3.1 重组DNA技术的基本工具 课件-2024-2025学年高二年级下学期人教版2019选择性必修3

如何能培育出自身就能抵抗虫害的棉花新品种呢？ 普通棉花 抗虫棉 按照人们的愿望，通过转基因等技术赋予生物新的遗传特性，创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。由于基因工程是在 DNA分子水平上进行设计和施工的，因此又叫做重组DNA技术。 操作对象： 操作水平： 原理： 结果： 意义： 基因（DNA） DNA 分子水平 基因重组 创造出人类需要的新的生物类型和生物产品 定向改造生物遗传特性；克服远缘杂交不亲和障碍。 基因工程 别称： 操作环境： 重组DNA技术、转基因技术 生物体外 基本过程： 剪切→拼接→导入→表达 1944年,艾弗里等人通过肺炎链球菌的转化实验，证明遗传物质是DNA，DNA可以在同种生物个体间转移。 1961年尼伦伯格和马太破译第一个编码氨基酸密码子。截至1966年64个密码子均被成功破译。 1970年细菌中发现了第一个限制性内切核酸酶（简称限制酶） 1972年伯格首先在体外进行了DNA改造的研究，成功构建了第一个体外重组DNA分子。 1982年第一个基因工程药物-重组人胰岛素被批准上市。基因工程药物成为世界各国研究和投资开发热点。 1953年沃森和克里克建立了DNA双螺旋结构模型并提出了遗传物质自我复制的假说。 1967年发现在细菌拟核DNA之外的质粒有自我复制能力，并可以在细菌细胞间转移。 20世纪70年代初多种限制酶、DNA连接酶和逆转录酶被相继发现。为DNA切割、连接及功能基因的获得创造了条件。 1973年证明质粒可以作为基因工程的载体，构建重组DNA，导入受体细胞，使外源DNA在原核细胞中成功表达，并实现了物种间的基因交流。基因工程正式问世。 1985年穆里斯等人发明PCR,为获取目的基因提供了有效手段。 科技探索之路:基因工程的发展历程 1958年梅塞尔森和斯塔尔用实验证明了DNA的半保留复制。几乎同一时间确立的中心法则阐明了遗传信息流动的方向。 1950年埃德曼发明一种测定氨基酸序列的方法。2年后桑格首次完成对胰岛素氨基酸序列的测定。 1990年人类基因组计划启动，2003年，该计划的测序任务顺利完成。 1977年桑格等发明DNA序列分析方法，为基因序列图的绘制提供可能。DNA合成仪的问世为体外合成DNA提供了方便。 1983年农杆菌转化法培育出世界上第一例转基因烟草。基因工程进入迅速发展阶段。 1984年我国科学家朱作言团队培育出世界上第一条转基因鱼。 2013年华人科学家张峰及团队首次报道利用最新的基因组编辑技术-CRSPR (成簇规律间隔短回文重复)技术编辑哺乳动物基因组，该技术可以实现对特定基因的定点插入、敲除或替换。 21世纪以来，发明多种高通量测序技术，可以实现低成本测定大量核酸序列，加速人们对基因组序列了解。 基因工程诞生的理论基础 1.为什么不同生物的DNA分子能拼接起来？(拼接的基础) ①DNA的基本组成单位相同（四种脱氧核苷酸） 2.为什么一种生物的基因可以在另一种生物细胞内表达？ (表达的基础) ②都遵循碱基互补配对原则 ③DNA分子的空间结构都是规则的双螺旋结构 ①基因是控制生物性状的结构与功能单位 ②遗传信息的传递都遵循中心法则 ③生物界几乎共用一套遗传密码 基因在空间上转移并成功表达。 脱氧 核糖 含氮碱基 磷酸 DNA平面结构 DNA立体结构 从社会中来 转基因番木瓜（左）与非转基因番木瓜（右） 番木瓜容易受番木瓜环斑病毒的侵袭。当番木瓜被这种病毒感染后，产量会大大下降。 科学家通过精心设计，用“分子工具”培育出了转基因番木瓜，它可以抵御番木瓜环斑病毒。 DNA双螺旋的直径只有2nm,对如此微小的分子进行操作，是一项非常精细的工作，更需要专门的“分子工具”。 “分子手术刀” 准确切割DNA分子 “分子缝合针” 将DNA片段连接起来 “分子运输车” 将体外重组好DNA分子导入受体细胞 抗病基因与运载 体DNA“缝合” 抗病基因 提取出来 抗病基因进入番木瓜 分子工具 第3章 基因工程 第1节 重组DNA技术的基本工具 本节聚焦 1、重组DNA技术所需的三种基本工具是什么？他们的作用分别是什么？ 2、基因工程载体需要具备什么条件？ 阅读教材P70-75，思考并回答下列问题： 1.限制酶的来源？种类？特点？识别序列长度？切割结果？ 2.DNA连接酶的作用、种类及区别？ 3、基因工程载体有哪些种类？什么是质粒？载体的作用？需要具备什么条件? 4、DNA粗提取和鉴定的原理，以及材料的选择。 5.NA粗提取和鉴定的实验步骤。 自主探究（思） 一、限制性内切核酸酶----“分子手术刀” 限制酶的来源？种类？特点？识别序列长度？切割结果？ 主要是原核生物 来源： 种类： 数千种 限制酶不是一种酶，而是一类酶。 作用： 识别双链DNA分子特定核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的磷酸二酯键断开。 专一性 5' 3' 5' 3' T G C C G T A A 切割DNA分子的工具是限制性内切核酸酶，又称限制酶。 磷酸二酯键 ①只能识别DNA双链不识别RNA或DNA单链 ②识别特定的核苷酸序列非碱基序列 ③有专一性但并非一种限制酶只识别一种特定的核苷酸序列 识别序列长度： 大多数限制酶的识别序列由6个核苷酸组成；也有少数限制酶的识别序列由4个、8个或其他数量的核苷酸组成。 一、限制性内切核酸酶----“分子手术刀” 限制酶的来源？种类？特点？识别序列长度？切割结果？ EcoRⅠ ……G-A-A-T-T-C…… ……C-T-T-A-A-G…… HindⅢ ……A-A-G-C-T-T…… ……T-T-C-G-A-A…… BamHⅠ ……G-G-A-T-C-C…… ……C-C-T-A-G-G…… TaqⅠ ………T-C-G-A……… ………A-G-C-T……… 1.都可以找到一条中（心）轴线； 2.中轴线两侧的双链DNA上的碱基是反向对称重复排列的 ，称为回文序列。 正向读与另一条链反向读的碱基顺序完全一致。 限制酶所识别的序列的特点： 一、限制性内切核酸酶----“分子手术刀” 限制酶的来源？种类？特点？识别序列长度？切割结果？ 切割结果： 形成黏性末端或平末端。 5' 5' 3' 3' 5' 5' 3' 3' 黏性末端 平末端 EcoR I 识别序列为GAATTC 切割部位为G与A之间 当限制酶在它识别序列的中轴线两侧将DNA分子的两条链分别切开时，产生的是黏性末端。 Sma I 识别序列为CCCGGG 切割部位为C与G之间 当限制酶在它识别序列的中轴线处将DNA分子的两条链分别切开时，产生的是平末端。 限制酶的命名: EcoRⅠ 属名Escherichia首字母 种名coli 前两个字母 R型菌株 从中分离的第一个限制酶 例如：流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae)d株中先后分离到3种限制酶，则分别命名为: Hind I Hind II Hind III EcoRⅠ：大肠杆菌（Escherichia coli）R型菌株中分离出的第一个限制酶； SmaⅠ：粘质沙雷氏菌（Serratia marcescens）中分离出的第一个限制酶。 一、限制性内切核酸酶----“分子手术刀” ②一个限制酶切割一次，断开___个磷酸二酯键，形成___个黏性末端. 产生___个游离的磷酸基团，消耗 分子水。 ③不同DNA分子用同一种限制酶切割形成的黏性末端相同吗？ _____。原因是______________________________。 不同限制酶切割产生的黏性末端是否一定不同？__________ ④限制酶能切开RNA分子的磷酸二酯键吗？