2025届高三生物二轮复习课件微专题-PCR技术的延申

微专题 PCR技术的延申 1 1.RT-PCR技术 (1)过程：逆转录PCR(RT-PCR)一般分为两步，先以mRNA为模板,在逆转录酶的催化下合成cDNA的第1条链，再以第1条链为模板做常规PCR，从而获得双链cDNA分子。 (2)应用：逆转录PCR可从mRNA出发获取目的基因，也可以研究基因的表达情况，实时荧光定量RT-PCR还可用于病毒定量检测。 荧光探针法:是临床检测中最常用的检测方法。PCR扩增时，加入一对引物的同时再加入一个特异性的荧光探针。该探针是一个寡核苷酸，5′端标记一个荧光报告基团(Reporter，R)，3′端标记一个淬灭基团(Quencher，Q)。 当探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收，以至于无法检测到荧光信号； 而当PCR扩增时(在延伸阶段)，探针会被Taq酶的5′→3′外切酶活性酶切降解，使报告基团和淬灭基团分离，报告基团发射底的荧光不会再被吸收，从而可以在荧光监测系统接收到荧光信号，即每扩增一条DNA，就形成一个荧光分子，PCR产物越多，荧光信号累积的越多，荧光强度越大。 荧光定量PCR仪能够监测出荧光到达预先设定阈值的循环数(Ct值)与病毒核酸浓度有关，病毒核酸浓度越高，Ct值越小。Ct>40或无Ct值判定为阴性。 2）带荧光标记的探针，其___端带有荧光物质，在延伸阶段，通过检测反应体系中的_________，可以达到检测________________的目的。 [新冠热点题型] 荧光定量PCR是一种在PCR反应体系中加入荧光标记的探针，利用荧光信号的积累，对整个PCR进程进行检测，最后对PCR产物扩增量进行定量分析技术。作用原理如下图所示： 1）据图分析，TaqDNA聚合酶的作用有：________________（答两点） 催化DNA的合成（子链延伸）、分解与模板杂交的荧光探针 5' 荧光强度 PCR产物扩增量 [新冠热点题型] 荧光定量PCR是一种在PCR反应体系中加入荧光标记的探针，利用荧光信号的积累，对整个PCR进程进行检测，最后对PCR产物扩增量进行定量分析技术。作用原理如下图所示： 3）若运用该技术检测COVID-19 （新冠病毒）的核酸，图中所示 模板DNA来源于_____________________________________________； 以COVID-19的RNA为模板逆转录合成DNA 设计与新冠病毒（COVID-19）的基因片段碱基互补配对的序列 为精确定位并复制新冠病毒基因，设计引物和荧光标记的探针时应该遵循的思路是______________________________________ 下列有关叙述正确的是（ ） A.每个模板DNA分子含有2个游离的磷酸基团 B.做qPCR之前，需要先根据目的基因的核苷酸序列合成1种引物和1种Taqman探针 C.在反应过程中，需要细胞中的ATP为新链的合成提供能量 D.荧光信号达到设定的阈值时，经历的循环数越少，说明含有的病变的概率越小 A 1对引物 dNTP 大 DNA分子为反向平行的两条链，每条链都含有1个游离的磷酸基团，则一个DNA分子含有2个游离的磷酸基团，A正确； 做qPCR之前，需要先根据目的基因的核苷酸序列合成1对引物和1种Taqman探针，B错误； 在反应过程中，dNTP为新链的合成提供能量，C错误； 若荧光信号达到设定的阈值时，经历的循环数越少，说明扩增次数越少，说明更多的荧光探针与目的基因进行了碱基互补配对，可推测获得的核酸产物中含有病变的概率越大，D错误。 2.