复习专题03 基因工程（上）（串讲课件）-2024-2025学年高二生物下学期期末考点大串讲（浙科版2019）

1 复习专题03 基因工程（上） 期末考点大串讲 浙科版2019|高二期末复习 目录 1. 课程标准 2. 考点梳理 高频命题点01 基因工程及其工具 高频命题点02 DNA的粗提取和鉴定 高频命题点03 基因工程的基本操作步骤 高频命题点04 PCR扩增DNA片段及凝胶电泳鉴定 高频命题点05 基因工程的应用 高频命题点06 蛋白质工程 3. 真题检测 1. 课程标准 概念5 基因工程赋予生物新的遗传特性 5.1 基因工程是一种重组DNA技术 5.1.1 概述基因工程是在遗传学、微生物学、生物化学和分子生物学等学科基础上发展而来的 5.1.2 阐明DNA重组技术的实现需要利用限制性内切核酸酶、DNA连接酶和载体三种基本工具 5.1.3 阐明基因工程的基本操作程序主要包括目的基因的获取、基因表达载体的构建、目的基因导入受体细胞和目的基因及其表达产物的检测鉴定等步骤 5.1.4 举例说明基因工程在农牧、食品及医药等行业的广泛应用改善了人类的生活品质 5.2 蛋白质工程是基因工程的延伸 5.2.1 概述人们根据基因工程原理，进行蛋白质设计和改造，可以获得性状和功能更符合人类需求的蛋白质 5.2.2 举例说明依据人类需要对原有蛋白质结构进行基因改造、生产目标蛋白的过程 2. 考点梳理 高频命题点01 基因工程及其工具 基因工程P99第二段：是指有意识地把一个人们所需要的基因转入另一个生物体中，使后者获得新的遗传性状或表达所需要产物的技术。基因工程的核心是构建重组的DNA分子。 1. 工程别名： 2. 操作对象： 3. 操作水平： 4. 变异类型/原理： 5. 优点： 重组DNA技术 基因 分子水平 基因重组 打破物种间的界限，定向改造生物的遗传性状 细胞or分子？ 2. 考点梳理 高频命题点01 基因工程及其工具 （1）为什么可以把人的DNA和大肠杆菌的DNA拼接？基于哪些理论？ ①DNA的基本组成单位都是4种脱氧核苷酸 ②双链DNA的空间结构都是双螺旋结构 （2）两种亲缘关系极远，为什么人的胰岛素原基因可以在大肠杆菌细胞内表达？ ①遗传信息的传递遵循中心法则 ②生物界共用一套遗传密码 6. 三大理论基础：__________________、__________________和__________________ ①DNA是生物遗传物质 ②DNA双螺旋结构的确立 ③遗传密码的破译、“中心法则”的完善 理论基础P99倒数第二段 2. 考点梳理 高频命题点01 基因工程及其工具 关键步骤一：从人的染色体DNA中把胰岛素原基因（目的基因）提取出来 关键步骤及其目的 对应的基因工程 工具 “分子手术刀” 限制性内切核酸酶 关键步骤三：目的基因能够结合到载体上 “分子运输车” 基因载体——质粒、病毒等 关键步骤二：目的基因进入大肠杆菌中 分子缝合针 DNA连接酶 2. 考点梳理 高频命题点01 基因工程及其工具 识别并附着特定的脱氧核苷酸序列，并对每条链中特定部位的两个脱氧核苷酸之间的磷酸二酯键进行切割的一类核酸水解酶 氢键自动断裂 限制酶：只切割磷酸二酯键 1. DNA剪切——限制性内切核酸酶（简称“限制酶”） A A T T G C C T T A A G 3’ 3’ 5’ 5’ A A T T G C C T T A A G EcoRⅠ 氢键可以自发断裂和形成 Q：请指出限制酶EcoRⅠ具体切割的是哪个键？ 1.限制酶只切割磷酸二酯键，氢键自动断开 2. 考点梳理 高频命题点01 基因工程及其工具 2. 限制酶识别序列及其切割位点的表达方式和辨认 5’ 5’ 3’ 3’ 5’—GGATCC —3’ 3’—CCTAGG —5’ 5’—G 3’—CCTAG GATCC —3’ G —5’ + （2）写出切割的另一半 粘性末端 （2)写出Sau3AⅠ的粘性末端 —GATC — —CTAG — Sau3AⅠ 1. 用同一种限制酶切割后形成的两个粘性末端相同，且能够碱基互补配对 2. 不同的限制酶可能切割形成互补的黏性末端 （3）根据下图写出限制酶的识别序列及其切割位点 3. 限制酶识别序列及其切割位点的表达方式和辨认 —A —TCTAG 简写 限制酶的识别序列具有180°旋转对称的回文结构，序列中有一条中心轴线，中轴线两侧的双链DNA上的碱基是反向、对称、重复排列的 SmaⅠ 平末端　　　平末端 SmaI限制酶的切割： 只能识别CCCGGG序列，并在C和G之间切开。 3. 限制酶识别序列及其切割位点的表达方式和辨认 1. 限制酶来源：主要从细菌等微生物中分离纯化 2. 作用：破坏外源DNA，但不破坏自身DNA 机制P100第三段：自身DNA经过相应的化学修饰（如DNA甲基化修饰）不会被限制酶破坏→限制酶的保护作用是细菌等进化出的一种防御机制。 （2）内切酶和外切酶 ：“内切核酸酶”: 将外源DNA分子从内部剪成片段 “ 外切核酸酶”: 从DNA两端逐步剪切核苷酸 3. “限制性”？“内切”？“核酸酶”？ （1）限制性：特定的识别序列、特定的识别位点 （3）核酸酶=核酸水解酶 ：断开核苷酸之间的磷酸二酯键，水解DNA片段 1. DNA剪切——限制性内切核酸酶（简称“限制酶”） 4. 限制酶是否存在专一性？若有，在哪些方面体现？ 存在专一性 （1）只能识别双链DNA （2）只能结合特定的核苷酸序列 1. DNA剪切——限制性内切核酸酶（简称“限制酶”） DNA 5′ 3′ 3′ 5′ 目的基因（外源基因） G C A T T G C A A C G T C G T A G C A T T G C A 5′ 3′ 3′ 5′ 关键步骤一：从人的染色体DNA中把胰岛素原基因（目的基因）剪切下来 Q1:若要将某个目的基因从DNA分子上剪切下来，这个DNA分子上需要含有几个相应限制性内切核酸酶的识别位点？