专题02 发酵工程（期末复习课件）高二生物下学期浙科版

1 复习专题02 发酵工程 期末考点大串讲 浙科版2019|高二期末复习 一　微生物的培养需要适宜条件 1. 培养基为目标微生物提供适宜的生长环境 含义 满足微生物　　　　　或　　　　　　　的需求而配制的___________　　　　 成分 水、无机盐、碳源、氮源、生长因子等 生长繁殖 积累代谢产物 混合养料 理化特性 成分上 “　　　　　　　　　　”。即细菌培养基中要含有较高的有机氮，常用蛋白胨和酵母提取物等来配制；霉菌培养基一般用可溶性淀粉加无机物配制，或用添加蔗糖的豆芽汁等配制 pH上 细菌通常要求在　　　　　的环境中生长，霉菌要求在____________的环境中生长 细菌喜荤，霉菌喜素 中性偏碱 中性偏酸 分类 按物理特征 固体培养基 通常是在液体培养基中添加一定量的凝固剂制成的。“平板”易清楚观察到________，常用于微生物分离、鉴定、活菌计数等；“斜面”常用于菌种________　　　　 液体培养基 是没有添加凝固剂的培养基，常用于______________某种微生物 按化学成分 合成培养基 化学成分__________，用于在实验室进行的、要求可重复性强的各种研究工作 天然培养基 化学成分____________或成分________，成本较低，常用于大规模的　　　　工业 菌落 保存 大规模快速繁殖 完全清楚 不十分清楚 不恒定 生物发酵 二、无菌操作 （1）实验器具与培养基灭菌： 基础 高压灭菌 烘箱中烘干 超净工作台 黏附 （2）较高温度下会分解的有机化合物的灭菌和使用过的器皿、废弃物的处理： ①对较高温度下会分解的物质，采用已灭菌的、孔径最小的___________过滤除菌，如对尿素、葡萄糖的灭菌。 ②对含葡萄糖的培养基，可采用适当降低　　　　、 　　　　以及延长时间的高压灭菌方法灭菌。 ③所有使用过的器皿、废弃物等必须先经过　　　　　后再洗涤或倾倒。 G6玻璃砂漏斗 温度 压力 高压灭菌 （3）接种过程中的灭菌和无菌操作： ①接种环和涂布器的灭菌： a.接种环：接种前先将接种环的环部、金属丝、金属丝与柄的连接部、连接部的上端在明火上　　　　，待　　　　后再接种。 b.涂布器：使用时浸泡在75%的　　　　中，接种前将涂布器在酒精灯火焰上　　　　，　　　　后涂布。 ②瓶口或试管口的灭菌：接种过程中，打开塞子 　　和塞上塞子____都要将瓶口或试管口在酒精灯火焰上　　　　灭菌。 ③接种时要靠近酒精灯的　　　　。 灼烧　 冷却 酒精 灼烧 冷却 后 前 灼烧 火焰 微生物纯化的方法： 平板划线法 稀释涂布平板法 平板划线法是通过接种环在琼脂固体培养基表面连续划线的操作，将聚集的菌种逐步稀释分散到培养基的表面。在数次划线后培养，可以分离到由一个细胞繁殖而来的肉眼可见的子细胞群体。 将菌液进行一系列的梯度稀释，然后将不同稀释度的菌液分别涂布到琼脂固体培养基的表面，进行培养。 三、目标微生物的分离、纯化与计数 第1区划线 接种环灭菌 第2区划线 接种环灭菌 第3区划线 接种环灭菌冷却 接种环灭菌 1 2 3 4 5 蘸取菌液 目的：杀死上次划线时残留菌种，确保每次划线菌种来自上次划线的末端，从而使每次划线时菌种数目逐渐减少，直至得到单个细胞 1、平板划线法 多次连续平行划线法 划3个平板（重复实验） 1个不划线（空白对照） 连续平行划线法 ①接种环只蘸一次菌液,要在培养基不同位置连续划线多次 ②每次划线前后灼烧接种环进行灭菌 ③划线首尾不能相接 ④划线后，培养皿倒置培养 接种结束后接种环灭菌： 杀死接种环上残留的菌种，避免细菌污染环境和感染操作者 2、稀释涂布平板法 第1步:系列梯度稀释操作 ①将分别盛有9ml水的6支试管灭菌，并按101～106顺序编号。 ②用移液管吸取1ml菌液，注入101倍稀释的试管中。使菌液与水充分混匀。依次类推，直至完成最后一支试管的稀释。 