．（2025·山东聊城·二模）大豆中转录调控因子Y蛋白可以和某些基因启动子序列结合，促进其表达以增强大豆对干旱和盐胁迫的抗性。研究人员通过逆转录获得Y基因并将其下游终止密码子对应序列剔除，然后与载体上绿色荧光蛋白基因（GFP）进行拼接获得融合基因。成功 表达的Y-GFP融合蛋白可用于Y蛋白调控机理的研究。    (1)研究中首先要对Y基因进行PCR扩增。PCR反应要在一定的缓冲液中进行，缓冲液中一般需要加入Mg²+,其原因是 。图甲所示Y基因序列为转录的 （填“模板链”或“非模板链”）。已知EcoRI识别序列为5'-GAATTC-3'，BamHI识别序列为5'-GGATCC-3',这些限制酶识别序列不影响融合蛋白基因的表达。为使Y基因正确接入载体并成功表达出Y-GFP合蛋白，Y基因下游扩增引物应为5'- -3'（包括添加的限制酶识别序列，共写12个碱基）。 (2)将初步构建的Y-GFP基因表达载体转入大豆细胞后，对经潮霉素筛选得到的两个不同细胞系总蛋白进行抗体检测，电泳结果如图乙所示。其中细胞系 能成功表达出Y-GFP融合蛋白。 (3)为探究Y蛋白能否与S基因（大豆类固醇化合物合成的关键基因）启动子序列结合，用S基因启动子序列制作的探针进行相关实验，实验结果如图丙所示。已知Y蛋白与DNA序列结合后，可在凝胶电泳中产生阻滞条带。据图分析，Y蛋白 （填“能”或“不能”）与S基因启动子序列结合，相比于a条带， 条带放射性低的原因是 。 (4)过表达Y基因或施加外源大豆类固醇化合物均可显著增强大豆对干旱和盐胁迫的抗性。综上所述，Y蛋白增强大豆对干旱和盐胁迫抗性的机理是 。 【答案】(1) DNA聚合酶需要 Mg²+激活 非模板链 GGATCCATGTTC (2)2 (3) 能 100倍未标记的探针与同位素标记的探针竞争性结合Y蛋白，导致b处带有放射性的阻滞条带减少 (4)Y蛋白（通过与S基因启动子序列结合）促进S基因表达，促进固醇类化合物生成，增强大豆对干旱和盐胁迫的抗性 【分析】基因工程的基本操作步骤主要包括四步：①目的基因的获取；②基因表达载体的构建；③将目的基因导入受体细胞；④目的基因的检测与表达。其中，基因表达载体的构建是基因工程的核心。 【详解】（1）由于DNA聚合酶需要 Mg²+激活，因此缓冲液中一般需要加入Mg²+。转录出来的信使RNA，翻译时的起始密码子应该是AUG，AUG应该跟模板链TAC是互补配对的，跟非模板链ATG是相同的，图中Y基因单链部分，左端起始位置是ATG刚好跟信使RNA的起始位置是相同的，故图甲所示Y基因序列为转录的非模板链。据题图分析可知，Y基因上面没有那个EcoRI和BamHI的识别序列，所以要扩增Y基因的时，引物的5'端是要加上EcoRI和BamHI的识别序列，根据载体结构，左端是启动子，右端是终止子，图中Y基因单链部分是非模板链，所以Y基因是从左到右与载体部分连接。故在Y基因的左端连接EcoRI的识别序列，Y基因的右端连接BamHI的识别序列。即Y基因的下游扩增引物上面应该加BamHI的识别序列，再根据题干信息“在获得Y 基因并将其下游终止密码子对应序列剔除”可知，Y基因下游最左端的三个碱基转录为终止密码子，故这三个碱基要剔除，所以为使Y基因正确接入载体并成功表达出Y-GFP 融合蛋白，Y基因下游扩增引物应 为5'- GGATCCATGTTC -3'。 （2）将初步构建的Y−GFP基因表达载体转入大豆细胞后，需要对经潮霉素筛选得到的细胞系进行抗体检测以确认是否成功表达出Y−GFP融合蛋白。根据图乙的电泳结果可以看出，细胞系2在预期位置出现了明显的条带而细胞系1没有，因此可以判断细胞系2能成功表达出Y−GFP融合蛋白。 （3）根据图丙的实验结果和已知信息，可以看出Y蛋白与DNA序列结合后，可以在凝胶电泳中产生阻滞条带。而实验组（加入Y蛋白）的条带相对于对照组（未加入Y蛋白）产生了阻滞，说明Y蛋白能与S基因启动子序列结合。相比于a条带（对照组），b条带（实验组）放射性低的原因是100倍未标记的探针与同位素标记的探针竞争性结合Y蛋白，导致b处带有放射性的阻滞条带减少。 （4）根据题目信息和分析结果，Y蛋白增强大豆对干旱和盐胁迫抗性的机理是Y蛋白与S基因启动子序列结合，促进S基因的表达，进而促进大豆固醇类化合物的合成，从而增强大豆对干旱和盐胁迫的抗性。 60．（2025·宁夏银川·二模）酵母细胞表达系统是一种利用酵母菌作为宿主来生产重组蛋白的技术平台。土壤中存在产PG酶(增大蛋白质的溶解性)的金黄杆菌，研究人员设计了利用基因工程高效生产PG 酶的方案，流程如图1所示，相关限制性内切核酸酶的识别和切割位点如图2所示。回答下列问题：    (1)过程①应用了 PCR 技术，利用PCR 技术扩增时，需要 种引物，引物的作用是 。一般还需要往PCR反应缓冲液中加入Mg²⁺，其原因是 。PCR反应过程可在 PCR 扩增仪中自动完成，而后常用 来鉴定PCR 的产物。 (2)完成过程②需要先将PG酶基因与pPIC9K 质粒重组，据图分析，该过程中最好选择限制酶 切割。 (3)结合图中过程③分析，将重组质粒导入大肠杆菌内的目的是 。过程④中将重组质粒酶切后，整合在酵母菌染色体上。 【答案】(1) 2 使DNA聚合酶能从引物的3°端开始连接脱氧核苷酸 DNA聚合酶需要Mg2+激活 琼脂糖凝胶电泳 (2) Bgl II和Not I (3) 利用大肠杆菌繁殖速度快的特点，短时间内可获取大量的重组质粒 【分析】基因工程技术的基本步骤：(1)目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。(2)基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。(3)将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。(4)目的基因的检测与鉴定。 【详解】（1）利用PCR技术扩增时，DNA聚合酶不能从DNA链的一端直接开始合成子链，需要在反应体系中添加2种引物，分别与两条模板链结合，使DNA聚合酶能从引物的3'端开始连接脱氧核苷酸。DNA聚合酶需要Mg2+激活，故一般还需要往PCR反应缓冲液中加入适量的Mg2+。PCR反应过程可以在PCR扩增仪中自动完成，PCR的产物的分子量大小等不同，常用琼脂糖凝胶电泳来鉴定PCR的产物。 （2） 过程②是将目的基因导入受体细胞的过程，在此之前需要先构建基因表达载体，即将PG酶基因与pPIC9K质粒重组。在构建基因表达载体时，需要用同一种限制酶或能产生相同末端的限制酶分别切割质粒和目的基因，根据图1和图2分析，PG酶基因两端序列分别含有Bgl II和Not I识别位点，故最好选择限制酶Bgl II和Not I切割能产生和目的基因相同的末端。 （3） 大肠杆菌繁殖速度快，将重组质粒导入大肠杆菌内，短时间内可获取大量的重组质粒。 61．（2025·天津河北·二模）东北酸菜是白菜经腌制而成的传统食品。发酵过程中若霉菌等微生物大量繁殖会导致酸菜腐败发臭。研究人员从酸菜中分离出具有抑菌活性的乳酸菌，该类乳酸菌因能分泌新型细菌素（多肽）而具有抑菌活性。为获得细菌素表达量更高的工程菌用于生产，进行了相关研究。回答下列问题。 (1)乳酸菌产生的乳酸能溶解碳酸钙而产生溶钙圈。研究人员为从市售多个品牌的酸菜中分离纯化乳酸菌，配制含有碳酸钙的固体培养基，利用 法对该培养基进行灭菌，并采用 法将酸菜液接种到培养基中，选择有溶钙圈的菌落并继续进行纯培养，选择对霉菌抑菌率高的菌株进行后续操作。 (2)研究人员从上述乳酸菌中提取细菌素基因，将其导入受体菌，再对受体菌做进一步的检测与鉴定。如图是细菌素基因及构建的基因表达载体的示意图。 ①利用PCR技术扩增细菌素基因时，应选择的一对引物是 ，PCR过程中，经过4轮循环，消耗引物的个数是 。 ②若以细菌素基因甲链为转录的模板链，为构建基因表达载体，应在与甲链结合的引物的5'端加入 （填“BamHI”或“NdeI”）的识别序列。 ③转化操作后提取受体细胞中的DNA，并利用选择的引物进行扩增，再对扩增产物进行电泳检测，结果如下图。 电泳结果表明 。 【答案】(1) 高压蒸汽灭菌/湿热灭菌 平板划线法/稀释涂布平板法 (2) 引物2和引物3 30 BamHI 目的基因已成功导入受体细胞 【分析】1、筛选和分离微生物常用的接种方法有稀释涂布平板法和平板划线法。（1）平板划线法：将已经熔化的培养基倒入培养皿制成平板，接种，划线，在恒温箱里培养。