__________ 合作探究（议） 任务一：讨论限制酶相关问题 1、写出下列限制酶切割形成的末端 ________ _______ _______ _______ 可能会相同 同尾酶：识别的靶序列不同，但是酶切后形成的黏性末端相同。 ①EcoRⅠ专一识别的序列_________，并使______之间的__________键断开。 GAATTC G和A 磷酸二酯 两 相同 2 两 两 -G -CCTAG GATCC- G- -G -CTTAA AATTC- G- -A -TTCGA AGCTT- A- -A -TCTAG GATCT- A- 不能 酶具有专一性，识别的序列相同 2、①该DNA片段上EcoRI的识别序列和切割位点在哪儿？ 合作探究（议） ②要想获得某个特定性状的目的基因必须要用限制酶切几个切口？可产生几个黏性(平)末端？ 要切2个切口，产生4个黏性(平)末端。 ③如果把两种来源不同的DNA用同种限制酶来切割，会怎样？ 会产生相同的黏性(平)末端 5’...G 3’...CTTAA AATTC...3’ G...5’ 黏性末端 黏性末端 目的基因 黏性末端 黏性末端 3.请判断：以下黏性末端是由 种限制酶作用产生的。 3 ①用EcoRⅠ酶切，能得到 种DNA片段； ②用PstⅠ完全酶切，能得到 种DNA片段； ③同时用SmaⅠ和PstⅠ完全酶切，能得到 种DNA片段； ④只用PstⅠ酶切，最多能得到 种DNA片段。 2 3 5 5 4、下图甲是一个DNA片段，箭头处代表不同限制酶的切点，据图回答： 合作探究（议） 5、你能根据所掌握的知识，推测限制酶存在于原核生物中的主要作用是什么吗？ 原核生物容易受到自然界外源DNA的入侵，所以它在长期的进化过程中形成了套完善的防御机制。限制酶就是它的一种防御性工具。当外源DNA入侵时，它会利用限制酶来切割外源DNA使之失效，以保证自身的安全。 6、为什么限制酶不切割细菌本身的DNA分子？ 该生物中不存在该酶的识别序列或识别序列已被修饰。（如甲基化） 用同种限制酶切割(EcoRⅠ) T G A A T T C G A C T T A A G C A G A A T T C T T C T T A A G A 思考：把两种来源不同的DNA进行重组，应该怎样处理？ 缺口怎么办？ 二、DNA连接酶----“分子缝合针” 什么是DNA连接酶，其作用、种类及区别？ 作用： 将双链DNA片段缝合起来，恢复被限制酶切开的磷酸二酯键。 能够将两个DNA片段连接起来的酶称DNA连接酶。 注意：①不是连接氢键，不能直接连接两条单链的DNA！也不能将单个脱氧核苷酸连接到DNA链上！ ②DNA连接酶没有识别特异性(相同或互补的黏性末端以及平末端都能连接) 种类： 类型 E.coli DNA连接酶 T4 DNA连接酶 来源 功能 缝合 和 ； 缝合__________和 _______________ 结果 恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的_________________ 大肠杆菌 T4噬菌体 黏性末端 黏性末端 平末端(效率低) 磷酸二酯键 平末端 （连接平末端效率远低于T4 DNA连接酶） 旁栏思考题:DNA连接酶和DNA聚合酶是一回事吗？为什么？ DNA连接酶 DNA聚合酶 相同 作用实质 化学本质 不 同 点 模板 作用对象 作用结果 用途 都能催化形成磷酸二酯键 都是蛋白质 不需要 需要DNA的一条链作模板 形成完整的重组DNA分子 形成DNA的一条链 基因工程 DNA复制 在两个DNA片段间形成磷酸二酯键 将单个核苷酸连接到已有DNA片段上，形成磷酸二酯键 【核心归纳】与DNA相关的几种酶的比较 名称 作用部位 作用底物 作用结果 限制酶 磷酸二酯键 DNA 形成带黏性末端或平末端的DNA片段 DNA连接酶 磷酸二酯键 DNA片段 形成重组DNA分子 DNA聚合酶 磷酸二酯键 脱氧核苷酸 以单链DNA为模板，将单个脱氧核苷酸依次连接到单链末端，形成子代DNA DNA水解酶 磷酸二酯键 DNA 将DNA片段水解为单个脱氧核苷酸 解旋酶 碱基对之间的氢键 DNA 将双链DNA分子局部解旋为单链，形成两条长链 RNA聚合酶 磷酸二酯键 核糖核苷酸 以单链DNA为模板，将单个核糖核苷酸依次连接到单链末端，形成单链RNA 种类 用途 不同点 质粒、噬菌体 植物病毒 动物病毒 三、基因进入受体细胞的载体—“分子运输车” 基因工程载体有哪些种类？