注意：移液管需要经过灭菌。操作时，试管口和移液管应在离火焰1 ∽2cm处。 101 102 103 104 105 106 稀释倍数有要求：确保菌落数在30—300之间 第2步:涂布平板操作 ①将涂布器浸在盛有酒精的烧杯中 滴 ②取少量稀释液（不超过0.1ml ），滴加到培养基表面 灼 ③将沾有少量酒精的涂布器在火焰上引燃，待酒精燃尽后，冷却8-10s。 涂 各梯度分别涂布3个平板1个不涂布作空白对照 浸 滴 燃 涂 ④用涂布器将菌液均匀地涂布在培养基表面。涂布时可转动培养皿，使涂布均匀 第3步:培养 各梯度分别涂布3个平板 设置两个空白对照 放入37℃恒温箱中培养12h～24h 选择培养基 牛肉膏蛋白胨培养基 图中的1、2、3平板是选择培养基，4平板为牛肉膏蛋白胨培养基，以判断选择培养基是否具有筛选作用；另外，还要有 个对照，即不涂布稀释液的 。 两 选择培养基和牛肉膏蛋白胨培养基，以验证培养基中是否含有杂菌 两种方法都可以获得单细胞菌落，用于分离纯化微生物 不能计数 平板划线法 稀释涂布平板法 两种接种方法的判断 可以计数 共同点： 3、微生物数量测定的两种方法 1.稀释涂布平板法 ——间接计数法 原理：当样品的 足够高时，培养基表面生长的一个 ，来源于样品稀释液中的一个 。通过统计平板上的 ，就能推测出样品中大约含有多少 。 稀释度 菌落 活菌 菌落数 活细菌 恰当的稀释度是成功统计菌落数目的关键。 计算：每克样品中的菌落数 ＝(C÷V)×M C代表某一稀释度下平板 上生长的平均菌落数。 V代表涂布平板时所用的 稀释液的体积(mL) M代表稀释倍数 请计算：4号试管的结果表明每克土壤中的活菌数约为 个 1.1×108 注意： ①若重复组结果相差太大， 则说明操作有误。 ②统计的菌落往往比活菌的实际数低。 因为当两个或多个细胞连在一起时，繁殖后形成的还是一个菌落 练：两同学用稀释涂布平板法测定同一土壤样品中的细菌数。从对应稀释倍数为106的培养基中，得到以下两种结果。⑴甲在该浓度下涂布了一个平板，统计菌落数为230。⑵乙在该浓度下涂布了三个平板，统计菌落数分别为21、212、256，该同学以这三个平板上菌落数平均值163作为统计结果。 你认为这两位同学的作法正确吗？如果有问题，错在哪？ 甲：没有重复实验（至少涂布3个平板） 乙：A结果与其他两个相差太大，，数值不科学。 1.原理：利用______________，显微镜下计算样品中微生物的数量。 血细胞计数板 计数板正面 计数板侧面 计数室 滴液处 计数室（中间大方格）长宽各为1mm，深度为0.1mm，其体积为______mm3 ， 合_________mL。 1mm2 0.1 1×10-4 计数室 2.显微镜直接计数法——直接计数法 25个中格 16个小格 16个中格 25个小格 25X16 = 400小格 16X25 = 400小格 每个计数室（大方格）共有400小格，总容积为0.1mm3（1×10-4mL） * * * * * * * * * 抽样检测： 5×16=80个小格 抽样检测： 4×25=100个小格 如何计数？ 25个中格 16个中格 A3 A1 A2 A4 A1 A2 A3 A4 A5 抽样检测： 5×16=80个小格 抽样检测： 4×25=100个小格 每mL培养液中酵母菌数量 = 所数小方格中细胞总数 所数的小方格数 x 400 ÷ （1×10-4） 每个计数室（大方格）共有400小格， 总容积为0.1mm3（1×10-4mL） 计算时，还要注意“稀释倍数” 如何计数？ 选择培养基 （1）概念：在培养基中添加（或减去）某种　　　　，使得只有某些_______的微生物能够生长，　　　微生物均不能生长。 （2）作用：从混杂的微生物群体中　　　　　出所需种类的目标微生物，也可以从已知种类的混杂的细胞群体中筛选出特定的细胞。 