重叠延伸PCR技术 重叠PCR是采用具有 互补末端的引物,使PCR产物形成了重叠 链,从而在随后的扩增反应中通过重叠链的 延伸,将不同来源的扩增片段重叠拼接起来的技术,主要应用于基因的定点突变与基因拼接,基本过程如图所示: (2023·山东泰安模拟预测)通过设计引物，运用PCR技术可以实现目的基因的定点诱变。下图为基因工程中获取突变基因的过程，其中引物1序列中含有一个碱基T不能与目的基因片段配对，但不影响引物与模板链的整体配对，反应体系中引物1和引物2的5′端分别设计增加限制酶a和限制酶b的识别位点。下列有关叙述正确的是(　) A．在PCR反应体系中还需要加入4种游离脱氧核苷酸、解旋酶、Taq酶等 B．第3轮PCR结束后，含突变碱基对且两条链等长的DNA占1/2 C．引物中设计两种限制酶识别位点有利于目的基因定向插入载体 D．第2轮PCR，引物1能与图中②结合并且形成两条链等长的突变基因 C 1/4 ②较长 PCR反应体系通过高温使DNA解旋(变性)，不需要加入解旋酶，A错误；第3轮PCR结束后，含突变碱基对且两条链等长的DNA有2个，而总DNA分子有8个，所以占1/4，B错误；引物中设计两种限制酶识别位点，可以使目的基因定向插入限制酶切割后的载体，C正确；第2轮PCR，引物1能与图中②结合并且形成两条链不等长的突变基因，其中②较长，D错误。 ①该过程需要______种引物； ②PCR1的产物AB是引物___和引物___扩增的结果； ③PCR2的产物CD是引物___和引物___扩增的结果； ④产物AD的形成需要引物吗？___________________________________ 4 a b c d 不需要，但需要耐高温的DNA聚合酶 10 ⑤需要改变的碱基位于引物___和引物___上 ⑥引物b和引物c之间有什么关系？____________________________ ⑦PCR3中突变产物AD的扩增需要引物___和引物___ b c 引物b和引物c应有部分碱基互补的关系 a d 11 ③进行第三次PCR时（图中PCR3 ）________（填“需要”或“不需要”）加入上述 引物A∼D ，引物（理由）是 。 不需要 PCR1和PCR2的产物退火以后已经形成类似引物作用的3^′端，可以在DNA聚合酶的作用下直接延伸 12 2.科学家将抗人大肠癌单克隆抗体基因(ND -1)与酵母胞嘧啶脱氨酶基因(CD)融合,在大肠杆菌中成功地表达了单链抗体与酶的融合蛋白,这类蛋白的疗法称为由抗体介导的酶解前药疗法(ADEPT)。ND -1—CD融合基因的构建方法如图所示。下列有关叙述错误的是 (　　) A.图中两条杂交链的获得至少需要经过1次扩增循环 B.图中杂交链延伸成ND -1—CD融合基因的过程不需要添加引物 C.PCR反应体系中须加入耐高温的 DNA聚合酶,该酶主要在延伸过程 起作用 D.该融合蛋白应是利用抗体部分特 异性地识别人大肠癌细胞并将酶带 到靶部位 A 2 解析:经过一次循环得到的杂交链,引物P2端和引物P3端都为相应链的5'端,不可直接延伸子链,为了使杂交链顺利延伸子链,至少需要经过2次循环才能得到如图所示的引物P2端和引物P3端都为相应链的3'端杂交链,A错误;杂交链延伸生成ND -1—CD融合基因的过程中,不需要加入引物,两条母链的起始位置的碱基序列即为引物,可以作为子链合成的引物,为DNA聚合酶提供3'端,B正确;PCR反应体系中须加入耐高温的DNA聚合酶,该酶主要在延伸过程起作用,即催化DNA在高温条件下进行复制,C正确;抗体可以特异性识别抗原成分,故该融合蛋白应是利用抗体部分特异性地识别人大肠癌细胞并将酶带到靶部位,D正确。 3.