在划线的开始部分，微生物往往连在一起生长，随着线的延伸，菌数逐渐减少，最后可能形成单个菌落。（2）稀释涂布平板法：将待分离的菌液经过大量稀释后，均匀涂布在培养皿表面，经培养后可形成单个菌落。 2、引物是一小段能与DNA母链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸。用于PCR的引物长度通常为20〜30个核苷酸。引物使DNA聚合酶能够从引物的3'端开始连接脱氧核苷酸。PCR过程需要两种引物，能分别与目的基因两条链的3'端通过碱基互补配对结合。 【详解】（1） 常用高压蒸汽灭菌（湿热灭菌）对培养基进行灭菌。分离微生物常用的接种方法有稀释涂布平板法和平板划线法，即可采用稀释涂布平板法和平板划线法将酸菜液接种到培养基中，选择有溶钙圈的菌落并继续进行纯培养。 （2）①PCR过程需要两种引物，能分别与目的基因两条链的3'端通过碱基互补配对结合，图中连接羟基的是3’端，因此利用PCR技术扩增细菌素基因时，应选择的一对引物是引物2和引物3。引物作用使DNA聚合酶能够从引物的3'端开始连接脱氧核苷酸。每一条子链的形成都需要引物，故PCR过程中，经过4轮循环，消耗引物的个数是2×24-2=30。 ②若以细菌素基因甲链为转录的模板链，图中细菌素基因转录方向为从右往左，即启动子位于右端，终止子位于左端，与甲链结合的引物为引物2，即在引物2的5＇端加入BamHI的识别序列。 ③转化操作后提取受体细胞中的DNA，并利用选择的引物进行扩增，再对扩增产物进行电泳检测，结果如图，通过比对可以看出只在受体菌中提取出来扩增产物DNA，这说明受体菌中含有目的基因，即目的基因已经成功导入受体细胞。 62．（2025·吉林·二模）低温是限制农作物产量的重要胁迫因子。科学家将寒带植物中的抗寒基因CBFs转移到拟南芥中构建拟南芥耐寒模型，用于植物低温胁迫机制的相关研究。回答下列问题：         限制酶 识别序列 EcoR I 5'G↓AATTC 3' BamH I 5'G↓GATCC 3' Sph I 5'CGTAC↓G 3 Sau3A 5'↓GATC3 Xma I 5'C↓CCGGG 3' Asc 1 5'G↓GCGCGGG 3' Mun I 5'C↓AATTG 3 (1)植物的生长发育的调控，是由基因表达调控、 和环境因素调节共同完成的。 (2)设计引物克隆目的基因。如图所示应选择引物 对CBFs基因进行克隆，为了后续能将目的基因正确连接到载体上，应在CBFs基因上游引物的5′端添加 （“SphⅠ”或”Sau3A”或“MunⅠ”）识别序列。 (3)根据图示Ti质粒的结构，应选用限制酶 切割Ti质粒，并通过 酶进行连接，连接后导入农杆菌，在培养基中添加 来筛选成功导入质粒的农杆菌。 (4)将拟南芥叶片浸泡在转基因农杆菌菌液中一段时间对其进行转化，然后提取叶片中的DNA，通过PCR对CBFs基因是否整合到拟南芥基因组中进行检测，结果如下图所示，该转基因叶片的基因组中可能已整合CBFs基因。PCR结果中显示出小分子非目标条带，产生的原因可能是 A．引物特异性不佳 B．复性温度太高 C．变性温度不够 (5)现已获取成功转入CBFs基因的拟南芥植株，利用 技术对其进行检测，结果表明转入CBFs基因的拟南芥植株没有表达出相应的mRNA。后续还应通过改变 ，以利于RNA聚合酶与之识别和结合，进而实现CBFs基因在拟南芥中的转录。 【答案】(1)激素调节 (2) ①④ Mun I (3) EcoRⅠ和SphⅠ DNA连接 氨苄青霉素 (4)A (5) PCR 启动子 【分析】PCR反应过程:变性→复性→延伸。变性:当温度上升到90℃以上时，双链DNA解聚为单链，复性:温度下降到50℃左右，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合，延伸:72℃左右时，Taq酶有最大活性，可使DNA新链由5'端向3'端延伸。 【详解】（1）植物的生长发育受基因的控制，同时受植物激素和环境因素的调节，即植物的生长发育的调控，是由基因表达调控、激素调节和环境因素调节共同完成的。 （2）PCR扩增是从模板链的3'→5'，结合图示可知，要扩增CBFs基因需要引物①④。为了保证目的基因成功转录，首先CBFs基因应插入到质粒的启动子和终止子之间，其次目的基因的转录方向应与Ti质粒上的转录方向一致，可使用EcoR I和Sau3A切割质粒（AmPr为氨卞青霉素抗性基因，在后期的筛选中需要使用，不能使用BamH I酶切），由于使用EcoRI会破坏目的基因结构的完整性，可使用Mun I切割目的基因，即上游引物的5′端添加Mun I识别序列，下游引物的5′端添加Sau3A识别序列。 （3）结合目的基因和质粒，CBFs基因应插入到质粒的启动子和终止子之间，EcoRI会破坏目的基因结构的完整性，AmPr为氨卞青霉素抗性基因，在后期的筛选中需要使用，需要选择限制酶Sph I和Sau3A切割Ti质粒，并通过DNA连接酶进行连接，连接后导入农杆菌。成功导入重组Ti质粒的农杆菌含有氨卞青霉素抗性基因，因此在培养基中添加氨卞青霉素来筛选成功导入质粒的农杆菌。 （4）A、PCR结果中显示出小分子非目标条带，说明引物可以和非目的基因复制起始端互补配对，从而扩增出非目的基因，A正确； B、若复性温度太高，则可能导致引物不能与目的基因模板链结合，从而不能扩增目的基因，也无法扩增非目的基因，B错误； C、变性温度不够，氢键无法充分断裂，DNA（目的基因和非目的基因）无法解旋形成单链，不能完成PCR扩增，C错误。 故选A。 （5）检测转入CBFs基因的拟南芥植株没有表达出相应的mRNA，可以利用核酸分子杂交技术，也可以结合逆转录的方法和PCR技术进行检测。RNA聚合酶识别和结合的是DNA上的启动子，为了有利于基因的表达，后续还应通过改变启动子，以利于RNA聚合酶与之识别和结合，进而实现CBFs基因在拟南芥中的转录。 63．（2025·四川达州·二模）茄子的花为两性花，其花和果皮因富含花青素而呈紫色，花青素的合成由两对等位基因A/a、B/b控制。为揭示茄子花青素合成的遗传机制，科研人员用纯合白花白果甲与纯合白花白果乙杂交，结果如图。请据图回答下列问题： (1)根据F2中紫花与白花的比例为 ，可初步判定等位基因A/a、B/b位于 （填“一对”或“两对”）同源染色体上。 (2)由F2中紫果与白果的比例，可推测花青素的合成还与等位基因D/d有关，基因d不抑制花中花青素的合成， （填“抑制”或“不抑制”）果皮中花青素的合成。由此假设可推知F2的白花白果中纯合子所占的比例应为 。 (3)为验证上述假设是否成立，科研团队进行了以下实验： ①对图中的F1进行测交，发现子代表现型及比例始终为 ，说明假设成立。 ②选取图中F1植株和大量F2紫花白果植株，分别从2号、3号和6号染色体提取到A/a、B/b、D/d基因并进行凝胶电泳，出现如图所示的五类结果。 该电泳结果 （填“支持”或“不支持”）上述假设，其中基因 （选填电泳图谱中的数字1～6）代表基因d。 【答案】(1) 9：7 两对 (2) 抑制 3/14 (3) 紫花紫果：紫花白果：白花白果=1：1：6 支持 6 【分析】基因自由组合定律：位于非同源染色体上的非等位基因的分离或组合是互不干扰的；在减数分裂过程中，同源染色体上的等位基因彼此分离的同时，非同源染色体上的非等位基因自由组合。 【详解】（1） 由题给 F₂ 中“紫花”（36）∶“白花”（28）＝9∶7，是9∶3∶3∶1的变式可知，等位基因A/a、B/b位于两对同源染色体上。 （2）根据题干，基因d不抑制花中花青素的合成，但抑制果皮中花青素的合成，结合题中 F₂ 紫果∶白果的表现，可推知第三对基因 D/d 只抑制果皮中花青素的合成，而对花中的花青素合成不起抑制作用因此，基因d的作用是抑制果皮中花青素的合成；进一步可算出，在 F₂ 总数中白花白果占 28/64，其中有 6 种纯合基因型均表现为白花白果（ aaabbdd、aaBBdd 、AAbbdd、AABBdd等），其发生概率之和为 6/64，故在这 28/64 株白花白果中，纯合个体所占比例为 (6/64) ÷ (28/64) ＝ 3/14。 （3）①F₁AaBbDd 与 aabbdd 测交时，F₁ 可产生 8 种等比配子，与 aabbdd 配子（abd一种）结合后，子代表型紫花紫果：紫花白果：白花白果=1：1：6。 ②从图中电泳带型可见，所有 F₂ 紫花白果植株在 D/d 位点均呈隐性纯合带型（与推断 dd 一致），且与上述三基因独立分配、d 只抑制果皮的假设相符，故电泳结果支持该假设；由图可知，所有的植株均含有基因6，故可确第 6 号电泳带代表 d 基因。 