3.2 基因工程的基本操作程序（第2课时）课件-2024-2025学年高二下学期生物人教版（2019）选择性必修3

韩国华城连环杀人案 南医大碎尸案 探究·实践 DNA片段的扩增及电泳鉴定 探究·实践 DNA片段的扩增及电泳鉴定 1.实验原理 (1)DNA片段的扩增 ①利用PCR可以在体外进行DNA片段的扩增。 ②PCR利用了DNA的热变性原理，通过调节温度来控制DNA双链的解聚与结合。 ③PCR仪实质上就是一台能够自动调控温度的仪器。一次PCR一般要经历30次循环。 (2)DNA片段的电泳鉴定 ①DNA分子具有可解离的基团，在一定的pH下，这些基团可以带上正电荷或负电荷。在电场的作用下，这些带电分子会向着与它所带电荷相反的电极移动，这个过程就是电泳。 ②PCR的产物一般通过琼脂糖凝胶电泳来鉴定。 在凝胶中DNA分子的迁移速率与凝胶的浓度、DNA分子的大小和构象等有关。凝胶中的DNA分子通过染色（EB染色），可以在波长为300nm的紫外灯下被检测出来。 PCR 的产物一般通过琼脂糖凝胶电泳来鉴定 凝胶电泳原理示意图 若电泳缓冲液使DNA带负电荷，加样孔侧应连电极的哪一极？负极 探究·实践 DNA片段的扩增及电泳鉴定 2.材料用具 (1)仪器 (2)用具 PCR 仪、微量离心管、微量移液器、一次性吸液枪头、电泳装置（包括电泳仪、电泳槽等） 4种脱氧核苷酸的等量混合液、2种引物、TaqDNA 聚合酶、模板 DNA 、扩增缓冲液、无菌水、电泳缓冲液、凝胶载样缓冲液、琼脂糖和核酸染料等。 PCR仪 用于向微量离心管中转移PCR配方中的液体，每吸取一种试剂后，其上的枪头都必须更换 一次性吸液枪头 电泳装置 微量离心管 探究·实践 DNA片段的扩增及电泳鉴定 3.方法步骤 (1) PCR加样操作 用微量移液器按右栏中配方或PCR试剂盒说明书，在 微量离心管中一次加入各组分。 PCR反应体系的配方 10倍浓缩的扩增缓冲液 5 μL 20 mmol/L的4种脱氧核苷酸的等量混合液 1 μL 20 μmol/L的引物Ⅰ 2.5 μL 20 μmol/L的引物Ⅱ 2.5 μL H2O 28～33 μL 1～5 U/μL的Taq DNA聚合酶 1～2 U 模板DNA 5～10 μL 总体积 50 μL 注：模板DNA的用量为1pg～1μg （注意：酶和缓冲液要在冰块上缓慢融化，用后置于-20℃冰箱中保存。一般分装成小份，避免反复融化导致活性降低甚至失活） 为保证加入反应体系中的各试剂体积的准确性，建议按照加入体积的大小，由大到小依次加入各试剂，即先加入无菌水。为保护酶的活性，一般最后加入DNA聚合酶。 探究·实践 DNA片段的扩增及电泳鉴定 (2)离心 (3)PCR 循环程序 变性 复性 延伸 预变性 94℃，5min 30次 94℃，30s 55℃，30s 72℃，1min 最后1次 94℃，1min 55℃，30s 72℃，10min 3.方法步骤 盖严离心管的盖子。放入离心机，离心10s，使反应液集中在离心管底部。 参照下表参数，设置好PCR仪的循环程序。将装有反应液的微量离心管放入PCR仪中进行反应。 使DNA充分变性，利于引物更好地与模板结合 使子链充分延伸 探究·实践 DNA片段的扩增及电泳鉴定 3.方法步骤 根据DNA片段大小，用电泳缓冲液配制适合浓度的琼脂糖溶液（一般质量分数为0.8%～1.2%）。琼脂糖用沸水浴或微波炉熔化，稍冷却加入适量核酸染料混匀。 将琼脂糖溶液倒入模具，并插入大小合适的梳子（以形成加样孔）。 待凝胶凝固后，将梳子拔出。 (4)制备凝胶 梳子孔为加样孔，加样孔侧连电极负极 探究·实践 DNA片段的扩增及电泳鉴定 3.方法步骤 (5)电泳加样 将凝胶放入电泳槽，加电泳缓冲液没过凝胶约1mm。将PCR扩增产物与凝胶载样缓冲液（内含有指示剂）混合，用微量移液器缓慢注入加样孔。留一个加样孔加入指示分子大小的标准参照物（Marker）。 (6)电泳 (7)观察、照相 接通电源，设定电压（一般1～5V/cm），待指示剂前沿迁移至接近凝胶边缘时，停止电泳。 