(2024·济宁三模)PCR技术的实用性和极强的生命力使其成为生物科学研究的一种重要方法,极大地推动了分子生物学以及生物技术产业的发展。下面是两个具体实验中的PCR技术应用,请根据资料回答下列问题: (1)重叠延伸PCR技术是一种通过寡聚核苷酸链之间重叠的部分互相搭桥、互为模板,通过多次PCR扩增,从而获得目的基因的方法。利用该技术可以实现基因的定点诱变。它在需要诱变的位置合成两个带有变异基因碱基的互补引物,然后分别与引物a和引物d做PCR,这样得到的两个PCR引物产物都带有变异基因,并且彼此重叠,再将重叠部位进行重组PCR就能得到诱变PCR产物,如图所示: ①PCR扩增DNA的过程中,引物a、b、c、d中,PCR1应选择图1中引物_____,大量扩增突变产物AD则应选择引物_____。  ②重叠延伸PCR通过___________________________实现定点突变。PCR1和PCR2需要分别进行的原因是_________________________。  a和b a和d 在引物b和c上引入突变碱基 引物b和引物c可以互补配对,导致引物失效　 ③若正常基因可被限制酶DpnⅠ识别并切割,特定位点突变后的基因不能被DpnⅠ识别,请设计实验思路鉴定上述过程获得的突变产物AD是否为突变基因: 用限制酶DpnⅠ分别处理正常基因和上述过程获得的突变产物AD,然后进行电泳;若上述过程获得的突变产物AD的电泳条带只有一条且大于正常基因的电泳条带,则为突变基因　 解析:①PCR扩增DNA的过程中,新合成的两条单链延伸方向相反,根据图中引物的方向可知,PCR1应选择引物a和b,得到产物AB。PCR2应选择引物c和d,得到产物CD。重叠延伸时,可以分别以AB上链和CD下链为引物进行延伸,所以不需要引物。突变产物AD扩增选择的引物是a和d。 ②重叠延伸PCR通过在引物b和c上引入突变碱基实现定点突变,引物b和c分别和第一代DNA的两条单链的对应碱基互补,则在同一PCR中引物b和引物c可以互补配对,导致引物失效,所以PCR1和PCR2需要分别进行。 ③实验设计思路见答案。 3.反向PCR技术 反向PCR技术是根据DNA片段中间的已知序列设计引物,扩增已知序列两侧的未知序列。扩增思路:先从未知序列的两侧把DNA切成片段,然后通过DNA连接酶将DNA片段环化;再利用已知序列的两端设计引物,只不过引物相对于已知序列是反向配置的,所以子链反向延伸(如图)。 (2)反向PCR可用于扩增未知序列,其原理如下图所示。下图链状DNA分子内侧是已知序列,外侧为未知序列。 ①不直接在图2中DNA分子的两端设计引物并进行扩增,原因是___________。  DNA两端序列未知,无法设计引物 ②图3中环状DNA进行PCR的过程中,沿引物A延伸子链的延伸方向是________ (填“顺时针”或“逆时针”),PCR产物______ (填“含有”或“不含”)EcoRⅠ的酶切位点。  逆时针 含有 解析:①利用PCR技术扩增目的基因的前提是要有一段已知目的基因的核苷酸序列作为引物,由于该DNA分子两端的脱氧核苷酸序列未知,故无法设计引物,所以不能直接在图2中DNA分子的两端设计引物并进行扩增。 ②据图中未知序列的位置可知,图3中环状DNA进行PCR的过程中,沿引物A逆时针延伸子链,沿引物a顺时针延伸子链,才能扩增到未知序列,由于碱基互补配对,环化后的DNA分子含有EcoRⅠ的切割位点,则PCR产物含有EcoR Ⅰ 的酶切位点。 (1)如表所列为已知的DNA序列和设计的一些PCR引物，步骤Ⅲ选用的引物必须是________。 