64．（2025·山西吕梁·二模）大豆是我国重要的油料作物和植物蛋白的主要来源，但盐胁迫会严重影响大豆植株的生长。研究人员欲将酵母菌细胞中的耐盐基因ENA1导入大豆体内以提高其耐盐性，如图为构建的基因表达载体的部分结构。回答下列问题：    (1)利用PCR方法从酵母菌基因组中扩增ENA1基因时需根据 设计引物，PCR反应体系中除加入ENA1基因、4种脱氧核苷酸等物质外，还需加入 酶。 (2)为了检测目的基因是否正向插入，可选用图中的引物 对其进行扩增，并对扩增产物进行电泳，若结果为 （填“获得扩增产物”或“未获得扩增产物"），则说明ENAI基因正向插入。 (3)将目的基因导入植物细胞常采用的方法为 ，得到转基因大豆植株后，研究人员对转基因大豆T2～T4代进行了PCR及电泳，实验结果如下图所示（1kb=1000bp）：    图中1组为标准对照组，2组为加水对照组，3组为加入野生型大豆DNA的PCR产物组，则4~7组为加入 组，已知ENA1基因扩增条带大小为550bp，Bar基因扩增条带大小为441bp，则图 表示扩增的基因为ENA1，连续三代PCR检测结果说明 。 (4)Bar基因为抗草甘膦基因，大豆在生长过程常喷洒草甘膦进行除草，推测该实验在转入ENA1基因的同时还转入Bar基因，目的是排除 。从分子水平检测转基因大豆体内目的基因是否完成了表达，可采用 方法。 【答案】(1) ENA1基因两侧的碱基序列 耐高温的DNA聚合（或TaqDNA聚合） (2) 1、4 获得扩增产物 (3) 农杆菌转化法 转基因大豆DNA的PCR产物 A Bar和ENA1基因已经分别转入受体大豆中，且在转基因大豆不同代际间能够稳定遗传 (4) 草甘膦对植物生长的影响 抗原—抗体杂交 【分析】PCR技术是聚合酶链式反应的缩写，是一项根据DNA半保留复制的原理，在体外提供参与DNA复制的各种组分与反应条件，对目的基因的核苷酸序列进行大量复制的技术。 【详解】（1）利用PCR方法从酵母菌基因组中扩增ENA1基因时需根据ENA1基因两侧的碱基序列设计引物，PCR反应体系中除加入ENA1基因、4种脱氧核苷酸等物质外，还需加入耐高温的DNA聚合酶或TaqDNA聚合酶。 （2）为了检测目的基因是否正向插入，可选用图中的引物1和引物4对其进行扩增，并对扩增产物进行电泳，若结果为获得扩增产物，则说明ENA1基因正向插入。 （3）将目的基因导入植物细胞常采用的方法为农杆菌转化法。图中1组为标准对照组，2组为加水对照组，3组为加入野生型大豆DNA的PCR产物组，则4~7组为加入转基因大豆DNA的PCR产物组，已知ENA1基因扩增条带大小为550bp，Bar基因扩增条带大小为441bp，则图A表示扩增的基因为ENA1。连续三代PCR检测结果说明Bar和ENA1基因已经分别转入受体大豆中，且在转基因大豆不同代际间能够稳定遗传。 （4）Bar基因为抗草甘膦基因，大豆在生长过程常喷洒草甘膦进行除草，推测该实验在转入ENA1基因的同时还转入Bar基因，目的是使转基因植物能够抗草甘膦，从而排除草甘膦对植物生长的影响。从分子水平检测转基因大豆体内目的基因是否完成了表达，可采用抗原—抗体杂交方法。 65．（2025·四川达州·二模）为了提升猪瘟病毒疫苗的效果，科研人员构建了猪瘟病毒p30蛋白基因（p30）与白喉毒素无毒突变基因（CRM197A）的融合基因表达质粒，以生产融合蛋白疫苗。图1为质粒构建、疫苗生产以及效果测试示意图。请回答下列问题： (1)完成图1的过程②需要向反应体系中加入 酶。利用PCR技术扩增p30-CRM197A融合基因时，需要向反应体系中添加的引物是 （选填图中的F1~F4）。 (2)选用大肠杆菌作为受体细胞时，一般先用 处理大肠杆菌，使其处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态。图1中培养导入重组质粒的大肠杆菌时，采用的接种方法是 。 (3)筛选时，科研人员挑选了5个菌落，提取质粒后加入BamHI、HindⅢ酶切、电泳，结果如图2： ①可初步判断 号菌落的质粒中含有p30-CRM197A融合基因。 ②p30基因和CRM197A基因 （填“含”或“不含”）BamHI和HindⅢ酶切位点，理由是 。 (4)科研人员在检测上述菌落时发现某个菌落同时含有空载质粒和融合基因表达质粒，出现此现象的可能原因有： ①有些大肠杆菌同时导入了空载质粒和融合基因表达质粒： ②导入空载质粒的大肠杆菌和导入触合基因表达质粒的大肠杆菌在接种时未分散开，导致 。 (5)为检测融合蛋白疫苗的效果，科研人员将p30蛋白、p30-CRM197A融合蛋白分别注入小鼠体内，一段时间后检测抗体含量，结果如图3所示。据此可判定融合蛋白疫苗效果更好，依据是 。 【答案】(1) DNA聚合酶 F1、F4 (2) Ca2+ 稀释涂布平板法 (3) 2、4 不含 2和4中只有两个条带（或若含有酶切位点，2和4中条带数应多于两条） (4)某个菌落中同时含有空载质粒和融合基因表达质粒 (5)（诱发机体）短时间内产生更多抗体（或作用效果快），长时间维持较高水平抗体（或持续时间长） 【分析】基因工程技术的基本步骤： （1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。 （2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。 （3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。 （4）目的基因的检测与鉴定。 【详解】（1）由图可知，图1中②过程，为DNA分子子链延伸过程，所需酶为DNA聚合酶。利用PCR技术扩增p30-CRM197A融合基因时，需选用的引物是F1和F4。 （2）选用大肠杆菌作为受体细胞时，一般先用Ca2+处理大肠杆菌，使其处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态。由图可知，图1中培养导入重组质粒的大肠杆菌时的接种方法是稀释涂布平板法。 （3）①由图1可知，构建成功的融合基因表达质粒经BamHI、Hind Ⅲ酶切含600+500+25=1125个碱基对，结合图2可知，2、4号菌落含有构建成功的融合基因表达质粒。 ②由于2和4中只有两个条带（大的一个条带为志林5900个碱基对的条带，小的一个条带为目的基因的1125个碱基对的条带），所以p30和CRM197A基因不含 BamHI、Hind Ⅲ酶切位点，若含有酶切位点，2和4中条带数应多于两条。 （4）某由图1可知，上述菌落是经稀释涂布平板法获得的，可能在涂布平板时含有不同质粒的细菌未分开，形成一个菌落，导致某个菌落中同时含有空载质粒和融合基因表达质粒。 （5）由图3可知，p30-CRM197A融合蛋白注入小鼠体内后，产生抗体快，维持高抗体量时间长，说明其作为疫苗效果较p30蛋白更好。 66．（2025·黑龙江哈尔滨·二模）在2024年国际基因工程大赛全球总决赛中，中国农业大学代表队实现了在根瘤菌中生产高附加值的ω--3多不饱和脂肪酸 DHA 并因此荣获金牌，为全球可持续发展提供了新思路。已知 FADSI基因是控制ω--3多不饱和脂肪酸 DHA 合成的关键基因。下图1为质粒（大小3000bp）和 FADSI（大小300bp）示意图,  Tet'表示四环素抗性基因, Amp'表示氨苄青霉素抗性基因, BamHⅠ、 BclⅠ、 NotⅠ、Sau3AⅠ表示不同的限制酶，四种限制酶的识别序列及切割位点如下表所示（对应箭头指向位置为相应限制酶的切割位点，不考虑其他未知的酶切位点）。请回答下列问题：    限制酶 BamH Ⅰ Bcl Ⅰ Sau3A Ⅰ NotⅠ 识别序列及切割位点 (1)为了获取更多 FADSI 基因，可利用 PCR 技术对其进行扩增。为保证扩增效率，至少需加入 种引物。 (2)构建重组质粒时，技术人员仅使用了Sau3AⅠ一种限制酶以及 酶即实现了 FADSI基因与质粒的重新连接，原因是 。 (3)若 BamHⅠ酶切的 DNA 末端与 BclⅠ酶切的 DNA 末端连接起来,其连接部位的6个碱基对序列为 。 (4)为存储含 FADSI 基因的重组质粒，导入大肠杆菌，采用含有“氨苄青霉素”的培养基进行筛选，得到A、B两类菌落，则这两类菌落的质粒导入情况是 。