什么是质粒？载体的作用？需要具备什么条件? 通常利用质粒作为载体，将基因送入细胞，相当于一种运输工具。 种类： 质粒、噬菌体和动植物病毒等。 将外源基因导入细菌等细胞 将外源基因导入植物细胞 将外源基因导入动物细胞 来源不同，在大小、结构、复制方式以及可以插入外源DNA片段的大小也有很大差别 质粒是一种裸露的、结构简单、独立于真核细胞细胞核或原核细胞拟核DNA之外，并具有自我复制能力的环状双链DNA分子。 在基因工程操作中，真正被用作载体的质粒，都是天然质粒的基础上进行过人工改造的。 作用： ①作为运载工具，将目的基因导入受体细胞中 ②在受体细胞内对目的基因进行大量复制 三、基因进入受体细胞的载体—“分子运输车” 基因工程载体有哪些种类？什么是质粒？载体的作用？需要具备什么条件? 载体具备的条件： ①有一个至多个限制酶切割位点。 （供外源DNA片段（基因）插入其中。） ②在受体细胞中稳定存在并能自我复制或整合到受体DNA上，随受体DNA同步复制。 （使外源基因在受体细胞中稳定存在并复制，以扩增外源基因的数量） ③具有特殊的标记基因。 (便于重组DNA分子的筛选。) ④对受体细胞无害、易分离 （避免受体细胞受到损伤） 标记基因及筛选原理 重组DNA导入受体细胞不是100%，而且导入率较低。 ①抗生素的抗性基因，如: 抗氨苄青霉素基因(ampr)、抗四环素基因(tetr) ②荧光蛋白基因，如: 绿色荧光蛋白基因(GFP)、红色荧光蛋白基因(RFP) 标记基因： 标记基因筛选原理： 载体上的标记基因一般是某种抗生素的抗性基因，而受体细胞没有抵抗该抗生素的能力。将含有某抗生素抗性基因的载体导入受体细胞，抗性基因在受体细胞内表达，受体细胞对该抗生素产生抗性。在含有该抗生素的培养基上，导入了载体并成功表达了的受体细胞才能够生存。 (1)获取目的基因和切割载体时, 通常使用同种限制酶,目的是 。但是使用该法缺点是容易发生 、 以及 .为了避免上述情况可采取的措施是 . 产生相同的黏性末端，便于连接 目的基因与质粒反向连接 目的基因、质粒的自身环化 分别使用两种限制酶切割目的基因和运载体 小结 目的基因与目的基因相连、质粒与质粒相连 根据目的基因两端的限制酶切割位点确定限制酶的种类 ①应选择切割位点位于目的基因两端的限制酶，如图甲可选择 ； ②不能选择切割位点位于目的基因内部的限制酶，如图甲不能选择 ； ③为避免目的基因和质粒的自身环化和随意连接，也可使用不同的限制酶切割目的基因和质粒，如图甲也可选择用 两种限制酶(但要确保质粒上也有这两种酶的切割位点) 根据质粒的特点确定限制酶的种类 ①所选限制酶要与切割目的基因的限制酶一致，以确保产生相同的黏性末端； ②质粒作为载体必须具备标记基因等，所以所选择的限制酶尽量不要破坏这些结构，如图乙中限制酶 会破坏标记基因；如果所选酶的切割位点不止一个，则切割重组后可能丢失某些片段，若丢失的片段含复制起点区，则切割重组后的片段进入受体细胞后不能自主复制。 (2)选择限制酶切割位点的基本原则： 小结 PstⅠ SmaⅠ PstⅠ和EcoRⅠ SmaⅠ GAGCCATACTTAA AATTCTCGGTATG P73思考•讨论：重组DNA分子 请同学找到两条片段上EcoRI的识别序列和切割位点。 …TATCGTACGATAGGTACTTAA …ATAGCATGCTATCCATG AATTCGGCATAC… GCCGTATG… …TCCTAG …AGGATCTTAA GAGCCATACTTAA AATTCTCGGTATG AATTCCATAC… GGTATG… 5′ 3′ 5′ 3′ 5′ 3′ 5′ 3′ 不能，因为基因的长度一般在100个碱基对以上。 剪刀代表限制酶；透明胶条代表DNA连接酶。 讨论1、剪刀和透明胶条分别代表哪种“分子工具” ？ 2、你制作的黏性末端的碱基能不能互补配对？如果不能，可能是什么原因造成的？ 3、你插入的DNA片段能称得上一个基因吗？ 可能是剪切位点或连接位点的选择不对（也可能是其他原因）。比如在书写将要重组的两个DNA分子时，一般要求有同一种限制酶的识别和切割位点，这样切割后才会露出相同的黏性末端，否则黏性末端不同，碱基就无法配对。 探究实践：DNA分子的粗提取和鉴定 一、DNA粗提取和鉴定的原理 1.提取原理： 利用DNA、RNA、蛋白质和脂质等在物理和化学性质方面存在的差异，提取DNA，去除其他成分。 ②DNA在不同浓度的NaCl溶液中的溶解度不同，可提纯DNA。 ①DNA不溶于酒精，细胞中某些蛋白质溶于酒精，初步分离DNA和蛋白质。 0 DNA溶解度 NaCl浓度（mol/L） 0.14 2 当NaCl的物质的浓度为0.14 mol/L时，DNA的溶解度最小，此时DNA析出。当NaCl的物质的量浓度为2mol/L时，DNA的溶解度最大。 2.鉴定原理： 二苯胺有毒，现配现用并用棕色瓶存放。 在一定温度下，DNA遇二苯胺试剂会呈现蓝色。 探究实践：DNA分子的粗提取和鉴定 二、材料用具 1.选材： DNA含量相对较高的生物组织，如新鲜洋葱、香蕉、菠菜、菜花和猪肝等。 ①不能用哺乳动物成熟的红细胞,其无细胞核和线粒体，几乎不含DNA 。 ②以血液为实验材料时，每100mL血液中需要加入3g柠檬酸钠，防止血液凝固。 ③利用动物细胞提取DNA破碎细胞的方法：动物细胞无细胞壁，可直接吸水涨破。 2.试剂： 试剂 作用 研磨液 体积分数为95%的酒精 2mol/L 的NaCl溶液 二苯胺试剂 蒸馏水 析出DNA 溶解DNA 鉴定DNA，要现配现用 溶解并提取DNA 研磨液成分 作用 SDS 使蛋白质变性 EDTA 抑制DNA酶 Tris-HCl缓冲液 稳定DNA (1)研磨：称取约30g 洋葱，切碎，然后放入研钵中，倒入10 mL 研磨液，充分研磨（可加入少量石英砂助研）。 探究实践：DNA分子的粗提取和鉴定 三、方法步骤 (2)提取上清液：在漏斗中垫上纱布,将洋葱研磨液过滤到烧杯中,在4℃冰箱中放置几分钟后,再取上清液。也可以直接将研磨液倒入塑料离心管中,在1500r/min的转速下离心5min,再取上清液放入烧杯中。 (3)加酒精析出：在上清液中加入体积相等的、预冷的酒精溶液(体积分数为95%),静置2~3 min,溶液中出现的白色丝状物就是粗提取的DNA。用玻璃棒沿一个方向搅拌,卷起丝状物,并用滤纸吸去上面的水分;或者将溶液倒入塑料离心管中,在10000r/min的转速下离心5min,弃上清液,将管底的沉淀物(粗提取的DNA)晾干。 （4）NaCl溶液溶解DNA并鉴定:取两支20mL的试管，各加入2mol/L的NaCl溶液5mL。将丝状物或沉淀物溶于其中一支试管的NaCI溶液中。向两支试管中各加入4mL的二苯胺试剂。混合均匀后，将试管置于沸水中加热5min。待试管冷却后，比较两支试管中溶液颜色的变化。 都加入2mol/L氯化钠溶液 实验组加入丝状物 对照组不加入丝状物 都加入4mL二苯胺试剂 实验组 水浴加热 对照组 视频：DNA的粗提取与鉴定 合作探究（议） DNA的粗提取和鉴定 1、研磨：①充分研磨的目的： ②研磨时间不宜太长： ③有条件的可以在材料处理的过程中加入纤维素酶、果胶酶： ④研磨不宜太用力 破碎细胞，使DNA分子从细胞核中释放出来。 防止研磨时产生的热量影响DNA的提取量 有利于充分研磨 2、取上清液： ①过滤能用滤纸代替吗？ 