催化几个磷酸二酯键的水解？产生几个粘性末端？ Q2：上述过程中消耗H2O还是产生H2O？几分子？ Q3:这两个限制酶识别位点与目的基因的位置关系？ Q4:对于酶切位点隐含的要求？ 2个 4个 4个 消耗水 4个 目的基因的两侧 目的基因内部不含相应位点 DNA 5′ 3′ 3′ 5′ 1. 如果把两种来源不同的DNA用同一种限制酶来切割，会发生什么？ 会产生相同的黏性(平)末端，然后让两者的黏性(平)末端黏合起来，可以合成重组的DNA分子了 2. 如果让两者的黏性末端通过氢键连接起来，是否就可以形成重组的DNA分子了？ 关键步骤三：目的基因能够结合到DNA载体上 二、DNA连接酶 缝合切口 缝合切口 1. 用途P100最后一句：将不同来源的2个DNA分子的双链通过磷酸二酯键分别连接起来，形成一个稳定的重组DNA分子。注意：氢键自动生成 2. DNA连接酶的作用部位是磷酸二酯键，而不是氢键 3. 一般将具有末端碱基互补配对的2个DNA片段连接在一起，形成重组DNA分子 2. 考点梳理 高频命题点01 基因工程及其工具 DNA连接酶类型 P101 类型 E·coli DNA连接酶 T4DNA连接酶 来源 功能 大肠杆菌 T4噬菌体 恢复 磷酸 二酯键 只能连接黏性末端 能连接黏性末端和平末端(效率较低) 相同点 差别 2. 考点梳理 高频命题点01 基因工程及其工具 DNA片段1 DNA片段2 ① ② ③ ④ 先切割后连接 用同一种限制酶切割 重组DNA 不同的DNA分子用同一种限制酶切割会产生相同的粘性末端。 关键步骤三：目的基因能够结合到DNA载体上 19 三、运输工具——载体 质粒（最常用） λ噬菌体 植物病毒 动物病毒 导入大肠杆菌等细菌内 导入植物、动物细胞内 2. 种类 P102最后一句 1. 载体P102第一段：具备自主复制能力的DNA分子→原因2 关键步骤二：目的基因进入大肠杆菌中 质粒(基因表达载体)的必要条件（特点）P102第二段 1. 含有复制起点； 2. 含有一种或多种限制酶的识别序列； 3. 具有筛选作用的标记基因 4. 对受体细胞无害 能够独立自主复制并稳定存在 便于鉴定和筛选，如抗生素抗性基因、荧光标记基因 方便外源基因插入载体中 四环素 抗性基因 氨苄青霉素抗性基因 ori 2. 考点梳理 高频命题点01 基因工程及其工具 酶种类 作用底物 作用部位 作用结果 限制酶 DNA分子 DNA连接酶 磷酸二酯键 DNA聚合酶 磷酸二酯键 解旋酶 DNA分子 DNA水解酶 DNA分子 磷酸二酯键 DNA分子片段 脱氧核苷酸 碱基对中的氢键 磷酸二酯键 DNA相关酶总结 2. 考点梳理 高频命题点01 基因工程及其工具 22 【例】DNA重组技术可以赋予生物以新的遗传特性，创造出更符合人类需要的生物产品。在此过程中需要使用多种工具酶。下列相关叙述正确的是（　　） A．所有的限制酶都具有专一性，不同限制酶切割产生的黏性末端都不同 B．限制酶和DNA连接酶分别能催化磷酸二酯键的断裂和形成 C．限制酶识别序列越短，则相应酶切位点在DNA中出现的概率越小 D．DNA连接酶可以将游离的单个脱氧核苷酸连接成双链结构 B 【详解】A、所有的限制酶都具有专一性，不同限制酶切割产生的黏性末端可能相同，A错误； B、限制酶能够识别特定的DNA序列并催化磷酸二酯键的断裂，而DNA连接酶能够催化磷酸二酯键的形成，将DNA片段连接起来，B正确； C、限制酶识别序列越短，则相应酶切位点在DNA中出现的概率越大，因为短序列在DNA中出现的频率较高，C错误； D、DNA连接酶的功能是将DNA片段连接起来，而不是将游离的单个脱氧核苷酸连接成双链结构，D错误。 【例】已知某种限制性核酸内切酶在一线性DNA分子和一环状DNA分子上各有3个酶切位点，如图中箭头所指，如果线性DNA分子在3个酶切位点上都被该酶切断，则会产生a、b、c、d四种不同长度的DNA片段；环状DNA分子在3个酶切位点上都被该酶切断，则会产生e、f、g三种不同长度的DNA片段。现有上述多个线性DNA分子和环状DNA分子，若在每个DNA分子上至少有1个酶切位点被该酶切断，则从理论上讲，经该酶切后，这些线性DNA分子和环状DNA分子最多能产生长度不同的DNA片段种类数各是( ) A．4和6 B．9和6 C．9和7 D．12和7 C 【详解】多个线性DNA分子，若每个DNA分子上至少有1个酶切位点被该酶切断，该线性DNA分子会产生a、b、c、d四种不同长度的DNA片段，会产生a，b，c，d，ab，bc，cd，bcd，abc，共有9种片段。多个环状DNA分子，若每个DNA分子上至少有1个酶切位点被该酶切断，则会产生abc，ab，bc，ac，a，b，c，共有7种片段 【例】某一质粒载体如图所示，外源DNA插入到Ampr或Tetr中会导致相应的基因失活（Ampr表示氨苄青霉素抗性基因，Tetr表示四环素抗性基因）。有人将此质粒载体用BamHI酶切后，与用BamHI酶切获得的目的基因混合，加入DNA连接酶进行连接反应，用得到的混合物直接转化大肠杆菌，结果大肠杆菌有的未被转化，有的被转化。被转化的大肠杆菌有三种，分别是含有环状目的基因、含有质粒载体、含有插入了目的基因的重组质粒的大肠杆菌。回答下列问题： （1）质粒载体作为基因工程的工具，应具备的基本条件有                              （答出两点即可）。而作为基因表达载体，除满足上述基本条件外，还需具有启动子和终止子。 （2）如果用含有氨苄青霉素的培养基进行筛选，在上述四种大肠杆菌细胞中，未被转化的和仅含有环状目的基因的细胞是不能区分的，其原因是                  ；并且含有质粒载体和含有插入了目的基因的重组质粒（或重组质粒的细胞也是不能区分的，其原因是                    。