研究者从两菌落中挑选出菌落1和2，提取质粒进行PCR扩增，利用Sau3AⅠ酶切后经电泳的结果如图2。推测图2中，菌株 可能就是目的菌株，理由 。    (5)相对于动植物，利用根瘤菌生产ω--3多不饱和脂肪酸 DHA 的优点 。（至少答出两点） 【答案】(1)2 (2) DNA连接酶 Sau3AⅠ可以识别BamHⅠ、BclⅠ的切割位点，并切割产生相同的黏性末端 (3)5'-TGATCC-3'   5'-GGATCA-3' (4) 导入空白质粒、导入重组质粒 1 理论上重组质粒经过Sau3AⅠ酶切后形成两种产物，原始质粒长度约3000bp，FADSI 大小300bp，与菌株1电泳结果符合 (5)易培养、成本低、可大量生产、可在短时间内获得大量产物 【分析】基因工程技术的基本步骤：（1）目的基因的获取方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。（2）基因表达载体的构建是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等，标记基因可便于目的基因的鉴定和筛选。（3）将目的基因导入受体细胞根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是钙离子处理法。（4）目的基因的检测与鉴定分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA是否插入目的基因——PCR技术；②检测目的基因是否转录出了mRNA——PCR技术；③检测目的基因是否翻译成蛋白质——抗原一抗体杂交技术。个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。 【详解】（1）PCR技术需要两种引物（正向引物和反向引物）来扩增特定的DNA片段。因此，答案是2种引物。 （2）Sau3AⅠ可以识别BamHⅠ、BclⅠ的切割位点，并切割产生相同的黏性末端，构建重组质粒需要使用限制酶切割质粒和目的基因，然后使用DNA连接酶将两者连接起来。题目中提到仅使用了Sau3AⅠ一种限制酶，这可能是因为Sau3AⅠ切割后产生的黏性末端与BamHⅠ切割后的末端相同（GATC），因此可以使用DNA连接酶将FADSI基因与质粒连接起来。 （3）BamHⅠ的切割位点是G↓GATCC，产生的是GATC的黏性末端。 BclⅠ的切割位点是T↓GATCA，产生的是GATC的互补黏性末端（CTAG）。 当BamHⅠ和BclⅠ切割后的末端连接起来时，连接部位的6个碱基对序列应该是5'-TGATCC-3' 5'-GGATCA-3'。 （4）培养基中含有氨苄青霉素，能在该培养基上生长的大肠杆菌都含有氨苄青霉素抗性基因。普通质粒和重组质粒都含有 Amp'（氨苄青霉素抗性基因），所以能在含氨苄青霉素培养基上形成菌落。A 类菌落可能导入的是普通质粒，B类菌落可能导入的是重组质粒。重组质粒由 3000bp 的质粒和 300bp 的 FADSI 基因组成，用 Sau3AⅠ 酶切后，会产生大小约为 300bp（FADSI 基因片段）和 3000bp（质粒片段）的片段。菌株1的酶切电泳结果有这两种大小的片段，符合重组质粒酶切后的预期，所以菌株1 可能是目的菌株。 （5）与动植物相比，根瘤菌作为微生物，具有繁殖速度快的特点，在短时间内可产生大量后代，能快速大量生产 DHA。根瘤菌培养条件相对简单，易于培养，且培养成本低。此外，微生物培养过程对环境的污染相对较小，更符合可持续发展的要求。 67．（2025·河南·二模）科研人员根据获得的红花转录因子基因（CtWRI1）的cDNA序列设计引物，通过PCR获得CtWRI1编码序列，并通过烟草遗传转化对其功能进行研究。图甲为实验过程中使用的Ti质粒图谱及T-DNA结构，其中Rifr代表利福平抗性基因，bar代表除草剂抗性基因，LB和RB分别代表T-DNA的左边界和右边界。图乙为不同限制酶的酶切序列和CtWRI1的结构及转录方向。 回答下列问题： (1)为了将CtWRI1编码序列与图甲中的Ti质粒正确连接，构建引物F和引物R时应在 端分别添加 的识别序列，通过酶切和连接后可获得连接产物。 (2)CtWRIl转录的模板链的序列为：5'-TTAGCCT……TACCGACAT-3'，请写出引物R的前10位碱基序列：：5'- -3'。 (3)通过 法将CtWRII编码序列导入烟草细胞，利用含 的培养基对烟草细胞进行初步筛选，再通过 技术获得转基因烟草。可以通过 等技术从分子水平上检测烟草细胞的染色体DNA上是否插入了CtWRI1编码序列。 (4)科研人员测定野生型烟草（WT）和转基因烟草中CtWRI1的相对表达量、脂肪酸合成基因的相对表达量和种子含油量，结果见图丙。据图丙分析，转基因烟草种子含油量增加的可能原因是 。 【答案】(1) 5' SacⅠ和Pst Ⅰ (2)CTGCAGTTAG (3) 农杆菌转化 除草剂 植物组织培养 PCR (4)CtWRI1 的过量表达促进了脂肪酸合成相关基因的表达，进而促进了油脂的合成 【分析】基因工程的基本操作程序包括：提取目的基因、目的基因与运载体结合、将目的基因导入受体细胞、目的基因的检测和表达。 （1）提取目的基因：获取目的基因是实施基因工程的第一步。如植物的抗病（抗病毒 抗细菌）基因，种子的贮藏蛋白的基因，以及人的胰岛素基因干扰素基因等，都是目的基因； （2）目的基因与运载体结合：基因表达载体的构建（即目的基因与运载体结合）是实施基因工程的第二步，也是基因工程的核心； （3）将目的基因导入受体细胞：将目的基因导入受体细胞是实施基因工程的第三步。目的基因的片段与运载体在生物体外连接形成重组DNA分子后，下一步是将重组DNA分子引入受体细胞中进行扩增； （4）目的基因的检测和表达：目的基因导入受体细胞后，是否可以稳定维持和表达其遗传特性，只有通过检测与鉴定才能知道。这是基因工程的第四步工作。 【详解】（1）引物设计时，应在5'端添加限制酶识别序列，因为DNA聚合酶只能从引物的3'端开始延伸子链，所以要将限制酶识别序列添加在5'端，便于后续的酶切和连接操作；由图甲中T - DNA结构可知，在启动子2和终止子之间有多个限制酶酶切位点，为保证CtWRI1编码序列能正确插入且不破坏其他重要元件，同时考虑到限制酶切割后的黏性末端能正确连接，结合图乙中CtWRI1的结构及转录方向，应在引物F和引物R的5'端分别添加SacⅠ和Pst Ⅰ的识别序列。这样切割后产生的黏性末端可以正确连接，构建基因表达载体； （2）已知CtWRIl转录的模板链的序列为：5'-TTAGCCT……TACCGACAT - 3'，转录是从DNA模板链的3'端向5'端进行，而引物R与模板链的3'端互补配对，所以引物R的前10位碱基序列与模板链从3'端开始的前10个碱基互补。需要在5'端添加限制酶PstⅠ的识别序列，所以引物R的前10位碱基序列为5'-CTGCAGTTAG - 3'； （3）将目的基因导入植物细胞常用农杆菌转化法，本题中将CtWRII编码序列导入烟草细胞也可通过农杆菌转化法。因为Ti质粒可以整合到植物细胞的染色体DNA上，从而将目的基因导入受体细胞；由图甲可知，Ti质粒上含有bar代表的除草剂抗性基因，所以利用含除草剂的培养基对烟草细胞进行初步筛选，能够在该培养基上存活的细胞可能含有重组Ti质粒，即可能导入了CtWRII编码序列；将导入目的基因的烟草细胞培养成完整的转基因烟草植株，需要通过植物组织培养技术，利用植物细胞的全能性，将单个细胞培养成完整植株；从分子水平上检测烟草细胞的染色体DNA上是否插入了CtWRI1编码序列，可采用PCR技术从分子水平上检测烟草细胞的染色体DNA上是否插入了CtWRI1编码序列； （4）据图丙分析，转基因烟草中CtWRI1的相对表达量高于野生型烟草，同时脂肪酸合成基因的相对表达量也高于野生型烟草，而种子含油量转基因烟草也高于野生型烟草。所以转基因烟草种子含油量增加的可能原因是CtWRI1 的过量表达促进了脂肪酸合成相关基因的表达，进而促进了油脂的合成，最终导致种子含油量增加。 68．（2025·重庆·二模）隐花色素CRY是植物的蓝光受体。研究发现，其在蓝光作用下可与赤霉素信号转导通路中的关键蛋白GAI结合并提高其稳定性。为探究CRY蛋白的哪个部位可以与GAI蛋白发生相互作用，研究者分别构建了含CRY基因不同片段和GAI基因的表达载体。翻译过程中，肽链的合成方向是氨基端→羧基端(如图1)，GAI基因与载体结构信息如图2。      (1)PCR的每次循环一般可分为三步，其中理论温度最低一步的主要目的是 。 (2)研究发现，赤霉素通过对GAI蛋白的降解，来实现下游的信号调控，据此分析，蓝光照射下植物的株高将 (填“变高”或“变矮”)。 (3)为使表达出的GAI蛋白的氨基端带有一段标签短肽GST，在通过PCR技术扩增GAI基因时可采取的措施是 ，将所得修饰后的GAI基因和质粒构建基因表达载体(质粒1)导入大肠杆菌后，在含卡那霉素的培养基上筛选到多个抗性菌落，为检测菌落中是否携带GAI基因，将引物R₀、F₀、R₁、F₁共同加入反应体系后，分别以抗性菌落的DNA为模板进行PCR扩增后并电泳。理论上携带重组质粒的PCR产物电泳结果应出现的条带数目为 。若要确定GAI基因是否正确连入质粒，则可选用引物 进行PCR扩增，并电泳检验是否存在产物。 (4)分别扩增CRY蛋白的氨基端与羧基端基因，并利用上述的方法使其带有短肽标签His，获得重组质粒2和质粒3。将质粒1、2和3分别导入细胞，裂解细胞收集到三种蛋白，将不同蛋白分别通过带有His抗体的介质，洗脱丢弃未结合蛋白，利用抗原—抗体杂交的方法向介质中加入带荧光标记的抗 抗体，洗脱未结合抗体。若荧光检测结果如图3，则可确定与CRY蛋白可与GAI结合的区域是 。 【答案】(1)复性，即冷却到55-60℃，使引物与DNA单链结合。 (2)变矮 (3) 在引物F1的5′端（左侧）添加编码GST的核苷酸序列 2/二 F1、R0或F0、R1 (4) GAI蛋白 CRY蛋白的氨基端 【分析】基因工程的基本操作步骤包括目的基因的获取、基因表达载体的构建、将目的基因导入受体细胞、目的基因的检测与鉴定。基因工程至少需要三种工具：限制性核酸内切酶（限制酶）、 DNA 连接酶、运载体。 【详解】（1）PCR是聚合酶链式反应的缩写。它是一项根据DNA半保留复制的原理，该过程需要经过高温变性、低温复性、中温延伸三步，理论温度最低一步低温复性，即冷却到55-60℃，使引物与DNA单链结合。 （2）赤霉素通过对GAI蛋白的降解来促进植物细胞伸长，该植物中含有CRY基因不同片段和GAI基因的表达载体，存在CRY于GAI蛋白结合，蓝光作用下GAI蛋白无法降解，因此该植物变矮。 （3）翻译过程中，肽链的合成方向是氨基端→羧基端，GST的氨基端对应mRNA的5'端，即GST基因转录模板链的3'端，DNA聚合酶从引物的3'端连接脱氧核苷酸，为使表达出的GAI蛋白的氨基端带有一段标签短肽GST，应在引物F1的5′端（左侧）添加编码GST的核苷酸序列；将引物R0、F0、R1、F1共同加入反应体系后，分别以抗性菌落的DNA为模板进行PCR扩增后并电泳，能得到2条带，一条GAI基因的条带，一条比GAI基因长的条带；若要确定GAI基因是否正确连入质粒，则可选用引物F1、R0或F0、R1进行扩增。 （4）将质粒1、质粒2和质粒3分别导入细胞，裂解细胞收集到三种蛋白，将不同蛋白依次通过带有His抗体的介质，未结合蛋白将被洗脱丢弃，实验过程中应使用GST-GAI的抗体进行抗原—抗体杂交；泳道A未出现条带的原因是质粒1和空质粒中没有表达出标签His，因而没有被His抗体结合，而被洗脱，进而不能表现出相应的条带。CRY蛋白的氨基端和羧基端均可以与GAI蛋白发生相互作用，因而B和C泳道均出现相应的条带。这里B泳道出现条带的机理是质粒2带有标签His，因而会被His抗体结合而不被洗脱，由于质粒2表达出的CRY蛋白的氨基端带有与GAI结合的部位，因而能与融合蛋白的抗体进行特异性结合，因而表现出相应的条带。因此可确定与CRY蛋白可与GAI结合的区域是CRY蛋白的氨基端。 69．（2025·四川广安·二模）干旱胁迫是限制作物产量和品质的一个重要影响因素。科研人员通过转基因技术将大肠杆菌的耐旱基因（mtlD）整合进玉米基因组，增强了玉米的抗旱性。据图回答问题。 限制酶 识别序列及切割位点（5'→3'） BamHI G↓GATCC BclI T↓GATCA SmaI CCC↓GGG (1)可采用PCR技术扩增目的基因，PCR扩增的原理是 。在反应体系中除加入模板、dNTP、含Mg2+的缓冲液外，还需要加入 。 (2)为了保证mtlD基因正确连接到质粒中以构建重组质粒，在设计mtlD基因的引物时，应在两种引物的5'端分别添加 限制酶的识别序列，请据此设计转录模板链的引物5'- -3'（含12个碱基序列）。酶切后的目的基因片段和质粒通过 （填“EcoliDNA连接酶”、“T4DNA连接酶”或“E-coliDNA连接酶或T4DNA连接酶”）进行连接。 (3)为检测mtlD基因是否成功插入质粒中，研究人员从受体菌中提取质粒，使用SmaI和 进行双酶切，通过电泳检测酶切结果，若电泳结果出现 个条带，则说明插入成功。 (4)从个体水平上检测耐旱基因是否在玉米体内正常表达，请写出鉴定方法 。 【答案】(1) DNA的半保留复制 引物和耐高温DNA聚合酶（TaqDNA聚合酶） (2) BamHI和SmaI GGATCCATCTAC T4DNA连接酶 (3) BamHI 2 (4)将玉米栽种在干旱的环境中 【分析】PCR反应过程：变性一复性→延伸。变性：当温度上升到90C以上时，双链DNA解聚为单链，复性：温度下降到50℃左右，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合，延伸：72℃左右时，Taq酶有最大活性，可使DNA新链由5'端向3’端延伸。 【详解】（1）PCR扩增的原理是DNA的半保留复制原理，在PCR反应体系中，除加入模板、dNTP（脱氧核苷酸）、含Mg²⁺的缓冲液外，还需要加入引物（为DNA聚合酶提供合成的起始位点）和Taq酶（耐高温DNA聚合酶，能在高温下催化DNA合成） （2）为将图中质粒和mt1D基因正确连接构建重组质粒，设计mt1D基因的引物时，由于目的基因中间有BclⅠ的识别序列，因此不能在引物中设计该序列，而只能选择与该引物能产生相同黏性末端的引物BamHI，即需要在两种引物的5'端分别添加BamHI、SmaⅠ酶的识别序列， 所以在设计mtlD基因的引物的5'端应添加BamHI限制酶的识别序列G↓GATCC ，由于要扩增的是mtlD基因（耐旱基因），转录模板链的引物5'-GGATCCATCTAC-3'，酶切后的目的基因片段和质粒通过T4DNA连接酶进行连接。因为EcoliDNA连接酶只能连接黏性末端，T4DNA连接酶既能连接黏性末端，又能连接平末端。 （3）结合小问2可知，研究人员从受体菌中提取质粒，使用SmaI和BamHI进行双酶切，通过电泳检测酶切结果，若电泳结果出现2个条带，目的基因片段、剩余的质粒大片段，则说明插入成功。 （4）从个体水平上检测耐旱基因是否在玉米体内正常表达，可以将玉米栽种在干旱的环境中，看玉米能否正常生长。 70．（2025·河南·二模）生长激素制剂是治疗垂体性侏儒症的特效药。人们从450升大肠杆菌培养液中提取的生长激素，相当于6万头动物的全部产量。图1是通过基因工程将人的生长激素基因导入大肠杆菌中生产生长激素的过程，图2是基因工程中所用到的质粒，图3是通过PCR获取和扩增目的基因。请回答下列问题：    (1)图1通过 过程得到目的基因A后，通过③过程进行PCR扩增。图1中基因工程的核心步骤是 （填序号）。 (2)若利用图3过程获取和扩增A基因，需要选择的一对引物是 。图3中的基因表达时， （填“a”或“b”）链作为转录的模板链。 (3)要使A基因能正确与图2中的质粒拼接在一起，需要在所选引物的 端分别增加相应的限制酶的酶切位点。分析图2和图3，为了防止目的基因的反向连接，可在目的基因的上、下游分别添加 （填限制酶名称）的识别序列。 (4)科学家将A基因与乳腺蛋白基因的启动子等重组在一起，导入性染色体组成为 的哺乳动物受精卵中，然后将其处理并输送入受体动物体内，使其生长发育成转基因动物，若该动物 ，则转基因动物培育成功。 【答案】(1) 逆转录/反转录 ④ (2) 引物2和引物3 b (3) 5' AluI、HindII (4) XX 乳腺中可表达出生长激素 【分析】基因工程技术的基本步骤：（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。（4）目的基因的检测与鉴定。 【详解】（1）由RNA→DNA的过程是逆转录过程，故图1中的目的基因是由mRNA经过逆转录过程获得的；图1中基因工程的核心步骤是过程④基因表达载体的构建。 （2）DNA分子中，游离的磷酸端是5'端，游离的羟基端是3'端，由于需要在引物的3'端延伸子链，因此选择引物2和引物3；转录过程中，mRNA的延伸方向为5′一3'，DNA中模板链的方向与之相反，因此图3中的基因表达时b链作为转录的模板链。 （3）由于子链沿着5’→3'的方向延伸，为保证准确复制，需要在所选引物的5′端分别增加相应的限制酶的酶切位点；转录方向是向右的，所以基因A在连接图2载体时，上游应靠近启动子，下游靠近终止子，而图2中不能选EcoRI酶切割质粒，会破坏复制原点，为了防止目的基因的反向连接，所以应该在目的基因上游添加AluI酶识别序列，下游添加HindII酶识别序列。 （4）目的基因要只在乳腺细胞表达，需要将基因A与乳腺蛋白基因的启动子等重组在一起，导入性染色体组成为XX（雌性的性染色体组成）的哺乳动物受精卵中，然后将其处理并输送入受体动物体内，使其生长发育成转基因动物，若该动物乳腺中可表达出生长激素，则转基因动物培育成功。 71．（2025·黑龙江齐齐哈尔·二模）番茄不耐寒，低温易冻伤，难以储藏。我国科研人员从某种耐寒植物中提取了抗冻基因AtCOR15a，经过转基因技术获得转基因抗冻的番茄新品种，操作流程如图。回答下列问题： (1)与杂交育种相比，基因工程育种的优点有 （填序号）。 ①操作方法简便 ②目的性强，能定向改造生物性状 ③育种周期短 ④不受生殖隔离限制，能克服远缘杂交不亲和障碍 ⑤安全性高，对生态没有威胁 (2)获得图中①的过程称为 ，该过程使用的限制酶是 原因是： 。 (3)将①与用 处理的农杆菌混合，从而将目的基因导入农杆菌，最终整合到宿主胞的 上，该方法称为 。 (4)如果已知一小段DNA的序列，可采用PCR的方法，简捷地分析出已知序列两侧的序列，过程称为反向PCR，具体流程如下图（以EcoRI酶切为例） 若下表所列为已知的DNA序列和设计的一些PCR引物，选用的PCR引物序列必须是 引物①②③④中选择，填编号）。 DNA序列（虚线处省略了部分核苷酸序列） 已知序列 5'-AACTATGCGCTCATGA-GCAATGCGTAGCCTCT-3' 3'-TTGATACGCGAGTACT-CGITACGCAICGGAGA-5' PCR引物 ①5' -AACTATGCGCTCATGA-3'      ②5' -GCAATGCGTAGCCTCT-3' ③5' -AGAGGCTACGCATTGC-3'      ④5' -TCATGAGCGCATAGTT-3' (5)为了提高AtCOR15a基因在受体细胞的表达水平，可将AtCOR15a基因与外源强启动子连如下图所示。 利用PCR检测上述连接是否成功，可选择的引物组合是 （填序号组合）。（注：图中①、②、③、④表示引物） 【答案】(1)②③④ (2) 基因表达载体的构建 BamHI和Hind III 目的基因两侧和T-DNA内部含有BamHI和HindIII的酶切位点，确保目的基因插入到Ti质粒的T-DNA中 (3) Ca2+ 染色体DNA 农杆菌转化法 (4)②④ (5)①和③或①和④ 【分析】采用PCR技术扩增DNA的过程为：变性、退火、延伸、终止，PCR技术扩增目的基因的原理：DNA双链复制，引物是一小段单链DNA，引物5′端的碱基可以与DNA两条链的3′端的碱基进行碱基互补配对，可作为DNA复制的起始点，子链的延伸方向从5′→3′。 【详解】（1）与杂交育种相比，基因工程育种的操作方法较复杂，容易造成基因污染进而对生态产生威胁，但基因工程育种的目的性强，能定向改变生物性状，且育种周期短，不受生殖隔离限制，能克服远缘杂交不亲和障碍，②③④正确，①⑤错误。 故选②③④。 （2）获得图中①的过程为基因表达载体的构建。该过程使用的限制酶是BamHI和Hind III，原因是为了能筛选重组DNA分子，必须保留标记基因（即质粒上的抗生素抗性基因），故不能选择SmaI。若选择EcoRI，则目的基因两端具有相同的黏性末端，目的基因会自身环化，且不保证插入到T-DNA中。目的基因两侧和T-DNA内部含有BamHI和Hind III的酶切位点。综上，采用双酶切法，据图选用的两种限制酶组合是BamHI和Hind III。 （3）用Ca2+处理的，可使农杆菌处于容易吸收周围环境DNA分子的状态，从而将目的基因导入农杆菌，最终整合到宿主细胞的染色体DNA上，该方法称为农杆菌转化法。 （4）引物是一小段单链DNA，引物5'端的碱基可以与DNA两条链的3'端的碱基进行碱基互补配对，可作为DNA复制的起始点，子链的延伸方向从5'→3'，据题图可知，结合已知序列可知，能与片段F左边配对的引物为④，与右边配对的引物为②，故步骤III选用的PCR引物应当为②④。 （5）利用PCR检测AtCOR15a基因与外源强启动子连接是否成功，应当将强启动子和AtCOR15a基因都扩增出来，所以可选择的引物组合是①＋③或①＋④。 72．（2025·河南郑州·二模）棉花是重要的经济作物，但其生长易受杂草和棉铃虫的侵害，从而造成减产。科学家成功构建了抗除草剂和抗虫双价植物表达载体pBI121-Bar/Bt（pBI121是Ti质粒，Bar是抗除草剂基因，Bt是抗虫基因），构建过程如下图所示，并通过农杆菌转化法获得了具有两种抗性的转基因棉花。请回答相关问题。 (1)Ti质粒pBI121中的35S序列属于 （填“启动子”或“终止子”），它的作用是 。据图分析，Bar基因插入MCS序列后，以 （填“α”或“β”）链为模板进行转录。 (2)请仿照图例在下图合适位置中标出MCS序列被酶切后产生的切口，以保证能成功构建重组质粒pBI121-Bar 。    (3)检测pBI121-Bar是否重组成功，通常要用到大肠杆菌，经Ca2+诱导后使其处于能 的状态，筛选时需向培养基中额外添加 （填物质名称），然后挑选平板上生长的单菌落，利用Bar基因两端序列制作的引物进行PCR，并采用 来鉴定PCR的产物。 (4)pBI121-Bar与Bt-4AB成功重组后，需导入农杆菌LBA4404中，该农杆菌含Vir基因，酚类物质可以诱导其表达。Vir基因表达的产物能识别Ti质粒的LB/RB序列，水解 （填化学键）将T-DNA剪切下来。 (5)农杆菌与棉花愈伤组织共培养时，T-DNA发生转移并整合到 。个体水平上检测时，可通过 来确定棉花是否具有抗性及抗性程度。 【答案】(1) 启动子 RNA聚合酶识别和结合的部位，驱动基因转录出mRNA α (2)如下图    (3) 吸收周围环境中的DNA分子 卡那霉素 琼脂糖凝胶电泳 (4)磷酸二酯键 (5) 棉花细胞染色体DNA 使用棉铃虫和除草剂处理转基因棉花 【分析】基因工程的基本操作程序包括：提取目的基因、目的基因与运载体结合、将目的基因导入受体细胞、目的基因的检测和表达。 （1）提取目的基因：获取目的基因是实施基因工程的第一步。如植物的抗病（抗病毒 抗细菌）基因，种子的贮藏蛋白的基因，以及人的胰岛素基因干扰素基因等，都是目的基因； （2）目的基因与运载体结合：基因表达载体的构建（即目的基因与运载体结合）是实施基因工程的第二步，也是基因工程的核心； （3）将目的基因导入受体细胞：将目的基因导入受体细胞是实施基因工程的第三步。目的基因的片段与运载体在生物体外连接形成重组DNA分子后，下一步是将重组DNA分子引入受体细胞中进行扩增； （4）目的基因的检测和表达：目的基因导入受体细胞后，是否可以稳定维持和表达其遗传特性，只有通过检测与鉴定才能知道。这是基因工程的第四步工作。 【详解】（1）Ti 质粒 pBI121 中的35S序列属于启动子。因为启动子是 RNA 聚合酶识别和结合的部位，能驱动基因转录出 mRNA，而35S序列具有这样的功能。它的作用是RNA聚合酶识别和结合的部位，驱动基因转录出mRNA。观察，Bar 基因插入 MCS 序列后，以α链为模板进行转录。因为根据转录的方向以及基因插入的位置等可以判断出模板链； （2）要构建重组质粒pBI121 - Bar，需用EcoR I和BamH I切割。EcoR I识别序列为5'-G↓AATTC - 3'，BamH I识别序列为5'-G↓GATCC - 3'。在给定的DNA序列中： 对于5'-GAATTCCTCGAGGG TACCTCTAGACTGCAGGCATGCGGATCC - 3'，在GAATTC处，5'端切割后为5'-G - 3'，3'端为5'-AATTCCTCGAGGG TACCTCTAGACTGCAGGCATGCGGATCC - 3'；在GATCC处，5'端切割后为5'-G - 3'，3'端为5'-ATCC - 3'。  