3.2基因工程的基本操作程序课件-2024-2025学年高二下学期生物人教版选择性必修3（第二课时）

第3章 第2节 1 第二步：基因表达载体的构建 二/ 第一步：目的基因的筛选与获取 一/ 第三步：将目的基因导入受体细胞 三/ 第四步：目的基因的检测与鉴定 四/ DNA 片段的扩增及电泳鉴定 五/ 一 基因表达载体的构建 思考：如何获得一只荧光鱼 基因工程的操作步骤 1.目的基因的筛选与获取 2.基因表达载体构建 （核心） 3.将目的基因导入受体细胞 4.目的基因的检测和鉴定 任务一：基因表达载体的构建 活动1：构建gfp基因的表达载体 问题1：为什么构建gfp基因的表达载体？ ①直接将生物的所有DNA导入受体，针对性差，无法确定是否导入受体细胞 根据阅读获得的信息，思考下列问题： ②目的基因导入受体，往往会被细胞分泌的酶分解消化掉，不能表达 ③目的基因游离的DNA片段无法随着细胞的分裂进行复制，导致子代细胞不含有该基因 ④目的基因不含有表达元件，如启动子、终止子等，无法直接表达 一 基因表达载体的构建 任务一：基因表达载体的构建 活动1：构建gfp基因的表达载体 问题2：表达载体由哪些元件组成？ 复制原点 根据阅读获得的信息，思考下列问题： 复制 原点 标记基因 Xba Ⅰ Hind Ⅲ BamH Ⅲ Sma Ⅰ 启动子 标记基因 多克隆位点：多个限制酶切点 启动子 终止子 终止子 一 基因表达载体的构建 一 基因表达载体的构建 1：表达载体 (1)：表达载体组成 ①启动子 本质： 特殊序列结构的DNA片段 位置：基因上游 功能： RNA聚合酶识别和结合的部位，驱动基因转录出mRNA，最终表达出来需要蛋白质 特性：对于多细胞受体生物，具有物种特异性和基因表达的组织细胞特异性 限制酶切割位点 一 基因表达载体的构建 1：表达载体 (1)：表达载体组成 ①启动子 诱导型启动子 根据需要为目的基因加上受某种物质或者环境因素影响而诱导表达的启动子，使目的基因在受体生物细胞中的表达受到控制。 如：雌激素诱导启动子 限制酶切割位点 一 基因表达载体的构建 1：表达载体 (1)：表达载体组成 ①启动子 不同类型启动子 组成型启动子（一直干活） 限制酶切割位点 组织特性启动子（特定组织中干活） 诱导型启动子（特定诱导物下干活） 一 基因表达载体的构建 1：表达载体 (1)：表达载体组成 ①启动子 本质： 特殊序列结构的DNA片段 位置：基因下游 功能： 使转录在所需的地方停下来，即终止转录 限制酶切割位点 ②终止子 一 基因表达载体的构建 1：表达载体 (1)：表达载体组成 ①启动子 位置：启动子和终止子之间 本质：一般具有多种限制酶的酶切位点 功能：目的基因插入的部位 限制酶切割位点 ②终止子 ③多克隆位点 一 基因表达载体的构建 1：表达载体 (1)：表达载体组成 ①启动子 类型： 限制酶切割位点 ②终止子 ③多克隆位点 ④标记基因 抗生素的抗性基因，如：抗氨苄青霉素基因、抗四环素基因 荧光蛋白基因，如：绿色荧光蛋白基因（GFP）、红色荧光蛋白基因（RFP） 生化标记基因，如：lacZ（β半乳糖苷酶基因） 营养缺陷型基因，如：合成某些氨基酸 功能：便于重组DNA分子的筛选 一 基因表达载体的构建 1：表达载体 (1)：表达载体组成 ①启动子 特性： 限制酶切割位点 ②终止子 ③多克隆位点 ④标记基因 与特定的受体细胞相匹配。 功能：外源基因在受体细胞中能稳定复制并遗传 ⑤复制原点 任务一：基因表达载体的构建 活动1：构建gfp基因的表达载体 问题3：酶切位点为何要位于启动子和终止子之间？ 酶切位点为目的基因的连接位点 目的基因必需插入启动子与终止子之间才能被转录 一 基因表达载体的构建 （目的基因为何要连在启动子和终止子之间？） 