在上述筛选的基础上，若要筛选含有插入了目的基因的重组质粒的大肠杆菌的单菌落，还需使用含有            的固体培养基。 【答案】 能自我复制、具有标记基因 二者均不含有氨苄青霉素抗性基因，在该培养基上均不生长 二者均含有氨苄青霉素抗性基因，在该培养基上均能生长 四环素 【例】某一质粒载体如图所示，外源DNA插入到Ampr或Tetr中会导致相应的基因失活（Ampr表示氨苄青霉素抗性基因，Tetr表示四环素抗性基因）。有人将此质粒载体用BamHI酶切后，与用BamHI酶切获得的目的基因混合，加入DNA连接酶进行连接反应，用得到的混合物直接转化大肠杆菌，结果大肠杆菌有的未被转化，有的被转化。被转化的大肠杆菌有三种，分别是含有环状目的基因、含有质粒载体、含有插入了目的基因的重组质粒的大肠杆菌。回答下列问题： （3）基因工程中，某些噬菌体经改造后可以作为载体，其DNA复制所需的原料来自于         。 （4）在基因工程的基本步骤中，                     是基因工程的核心。 【答案】受体细胞 基因表达载体的构建 答案 2. 考点梳理 高频命题点02 DNA的粗提取和鉴定 （1）实验原理： DNA、RNA、蛋白质和脂质等在 方面存在差异，可以利用这些差异，选用适当的物理或化学方法去除其他成分，对DNA进行提取。 物理和化学性质 ①研磨液 ②体积分数为95%的酒精 ③2mol/L 的NaCl溶液 ④二苯胺试剂 含有NaCl、EDTA、SDS、Tris（缓冲液）和HCl 析出DNA 溶解DNA 鉴定DNA，要现配现用 <m></m>与蛋白质在不同浓度的<m></m>溶液中溶解度不同 项目 溶解规律 溶液 溶液 _________________________________ 溶解 析出 蛋白质 溶液物质的量浓度从 逐渐降低的过程中,蛋 白质溶解度逐渐增大 部分发生盐 析沉淀 溶解 （2）实验原理 28 研磨液 尼龙纱布 上清液 （3）实验步骤 冷酒精 冷酒精 玻璃棒 二苯胺试剂 29 1. 实验结论说明絮状物中含有什么？ 2. 鉴定时，为什么要设置只加入二苯胺试剂的试管？ 3. 实验中研磨生物材料、倒入冷酒精的目的分别是什么？ 絮状物中含有 DNA 作为对照 研磨生物材料的目的是破坏细胞结构，利于提取 DNA； 倒入冷酒精的目的是使DNA 钠盐形成絮状沉淀物而析出 不能，无细胞核；后者可以 （4）实验讨论 4. 若实验材料换成动物细胞，能否使用哺乳动物成熟红细胞？鸡血细胞？ 5. 酒精预冷的目的是？ ①低温抑制核酸水解酶的活性，进而减少DNA的降解 ②抑制DNA分子运动，使其易形成沉淀析出 ③有利于增加DNA的柔韧性，减少其断裂   【例】关于“DNA的粗提取和鉴定”实验，下列说法正确的是（    ） A．研磨时倒入的研磨液，是为了破坏细胞壁 B．离心研磨液是为了加速DNA的沉淀 C．在DNA提取物中加入二苯胺，迅速呈现蓝色 D．提取DNA时要用玻璃棒沿一个方向缓缓搅动 D 【详解】A、研磨液是用于破坏细胞结构和细胞膜的试剂，其作用是将细胞破坏，释放出细胞内的DNA，A错误； B、离心研磨液是为了加速细胞膜、细胞器、一些较大杂质等的沉淀，B错误; C、需要沸水浴加热才可以看到蓝色，C错误； D、提取DNA时要用玻璃棒沿一个方向缓缓搅动是为了使DNA分子不断裂，D正确。 【例】某兴趣小组以香蕉为原材料进行DNA粗提取、扩增及电泳鉴定系列实验。下列叙述正确的是（　　） A．提取DNA时，研磨后需用滤纸进行过滤 B．可利用DNA在酒精中溶解度大的特点来提取DNA C．琼脂糖熔化前需将适量的核酸染料加入并进行混匀 D．若DNA带负电，则凝胶加样孔应位于电泳槽负极侧 D 【详解】A、研磨液需用纱布进行过滤，而不是用滤纸，以保证提取到更多的DNA，A错误； B、蛋白质可溶于酒精，而DNA在冷酒精在溶解度很低，所以在提取DNA时加入酒精，使溶于酒精的蛋白质等物质溶解，而让DNA析出，B错误； C、在沸水浴或微波炉内加热至琼脂糖熔化，稍冷却后加入适量核酸染料混匀，C错误； D、靠近加样孔的一端为负极，接通电源，带负电的DNA分子向正极移动而使DNA逐渐分离，D正确。 2. 考点梳理 高频命题点03 基因工程的基本操作步骤 目的基因：人们感兴趣的基因、想研究的基因。如苏云金芽孢杆菌的抗虫基因，植物的抗病（抗病毒、抗细菌）基因、抗除草剂基因，以及人的胰岛素基因、干扰素基因等 基因工程的基本操作程序主要包括四个步骤P104： (一）获取目的基因 (二）构建重组DNA分子 (三）将重组DNA分子导入受体细胞（宿主细胞） (四）检测目的基因及表达产物 2. 考点梳理 高频命题点03 基因工程的基本操作步骤 （一）获取目的基因 目的基因序列已知 目的基因序列未知：基因文库 用化学合成法合成目的基因（已知DNA、mRNA、 氨基酸序列） 聚合酶链式反应（PCR)扩增目的基因 基因组文库 cDNA文库 2. 考点梳理 高频命题点03 基因工程的基本操作步骤 （一）获取目的基因——目的基因序列已知 1. 用化学合成法合成目的基因 （1）已知目的基因的脱氧核苷酸序列 （2）已知其转录形成的mRNA序列 （3）已知其表达（翻译）产物的氨基酸序列 2. 考点梳理 高频命题点03 基因工程的基本操作步骤 前提：基因比较小、核苷酸序列已知 方法：通过DNA合成仪用化学方法直接合成目的基因（将核苷酸按顺序一个一个连接起来） （1）已知目的基因的脱氧核苷酸序列 2. 考点梳理 高频命题点03 基因工程的基本操作步骤 （2）已知其转录形成的mRNA序列 逆（反）转录法： 目的基因的mRNA 单链DNA（cDNA） 双链DNA (即目的基因) 逆转录 合成 Q：所得目的基因与真实基因相比，长度有无差别？ 