对于3'-CTTAAGGAGCTCCCATGGAGATCTGACG TCCGTAGGCCTAGG - 5'，与EcoR I识别序列互补处切割后，5'端为3'-CTTAA - 5'，3'端为3'-GGAGCTCCCATGGAGATCTGACG TCCGTAGGCCTAGG - 5'；与BamH I识别序列互补处切割后，5'端为3'-CCTAGG - 5' ，3'端为3'-GTAGGC - 5' 。标注如图所示：  ； （3）经 Ca2+诱导后使其处于能吸收周围环境中 DNA 分子（感受态）的状态。这是基因工程中常用的使微生物细胞成为感受态细胞以便吸收外源 DNA 的方法；筛选时需向培养基中额外添加卡那霉素，因为pBI121 - Bar质粒上含有卡那霉素抗性基因（Kan），成功导入重组质粒的大肠杆菌能在含卡那霉素的培养基上生长；利用Bar基因两端序列制作的引物进行PCR，并采用琼脂糖凝胶电泳来鉴定PCR的产物。通过电泳可以根据DNA片段的大小和迁移速率等判断PCR产物是否符合预期；   （4）Vir 基因表达的产物能识别 Ti 质粒的 LB/RB 序列，水解磷酸二酯键将 T - DNA 剪切下来。因为 DNA 分子中的磷酸二酯键连接着核苷酸之间的磷酸和五碳糖，要将 T - DNA 剪切下来需要破坏这种化学键； （5）农杆菌与棉花愈伤组织共培养时，T-DNA发生转移并整合到棉花细胞的染色体DNA上。个体水平上检测时，可通过使用棉铃虫和除草剂处理转基因棉花，观察害虫的取食情况和棉花的受害情况等，来确定棉花是否具有抗性及抗性程度。 73．（2025·安徽合肥·二模）青岛假单胞菌P中存在的单加氧酶（alkB）基因是有效降解石油烃的关键酶基因。科研人员利用该基因按照如图1所示流程获得了优质大肠杆菌工程菌，进行石油污染物降解。回答下列问题。    (1)科研人员常从 的环境中获取青岛假单胞菌P。 (2)科研人员设计了一个PCR体系进行alkB基因的扩增，然后进行琼脂糖凝胶电泳技术分析，结果如图2所示。    ①为了便于alkB基因与pET-28载体有效拼接，PCR扩增时需要在alkB基因X、Y两侧分别添加BamHI和HindⅢ酶切位点。BamHI和HindⅢ酶的识别序列及alkB基因的部分序列如图2所示。写出结合在Y侧的引物的序列5' 3'。 ②研究人员初步判断该PCR体系成功扩增出了alkB基因，据图2分析，判断的依据是 。 (3)在摇床培养大肠杆菌时，需添加一些诱导物，诱导alkB基因表达，同时，还需要加入卡那霉素，添加卡那霉素的作用是 。 (4)经LB培养基活化诱导后，科研人员取菌液4mL接种到100mL的原油培养基中，设置阴性对照组，检测工程菌的降解能力，结果如图3所示。    ①阴性对照组应向原油培养液中加入 。 ②根据实验结果，得到的实验结论为 。 【答案】(1)富含石油烃 (2) AAGCTTATCG 实验组中可见一条约为660bp的特异性条带,与预期大小相符 (3)杀灭杂菌，有利于筛选出大肠杆菌工程菌 (4) 等体积（4mL）灭菌后的液体LB培养基 大肠杆菌工程菌能够比较好地降解石油经，但对不同烷经类化合物的降解效果不同 【分析】基因工程的基本操作步骤主要包括四步：目的基因的获取；基因表达载体的构建；将目的基因导入受体细胞；目的基因的检测与表达。 【详解】（1）由题意“青岛假单胞菌P中存在的单加氧酶（alkB）基因是有效降解石油烃的关键酶基因”可知，应从富含石油烃的环境中获取青岛假单胞菌P。 （2）已知要在 Y 侧添加 HindIII 酶切位点，其识别序列为 5'-A↓AGCTT-3'，引物能与目的基因两条链的3'端通过碱基互补配对结合，由此可知，结合在Y侧的引物的序列5'AAGCTTATCG3'。由图2可知，alkB 基因有650bp，判断该PCR体系成功扩增出了alkB基因的原因是实验组中可见一条约为660bp的特异性条带，与预期大小相符。 （3）pET - 28 载体含有卡那霉素抗性基因，在摇床培养大肠杆菌时加入卡那霉素，是为了杀灭杂菌，筛选出含有重组质粒（即导入了 pET - 28 载体和 alkB 基因）的大肠杆菌 ，不含重组质粒的大肠杆菌因无卡那霉素抗性而不能存活。 （4）设置阴性对照组的目的是排除其他因素对实验结果的干扰，所以应向原油培养液中加入 4mL灭菌后的液体LB培养基 ，以与接种了工程菌菌液的实验组形成对照。从图 3 实验结果可以看出，与阴性对照组相比，接种工程菌的实验组中原油中不同碳链长度的石油烃含量明显降低，说明 大肠杆菌工程菌能够比较好地降解石油经，但对不同烷经类化合物的降解效果不同。 74．（2025·安徽安庆·二模）随着全球工业化的推进，环境雌激素来源于各种农药及其代谢物、防晒剂等，并通过污水排放和地表水径流进入水体环境，进入人体内的环境雌激素对人类健康产生了极大的危害。在环境雌激素的诱导下，斑马鱼表达卵黄蛋白原的水平与环境雌激素的浓度呈正相关。若向斑马鱼体内转入荧光蛋白基因，在特定条件下能发出荧光。科研人员欲利用基因工程技术，构建能够监测环境中雌激素污染物的转基因荧光斑马鱼，实验部分流程如图1所示。图2所示pEGFP-1是一种无启动子的绿色荧光蛋白（EGFP）载体，其中KanR为卡那霉素抗性基因，ori为复制起点，poly（A）为终止子序列，BamHⅠ、HindⅢ、StuⅠ、KasⅠ所指位置分别是4种限制酶的切割位点。回答下列问题： (1)基因工程的核心环节是 。已知卵黄蛋白原启动子序列中无上述四种酶的识别序列，扩增时应在引物的 端添加相应的碱基序列，不在另一端进行操作的原因是 。 (2)依据pEGFP-1的结构，应选择 两种酶对质粒进行切割，再利用DNA连接酶将其与卵黄蛋白原启动子序列缝合。不选用另外两种酶切割的理由是 （答出两点）。 (3)对重组质粒进行检测和鉴定后，通过 法导入斑马鱼的胚胎中，并从个体水平检测转基因斑马鱼是否表现出绿色荧光。为避免转基因斑马鱼逃逸带来生物安全问题，可考虑采取的措施是 （答1点）。 【答案】(1) 基因表达载体的构建 （游离的）脱氧核苷酸连接到引物的端以延伸子链 (2) HindⅢ和BamHⅠ 会破坏标记基因；使目的基因位于终止子的下游，影响目的基因的表达 (3) 显微注射 导入不育基因、导入仅导致生殖细胞凋亡的基因等 【分析】基因工程的步骤： （1）提取目的基因：基因组文库中获取、cDNA文库中获取； （2）目的基因与运载体结合：将目的基因与运载体结合的过程，实际上是不同来源的DNA重新组合的过程。如果以质粒作为运载体，首先要用一定的限制酶切割质粒，使质粒出现一个缺口，露出黏性末端。然后用同一种限制酶切断目的基因，使其产生相同的黏性末端（部分限制性内切酶可切割出平末端，拥有相同效果）； （3）将目的基因导入受体细胞：将目的基因导入受体细胞是实施基因工程的第三步。目的基因的片段与运载体在生物体外连接形成重组DNA分子后，下一步是将重组DNA分子引入受体细胞中进行扩增； （4）目的基因的检测和表达； 【详解】（1）基因工程的核心环节是基因表达载体的构建。已知卵黄蛋白原启动子序列中无上述四种酶的识别序列，扩增时应在引物的5'端添加相应的碱基序列，不在另一端进行操作的原因是游离的脱氧核苷酸连接到引物的3′端以延伸子链； （2）依据pEGFP-1的结构，应选择HindⅢ和BamHⅠ两种酶对质粒和卵黄蛋白原启动子序列进行切割，再利用DNA连接酶缝合其中的磷酸二酯键。不选用另外两种酶切割的理由是会破坏标记基因，且目的基因位于终止子的下游，影响目的基因的表达； （3）目的基因导入动物细胞常用显微注射法，因此通过显微注射法将重组质粒导入斑马鱼的胚胎中。为避免转基因斑马鱼逃逸带来生物安全问题，可考虑导入不育基因、导入仅导致生殖细胞凋亡的基因等措施。 75．（2025·北京海淀·二模）大肠杆菌是基因工程中应用最广泛的受体细胞。研究者利用大肠杆菌开展转录起始和调控机制的研究。 (1)作为基因工程载体的质粒上一般含有启动子、 （至少填2个）等序列，其中启动子是RNA聚合酶识别和结合的部位。 (2)研究者利用大肠杆菌质粒进行体外单轮转录实验：用限制酶切割质粒，获得包含启动子序列的DNA模板，与足量RNA聚合酶混合并保温，使RNA聚合酶充分结合至启动子；依次加入足量的肝素（能与游离的RNA聚合酶结合，使其不能再结合启动子）和放射性标记的4种核糖核苷酸，一段时间后电泳检测转录产物，结果如图1。 ①电泳结果显示，除了正常长度的RNA外，转录还会产生 ，研究者称其为“无效转录物”。 ②对“无效转录物”的产生机制有两种假说： a．