不可以，因为DNA会被吸附到滤纸上而大量损失。 可能含有DNA、RNA以及蛋白质、脂质、糖类等。 ②上清液可能含有的物质？ 3、加酒精析出 (1)冷却的酒精溶液(体积分数95％)作用： ①抑制核酸水解酶活性，防止DNA降解；②低温有利于增加DNA分子柔韧性，减少断裂。③低温抑制DNA分子运动，使DNA易形成沉淀析出； (2)沿一个方向搅拌的原因： 减少DNA断裂，以便获得较完整的DNA分子。 4、溶解DNA并鉴定 ①实验的自变量是什么？ ②实验组溶液蓝色的深浅与什么有关？ 溶液中DNA的含量的多少 是否加入丝状物或沉淀物 探究实践：DNA分子的粗提取和鉴定 四、结果分析和评价 1、你提取出白色丝状物或沉淀物了吗？用二苯胺试剂鉴定的结果如何? 观察提取的DNA的颜色，如果不是白色丝状物，说明DNA中的杂质较多。二苯胺试剂鉴定呈现蓝色说明实验基本成功；如果不呈现蓝色，可能的原因有所提取的DNA含量低，或者在实验操作过程中出现了失误等。 2、你能分析出粗提取的DNA中可能含有哪些杂质吗？ 本实验粗提取的DNA可能仍然含有核蛋白、多糖等杂质。 3、与其他同学提取的DNA进行比较，看看实验结果有何不同，分析产生差异的原因。 实验结果不明显的可能原因： ①材料中的核物质没有充分释放出来，如研磨不充分或蒸馏水的量不够。 ②加入酒精后摇动或搅拌时过猛，DNA被破坏。 ③二苯胺最好现用现配，否则二苯胺变成浅蓝色，影响鉴定效果。 1.如果选用鸡血细胞进行实验，如何快速破碎细胞？ 2.有时会在DNA滤液中添加嫩肉粉（木瓜蛋白酶），这样有什么好处？ 3.有时还会反复利用不同浓度的NaCl溶液来溶解、析出DNA，试猜想该操作的目的？ 将鸡血细胞置于蒸馏水中，待细胞涨破后，收集滤液。 利用蛋白酶分解杂质蛋白，不分解DNA，有利于DNA与蛋白质分开。 进一步纯化DNA——用高盐浓度的溶液溶解DNA，能除去在高盐溶液中不能溶解的杂质；用低盐溶液使DNA析出，能除去溶解在低盐溶液中的杂质。因此，通过反复溶解与析出DNA，就能够除去与DNA溶解度不同的多种杂质。 五、进一步探究 4.本实验只是对DNA进行了粗提取，请在阅资料，了解实验室提取纯度较高的DNA的一种方法，并与本实验中所使用的方法进行比较，总结两种方法的异同。 方法1：可以先添加质量分数为25%的SDS溶液，使蛋白质变性后与DNA分开；随后，加入氯仿—异丙醇混合液(体积比为24：1)，通过离心将蛋白质及其他杂质除去，取上清液；可重复上述操作几次，直至上清液变成透明的黏稠液体。 方法2：由于苯酚可以迅速使蛋白质变性，抑制核酸酶的活性，因此还可以先用苯酚处理，然后离心分层，这时DNA溶于上层水相，蛋白质变性后存在于酚层中，用吸管、微量移液器等实验用具就可以将两者分开。 探究实践：DNA分子的粗提取和鉴定 刑侦破案 DNA提取的应用 基因组测序 插入人胰岛素基因的大肠杆菌 基因工程 亲子鉴定 1.判断下列是否正确 (1)限制酶只能用于切割目的基因，也可以识别和切割RNA(　　) (2)切割质粒的限制性核酸内切酶均能特异性地识别6个核苷酸序列(　　) (3)DNA连接酶能将两碱基间通过氢键连接起来(　　) (4)E·coli DNA连接酶既可连接平末端，又可连接黏性末端(　　) (5)限制性核酸内切酶、DNA连接酶和质粒是基因工程中常用的三种工具酶(　　) (6)限制酶切割位点应位于标记基因之外，不能破坏标记基因，以便进行检测。（     ） (7)将制备的含有DNA的滤液加入预冷的95%酒精溶液，静置2-3min可以将DNA析出（    ） (8)在DNA的粗提取与鉴定实验中，将丝状物溶解在2mol/LNaCl溶液中，加入二苯胺试剂即呈蓝色。（     ） × × × × × × 2.细菌中广泛存在限制性内切核酸酶，当有外来DNA入侵时，该酶能够识别入侵者双链DNA中特定核苷酸序列并将其水解。以下相关叙述正确的是(　　) A．