2. 考点梳理 高频命题点03 基因工程的基本操作步骤 非编码区 非编码区 非编码区 编码区 外显子 内含子 1 2 3 4 5 加 工 mRNA前体 成熟mRNA 不能编码蛋白质的序列（内含子+非编码区序列） 编码序列=外显子 1 2 3 4 5 启动子 终止子 ①真核生物基因 转 录 功能：不能编码蛋白质，调控遗传信息的表达 2. 考点梳理 高频命题点03 基因工程的基本操作步骤 非编码区 非编码区 启动子：RNA聚合酶的识别和结合位点 开始转录 编码区 ②原核生物基因 终止子：终止转录 2. 考点梳理 高频命题点03 基因工程的基本操作步骤 （3）已知其表达（翻译）产物的氨基酸序列 根据蛋白质中氨基酸序列推测mRNA的碱基序列，再推测DNA碱基序列，最后通过DNA合成仪人工合成出目的基因。 蛋白质的氨基酸序列 mRNA的核苷酸序列 目的基因的核苷酸序列 推测 推测 目的基因 化学合成 2. 考点梳理 高频命题点03 基因工程的基本操作步骤 （一）获取目的基因——目的基因序列已知 2. 聚合酶链式反应（PCR)扩增目的基因 P107-108 PCR技术概念：PCR全称为_______________，是在___________作用下，在_______进行DNA大量扩增的一种分子生物学技术。 原理：_________________ 结果： 聚合酶链式反应 DNA聚合酶 模板(目的基因的核苷酸序列) 4种脱氧核苷三磷酸 一对引物 Taq DNA聚合酶 指数 2n 使目的基因的片段在短时间内成百万倍地扩增 体外 DNA半保留复制 条件：_________________________、___________________、___________ 、 ___________ 方式：以_____方式扩增，即____（n为扩增循环的次数） 2. 考点梳理 高频命题点03 基因工程的基本操作步骤 A. DNA变性（90—95℃）：双链DNA模板在热作用下，_____断裂，解旋成2条___________ B. 退火（50—60℃）：____个引物分别与各自互补DNA单链结合 C.延伸（70℃-75℃）：分别以两条DNA单链为模板，_____________为原料，耐高温的____________酶在适宜的温度下，以引物与模板形成的小段DNA双链区为起点，催化合成一条新的DNA互补链。 氢键 单链DNA 2 4种脱氧核苷三磷酸 2. 聚合酶链式反应（PCR)扩增目的基因 P107-108 Taq DNA聚合酶 （一）获取目的基因——目的基因序列已知 2. 考点梳理 高频命题点03 基因工程的基本操作步骤 2. 聚合酶链式反应（PCR)扩增目的基因 P107-108 （1）4种脱氧核苷三磷酸（dNTP），d表示脱氧,N表示4种含氮碱基 包括dATP、 dGTP、 dTTP、 dCTP 作用： 1.参与复制时高能磷酸键断开，提供能量 2.高能磷酸键逐个断开，形成核苷酸（1个磷酸基团），作为原料加入DNA新链中 2. 考点梳理 高频命题点03 基因工程的基本操作步骤 2. 考点梳理 高频命题点03 基因工程的基本操作步骤 （2）2种引物 2. 聚合酶链式反应（PCR)扩增目的基因 P107-108 引物P107第二段：在体外根据目的基因的核苷酸序列人工合成的2段短的单链DNA PCR的2种引物分别与两条模板链配对 Q：引物1和引物2的延伸方向是？ 2. 考点梳理 高频命题点03 基因工程的基本操作步骤 （2011·江苏）设计引物是 PCR 技术关键步骤之一。某同学设计的两组引物（只标注了部分碱基序列）都不合理（图 1），请分别说明理由。 ①第1组： ； ②第2组： 。 引物I和引物Ⅱ局部发生碱基互补配对而失效 引物I’自身折叠后会出现局部碱基互补配对而失效 (2016·天津）采用PCR技术扩增HSA基因。图3中箭头表示一条引物结合模板的位置及扩增方向，请用箭头在方框内标出另一条引物的位置及扩增方向。 2. 考点梳理 高频命题点03 基因工程的基本操作步骤 长链—中长链 DNA 中长链—短链 DNA 短链—短链 DNA 2. 考点梳理 高频命题点03 基因工程的基本操作步骤 扩增次数 第1次 第2次 第3次 第4次 第n次 DNA总数 21 22 23 24 2n 长链-中长链DNA 中长链-短链DNA 短链-短链 DNA 含引物A(或B) 的DNA 2 0 0 2 2 2 4 0 2 2 6 8 2 2(n-1) 2n-2n 1 3 7 15 2n-1 PCR扩增DNA规律:对照课本P108 图4-11 2. 考点梳理 高频命题点03 基因工程的基本操作步骤 讨论 1.目的基因双链DNA片段在第 次循环后出现。 2.第n次循环后共有 个分子。这些分子可以分为3种类型：目的基因双链DNA片段（两条链等长）为 个，双链中有1条链长于目的基因的DNA片段为 个，双链均长于目的基因的DNA片段有 个。 3.共进行n轮循环，总共消耗引物A的数量 个。第n轮循环后，含有引物A的DNA数量 个。 三 （2n-2n） 2（n-1） 2 2n 2n-1 2n-1 2. 考点梳理 高频命题点03 基因工程的基本操作步骤 DNA复制 PCR技术 场所 细胞内（主要在细胞核） 体外 原理 DNA半保留复制 酶 解旋酶、DNA聚合酶 Taq DNA聚合酶 条件 细胞内温和的温度条件 控制温度在较高范围 原料 4种脱氧核苷酸 4种脱氧核苷三磷酸 结果 形成整个DNA分子 在短时间内形成大量的DNA片段 2. 考点梳理 高频命题点03 基因工程的基本操作步骤 （一）目的基因序列未知——构建基因文库 基因文库包括基因组文库和部分基因文库（如cDNA文库） 把某种生物的基因组DNA切成适当大小，分别与载体组合，通过载体分别转入不同的受体细胞，让外源DNA的所有片段分别在各个受体细胞中大量复制（即扩增），形成克隆。