化学成分 特定 其他 快速筛选　 四、微生物的选择培养 　 1、 筛选目的菌株的三种方法 方法 特点 举例 利用营养缺陷型选择培养基进行的选择培养 通过控制培养基的营养成分，使营养缺陷型微生物不能正常生长 缺乏氮源的培养基可筛选固氮微生物 利用某种化学物质进行的选择培养 在培养基中加入某种化学物质，抑制某些微生物，同时选择所需的微生物 加入青霉素的培养基可抑制细菌，分离出真菌 利用培养条件进行的选择培养 改变微生物的培养条件 将培养基放在高温环境中培养，可分离出耐高温的微生物 2、几种常用的鉴别培养基 名称 主要用途 主要化学物质 特征性变化 伊红-亚甲蓝琼脂培养基 鉴别大肠杆菌 伊红、亚甲蓝 出现带金属光泽的深紫色菌落 刚果红培养基 鉴别纤维素分解菌 刚果红、纤维素 纤维素被分解后出现透明圈 油脂培养基 鉴别产脂肪酶菌株 食用油、吐温、中性红指示剂 由淡红色变成深红色 淀粉培养基 鉴别产淀粉酶菌株 可溶性淀粉、KI-I2（碘-碘化钾） 淀粉被水解后出现透明圈 H2S试验培养基 鉴别产H2S菌株 醋酸铅 产生黑色沉淀 3、微生物筛选过程中必要的两种对照培养基及其作用 　五、果酒、果醋制作 项目 果酒制作 果醋制作 发酵菌种 菌种 酵母菌 醋酸菌 代谢类型 异养兼性厌氧型 异养需氧型 发酵条件 温度 25 ℃左右 30~35 ℃ 时间 7~10天 7~8天 氧气 前期需氧，后期无氧 一直需要充足的氧气 pH 酸性 酸性 联系 醋酸发酵可以在酒精发酵的基础上进行，酒精发酵为醋酸发酵提供原料 一是提供部分氧气促进酵母菌的需氧呼吸,进而促进酵母菌的大量繁殖,提供更多的菌种;二是保证发酵过程中不会有葡萄汁溢出。 提高酒精的产量，更多底物，可加速反应，便于直观观察。（制醋需要足够的酒精） 制作果酒时,哪些措施保证了 无氧条件 用凡士林密封吸管与小洞的连接处; 吸管的长臂插入水中阻止氧气进入 制作步骤 （1）制备装置：在矿泉水瓶盖上戳一个小洞，将可弯折吸管的短臂插入小洞，再用凡士林密封吸管与小洞的连接处。待装入葡萄、盖好盖子后，再将吸管长臂插入水中阻止氧气进入 　 （2）处理材料：将葡萄用清水洗净、晾干后，连皮挤碎后分别放入编号为1、2的两个矿泉水瓶中。所放入的葡萄体积不要超过矿泉水瓶的1/2。为提高酒精产量可在两个矿泉水瓶中适当添加白糖 制备装置处理材料 思考：1.将吸管的长臂端插入水中制作果醋时，为什么要给发酵好的果酒通入空气？ 2.打洞的位置应尽量避免开口向上，也不要把洞开得过大？ 发酵：(1)将少量干酵母用温水调匀后放入1号矿泉水瓶中，2号矿泉水瓶中，不加干酵母，其他处理同1号。盖好盖子后，将吸管长臂插入水中以阻止氧气进入。 (2)将两个矿泉水瓶放在25℃左右的环境中发酵。每天定时观察矿泉水瓶内葡萄的变化以及吸管长臂排出气泡的速度。7~10天后，待不再有气体产生时，停止发酵。用小刀在发酵液面以上将瓶壁戳一个小洞，将瓶中的上清液倒入相同编号的另一干净矿泉水瓶中，置于冰箱4℃冷藏室中静置保存，即得到自制的葡萄果酒. (3)选取酒味较重的一瓶，用小刀在矿泉水瓶壁（液面之上）戳一小洞，放置在温暖的环境中（ 30℃左右）。24h后打开瓶盖就会闻到果酒在有氧条件下发酵产生的果醋的气味. 将空气通入果酒时，空气中的醋酸菌进入发酵液，在有氧条件下将乙醇氧化成醋酸，进而制作果醋。 这样既可以减少环境中其他微生物的进入，也可以减少所产生的醋味逸散。 特别提醒 制作果酒、果醋的注意事项 (1)果酒发酵过程中产生的部分CO2会溶于发酵液而使发酵液的pH下降。 (2)由于果酒发酵旺盛期CO2产生量大,因此需及时排气,以防止发酵瓶爆裂。 (3)在缺氧、呈酸性的发酵液中,酵母菌可以生长繁殖,而绝大多数其他微生物因无法适应这一环境而受到抑制。 (4)乙醇与酸性条件下的重铬酸钾反应形成灰绿色,可对乙醇进行检测;闻味(出现酸味)可判断是否产生醋酸。 (5)当氧气、糖源都充足时,醋酸菌将葡萄中的糖分解成醋酸;当缺少糖源时,醋酸菌将乙醇变为乙醛,再将乙醛变为醋酸。