限制酶切割位点 箭头表示的是： 启动子的转录方向 即基因转录的方向 一 基因表达载体的构建 1：表达载体 (2)：表达载体构建过程 ①用一定的限制酶切割载体，使其出现一个切口。 ②用同种限制酶或能产生相同末端的限制酶切割含有目的基因的DNA片段 ③将切下的基因片段拼接 到载体的切口处，再加入 适量DNA连接酶，形成了一个重组DNA分子 基因表达载体 任务一：基因表达载体的构建 活动1：构建gfp基因的表达载体 问题5：双酶切比单酶切有哪些优点？ 根据阅读获得的信息，思考下列问题： 目的基因不会被环化 一 基因表达载体的构建 质粒不会重新环化 目的基因与质粒不会发生反向连接 任务一：基因表达载体的构建 活动1：构建gfp基因的表达载体 一 基因表达载体的构建 问题4：保证目的基因按照一定顺序插入，反插会产生什么影响？ 正向插入 反向插入 5’ 3’ 3’ 5’ 5’ 3’ 3’ 5’ 编码链 模板链 5’ 3’ A A U G C A C mRNA 编码链 模板链 G U G C A U U mRNA 一 基因表达载体的构建 问题4：保证目的基因按照一定顺序插入，反插会产生什么影响？ 5’ -A A U G C A C- 3’ mRNA 正向mRNA 5’ -G U G C A U U- 3’ mRNA 反向mRNA 5’ -A A U G C A C- 3’ 两个mRNA恰好反向互补 干扰翻译的进行（类别表观遗传中 反义RNA使基因沉默） 任务一：基因表达载体的构建 活动1：构建gfp基因的表达载体 问题5：载体有哪些类型？ 表达载体相比，有哪些特点。 根据阅读获得的信息，思考下列问题： 一 基因表达载体的构建 pBR载体只有： 复制起点 + 抗性基因 + 酶切位点 这类载体能否表达呢？ 没有启动子、终止子等表达元件，无法表达。此类载体能复制，成为克隆载体。 一 基因表达载体的构建 2：载体的类型 （1）表达载体 复制原点 + 表达元件 + 酶切位点 + 标记基因 限制酶切割位点 作用：目的基因在受体细胞内 表达，转录翻译成蛋白质。 复制原点 + 酶切位点 + 标记基因 作用：目的基因在受体细胞内 大量复制，但不一定表达。 （2）克隆载体 一 基因表达载体的构建 限制酶切割位点 ①启动子 ②终止子 ③多克隆位点 （限制酶切位点） ④标记基因 ⑤复制原点 基因表达载体 必须具备的条件 基因克隆载体 必须具备的条件 2：载体的类型 第二步：基因表达载体的构建 二/ 第一步：目的基因的筛选与获取 一/ 第三步：将目的基因导入受体细胞 三/ 第四步：目的基因的检测与鉴定 四/ DNA 片段的扩增及电泳鉴定 五/ 二 将目的基因导入受体细胞 任务二：目的基因导入受体细胞 活动1：如何将连有gfp基因的表达载体导入到斑马鱼受体细胞呢？ 二 将目的基因导入受体细胞 任务二：目的基因导入受体细胞 活动1：如何将连有gfp基因的表达载体导入到斑马鱼受体细胞呢？ 问题1：选择哪种细胞作为受体细胞适合？ 导入卵细胞（受精卵）可以获得稳定遗传的个体 二 将目的基因导入受体细胞 任务二：目的基因导入受体细胞 活动1：如何将连有gfp基因的表达载体导入到斑马鱼受体细胞呢？ 问题2：如何将载体导入到受精卵细胞？ 通过显微注射的方法 操作方法：首先将含有绿色荧光蛋白基因的表达载体提纯，并使DNA浓度保持在1-3ug/ml; 然后从雌性动物体内提取出卵（卵可以在体外受精，也可以在体内受精），采用显微注射仪进行显微注射。 