2025届高三生物二轮复习课件微专题-PCR引物的设计

微专题 PCR技术——引物的设计 1 深化点(一)　PCR技术及其应用 (一)PCR引物的特点与设计 1.PCR技术引物的作用与具备的特点 (1)PCR技术需要引物的原因 DNA聚合酶不能单独从头开始合成DNA,只能从一段DNA序列的3'端延伸DNA链,因此,DNA的复制需要引物。当引物与DNA母链通过碱基互补配对结合后,DNA聚合酶就能从引物的3'端开始延伸DNA链,因此DNA的合成方向总是从子链的5'端向3'端延伸。 深化点(一)　PCR技术及其应用 (一)PCR引物的特点与设计 1.PCR技术引物的作用与具备的特点 (2)PCR中使用的引物应具备的特点 ①引物能与DNA模板的碱基进行互补配对。 ②2种引物之间不能有互补的碱基序列,避免引物形成双链,导致扩增失败。 ③某一引物不能存在局部碱基序列互补配对,避免自身出现折叠配对,无法和模板DNA结合。 ④多数情况需要在2种引物的5'端添加不同限制酶识别的碱基序列,扩增出的DNA片段可以使用相应限制酶切割后与载体正向连接。 ⑤引物不能太短,以防扩增出非特异性DNA片段(非目的基因)。 2.PCR引物的设计和修饰 (1)PCR引物的设计原则 ①引物长度要适宜,用于PCR的引物长度通常为20~30个核苷酸。引物过长会导致其延伸温度提高,不适于Taq DNA聚合酶进行反应;引物过短特异性差,可导致引物与模板链随机结合。 ②引物内部应避免自身互补。引物自身不能有连续4个碱基的互补,以免形成发夹状结构,影响引物与模板的复性结合。 ③引物之间应避免互补。引物之间不能有连续4个碱基的互补,尤其应避免3'端的互补重叠,以防形成引物二聚体。 (2)引物的特异性和修饰 ①引物的特异性是指针对目标DNA片段设计出来的引物只能扩增出此目标DNA片段,而不能扩增出其他DNA片段。 ②引物5'端常见修饰包括:添加酶切位点、插入启动子、突变序列等。 在PCR反应中，延伸温度通常设定在略高于引物的Tm值的温度下进行。如果引物过长导致Tm值升高，那么为了保证引物与模板链的有效结合并顺利进行延伸反应，延伸温度也需要相应提高。 引物相关题目练习 1.引物的设计 (1)(2020·山东，25节选)通过PCR技术可在总cDNA中专一性的扩增出Wx基因的cDNA，原因是 _____________________________________________________。 引物是根据Wx基因的一段已知序列设计合成的 (或引物能与Wx基因的cDNA特异性结合) (2)(经典高考题节选)设计引物时需要避免引物之间发生_____________，而造成引物自连。同理也要避免引物之间的互补。复性温度的设定与引物长度、碱基组成有关，长度相同且____________的引物需要设定更高的复性温度。 碱基互补配对 G、C含量高 (3)若对PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，结果发现有两个或多个条带，从引物角度分析，原因可能是_____________________________。 引物过短导致引物的特异性下降 2.引物的修饰 (1)(2022·山东，25节选)某种类型的白血病由蛋白P引发，蛋白UBC可使P被蛋白酶识别并降解，药物A可通过影响这一过程对该病起到治疗作用。为探索药物A治疗该病的机理，需构建重组载体以获得融合蛋白FLAG－P和FLAG－PΔ。PΔ是缺失特定氨基酸序列的P，FLAG是一种短肽，连接在P或PΔ的氨基端，使融合蛋白能与含有FLAG抗体的介质结合，但不影响P或PΔ的功能。 ①为构建重组载体，需先设计引物，通过PCR特异性扩增P基因。用于扩增P基因的引物需满足的条件是____________________________________________________________，为使PCR产物能被限制酶切割，需在引物上添加相应的限制酶识别序列，该限制酶识别序列应添加在引物的______(填“3′端”或“5′端”)。 能与P基因模板链3′端的一段碱基序列互补配对的短单链核酸 5′端 ②PCR扩增得到的P基因经酶切连接插入载体后，与编码FLAG的序列形成一个融合基因，如图所示，其中“ATGTGCA”为P基因编码链起始序列。将该重组载体导入细胞后，融合基因转录出的mRNA序列正确，翻译出的融合蛋白中FLAG的氨基酸序列正确，但P基因对应的氨基酸序列与P不同。 据图分析，出现该问题的原因是 ___________________________________ _______________________________________________________________。修改扩增P基因时使用的带有EcoR Ⅰ识别序列的引物来解决该问题，具体修改方案是__________________________________________。 