基因组中所有DNA序列克隆的总汇被称为基因组文库。 好处：通过对受体菌的培养而储存基因 2. 考点梳理 高频命题点03 基因工程的基本操作步骤 基因组是指生物体所有遗传物质的总和，包括编码DNA和非编码DNA、线粒体DNA和叶绿体DNA。 基因组文库是指将某生物的全部基因组DNA用限制酶切割成一定长度的DNA 片段，再克隆到某种载体上而形成的集合。 许多DNA片段 重组DNA分子 限制酶 切割 用DNA 连接酶将DNA片段与载体连接 受体细胞 导 入 供体细胞中的DNA 增 殖 多个克隆 1. 构建基因组文库 （一）目的基因序列未知——构建基因文库 2. 考点梳理 高频命题点03 基因工程的基本操作步骤 2. 构建cDNA文库 cDNA（complementary DNA）是指互补DNA，从特定的组织或细胞中提取并纯化全部mRNA，然后在逆转录酶等酶的催化下，以mRNA为模板合成互补的DNA，即cDNAcDNA没有内含子而只有外显子的序列，只包含该生物的部分基因 mRNA 单链DNA 逆转录酶 DNA聚合酶 双链DNA（cDNA） 用DNA连接酶与载体连接 重组质粒 导入受体细胞 筛选含重组质粒的 受体细胞 多个克隆 增殖 2. 考点梳理 高频命题点03 基因工程的基本操作步骤 文库类型 cDNA文库 基因组文库 文库大小 基因中启动子 基因中内含子 基因多少 小 无 无 某种生物的部分基因 某种生物的全部基因 大 有 有 （一）目的基因序列未知——构建基因文库 2. 考点梳理 高频命题点03 基因工程的基本操作步骤 核酸探针为长度在几十到几百甚至上千碱基对的单链或双链DNA（RNA），用特殊示踪剂（如同位素、酶或有色基团）进行标记，能与待测样本中互补的非标记单链DNA或RNA以氢键结合（杂交），形成双链复合物（杂交体）。不完全匹配的杂交体的两链将会解离，而完全匹配的杂交体将保持双链。将未配对结合的探针洗去后，可用放射自显影或酶联反应等检测系统检测杂交反应结果。 如何从基因文库中筛选目的基因： 2. 考点梳理 高频命题点03 基因工程的基本操作步骤 （浙江2019年04）（二）回答与利用生物技术培育抗病品种有关的问题：通过抗病性强的植株获取抗病目的基因有多种方法。现已获得纯度高的抗病蛋白（可作为抗原），可通过____________________技术获得特异性探针，并将__________中所有基因进行表达，然后利用该探针，找出能与探针特异性结合的表达产物，进而获得与之对应的目的基因。 单克隆抗体 基因文库 （一）目的基因序列未知——构建基因文库 2. 考点梳理 高频命题点03 基因工程的基本操作步骤 如何从PCR技术扩增结果中筛选目的基因：琼脂糖凝胶电泳 2. 考点梳理 高频命题点03 基因工程的基本操作步骤 （二）构建重组DNA分子 1. 用一定的_________切割质粒，使其出现一个切口，形成__________。 2. 用_______________切断目的基因，使其产生_______________。 3. 最后用_______________将目的基因和载体连接在一起，形成了一个重组DNA分子（重组质粒） 限制酶 黏性末端 同一种限制酶 DNA连接酶 相同的粘性末端 Q：使用同一种限制酶可能出现什么问题？ ①质粒自身环化 ②目的基因自身连接 ③质粒与目的基因会发生反向连接 2. 考点梳理 高频命题点03 基因工程的基本操作步骤 （二）构建重组DNA分子 ①单酶切法 载体 目的基因 自连 片段间的连接 目的基因自连 质粒自连 目的基因与质粒连接 目的基因与目的基因连接 质粒与质粒连接 反向连接 1 1’ 1 1’ 1 1 1’ 1’ 1 1’ 1 1’ 正向连接 转录产物可能不同 2. 考点梳理 高频命题点03 基因工程的基本操作步骤 （二）构建重组DNA分子 载体 目的基因 自连 片段间的连接 目的基因自连 质粒自连 目的基因与质粒连接 目的基因与目的基因连接 质粒与质粒连接 反向连接 A B A B 正向连接 ②双酶切法：使用两种限制酶切割目的基因和载体，使其两端产生不同的黏性末端 2. 考点梳理 高频命题点03 基因工程的基本操作步骤 （二）构建重组DNA分子 1. 克隆载体：用于大量扩增___________的载体，必要元件有复制起点、标记基因和多个限制酶的识别位点 用途：如基因诊断、法医鉴定、判断物种亲缘关系等2. 表达载体：使目的基因既能扩增又能________________的载体，必要原件元件有复制起点、标记基因、多个限制酶的识别位点、____________和_____________。 用途：用于指导合成大量、稀有的蛋白质产物，如胰岛素、干扰素和抗癌药物 外源DNA 表达出相应蛋白质 启动子 终止子 标记基因 目的基因 2. 考点梳理 高频命题点03 基因工程的基本操作步骤 （三）将重组DNA分子导入受体细胞 转化P115最后一段：目的基因进入_________内，并且在受体细胞内维持_______和_______的过程 受体细胞：接受目的基因的细胞 原理：借鉴细菌或病毒侵染细胞的途径。 常用的受体细胞：大肠杆菌、枯草杆菌、农杆菌、酵母菌、动物细胞和植物细胞等。 受体细胞 稳定 表达 2. 导入植物细胞的方法 （1）农杆菌转化法 （2）基因枪法 （3）花粉管通道法 3. 导入动物细胞的方法 1. 导入微生物细胞的方法 （1）显微注射法 （2）利用腺病毒 制备感受态细胞（Ca2+处理） 2. 考点梳理 高频命题点03 基因工程的基本操作步骤 1. 