含有限制性内切核酸酶的细菌以RNA为遗传物质 B．细菌中含有多种细胞器 C．该酶可以保护细菌不受某些DNA病毒等的感染 D．含有限制性内切核酸酶的细菌自身的DNA也能被该酶水解 C　 √ √ 课后练习（检） 3.以下是几种不同限制酶切割DNA分子后形成的部分片段。下列叙述正确的是( ) A.以上DNA片段是由4种限制酶切割后产生的 B.②片段是在识别序列为 的限制酶作用下形成的 C.①和④两个片段在DNA聚合酶的作用下可形成重组DNA分子 D.限制酶和DNA连接酶作用的部位都是磷酸二酯键 D 4.DNA连接酶是重组DNA技术中常用的一种工具酶。下列相关叙述正确的是（ ） A.能连接DNA分子双链碱基对之间的氢键 B.能将单个脱氧核苷酸加到DNA片段的末端，形成磷酸二酯键 C.能连接用同种限制酶切开的两条DNA片段，重新形成磷酸二酯键 D.DNA连接酶只能连接双链DNA片段互补的黏性末端 C 5.下列关于基因运输工具——载体，必须具备的条件之一及理由均正确的是（ ） A.能够复制，以便目的基因插入其中 B.具有多个限制酶切割位点，便于目的基因的表达 C.具有某些标记基因，便于重组DNA的筛选 D.对受体细胞无害，便于重组DNA的筛选 C 课后练习（检） 6.某细菌质粒上有标记基因如图所示，通过标记基因可以推知外源基因(目的基因)是否转入成功。外源基因插入的位置不同，细菌在培养基上的生长情况也不同，如图所示是外源基因插入位置(插入点有a、b、c)示意图，请根据表中提供的细菌生长情况，推测①②③三种重组后细菌的外源基因插入点，正确的一组是（ ） 插入点 细菌在含氨苄青霉素的培养基上的生长状况 细菌在含四环素的培养基上的生长状况 ① 能生长 能生长 ② 能生长 不能生长 ③ 不能生长 能生长 A.①是c；②是b；③是a B.①是a和b；②是a；③是b C.①是a和b；②是b；③是a D.①是c；②是a；③是b 7.根据所学知识，完成以下填空： b a A.切断a处的酶为_______ B.连接a处的酶为_______ C.切断b处的酶为_______ ① ③④ ② a：磷酸二酯键；b：氢键 ①限制酶 ②解旋酶 ③DNA连接酶 ④DNA聚合酶 ⑤RNA聚合酶 课后练习（检） 6.图甲是含有目的基因的外源DNA片段，图乙是用于将目的基因导入受体细胞的质粒（阴影部分表示抗生素抗性基因），相关限制酶的作用部位如图所示，现欲培养转基因抗病植株，回答下列问题。 （1）在基因工程的操作中，不宜选用SmaI，原因是SmaI会破坏__________ 和__________________________。 （2）在基因工程的操作中，不宜选用EcoRI，原因是用EcoRI切割外源DNA片段后，___________________________________________________。 目的基因 质粒上的抗生素抗性基因 目的基因只有一侧含有黏性末端，不能插入到质粒中 （3）由于反应体系中含有大量的外源DNA片段和质粒，加入PstI一种限制酶后，会得到大量的目的基因片段和质粒片段，再加入DNA连接酶后，除了会形成目的基因与质粒连接的环状产物外，还会形成______________________连接的环状产物以及_____________________连接的环状产物。此外，目的基因与质粒的连接既可以是正向连接，也可以是____________，后者可能会导致目的基因无法正常表达。 目的基因与目的基因 质粒片段与质粒片段 反向连接 课后练习（检） 7.图1表示含有目的基因D的DNA片段长度(bp即碱基对)和部分碱基序列，图2表示一种质粒的结构和部分碱基序列。现有MspⅠ、BamHⅠ、MboⅠ、SmaⅠ4种限制性内切核酸酶切割的碱基序列和酶切位点分别为 C↓CGG、G↓GATCC、↓GATC、CCC↓GGG。