制果醋一般不直接利用葡萄糖氧化生成醋酸.而是借助酒精发酵的产物进行。因为在酒精发酵过程中，蛋白质、脂质等其他有机物被分解为口味独特、营养丰富的小分子有机物，使食醋独具特色，且发酵过程不易遭受杂菌污染 原理：泡菜是利用附生在蔬菜表面的植物乳杆菌、短乳杆菌和明串珠菌等发酵制成的。 制作步骤(1)处理材料：将圆白菜、白萝卜等洗净，切成3～4 cm长的小块；将泡菜坛洗净，用开水清洗坛子内壁2次，确保没有油脂附着在内壁上（否则泡菜水会“生花”长出白色霉点）。 (2)腌制泡菜 ①用盐和冷开水配制成6%的盐水：取6 g食盐，溶于100mL冷开水中，按此比例配制成所需体积的盐水。 六、利用乳酸菌发酵制作泡菜 冷开水是煮沸后冷却的水。煮沸有两大作用,一是除去水中的氧气,二是杀灭水中的微生物。冷却是为了防止水温度过高杀死蔬菜表面的乳酸菌。 ②将蔬菜、花椒、八角、白酒等放入坛内。白酒作用：抑制泡菜表面杂菌生长，调味剂增加醇香 ③将盐水加入坛中，没过蔬菜，基本装满泡菜坛。 ④盖上泡菜坛盖，用水封住坛口，防止外界空气进入。在腌制过程中须随时加满水。作用：造成无氧环境的方法，这样，坛内可利用蔬菜中天然存在的乳酸菌进行乳酸发酵。如不封闭，则会有许多需氧腐生菌生长，蔬菜会腐烂变质。 ⑤蔬菜在泡菜坛内腌制7天左右即可食用。取出腌制好的泡菜后，可以再加入新鲜蔬菜继续腌制。陈泡菜汁可以缩短腌制时间？（发酵菌） 小思考：1.制作泡菜过程中，盐的作用是什么？ 在制作泡菜过程中，盐的作用是调味和抑制微生物生长若盐含量过低，则易造成细菌污染。 2.在泡菜腌制过程中,泡菜坛中冒出气体说明什么? 蔬菜上存在酵母菌,气泡是酵母菌等微生物进行细胞呼吸产生CO2形成的。 核心归纳：1．泡菜制作的注意事项 (1)材料的选择及用量 ①蔬菜应新鲜，若放置时间过长，蔬菜中的硝酸盐易被还原 成亚硝酸盐。（亚硝酸盐含量低） ②用盐和冷开水配制成6%的盐水。 (2)防止杂菌污染：每次取样用具要洗净，要迅速封口。 (3)氧气需求 ①泡菜坛要选择透气性差的容器，以创造无氧环境，有利于乳酸菌发酵，防止蔬菜腐烂。 ②将泡菜坛坛盖边沿的水槽内注满水，以保证坛内乳酸菌发酵所需的无氧环境，并注意在发酵过程中经常向水槽中补水 (4)控制适宜的温度：控制在室温即可，温度偏高有害菌活动能力强，温度偏低不利于乳酸发酵。 腌制过程中,要注意控制时间、温度和食盐用量,防止杂菌的大量繁殖和亚硝酸盐含量过高（亚硝酸盐含量的影响因素） (5)泡菜腌制及质量检测指标：成功的关键是营造无氧环境。检测指标有乳酸的含量、泡菜的色泽和风味，在初期发酵的末期和中期发酵阶段，泡菜的乳酸含量为0.4%～0.8%，风味品质最好，因此，常把这个阶段作为泡菜的成熟期。也可以在显微镜下观察乳酸菌形态，比较不同时期泡菜坛中乳酸菌的含量。 2、泡菜发酵过程中乳酸菌、乳酸和亚硝酸盐含量的变化 项目 乳酸菌 乳　酸 亚硝酸盐 初期 少(有氧气,乳酸菌活动受抑制) 少 增加(硝酸盐还原菌的作用) 中期 最多(乳酸抑制其他菌活动) 增多,pH下降 下降(硝酸盐还原菌受抑制,部分亚硝酸盐被分解) 后期 减少(乳酸继续积累,pH继续下降,抑制自身活动) 继续增,pH继续下降 下降至相对稳定(硝酸盐还原菌被完全抑制) 注意：亚硝酸盐是硝酸盐还原菌促进硝酸盐还原形成的，而 不是硝化细菌氧化氨形成的。 1. 发酵工程的基本过程 七、发酵工程 2. 发酵工业所使用的菌种需要满足以下5个条件 （1）应选择　　　　的菌种，使菌种的发酵产物中，需要的产物多，不需要的产物少。 （2）培养基来源充足且廉价，被转化的效率高。 （3）菌种发酵产物易于　　　　。 （4）菌种对环境没有明显或潜在的危害。 （5）菌种的遗传特性和生产能力　　　　。 选育　　　　　　的菌种是发酵工业的前提条件。 高产 分离 稳定 高产、优质 3. 发酵工程的应用 $$