导入微生物细胞的方法: 制备感受态细胞（Ca2+处理） 首先用低温、低浓度的________________处理细胞，以增大细菌_____________的通透性，使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态，这种细胞称为_____________。再在低温条件下将重组DNA分子溶于缓冲液中与感受态细胞混合，促进感受态细胞吸收DNA分子，最后进行短暂的热刺激处理完成转化过程。P116第一段 Ca2+（如CaCl2） 细胞膜 感受态细胞 ①优点： 繁殖周期短；体积小易于培养操作；多为单细胞；遗传物质相对较少 ②流程： 大肠杆菌 低温CaCl2 感受态细胞 溶于缓冲液中的重组DNA分子 转化 2. 考点梳理 高频命题点03 基因工程的基本操作步骤 2. 导入植物细胞的方法:（1）农杆菌转化法 农杆菌能在自然条件下感染140多种双子叶植物或裸子植物的受伤部位（受伤部位会分泌大量酚类化合物，从而使农杆菌移向这些细胞），并诱导产生冠瘿瘤。Ti质粒的T-DNA区段（Transferring DNA）上有一个冠瘿碱合成基因，合成冠瘿碱，进而引发细胞癌变。一旦进入植物细胞内，T-DNA被随机插入基因组的某个位置。Vir 区（编码能够实现 T-DNA 转移的蛋白） 2. 考点梳理 高频命题点03 基因工程的基本操作步骤 2. 导入植物细胞的方法:（1）农杆菌转化法 研究者将T-DNA上的植物激素和冠瘿碱合成基因去掉，替换为目标基因。通常将抗生素抗性基因也附带在T-DNA区，用作筛选的标记基因。这样经工程改造的Ti质粒重新转入农杆菌体内。位于T-DNA区域内的所有基因都将被插入受感染的植物基因组中。研究者可利用抗生素抗性基因进行转化细胞的筛选。 目的基因 Ti质粒 表 达 载 体 农杆菌 植物细胞 植物细胞 染色体DNA 新性状植株 构建 转入 转入 插入 表达 2. 考点梳理 高频命题点03 基因工程的基本操作步骤 2. 导入植物细胞的方法:（1）农杆菌转化法 如何转入农杆菌？ 如何转入植物细胞 2. 考点梳理 高频命题点03 基因工程的基本操作步骤 根癌农杆菌中含有Ti质粒，其上有一段_________，农杆菌通过侵染植物伤口进入细胞后，可将T-DNA插入到____________________中。人们将目的基因插入到经过改造的T-DNA区，借助农杆菌的感染实现外源基因向植物细胞的转移与整合，然后通过植物组织培养技术，培养出转基因植株。主要侵染____________。 T-DNA 植物染色体DNA 双子叶植物 2. 考点梳理 高频命题点03 基因工程的基本操作步骤 “两次拼接”和“两次导入” 植物损伤 伤口分泌酚类物质 吸引农杆菌 T-DNA转移 整合至染色体DNA 目的基因维持稳定和表达 2. 导入植物细胞的方法:（1）农杆菌转化法 （2021.1浙江选考）（二）三叶青为蔓生的藤本植物，以根入药。由于野生三叶青对生长环境要求非常苛刻，以及生态环境的破坏和过度的采挖，目前我国野生三叶青已十分珍稀。（1）为保护三叶青的________多样性和保证药材的品质，科技工作者依据生态工程原理，利用________技术，实现了三叶青的林下种植。（2）依据基因工程原理，利用发根农杆菌侵染三叶青带伤口的叶片，叶片产生酚类化合物，诱导发根农杆菌质粒上vir系列基因表达形成________和限制性核酸内切酶等，进而从质粒上复制并切割出一段可转移的DNA片段（T-DNA）。T-DNA进入叶片细胞并整合到染色体上，T-DNA上rol系列基因表达，产生相应的植物激素，促使叶片细胞持续不断地分裂形成________，再分化形成毛状根。（3）剪取毛状根，转入含头孢类抗生素的固体培养基上进行多次________培养，培养基中添加抗生素的主要目的是_______________。最后取毛状根转入液体培养基、置于摇床上进行悬浮培养，通过控制摇床的________和温度，调节培养基成分中的_____________________________________，获得大量毛状根，用于提取药用成分。 遗传 间种 DNA聚合酶 愈伤组织 继代 杀灭发根农杆菌 转速 营养元素以及生长调节剂的种类和浓度 2. 考点梳理 高频命题点03 基因工程的基本操作步骤 2. 导入植物细胞的方法:（1）农杆菌转化法 （2022.6浙江选考）（二）回答与植物转基因和植物克隆有关的问题： (4)在用农杆菌侵染的方法进行植物转基因过程中，通常要使用抗生素，其目的一是抑制___________生长，二是筛选转化细胞。当选择培养基中抗生素浓度___________时，通常会出现较多假阳性植株，因此在转基因前需要对受体进行抗生素的___________检测。(5)为提高培育转基因植株的成功率，植物转基因受体需具有较强的___________能力和遗传稳定性。对培养的受体细胞遗传稳定性的早期检测，可通过观察细胞内___________形态是否改变进行判断，也可通过观察分裂期染色体的___________，分析染色体组型是否改变进行判断。(6)植物转基因受体全能性表达程度的高低主要与受体的基因型、培养环境、继代次数和___________长短等有关。同时也与受体的取材有关，其中受体为___________时全能性表达能力最高。 农杆菌 过低 敏感性 再生 细胞核 形态特征和数量 培养时间 受精卵 2. 考点梳理 高频命题点03 基因工程的基本操作步骤 2. 导入植物细胞的方法:（1）农杆菌转化法 2. 考点梳理 高频命题点03 基因工程的基本操作步骤 2. 导入植物细胞的方法:（2）基因枪法 基因枪的作用是用压缩气体(氦或氮等)动力产生一种冷的气体冲击波进入轰击室(因此可免遭由“热”气体冲击波引起的细胞损伤)，把吸附有DNA的金属颗粒打向细胞，穿过细胞壁、细胞膜、细胞质等层层构造到达细胞核，整合到植物DNA中表达，甚至可将目的基因导入叶绿体等细胞器中。