二 将目的基因导入受体细胞 二 将目的基因导入受体细胞 1：目的基因导入动物细胞 （1）方法 显微注射法 受体细胞：受精卵 （2）操作 目的基因表达载体提纯 取卵 （受精卵） 受精卵移植 显微注射法 雌性动物输卵管和子宫 发育为具有新性状的动物 显微镜下用口径1um的玻璃微管向受精卵注射含500-600个拷贝的含有目的基因的载体 二 将目的基因导入受体细胞 任务二：目的基因导入受体细胞 活动2：如何将连有gfp基因的表达载体导入到植物受体细胞呢？ 任务二：目的基因导入受体细胞 活动2：如何将连有gfp基因的表达载体导入到植物受体细胞呢？ 二 将目的基因导入受体细胞 二 将目的基因导入受体细胞 任务二：目的基因导入受体细胞 活动2：如何将连有gfp基因的表达载体导入到植物受体细胞呢？ 二 将目的基因导入受体细胞 任务二：目的基因导入受体细胞 活动2：如何将连有gfp基因的表达载体导入到植物受体细胞呢？ 问题2：有人认为“农杆菌Ti质粒中的生长素与细胞分裂素基因表达刺激了杨树枝条的增生”，同学们，你们认为这个合理吗？ 补充：当微生物缺少选择压力时，可能会发生质粒的丢失，导致质粒基因控制的性状不能稳定遗传 植物产生冠瘿瘤，说明两个激素基因 可以稳定遗传表达 二 将目的基因导入受体细胞 任务二：目的基因导入受体细胞 活动2：如何将连有gfp基因的表达载体导入到植物受体细胞呢？ 问题3：结合下图，尝试说出Ti质粒中的T-DNA序列是如何转移到杨树细胞中的，以及如何整合至其基因组的？ 二 将目的基因导入受体细胞 任务二：目的基因导入受体细胞 活动2：如何将连有gfp基因的表达载体导入到植物受体细胞呢？ 问题3：结合下图，尝试说出Ti质粒中的T-DNA序列是如何转移到杨树细胞中的，以及如何整合至其基因组的？ 当植物体受损时，伤口处的细胞会分泌大量的酚类化合物（乙醚丁香酮），吸引农杆菌移向这些细胞。 这时农杆菌中的Ti-DNA(可转移的DNA）可以转移到受体细胞，并且整合到受体细胞染色体的DNA上，即植物细胞的基因组上。 二 将目的基因导入受体细胞 任务二：目的基因导入受体细胞 活动2：如何将连有gfp基因的表达载体导入到植物受体细胞呢？ 将目的基因连接在Ti质粒上，农杆菌侵染植物后， Ti质粒中的T-DNA区段脱离质粒 携带目的基因的T-DNA进入受体 植物细胞并整合到染色体上。 问题4：请说出科学家选择农杆菌作为植物转基因过程中运载体的理由？ 二 将目的基因导入受体细胞 任务二：目的基因导入受体细胞 活动2：如何将连有gfp基因的表达载体导入到植物受体细胞呢？ 问题5：什么是冠瘿碱？Ti质粒上有冠瘿的合成基因，为什么冠瘿碱合成基因与冠瘿碱代谢基因位于Ti质粒上的不同位置？ 资料3：冠瘿碱是一种含氮有机物， 可以作为农杆菌的碳源和氮源，其他微生物 不能利用，因此，冠瘿碱是农杆菌专属营养。 冠瘿碱合成基因位于T-DNA上，这个基因一同转入杨树基因组中，表达产物将冠瘿碱的合成量增加。为农杆菌生存提供重组的营养。 冠瘿碱代谢基因一直位于农杆菌细胞中， 此基因表达的酶可以帮助农杆菌代谢利用冠瘿碱。 农杆菌让植物细胞帮助合成“营养物质” 二 将目的基因导入受体细胞 任务二：目的基因导入受体细胞 活动2：如何将连有gfp基因的表达载体导入到植物受体细胞呢？ 问题6：农杆菌为什么要刺激杨树枝条增生而长出冠瘿瘤，对农杆菌有何种价值呢？ 当3个结构基因随T-DNA转移并整合至受体细胞染色体后，生长素基因和细胞分裂素基因的表达产物引起质粒转化区植物细胞不断分裂与生长，加上冠瘿碱合成基因不断合成冠瘿碱并积累，导致植物细胞感染处冠瘿瘤的形成。 杨树被农杆菌寄生后增生出冠瘿瘤， 对农杆菌而言，植物增生为农杆菌提供了更适宜的生存空间； 同时合成冠瘿碱，还帮农杆菌提供营养。 二 将目的基因导入受体细胞 任务二：目的基因导入受体细胞 活动2：如何将连有gfp基因的表达载体导入到植物受体细胞呢？ 小节：农杆菌介导的遗传转化法是目前植物转基因技术中常用的方法。 