名称 DNA序列(虚线处省略了部分核苷酸序列) 已知序列 5′-AACTATGCGCTCATGA－－－GCAATGCGTAGCCTCT-3′ 3′-TTGATACGCGAGTACT－－－CGTTACGCATCGGAGA-5′ 引物 ①5′-AACTATGCGCTCATGA-3′ ②5′-GCAATGCGTAGCCTCT-3′ ③5′-AGAGGCTACGCATTGC-3′ ④5′-TCATGAGCGCATAGTT-3′ ②④ 由于已知序列的外侧是未知序列(如图中待扩增的未知序列)，因此无法设计引物。若要分析出已知序列两侧的未知序列，设计引物是关键，可以采用反向PCR技术。反向PCR的操作步骤可以分为两步。第一步是连接成环，即用限制酶切割DNA，用DNA连接酶将其连接成环，即图中Ⅰ酶切和Ⅱ连接过程。 第二步是反向扩增，即根据已知序列设计一对引物，以环状DNA两条链为模板，从已知序列向未知序列方向进行反向扩增，利用Taq DNA聚合酶无法将DNA连接成环的特点，得到链状DNA，即图中Ⅲ扩增过程。采用反向PCR扩增未知序列，又因子链的延伸方向从5′→3′，可根据已知序列3′-AGTACTCGCGTATCAA-5′和 3′-CGTTACGCATCGGAGA-′5，设计对应PCR引物是5′-TCATGAGCGCATAGTT-3′和5′-GCAATGCGTAGCCTCT-3′， (2)对产物测序，经分析得到了片段F的完整序列。下列单链序列中(虚线处省略了部分核苷酸序列)，结果正确的是______。 A.5′-AACTATGCG－－－AGCCCTT-3′ B.5′-AATTCCATG－－－CTGAATT-3′ C.5′-GCAATGCGT－－－TCGGGAA-3′ D.5′-TTGATACGC－－－CGAGTAC-3′ B 对产物测序，得到片段F的完整序列，因为片段F是被限制酶EcoR Ⅰ剪切的两端，所以5′端应该是AATTC，对应F片段的开头，故选B。 4.巢式PCR技术 利用两套引物进行两轮PCR扩增。首先利用第一对引物(外引物)对目的基因所在的DNA进行第一轮扩增(经过15~30次循环),第二轮扩增以第一轮扩增产物为模板,利用第二对引物(内引物或巢式引物)结合在第一轮扩增产物内部,经过15~30次循环,获得第二轮扩增片段(即目的基因),最终第二轮扩增片段短于第一轮,基本过程如图所示: 4.巢式PCR技术 优点： 提高特异性： 第一轮PCR使用一对外引物进行扩增，这些引物与模板DNA进行非特异性配对，可能导致非特异性产物的产生。 第二轮PCR使用一对内引物（巢式引物），这些引物位于第一轮PCR产物的内部，只能与正确扩增的产物结合，从而大大降低了非特异性扩增的可能性。 增强灵敏度： 第二轮PCR的扩增产物通常较短，这意味着它可以从低拷贝的起始DNA样本中扩增出更多的产物，从而克服了单次PCR扩增的灵敏度限制。通过两轮PCR，可以从有限的起始DNA中扩增得到足量的产物，这对于从低浓度的DNA样本中检测目标基因非常重要。 2.巢式 PCR 是指先后用外内引物扩增目的基因的方法。其原理为:先以比目的基因大的 DNA 片段为模板用外引物(F1，R1)进行扩增，获得大量含目的基因的中间产物，再以扩增后的中间产物为模板，用内引物(F2，R2)扩增目的基因，如图所示。下列说法错误的是( ) A.两对引物的碱基序列不相同， 但均应为单链 DNA片段 B.第二轮 PCR 反应能否进行，是 对第一轮 PCR 反应正确性的鉴定 C.由于和两套引物都互补的靶序 列较少，该技术可大大提高扩增的特异性 D.如果两套引物一起加入反应体系 中，外引物的复性温度应显著低于 内引物 D 高于，更长 向导RNA 它的部分序列通过碱基互补配对原则，与目的基因中希望被编辑的DNA序列相结合，sgRNA可以指导Cas蛋白对靶基因进行敲除、插入和突变修饰。 