主要适用于_______________，但转化效率较低。 单子叶植物 2. 考点梳理 高频命题点03 基因工程的基本操作步骤 2. 导入植物细胞的方法:（3）花粉管通道法 将重组DNA滴加到植物受粉后形成的花粉管通道内，利用植物在开花、受精过程中形成的花粉管通道，使其进入卵细胞、合子或早期胚胎细胞中，并进一步地被整合到受体细胞的基因组中，随着受精卵或其他细胞的发育而成为带转基因的新个体。该方法直接、简便且经济。 2. 考点梳理 高频命题点03 基因工程的基本操作步骤 3. 导入动物细胞的方法: （1）显微注射法 显微注射法：在显微镜下，用一根极细的玻璃针(直径1～2微米)直接将重组DNA注射到_________的细胞核内，体外培养一段时间后再把注射过重组DNA的_________移植到动物体内，使之发育成转基因幼仔。特点：DNA损失少，无需选择标记基因，整合效率高。不足：仪器设备要求高，操作比较烦琐。 受精卵 胚胎 2. 考点梳理 高频命题点03 基因工程的基本操作步骤 3. 导入动物细胞的方法: （2）利用腺病毒 2. 考点梳理 高频命题点03 基因工程的基本操作步骤 （四）检测目的基因及表达产物 类型 检测内容 方法 分子水平的检测 个体生物学水平的鉴定 检测目的基因是否在受体细胞中稳定地存在并遗传 检测目的基因是否表达出mRNA 载体上的标记基因 PCR 核酸分子杂交 检测目的基因是否表达出相应蛋白质 抗原-抗体杂交技术 个体是否表达出相应性状 抗虫鉴定、抗病鉴定等 核酸分子杂交 检测目的：检查目的基因进入受体细胞后，是否稳定遗传和表达其遗传特性 检测和鉴定的四个方面：DNA、RNA、蛋白质、个体性状 2. 考点梳理 高频命题点03 基因工程的基本操作步骤 1. 检测目的基因是否在受体细胞中稳定地存在并遗传： （1）载体上的标记基因 蓝白斑筛选法 Lac Z基因 Lac Z基因 X-gal(无色) 半乳糖+5-溴-4-氯靛蓝（蓝色） β-半乳糖酶 目的基因插入位点 导入了重组质粒的大肠杆菌 2. 考点梳理 高频命题点03 基因工程的基本操作步骤 Lac Z基因 X-gal(无色) 半乳糖+5-溴-4-氯靛蓝（蓝色） β-半乳糖酶 Lac Z基因 目的基因 插入位点 导入情况 菌落生长情况及特征 未导入 导入载体（空质粒） 导入重组DNA分子（目标情况） 不生长 生长，蓝色菌落 生长，白色菌落 2. 考点梳理 高频命题点03 基因工程的基本操作步骤 1. 检测目的基因是否在受体细胞中稳定地存在并遗传： （2）PCR技术+（琼脂糖凝胶电泳检测） 转基因生物 提取DNA 酶切 DNA作为模板 设计引物 PCR扩增 是否扩增出目的基因 电泳检测 M（marker）1-标准样品； 2：原始品系；3-9转M、N品系； 转Bt基因品系PCR琼脂糖凝胶电泳检测结果 2. 考点梳理 高频命题点03 基因工程的基本操作步骤 1. 检测目的基因是否在受体细胞中稳定地存在并遗传： （3）核酸分子杂交 ①制作出与目的基因序列互补的有同位素标记的DNA片段（基因探针），并用PCR扩增探针。 ②提取受体细胞全部DNA，然后酶切→电泳→碱变性处理DNA→转移至硝酸纤维素膜上固定→加入探针杂交 ③洗膜→放射性自显影→观察有无杂交带 2. 考点梳理 高频命题点03 基因工程的基本操作步骤 2. 检测目的基因是否表达出mRNA：核酸分子杂交 提取转基因生 物的全部RNA 制作基因探针，并用PCR扩增 变性 15N 15N 杂交分子 （可检测） 用_________________标记的具有特定核苷酸序列的DNA或RNA。 （”特定“：核酸探针的碱基排序由___________决定） Q：如何制作探针？ 放射性同位素或荧光 目的基因 2. 考点梳理 高频命题点03 基因工程的基本操作步骤 3. 检测目的基因是否表达出相应蛋白质：抗原-抗体杂交技术 P118第三段：从转基因生物中提取出蛋白质，用相应的抗体进行抗原—抗体杂交，若有杂交带或标记信号出现，表明目的基因已形成蛋白质产品。 Q：该抗体通过什么技术产生？ 蛋白质 脱分化 提取 苏云金杆菌 B淋巴细胞 出现杂交现象 说明在酵母菌中成功表达人胰岛素 人胰岛素 单克隆抗体 导入人胰岛素原的酵母菌 2. 考点梳理 高频命题点03 基因工程的基本操作步骤 4. 个体是否表达出相应性状 转基因生物 鉴定方法 成功标志 抗虫植物 抗病毒（菌）植物 抗盐植物 抗除草剂植物 获取目的基因产物的转基因生物 饲喂害虫（抗虫接种实验） 害虫死亡 病毒（菌）接种实验 未染病 盐水浇灌 正常生长 喷洒除草剂 正常生长 提取细胞产物与天然产品进行功能活性比较 功能、活性正常 2. 考点梳理 高频命题点03 基因工程的基本操作步骤 （浙江选考真题）转基因酵母功能鉴定。分别将转化了M、N基因的酵母菌株于液体培养基中培养至OD600为 0.6。将菌液用___________法逐级稀释至OD600为0.06、0.006和0.0006，然后各取10μL菌液用涂布器均匀涂布在固体培养基上，培养2天，菌落生长如图。该实验中阴性对照为_______________________________。由实验结果可初步推测：转运蛋白M和N中，转运Zn²+能力更强的是____________，依据是_____________________________________。 梯度稀释 锌吸收缺陷型酵母+空载体 N 转入N基因的这组酵母菌数量多 【例】将溶葡球菌酶基因转入奶牛基因组中获得转基因牛，在其乳腺中表达的溶葡球菌酶可以有效预防由葡萄球菌引起的乳房炎，使感染率下降。下列叙述错误的是（    ） A．上述操作至少需要三种分子工具：限制酶、DNA聚合酶、载体 B．