P基因编码链的第一个碱基与EcoR Ⅰ识别序列的最后两个碱基编码一个氨基酸，导致mRNA的密码子被错位读取 在引物中的EcoR Ⅰ识别序列3′端添加1个碱基 融合基因转录出的mRNA序列正确，翻译出的融合蛋白中FLAG的氨基酸序列正确，但P基因对应的氨基酸序列与P不同，说明P基因翻译时出错。由图可看出，在转录出的mRNA中，限制酶识别序列对应的最后两个碱基与P基因对应的第一个碱基构成一个密码子，导致读码框改变，翻译出的氨基酸序列改变，可通过在EcoR Ⅰ识别序列3′端添加1个碱基，使其碱基数目加上FLAG的碱基数目为3的倍数，这样能保证P基因转录出的mRNA上的读码框不改变，能够正常翻译。 (2)引物用PCR技术将DNA分子中的A1片段进行扩增，设计了引物Ⅰ、Ⅱ，其连接部位如图所示，X为某限制酶识别序列。扩增后得到的绝大部分DNA片段是图中的 √ 3.引物的结合方向 如图为X蛋白的部分基因序列，所示序列为引物结合的部分，据图分析： 扩增X蛋白基因所需的引物序列是____________________________； ______________________________。 5′-ATGCCGTAAGTCCTAC-3′ 5′-TGATCTACGGCTTACA-3′ 在第一次PCR循环结束后，得到以引物Ⅱ延长得到的单链。在以后的PCR循环中，以引物Ⅱ所形成的单链为模板在引物Ⅰ的作用下合成DNA时，引物Ⅱ上的X片段也被作为模板合成子链。因为两条引物间的片段以指数倍数扩增，实验结束得到的绝大部分DNA片段是选项中的D。 书写引物序列，一般从引物的5′端向3′端书写，避免误判。图中位于上方的模板链5′端磷酸基团在左侧，3′端羟基在右侧，可知与上方模板链配对的引物5′端在右侧，3′端在左侧，引物序为 5′-TGATCTACGGCTTACA-3′。同理推测另外一条引物的序列。 研究人员用无缝克隆技术（LIC技术）构建CAR基因表达载体如图，LIC技术依赖特定同源序列。 CAR基因两端序列如图所示，a链为编码链，PCR扩增目的基因时需要两种引物：F（左侧）、R（右侧），分别选用 （选项中为引物部分序列，方向为5’→3’）。 A.GATTAG......TGTTGG B.CCAACA......CTAATC C.TAGGTG......AGACCT D.AGGTCT......CACCTA AC 10 4.引物的选择 (2023·山东，25节选)科研人员构建了可表达J－V5融合蛋白的重组质粒并进行了检测，该质粒的部分结构如图甲所示，其中V 5编码序列表达标签短肽V5。 (1)构建重组质粒后，为了确定J基因连接到质粒中且插入方向正确，需进行PCR检测，若仅用一对引物，应选择图甲中的引物_________________。已知J基因转录的模板链位于b链，由此可知引物F1与图甲中J基因的_____(填“a链”或“b链”)相应部分的序列相同。 F1和R2(或F2和R1) a链 据图甲可知，引物F1与R2或F2与R1结合部位包含J基因的碱基序列，因此推测为了确定J基因连接到质粒中且插入方向正确，需进行PCR检测，若仅用一对引物，应选择图甲中的引物F1和R2或F2和R1。b是模板链，而根据图上启动子和终止子的位置可知转录方向是从左向右，对应的模板链方向应该是3′→5′，非模板链(a链)是5′→3′；考虑到DNA复制的方向是子链的5′→3′，引物延伸的方向也是5′→3′，所以引物结合的单链延伸方向是3′→5′；图中F1是前引物，在左侧，所以其配对的单链是3′→5′的b链，故其序列应该与a链相应部分的序列相同。 (2)重组质粒在受体细胞内正确表达后，用抗J蛋白抗体和抗V5抗体分别检测相应蛋白是否表达以及表达水平，结果如图乙所示。其中，出现条带1证明细胞内表达了_______________，条带2所检出的蛋白______(填“是”或“不是”)由重组质粒上的J基因表达的。 J－V5融合蛋白 不是 重组质粒在受体细胞内正确表达后，用抗J蛋白抗体和抗V5抗体分别检测相应蛋白是否表达以及表达水平。分析题图可知，用抗J蛋白抗体和抗V5抗体检测后，均有条带1，说明细胞内表达了J－V5融合蛋白。用抗J蛋白抗体检测后，出现条带2，而用抗V5抗体检测后，没有出现条带2，说明条带2所检出的蛋白不是由重组质粒上的J基因表达的。 为鉴定筛选出的菌落中是否含有正确插入目的基因的重组质粒，拟设计引物进行PCR鉴定。图中A所示为甲、乙、丙3条引物在正确重组质粒中的相应位置，PCR鉴定时应选择的一对引物是________。 5.利用PCR技术鉴定目的基因的连接方式 乙和丙 目的基因反向连接 某学生尝试用图中另外一对引物从某一菌落的质粒中扩增出了400 bp片段，原因是__________________。 如图A所示，如果用引物乙和丙，若正确连接则会产生350 bp片段，反向连接则不会出现；同理，若用引物甲和丙，无论正向连接还是反向连接均会产生450 bp片段。根据图B进行分析，若采用引物甲和乙，目的基因反向连接会扩增出400 bp片段。 $$