核酸酶Cas9 CRISPR/Cas9是一种基于细菌天然免疫机制开发的基因编辑技术。经简化改造的CRISPR系统由核酸内切酶Cas9和sgRNA两部分组成。 CRISPR/Cas9基因编辑技术及其应用 一种来自细菌的核酸内切酶功能Cas9sg在sgRNA引导下，切割与“向导”RNA结合的DNA，使DNA双链断裂(磷酸二酯键)。如Cas9识别的PAM是5'-NGG-3'(N表示任意核苷酸) CRISPR/Cas9系统 向导RNA 核酸酶Cas9 CRISPR/Cas9基因编辑技术及其应用 4.(2024·德州二模)CRISPR/Cas9基因编辑技术能对基因进行定点编辑,其原理如图1所示。科研人员根据猪的细胞表面抗原基因RAG1的启动子设计了sgRNA1和sgRNA2,并利用CRISPR/Cas9基因编辑技术获得了两种基因敲除猪,检测基因敲除猪体内的RAG1表达情况如图2所示。下列说法错误的是 ( 　) A.CRISPR/Cas9识别目标DNA序列主要与sgRNA序列的特异性相关 B.基因敲除猪的细胞表面抗原减少,器官移植过程中免疫排斥作用减弱 C.两种sgRNA都可引导Cas9在转录水平上减弱RAG1的表达 D.据图2可知,用 sgRNA2制备的 基因敲除猪用于 器官移植效果更好 D 解析:CRISPR/Cas9识别目标DNA序列主要与sgRNA编码序列有关,即主要与sgRNA序列的特异性相关,A正确;猪的细胞表面抗原会导致器官移植时发生免疫排斥,基因敲除猪的细胞表面抗原减少,器官移植过程中免疫排斥作用减弱,提高器官移植的成功率,B正确;启动子是RNA聚合酶识别与结合的位点,用于驱动基因的转录,科研人员根据猪的细胞表面抗原基因RAG1的启动子设计了sgRNA1和sgRNA2,故两种sgRNA都可引导Cas9在转录水平上减弱RAG1的表达,C正确;据图2可知,与对照组相比,用sgRNA1制备的基因敲除猪RAG1表达更低,说明用sgRNA1制备的基因敲除猪用于器官移植效果更好,D错误。 5.PMP22基因在人基因组中有多个拷贝，表达产生的PMP22蛋白在人髓鞘细胞中不可或缺，但PMP22蛋白过量可引发腓骨肌萎缩症(CMT1A)，科研人员希望利用CRISPR/Cas9基因编辑系统治疗CMT1A。回答下列问题： (1)CRISPR/Cas9基因编辑系统原理如图1所示，Cas9蛋白可切割特定部位的DNA双链，造成DNA损伤，一次切割过程中会产生____个游离的磷酸基团。机体修复DNA损伤时，可能会改变碱基序列。图中gRNA的作用是___________ ________________________。 2 定向引导Cas9蛋白与靶向基因结合 (2)科研人员本来的基因编辑方案是将gRNA结合位点设计在PMP22基因内部，后改为如图2所示的方案，该方案比起原方案的优点是: 既能专一性切除多余的PMP22基因，又能确保必要的PMP22基因不被破坏，比破坏PMP22基因结构更可靠 (3)科研人员希望在人髓鞘细胞中表达CRISPR/Cas9基因编辑系统，构建的基因表达载体如图3所示。 ①在对gRNA对应的DNA片段进行PCR扩增时，需要在上游和下游引物的5′端分别添加碱基序列_________________和__________________，保证DNA片段定向插入。 ②基因表达载体上，除了图示序列和标记基因外，还需要的序列是_________。 5′－GTCGAC－3′ 5′－GGATCC－3′ Cas9基因 为保证不破坏复制原点，DNA上游需添加Sal Ⅰ的识别序列；由于Xho Ⅰ与Sal Ⅰ为同尾酶，为避免目的基因与载体任意连接，DNA下游需添加BamH Ⅰ的识别序列。 