农杆菌是一种土壤细菌，它侵染植物细胞后，会使植物细胞形成肿瘤。 受感染的细胞可产生正常细胞所不能产生的生物碱，被农杆菌用作碳源和氮源。 人们发现在农杆菌中存在一种环形的Ti质粒，该质粒上的一段DNA能狗从一个细胞转移到另外一个细胞，这段DNA被称为转移DNA。T-DNA上包含有高等植物的生长素编码基因和细胞分裂素编码基因，可以插入植物基因组，引起植物细胞的变化。 将目的基因连接在T-DNA上，可将目的基因一同转移到植物的基因组上 二 将目的基因导入受体细胞 2：目的基因导入植物细胞 （1）土壤农杆菌转化法（最常用的方法） ①转化 农杆菌是一种在土壤中生活的原核生物，自然条件下感染双子叶植物和裸子植物，而对于大多数单子叶植物没有感染能力。 ①工具 农杆菌 目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内稳定存在和表达的过程 农杆菌侵染植物细胞后，会使植物细胞形成肿瘤 当植物体受到损伤后，伤口处的细胞会分泌大量酚类化合物，吸引农杆菌向这些细胞移动，受感染的植物细胞产生正常细胞所不能产生的生物碱，被农杆菌用作碳源和氮源。 二 将目的基因导入受体细胞 2：目的基因导入植物细胞 （1）土壤农杆菌转化法（最常用的方法） ③原理 Ⅰ.当植物体受到损伤后，伤口处的细胞会分泌大量酚类化合物，吸引农杆菌向这些细胞移动，农杆菌能将Ti质粒上的T-DNA（可转移DNA）转移到被侵染的细胞，并将其整合到受体细胞染色体的DNA上。 Ⅱ.农杆菌转化法就是将目的基因插到农杆菌Ti质粒的T-DNA特定区段上通过T-DNA将其插入植物细胞染色体的DNA上，使目的基因得到稳定的遗传和表达 二 将目的基因导入受体细胞 2：目的基因导入植物细胞 （1）土壤农杆菌转化法（最常用的方法） ①原理 二 将目的基因导入受体细胞 2：目的基因导入植物细胞 （1）土壤农杆菌转化法（最常用的方法） ② 过程 两次拼接 第一次拼接：目的基因拼接到Ti质粒的T-DNA上； 第二拼接（非人工操作）：被插入目的基因的T-DNA拼接到受体细胞染色体的DNA上。 二 将目的基因导入受体细胞 2：目的基因导入植物细胞 （1）土壤农杆菌转化法（最常用的方法） ④ 过程 两次导入 第一次导入：目的基因的重组Ti质粒导入农杆菌； 第二导入（非人工操作）：将含有目的基因的T-DNA导入受体细胞。 二 将目的基因导入受体细胞 2：目的基因导入植物细胞 （1）土壤农杆菌转化法（最常用的方法） ⑤ 处理方法 Ⅰ.将新鲜的从叶片上取下的圆形小片与农杆菌共培养，然后筛选转化细胞，并通过植物组织培养技术培育出完整的转基因植物 受体细胞：体细胞 二 将目的基因导入受体细胞 2：目的基因导入植物细胞 （1）土壤农杆菌转化法（最常用的方法） ⑤ 处理方法 Ⅱ.将花序直接浸没在含有农杆菌的溶液中一段时间，然后培养植株并获得种子，在进行筛选、鉴定等。 受体细胞：受精卵 二 将目的基因导入受体细胞 2：目的基因导入植物细胞 （1）土壤农杆菌转化法（最常用的方法） ⑥优点 T-DNA转化频率很高 ， Ti质粒上可插入几百至几千个碱基大小的DNA片段， 成本低、操作相对简单， 转基因后代的遗传组成比较容易分析。 二 将目的基因导入受体细胞 2：目的基因导入植物细胞 （2）花粉管通道法（我国科学家独创的一种方法） ①处理方法 Ⅰ.子房注入法： 用微量注射器将含有目的基因的DNA溶液直接注入子房中 二 将目的基因导入受体细胞 2：目的基因导入植物细胞 （2）花粉管通道法（我国科学家独创的一种方法） ①处理方法 Ⅱ. 柱头滴加法： 在植物受粉后的一定时间内，剪去柱头，将DNA溶液滴加在花柱切面上，使目的基因借助花粉管通道进入胚囊。 