一个RNA聚合酶与启动子结合后，先反复转录出多个无效转录物，然后该聚合酶在DNA上延伸并只转录出一个正常长度的RNA，最后从DNA上脱离。 b．一个RNA聚合酶与启动子结合后，仅转录出一个RNA，该聚合酶就从DNA上脱离；转录出的RNA多数为无效转录物，少数为正常长度的RNA。 单轮转录实验中，若DNA模板的数目（m）、无效转录物的数目（p）、正常长度RNA的数目（q）之间存在数量关系 （用m、p、q表示），则支持假说a。 (3)阻遏蛋白R能与启动子附近下游序列结合，抑制转录。设计实验探究R的作用是抑制RNA聚合酶与启动子的结合，还是抑制RNA聚合酶在DNA上的延伸。 ①其中实验组的步骤如下。请将正确的试剂对应的字母填入横线上。 DNA模板与足量 混合并保温，再加入足量 混合并保温；依次加入足量的 和 反应一段时间，然后加入 再反应一段时间，电泳检测转录产物。 a．IPTG（使R脱离且不再与DNA结合） b．肝素 c．RNA聚合酶 d．放射性标记的4种核糖核苷酸 e．阻遏蛋白R ②电泳结果如图2，表明R 。 【答案】(1)终止子、标记基因、复制原点 (2) 长度较短的RNA p＞q=m (3) e c b d a 抑制RNA聚合酶在DNA上的延伸 【分析】 基因工程技术的基本步骤： （1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成； （2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等； （3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样．将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法； （4）目的基因的检测与鉴定：分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA是否插入目的基因−−DNA分子杂交技术；②检测目的基因是否转录出了mRNA−−分子杂交技术；③检测目的基因是否翻译成蛋白质−−抗原−抗体杂交技术。个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。 【详解】（1）构建成功的基因表达载体应含有启动子，终止子、目的基因、标记基因（或复制原点）等结构，启动子是一段有特殊结构的DNA片段，位于基因的首端，它是RNA聚合酶识别和结合的部位，作用是驱动基因转录（出mRNA）。 （2）电泳结果显示，除了正常长度的RNA外，转录还会产生长度为2～6个核苷酸的多种RNA。假说a认为一个RNA聚合酶与启动子结合后，先反复转录出多个无效转录物，然后该聚合酶在DNA上延伸并只转录出一个正常长度的RNA，最后从DNA上脱离。所以若DNA模板的数目（m）＝正常长度RNA的数目（q）＜无效转录物的数目（p），则支持a观点。　　　　　　， （3）阻遏蛋白R能与启动子附近下游序列结合，抑制转录。若要设计实验探究R的作用是抑制RNA聚合酶与启动子的结合，还是抑制RNA聚合酶在DNA上的延伸，若先加入RNA聚合酶，其与DNA上的启动子先结合了，就无法验证“抑制RNA聚合酶与启动子的结合”的作用了，DNA模板先与阻遏蛋白R混合并保温，再加入足量RNA聚合酶混合并保温，依次加入足量的肝素和放射性标记的4种核糖核苷酸反应一段时间，然后加入IPTG（使R脱离且不再与DNA结合)再反应一段时间，电泳检测转录产物。若R的作用是抑制RNA聚合酶与启动子的结合，则在只加入R的条件下转录产物中应该是同时存在无效转录产物和正常RNA片段，结果与电泳图结果不符；若R是抑制RNA聚合酶在DNA上的延伸，则在只加入R的条件下转录产物中应该是不存在无效转录产物和正常RNA片段，在加入IPTG后R的抑制作用消失，开始有无效转录产物和正常RNA片段，与电泳结果相符，故可推测R的作用是抑制RNA聚合酶在DNA上的延伸。 四、实验题 76．（2025·北京东城·二模）我国科研人员培育出复粒水稻（CL），与普通单粒水稻（NCL）相比，具有多粒簇生的特点。 (1)油菜素内酯（BR）是一种植物激素，是参与调节水稻籽粒生长发育的有机物，作用具有 的特点。 (2)如图1所示，幼穗中分生组织将发育形成不同部位。研究人员检测了CL和NCL幼穗不同部位中BRD3（BR降解酶）的表达量。结果显示：与NCL相比，CL中 。    (3)研究人员利用图2质粒转录得到两种RNA探针，通过RNA杂交技术检测幼穗组织相关基因转录情况，具体步骤如下表，请将实验材料补充完整（填选项）。    步骤 实验组（探针序列与BRD3的mRNA互补） 对照组（探针序列与BRD3的mRNA相同） 使用限制酶将图2质粒切成线形 ① ② 使用RNA聚合酶转录得到RNA，制备带标记的探针 ③ ④ 取NCL和CL幼穗的组织，制作成临时装片 将探针加入处理好的装片中，结合探针的部位会产生显色反应 a.Nco I    b.Sal I    c.T7RNA聚合酶    d.SP6RNA聚合酶 观察2种水稻幼穗组织显色情况，在答题卡的图中标出预期结果。 。 (4)蛋白GSK和MADS均为BR信号通路中的调控因子，在体外进行实验的处理和结果如图3，结果说明 。经过一系列的研究，科研人员阐明了水稻通过BR-GSK-MADS通路调控复粒性状。    (5)已有研究表明，BR缺陷水稻的籽粒通常会变小。请从基因选择性表达的角度解释“CL同时具有多粒簇生和籽粒不变小特点”的原因。 。 【答案】(1)微量、高效 (2)P的BRD3的表达量明显较高，S中差别不大。 (3) a b d c (4)GSK可以维持MADS的磷酸化，但去磷酸化酶会引起MADS的去磷酸化 (5)在CL中，与多粒簇生相关的基因在特定细胞中选择性表达，使CL表现多粒簇生；同时，与籽粒大小相关的细胞中BR - GSK - MADS通路相关基因正常表达，维持籽粒正常大小 【分析】植物激素是由植物体产生的，能从产生部位运输到作用部位、对植物生命活动起到调节作用的微量有机物；启动子是RNA聚合酶识别并结合的位点，起到驱动转录的作用。 【详解】（1）油菜素内酯（BR）作为一种植物激素，具有微量、高效的特点。 （2）由图可知，花梗分生组织中，CL中BRD3的表达量高于NCL，小穗分生组织中二者差别不大，即与NCL相比，CL中P的BRD3的表达量明显较高，S中差别不大。 （3）①要得到与BRD3的mRNA互补的探针，根据图中基因转录方向以及启动子位置，需要用a限制酶NcoⅠ切割质粒，使得转录能从与BRD3基因的cDNA转录方向相反的方向进行。②要得到与BRD3的mRNA相同的探针，需要用b限制酶SalⅠ切割质粒，使得转录能从与BRD3基因的cDNA转录方向相同的方向进行。③当用NcoⅠ切割质粒后，启动转录需要d：SP6RNA聚合酶，因为此时是SP6启动子起作用。④当用SalⅠ切割质粒后，启动转录需要c：T7RNA聚合酶，因为此时是T7启动子起作用。由于实验组探针与BRD3的mRNA互补，对照组探针与BRD3的mRNA相同，预期结果应该是在NCL和CL幼穗组织中，实验组CL的P部位有显色反应（因为能与BRD3的mRNA杂交），其他无显色反应（NCL的P部位BRD3表达量低，对照组不能与BRD3的mRNA杂交 ，因为是相同序列，不会互补配对结合）。 （4）观察实验设置，有加入MADS、GSK、去磷酸化酶不同组合的情况，检测指标是磷酸化的MADS。当加入MADS时，均会出现磷酸化的MADS；而同时加入MADS和GSK组，磷酸化的MADS基本不变，说明GSK基本可以维持MADS的磷酸化；而加入MADS、GSK和去磷酸化酶时，磷酸化的MADS大量减少。这表明去磷酸化酶能使MADS去磷酸化。 （5）在CL中，与多粒簇生相关的基因在特定细胞中选择性表达，使CL表现多粒簇生；同时，与籽粒大小相关的细胞中BR - GSK - MADS通路相关基因正常表达，维持籽粒正常大小，所以CL同时具有多粒簇生和籽粒不变小特点。 77．（2025·广东清远·二模）茶树具有重要的经济价值，春季茶芽的萌发情况与其产量和品质密切相关。脱落酸ABA通过整合环境和代谢信号，精准控制休眠的诱导与解除时机。研究表明茶树EXP基因上游启动子区存在脱落酸相关响应元件，PIF7基因在植物的萌发中也具有重要作用，研究人员就茶树中的EXP基因和PIF7基因参与萌发的分子机制进行了研究。回答下列问题： (1)提取茶树总RNA，通过 过程，获取PIF7基因，作为克隆PIF7基因的模板。以下是EXP启动子部分序列和$$