5.(2024·山东高考)研究发现基因L能够通过脱落酸信号途径调控大豆的逆境响应。利用基因工程技术编辑基因L,可培育耐盐碱大豆品系。在载体上的限制酶BsaⅠ切点处插入大豆基因L的向导DNA序列,将载体导入大豆细胞后,其转录产物可引导核酸酶特异性结合基因组上的目标序列并发挥作用。载体信息、目标基因L部分序列及相关结果等如图所示。 (1)用PCR技术从大豆基因组DNA中扩增目标基因L时,所用的引物越短,引物特异性越___(填“高”或“低”)。限制酶在切开DNA双链时,形成的单链突出末端为黏性末端,若用BsaⅠ酶切大豆基因组DNA,理论上可产生的黏性末端最多有__种。载体信息如图甲所示,经BsaⅠ酶切后,载体上保留的黏性末端序列应为5'-________-3'和5'-________-3'。  低 44 GTTT CAAT 解析:引物的长短会影响其在目标DNA序列上的结合能力和特异性。引物过短可能导致非特异性扩增,即引物可能会结合到与目标序列不完全匹配或无关的DNA上,进而导致非特异性产物的形成,影响PCR的特异性和准确性。结合BsaⅠ识别序列可知,BsaⅠ酶切后产生的黏性末端含有4个碱基,故若用BsaⅠ酶切大豆基因组DNA,理论上可产生的黏性末端最多有4×4×4×4=44(种)。根据图甲所示的载体信息,经BsaⅠ酶切后,载体上保留的黏性末端序列应为5'-GTTT-3'和5'-CAAT-3'。 (2)重组载体通过农杆菌导入大豆细胞,使用抗生素__________筛选到具有该抗生素抗性的植株①~④。为了鉴定基因编辑是否成功,以上述抗性植株的DNA为模板,通过PCR扩增目标基因L,部分序列信息及可选用的酶切位点如图乙所示,PCR产物完全酶切后的电泳结果如图丙所示。据图可判断选用的限制酶是_______,其中纯合的突变植株是_____ (填序号)。  卡那霉素 SacⅠ ④ 解析:引物的长短会影响其在目标DNA序列上的结合能力和特异性。引物过短可能导致非特异性扩增,即引物可能会结合到与目标序列不完全匹配或无关的DNA上,进而导致非特异性产物的形成,影响PCR的特异性和准确性。结合BsaⅠ识别序列可知,BsaⅠ酶切后产生的黏性末端含有4个碱基,故若用BsaⅠ酶切大豆基因组DNA,理论上可产生的黏性末端最多有4×4×4×4=44(种)。根据图甲所示的载体信息,经BsaⅠ酶切后,载体上保留的黏性末端序列应为5'-GTTT-3'和5'-CAAT-3'。 解析:根据图甲可知,重组载体通过农杆菌导入大豆细胞当中的片段包含了卡那霉素抗性基因,因此可以通过使用卡那霉素筛选到具有该抗生素抗性的植株。根据图乙、丙可知,目标基因L的目标序列跟突变序列之间的差异只有在SacⅠ酶切位点上存在差异,BamHⅠ和EcoRⅠ这两个酶切位点完全相同,结合电泳结果可知,只能选用限制酶SacⅠ酶切PCR产物;限制酶SacⅠ在突变序列存在酶切位点,但是目标序列没有,因此经过该酶酶切后突变序列的电泳条带会出现两条,目标序列是一条带,根据图丙的电泳结果可知,只有④为纯和突变的植株。 (3)实验中获得1株基因L成功突变的纯合植株,该植株具有抗生素抗性,检测发现其体细胞中只有1条染色体有T-DNA插入。用抗生素筛选这个植株的自交子代,其中突变位点纯合且对抗生素敏感的植株所占比例为_____,筛选出的敏感植株可用于后续的品种选育。  1/4 设基因L突变为基因L',则该株基因L成功突变的纯合植株的基因型为L'L',由题中信息知,一条染色体插入了T-DNA,若其插入了L'所在染色体,其所在染色体记为L'1,则其自交子代的基因型及比例为L'1L'1∶L'1L'∶L'L'=1∶2∶1。 