可以通过PCR以及构建基因文库等方法来获取溶葡球菌酶基因 C．构建基因表达载体时，需加入乳腺中特异表达的基因的启动子 D．溶葡球菌酶基因与奶牛DNA都为双螺旋结构是二者拼接的基础 A 【详解】A、上述操作采用了基因工程技术，该技术至少需要三种分子工具：限制酶、DNA连接酶、载体，A错误； B、葡球菌酶基因为目的基因，获取目的基因的方法有PCR、构建基因文库等，B正确； C、要使目的基因只在乳腺组织中特异性表达，在构建基因表达载体时，需加入乳腺中特异表达的基因的启动子，C正确； D、不同DNA能相互拼接的基础是它们具有相同的化学组成（都是由脱氧核苷酸组成）和结构 （双螺旋结构），D正确。 【例】农杆菌转化法是植物基因工程中常用的将重组DNA分子导入受体细胞的方法，常见转化过程如图所示，其中①-④表示相关过程。在转化拟南芥时可使用蘸花法：待拟南芥开花后将花序浸润在农杆菌悬液中1-2min，农杆菌会随着萌发的花粉管进入胚囊，含目的基因的表达载体进入胚囊中的卵细胞，受精后待果实成熟，即可获得含有目的基因的拟南芥种子。下列叙述错误的是（　　） A．图中②③过程需要严格控制生长素和细胞分裂素类似物的比例 B．过程③获得的转基因试管苗中，单个细胞内可能同时存在多个BURY基因 C．蘸花法转化拟南芥前去掉已形成的果实，有利于提高含目的基因种子的比例 D．两种转化法均可在当代获得转基因植株，并在当代完成转基因性状的鉴定 D 【详解】A、图中②③过程表示脱分化和再分化过程，需要严格控制生长素和细胞分裂素类似物的比例，以诱导细胞的增殖和分化，A正确； B、过程③获得的转基因试管苗中，由于农杆菌转化植物细胞，可多次插入目的基因，故过程③获得的转基因试管苗中，单个细胞内可能同时存在多个BURY基因，B正确； C、蘸花法转化拟南芥后所得种子可能含有目的基因，而转化前已形成的果实中的种子均不含目的基因，故需要在转化前去掉，有利于提高含目的基因种子的比例，C正确； D、农杆菌转化法可在当代获得转基因植株，蘸花法转化法先获得含目的基因的种子，种子再种下去长成转基因植株，即在下一代中获得转基因植株，D错误。 【例】乳酸菌是乳酸的传统生产菌，但耐酸能力较差，影响产量。酿酒酵母耐酸能力较强，但不产生乳酸。研究者将乳酸菌的乳酸脱氢酶基因（LDH）导入酿酒酵母，获得能产生乳酸的工程菌株。下图1为乳酸和乙醇发酵途径示意图，图2为构建表达载体时所需的关键条件。 (1)乳酸脱氢酶在转基因酿酒酵母中参与厌氧发酵的场所应为           。 (2)获得转基因酿酒酵母菌株的过程如下： ①设计引物扩增乳酸脱氢酶编码序列。 为使扩增出的序列中编码起始密码子的序列由原核生物偏好的GTG转变为真核生物偏好的ATG，且能通过双酶切以正确方向插入质粒，需设计引物1和2。其中引物1的5′端序列应考虑           和           。 ②将上述PCR产物和质粒重组后，导入大肠杆菌，筛选、鉴定，扩增重组质粒。重组质粒上有            ，所以能在大肠杆菌中扩增。启动子存在物种特异性，易被本物种的转录系统识别并启动转录，因此重组质粒上的乳酸脱氢酶编码序列           （能/不能）在大肠杆菌中高效表达。 ③提取重组质粒并转入不能合成尿嘧啶的酿酒酵母菌株，在           的固体培养基上筛选出转基因酿酒酵母，并进行鉴定。 (3)以葡萄糖为碳源，利用该转基因酿酒酵母进行厌氧发酵，结果既产生乳酸，也产生乙醇。若想进一步提高其乳酸产量，下列措施中不合理的是___________（单选）。 A．进一步优化发酵条件 B．使用乳酸菌LDH基因自身的启动子 C．敲除酿酒酵母的丙酮酸脱羧酶基因 D．对转基因酿酒酵母进行诱变育种 【答案】(1)细胞质基质 (2) 包含BamHI的识别序列 将GTG改为ATG 原核生物复制原点 不能 缺失尿嘧啶 (3)B 【例】蜘蛛丝（丝蛋白）有着超强的抗张强度。可制成防弹背心、人造韧带等。蜘蛛通过在腹部的腺体生成蜘蛛丝，并使用一种名为“喷丝头”的器官将蛛丝排出体外。由于蜘蛛会互相攻击，吃掉同类，因此无法像蚕丝一样通过养殖大量生产。美国科学家兰迪·莱维斯把一些蜘蛛DNA转置到山羊的DNA中，使其产出的羊奶经过提炼、干燥后变成与蜘蛛丝质地一模一样的丝绸。下图是创造“蜘蛛羊”的过程，回答下列问题： (1)从         细胞中提取mRNA，反转录为cDNA，根据        设计引物，获取和扩增目的基因，通常采用         的方法来鉴定其扩增产物。 (2)甲过程需用到的工具有        （填工具名称）。对X中的启动子的要求是        。 (3)科学家将蜘蛛牵丝蛋白基因整合到细毛羊胎儿成纤维细胞中，并用此细胞作为核供体，结合核移植技术，成功获得了能合成蛛丝蛋白的转基因细毛羊。 ①对成纤维细胞进行体外传代培养时，需用胰蛋白酶处理贴壁细胞，使之分散成单个细胞，再用        法收集细胞，之后再继续分瓶培养。 ②用细毛羊卵母细胞作为核移植的受体，在核移植之前必须先对卵母细胞进行的操作是培养至        时期，通过显微操作去核法去除卵母细胞的细胞“核”，该“核”实质为        。 ③采用羊胎儿成纤维细胞进行转基因体细胞克隆的优势在于可以获得          。为了提高已有重组胚胎的利用率，可采用          技术。 【答案】(1) 蜘蛛腹部腺体 蛛丝蛋白基因两端的已知脱氧核苷酸序列 琼脂糖凝胶电泳 (2) 限制酶、DNA连接酶、载体 能使蜘蛛丝蛋白基因在乳腺细胞中特异性表达 (3) 离心法 MⅡ 纺锤体－染色体复合物 可以获得大量遗传物质相同的后代 胚胎分割 Lavf58.30.100 Lavf58.29.100 Bilibili VXCode Swarm Transcoder v0.7.28 Lavf58.30.100 $$