请回答下列问题： 图1 (1)若用限制酶SmaⅠ完全切割图1中DNA片段，产生的末端是______末端，其产物长度为_________________________。 537 bp、790 bp、661 bp　 平　 图2 (2)若图1中虚线方框内的碱基对被T—A碱基对替换，那么基因D就突变为基因d。从杂合子分离出图1及其对应的DNA片段，用限制酶SmaⅠ完全切割，产物中共有_____种不同DNA片段。 (3)若将图2中质粒和目的基因D通过同种限制酶处理后进行连接，形成重组质粒，那么应选用的限制酶是____________。在导入重组质粒后，为了筛选出含重组质粒的大肠杆菌，一般需要用添加___________的培养基进行培养。经检测，部分含有重组质粒的大肠杆菌菌株中目的基因D不能正确表达，其最可能的原因是 ____________________________________________________________。 BamH Ⅰ　 抗生素B　 同种限制酶切割形成的末端相同，部分目的基因D与质粒反向连接　 4　 课后练习（检） 限制酶 DNA连接酶 载体 ①对受体细胞无害； ②有一个至多个限制酶切割位点； ③有特殊的标记基因； ④能自我复制或能整合到宿主DNA上。 质粒、噬菌体 、动植物病毒 基因工程的基本工具 作为载体的条件 种类： 切开DNA分子的磷酸二酯键 来源： 主要来源于原核生物 特点： 作用部位： 具有专一性（能识别双链DNA分子的特定核苷酸序列） 结果： 形成黏性末端或平末端 连接部位：磷酸二酯键 种类：E.coliDNA连接酶、T4 DNA连接酶 作用：把两条双链DNA片段拼接起来 课堂小结 一、概念检测 1. DNA连接酶是重组DNA技术常用的一种工具酶。下列相关叙述正确的是（ ） A.能连接DNA分子双链碱基对之间的氢键 B. 能将单个脱氧核苷酸加到DNA片段的末端，形成磷酸二酯键 C. 能连接用同种限制酶切开的两条DNA片段，重新形成磷酸二酯键 D. 只能连接双链DNA片段互补的黏性末端，不能连接双链DNA片段的平末端 C 2.在重组DNA技术中，将外源基因送入受体细胞的载体可以是（ ） A.大肠杆菌的质粒 B. 切割DNA分子的酶 C. DNA片段的黏性末端 D. 用来识别特定基因的DNA探针 A 练习与应用 练习与应用 二、拓展应用 1.想一想，为什么限制酶不切割细菌本身的DNA分子？ 迄今为止，在基因工程操作中使用的限制酶绝大部分都是从细菌或霉菌中提取出来的，它们可以识别DNA上特定的碱基序列并使特定部位的磷酸二酯键断开。微生物在长期的进化过程中形成了一套完善的防御机制，可以将外源入侵的DNA降解。细菌中限制酶之所以不切割自身的DNA，是因为含有某种限制酶的细胞的DNA分子或者不具备这种限制酶的识别序列，或者通过甲基化酶将甲基转移到了限制酶所识别序列的碱基上，使限制酶不能将其切开。这样，尽管细菌中含有某种限制酶，也不会使自身的DNA被切断，并且可以防止外源DNA入侵。 2. 有2个不同来源的DNA片段A和B，A片 段用限制酶切speⅠ进行切割，B片段分 别用限制酶HindⅢ , XbaⅠ、EcoRⅤ和 XhoⅠ进行切割。各限制酶的识别序列 和切割位点如下。 (1)哪种限制酶切割B片段产生的DNA片段能与限制酶speⅠ切割A片段产生的DNA片段相连接？为什么？ (2)不同的限制酶切割可能产生相同的黏性末端，这在基因工程操作中有什么意义？ 识别DNA分子中不同核苷酸序列，但能切割产生相同黏性末端的限制酶被称为同尾酶。同尾酶使构建载体时，切割位点的选择范围扩大。例如，我们选择了用某种限制酶切割载体，如果目的基因的核苷酸序列中恰好含有该限制酶的识别序列，那么用该限制酶切割含有目的基因的DNA片段时，目的基因就很可能被切断；这时可以考虑用合适的同尾酶(目的基因的核苷酸序列中不能有它的识别序列)来获取目的基因。 XbaⅠ 因为XbaⅠ与SpeⅠ切割产生了相同的黏性末端。 练习与应用 $$