得到敏感型品种的原因是不具有卡那霉素抗性基因，也就没有向导DNA序列和核酸酶基因，目的是去除基因编辑工具，因为工具已经完成了使命。 解析:设基因L突变为基因L',则该株基因L成功突变的纯合植株的基因型为L'L',由题中信息知,一条染色体插入了T-DNA,若其插入了L'所在染色体,其所在染色体记为L'1,则其自交子代的基因型及比例为L'1L'1∶L'1L'∶L'L'=1∶2∶1。若用抗生素筛选这个植株的自交子代,筛选出来的子代中突变位点纯合且对抗生素敏感的植株(L'L')所占的比例为1/4。若其插入了其他染色体,所得结果相同。 拓展：Cre/LoxP重组酶系统基因编辑 Cre-LoxP系统是一种重组酶系统，能在DNA特定位点上执行删除、插入、易位及倒位，是一种广泛应用的基因编辑工具，可以达到在基因水平上对生物体进行定向遗传改造的目的，在真核和原核系统中均适用。 (1)Cre重组酶：由噬菌体P1的Cre基因编码，具有限制酶特性，能够特异性识别LoxP位点。能介导两个LoxP位点间的基因序列被删除或重组。 (2)LoxP序列：来源于P1噬菌体，包括两个13 bp的反向重复序列和一个8 bp的间隔区域，反向重复序列是Cre重组酶的特异识别位点，而间隔区域决定了LoxP位点的方向。 33 拓展：Cre/LoxP重组酶系统基因编辑 (1)Cre重组酶：由噬菌体P1的Cre基因编码，具有限制酶特性，能够特异性识别LoxP位点。能介导两个LoxP位点间的基因序列被删除或重组（具有DNA内切酶和DNA连接酶的活性）。 (2)LoxP序列：来源于P1噬菌体，包括两个13 bp的反向重复序列和一个8 bp的间隔区域，反向重复序列是Cre重组酶的特异识别位点，而间隔区域决定了LoxP位点的方向。 34 拓展：Cre/LoxP重组酶系统基因编辑 (3)①同向LoxP：如果两个LoxP位点位于一条DNA链上，且方向相同，Cre重组酶能有效切除两个LoxP位点间的序列，仅保留一个LoxP。 ②反向LoxP：如果两个LoxP位点位于一条DNA链上，但方向相反，Cre重组酶能导致两个LoxP位点间的序列倒位。 35 1.Cre-Loxp系统是基因工程中常用的特异性重组酶系统，该系统中的Cre酶能根据两个Loxp的方向删除或倒置位于两个Loxp序列间的基因，如图1所示。现使用Cre-Loxp系统构建TK基因缺失的病毒毒株，为研发该病毒的疫苗提供候选毒株，构建过程如图2所示，下列分析错误的是（    ） A．图1中Gene两端需含有两个相同的 碱基序列 B．位于RFP基因两端的Loxp序列方向相反 C．Cre酶处理之前，应初步筛选出有红色荧光基因的病毒 D．Cre酶在图2过程中的具有限制酶和DNA连接酶的功能 B 36 2.（2024·浙江杭州二模）Cre-loxP是一种常用的基因改造工具，Cre基因的表达产物是Cre酶，loxP是一段DNA序列。当Cre酶遇到两段loxP序列时，能将两段loxP序列中间的序列删除。甲为Cre基因的杂合个体（全身各细胞均表达Cre基因），乙是含外源基因D的纯合个体（D基因两端带有loxP序列），两种基因在染色体上的分布如图所示。现将甲和乙杂交，得到的F1自由交配，则F2中含D基因的个体的比例为（　 　） A.1/4      B.3/8       C.5/16       D.9/32 C 解析：结合题意可知，现有甲基因型记作CO（杂合子，一条染色体不含Cre基因），乙基因型可记作DO，两者交配，则F1的基因型及比例为1/4DC、1/4CO、1/4DO、1/4OO，故F1产生的配子种类及比例为1/4C、1/4D、2/4O，根据棋盘法可知，F1之间随机交配所得F2中，含有D的个体有1/16DC、1/16DD、4/16DO，又因为Cre酶能将两个loxP序列之间的序列删除，故1/16DC重组后不含D基因，则含有D的比例为1/16DD＋4/16DO＝5/16，C正确。