电泳结束后，取出凝胶置于紫外灯下观察、照相。 探究·实践 DNA片段的扩增及电泳鉴定 DNA片段的扩增--PCR技术 用微量移液器按照PCR反应体系配方或PCR试剂盒的说明书，在微量离心管中依次加入各组分。 待所有组分都加入后，盖严离心管的盖子。将微量离心管放入离心机里，离心约10s，使反应液集中在离心管的底部 循环程序 变性 复性 延伸 预变性 940C，5min 30 次 940C, 30s 550C, 30s 720C，1min 最后一次 940C，1min 550C, 30s 720C，10min 移液 离心 扩增 探究·实践 DNA片段的扩增及电泳鉴定 DNA片段的电泳鉴定--电泳 根据待分离DNA片段的大小，用 配制琼脂糖溶液，一般配制质量体积比0.8%-1.2%的琼脂糖溶液。在沸水浴或微波炉内加热至琼脂糖熔化。稍冷却后，加入适量的 混匀。 将温热的琼脂糖溶液迅速倒入模具，并插入合适大小的梳子，以形成 。 将扩增得到的PCR产物与 混合，再用微量移液器将混合液缓慢注入凝胶的 内。留一个加样孔加入指示分子大小的 。 配制 琼脂糖溶液 制备 琼脂糖凝胶 加样 电泳观察 接通电源，根据电泳槽 来设定电压，一般为1～5V/cm。待 前沿迁移接近凝胶边缘时，停止电泳。取出凝胶置于 观察和照相。 核酸染料 加样孔 电泳槽 电泳缓冲液 凝胶载样缓冲液（内含指示剂） 加样孔 标准参照物（Marker） 阳极至阴极之间的距离 紫外灯下 指示剂 填充电泳槽 待凝胶溶液完全凝固，小心拔出梳子，取出凝胶放入 内。将 加入电泳槽中，电泳缓冲液没过凝胶1mm为宜。 电泳缓冲液 探究·实践 DNA片段的扩增及电泳鉴定 注意事项 1.为避免外源DNA等因素的污染，PCR实验中使用的微量离心管、枪头和蒸馏水等在使用前必须进行高压灭菌处理。 2.该实验所需材料可以直接从公司购买，缓冲液和酶应分装成小份，并在-20℃储存。使用前，将所需试剂从冰箱拿出，放在冰块上缓慢融化。 3.在向微量离心管中添加反应组分时，每吸取一种试剂后，移液器上的枪头都必须更换。 4.在进行操作时，一定要戴好一次性手套。 5. PCR扩增不能随意加大试剂用量。复性时不一定均为引物与DNA模板结合，也存在DNA解开的两条单链的结合，因此一般在PCR实验中引物的投入量远大于产物量（但不能随意加大浓度）； 加样孔→ 探究·实践 DNA片段的扩增及电泳鉴定 4.结果分析与评价 探究·实践 DNA片段的扩增及电泳鉴定 可在紫外灯下直接观察到DNA条带分布及粗细程度评价扩增结果。 1.你是否成功扩增出DNA片段？判断的依据是什么？ 进行电泳鉴定的结果应该是一条条带，该片段大小约为750bp。 （条带的分布代表扩增产物的类型；条带的粗细代表扩增产物量的多少）。 （1）未出现扩增条带的主要原因 3.通过电泳条带能否确定扩增产物一定是所需的 DNA 片段？为什么 不能；电泳条带仅能显示扩增片段大致长度，不能显示精准 DNA 碱基数量，也不能呈现碱基序列。 探究·实践 DNA片段的扩增及电泳鉴定 2.你进行电泳鉴定结果是几条条带？如果不止一条条带，可能原因？ （2）出现非特异性扩增条带的主要原因 ①模板DNA出现污染 ②引物设计不合理、特异性不强，与非目的序列有同源性或形成引物二聚体 ③Mg2＋浓度过高 ④复性时温度过低 ⑤DNA聚合酶质量不好 ⑥Mg2＋浓度过高等 ①Taq DNA 聚合酶失活 ②引物出现质量问题 ③Mg2＋浓度过低 ④变性时温度低，变性时间短。⑤漏加了PCR反应成分，各反应成分用量不当 ⑥PCR程序设置不当等 18 Lavf58.51.100 Lavf55.33.100 Multimedia Cloud Transcode (cloud.baidu.com) Lavf58.29.100 Bilibili VXCode Swarm Transcoder v0.4.17 Lavf58.51.100 Lavf58.51.100 Lavf58.29.100 Packed by Bilibili XCoder v2.0.2 $$