二 将目的基因导入受体细胞 2：目的基因导入植物细胞 （2）花粉管通道法（我国科学家独创的一种方法） ②优点 Ⅰ.利用植物授粉后形成的天然花粉管通道，将外源基因携带进入胚囊，此时的受精卵未形成细胞壁，且正在进行活跃的DNA复制，容易将外源DNA片段整合到受体基因组中。 受体细胞：受精卵 Ⅱ.操作简单、技术成本低，免去了组织培养以及诱导再生植株的全套人工培养过程 二 将目的基因导入受体细胞 任务二：目的基因导入受体细胞 活动3：如何将连有gfp基因的表达载体导入到大肠杆菌受体细胞呢？ 二 将目的基因导入受体细胞 任务二：目的基因导入受体细胞 活动3：如何将连有gfp基因的表达载体导入到大肠杆菌受体细胞呢？ 资料3：大肠杆菌在0℃的CaCl2低渗溶液中会发生膨胀，菌体细胞质膜的磷脂层会形成特殊结构。当外源DNA接触菌体细胞质膜外侧时，Ca会与DNA分子结合形成复合物，吸附在质膜的外表面上，42℃的热激处理会使细菌细胞质膜的特殊结构出现许多通透性增强的膜间隙，外源DNA分子便通过膜间隙进入菌体细胞。 问题3：归纳导入大肠杆菌中的步骤 二 将目的基因导入受体细胞 任务二：目的基因导入受体细胞 活动3：如何将连有gfp基因的表达载体导入到大肠杆菌受体细胞呢？ 问题3：归纳导入大肠杆菌中的步骤 步骤1：用Ca2+处理大肠杆菌细胞，使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态，这种细胞被称为感受态细胞。 步骤2：是将重组表达载体DNA分子溶于缓冲液中与感受态细胞混合，在一定 温度下促进感受态细胞吸收DNA分子，完成转化过程。 二 将目的基因导入受体细胞 3：目的基因导入原核细胞 （1）受体细胞 原核细胞 大肠杆菌、枯草杆菌、农杆菌等 使用最广泛的是大肠杆菌 优点： 繁殖快、容易培养，遗传物质相对较少等。 二 将目的基因导入受体细胞 3：目的基因导入原核细胞 （2）处理方法 Ca2+处理法/感受态细胞法 Ca2+处理（CaCl2) 感受态细胞 增加细菌细胞膜的通透性 表达载体溶液与感受态细胞混合 感受态细胞吸收周围环境中DNA分子 二 将目的基因导入受体细胞 3：目的基因导入原核细胞 （2）处理方法 Ca2+处理法/感受态细胞法 感受态细胞： 用Ca2+处理大肠杆菌细胞，使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态，这种状态的细胞被称为感受态细胞，可以提高受体细胞的转化率。 二 将目的基因导入受体细胞 4.小节 (1) 受体细胞的选择： 植物： 动物： 微生物： 一般是受精卵 受精卵或体细胞 常用原核生物，如大肠杆菌 (2) 导入受体细胞的方法： 不同受体细胞方法不同 显微注射法 植物细胞 微生物细胞 动物细胞 土壤农杆菌转化法 花粉管通道法 基因枪法 Ca2+处理法/感受态细胞法 二 将目的基因导入受体细胞 将带有目的基因的载体DNA溶液与金粉或钨粉混匀，使DNA吸附于金属颗粒表面，然后在基因枪的一个真空小室中，利用高压放电将带有DNA的金粉或钨粉轰击进入受体细胞 适合条件：被子植物，特别是单子叶植物 了解 受体细胞 植物细胞 动物细胞 微生物细胞 常用方法 农杆菌转化法、花粉管通道法 显微注射法 感受态细胞法 受体细胞 体细胞、受精卵 受精卵 原核细胞 转化过程 农杆菌转化法为例： 将来目的基因插入Ti质粒的T-DNA上 转入农杆菌中 导入植物细胞 整合到受体细胞的DNA上 提纯含目的基因的表达载体 显微注射法 具有新性状的个体 受精卵发育 Ca2+处理细胞 感受态细胞 感受态细胞吸收DNA分子 基因表达载体与感受态细胞混合 Lavf58.29.100 Bilibili VXCode Swarm Transcoder v0.3.76 $$