ABD错误。故答案为C。 37 拓展：In－Fusion技术 以In-Fusion为代表的新型克隆方式，与传统的“限制性内切酶酶切-DNA连接酶连接”的克隆方法不同，是一种基于同源重组原理的分子克隆方法。 In-Fusion克隆在引物两头加上的是一段15~20 bp来自载体酶切位点两侧的同源序列。当带有载 体同源序列的PCR产物和线性化 之后的载体混合在一起后，由于 发生了同源重组交换，需要克隆 的片段就自动连上载体了。该技 术的关键是要在目的基因两端构 建与线性化质粒末端相同的 DNA序列(即同源序列，通常为1520bp) 38 (1)质粒构建过程：①质粒线性化；②PCR扩增出两端含线性化质粒同源序列的目的基因； ③目的基因与线性化质粒同源区域在In-Fusion酶的作用下形成重组质粒； ④将重组质粒导入受体细胞。 39 研究人员用无缝克隆技术（LIC技术）构建CAR基因表达载体如图，LIC技术依赖特定同源序列。 CAR基因两端序列如图所示，a链为编码链，PCR扩增目的基因时需要两种 引物：F（左侧）、R（右侧），分别选用 （选项中为引物部分序列，方向为5’→3’）。 A.GATTAG......TGTTGG B.CCAACA......CTAATC C.TAGGTG......AGACCT D.AGGTCT......CACCTA AC 40 融合PCR技术是采用具有互补末端的引物，将不同来源的扩增片段连接起来的方法，其过程如图1所示。图2是中间载体1和中间载体2(利用融合PCR技术构建成)构建成叶绿体定点整合表 达载体示意图(限制酶酶切位点标注于载体外侧)，叶绿体定点整合表达载体通过与叶绿体基因的同源重组，将目的基因整合于叶绿体DNA上的特定位点上。请据图回答下列问题： (1)图1第一阶段中PCR至少进行___次循环，才能获得双链等长的DNA，第二阶段中引物2与引物3部分碱基的__________关系使得两DNA能成功“搭桥”连接起来。 2 互补配对 (2)若通过融合PCR技术将启动子、标记基因、目的基因、终止子拼接起来，需要设计_____种引物，其中能够起着“搭桥”作用的引物有____种。 8 6 分析图1可知，在第一阶段中，利用PCR技术进行第一次扩增(循环)，得到的含有引物2、引物3的产物，其DNA双链不等长，该产物继续进行第二次扩增(循环)，才能获得双链等长的DNA。第二阶段中引物2与引物3部分碱基的互补配对关系使得两DNA能成功“搭桥”连接起来。 图1显示：通过融合PCR技术，每一次将两个DNA片段拼接起来，需要4个引物，其中有2个起着“搭桥”作用。依此类推，若通过融合PCR技术将启动子、标记基因、目的基因、终止子拼接起来，需要设计8种引物，其中能够起着“搭桥”作用的引物有6种。 (3)图2中需使用______________(填限制酶)和DNA连接酶将两中间载体构建成定点整合表达载体，途中定点整合表达载体上未标出的结构是__________。 Spe Ⅰ、Sal Ⅰ 复制原点 图2显示：启动子和终止子的两端分别有Spe Ⅰ和Sal Ⅰ的识别位点，叶绿体同源重组基因1与2之间也存在Spe Ⅰ和Sal Ⅰ的识别位点，因此图2中需使用Spe Ⅰ、Sal Ⅰ和DNA连接酶将两中间载体构建成定点整合表达载体，图中定点整合表达载体上未标出的结构是复制原点。 $$