【串讲课件】专题03 基因工程-2024-2025学年高二生物下学期期末考点大串讲（人教版2019）

专题03 基因工程 人教版选择性必修3《生物技术与工程》 —— 期末串讲复习 —— 目录 真 题 检 测 考点梳理 02 01 1. 限制性内切核酸酶(限制酶) 图中可见，限制酶在识别序列中心轴线两侧切开产生 的是__________，在识别序列中心轴线处切开产生的是_________。 黏性末端 平末端 考点梳理 考点一：基因工程的基本工具 基因工程的基本工具 1 (1)作用： (2)种类： 将双链DNA片段“缝合”起来，恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的磷酸二酯键。 E.coli DNA连接酶、T4 DNA连接酶 类型 E.coli DNA连接酶 T4 DNA连接酶 来源 功能 缝合 和 ； 缝合__________和_______________ 结果 恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的_________________ 大肠杆菌 T4噬菌体 黏性末端 黏性末端 平末端(效率低) 磷酸二酯键 ★DNA连接酶没有识别特异性(相同或互补的黏性末端以及平末端都能连接) 注意：不是连接氢键 平末端 （连接平末端效率远低于T4 DNA连接酶） 考点梳理 考点一：基因工程的基本工具 基因工程的基本工具 1 2.DNA连接酶 【核心归纳】与DNA相关的几种酶的比较 项目 DNA连接酶 限制酶 DNA聚合酶 解旋酶 作用 部位 磷酸二酯键 磷酸二酯键 磷酸二酯键 氢键 作用 对象 DNA片段 DNA 单个的脱氧 核苷酸 DNA 作用 结果 将两个DNA片段连接成完整的DNA分子 切割双链DNA分子 将单个的脱氧核苷酸连接到DNA单链末端 将双链DNA分子局部解旋为单链 磷酸二酯键 DNA 将DNA片段水解为单个脱氧核苷酸 DNA酶 考点梳理 考点一：基因工程的基本工具 基因工程的基本工具 1 1.作用： 2.种类： 质粒、噬菌体和动植物病毒等。 将目的基因转入受体细胞，在受体细胞内对目的基因进行大量复制。 种类 用途 不同点 质粒、噬菌体 植物病毒 动物病毒 将外源基因导入大肠杆菌 等受体细胞 将外源基因导入植物细胞 将外源基因导入动物细胞 来源不同，在大小、结构、复制方式以及可以插入外源DNA片段的大小也有很大差别 考点梳理 考点一：基因工程的基本工具 基因工程的基本工具 1 3.最常用的载体——质粒 一种裸露的、结构简单、独立于真核细胞细胞核或原核细胞拟核DNA之外，并具有自我复制能力的环状双链DNA分子。 其基因属于细胞质基因。不是一种细胞器 考点梳理 考点一：基因工程的基本工具 基因工程的基本工具 1 复制原点 目的基因 插入位点 氨苄青霉素抗性基因 ①能在细胞中进行自我复制，或整合到受体DNA上，随受体DNA同步复制。 外源DNA片段（目的基因）插入其中 ②有一个至多个限制酶切割位点 EcoR Ⅰ Sma Ⅰ . . . 便于重组DNA分子的筛选 ③具有标记基因 除了氨苄青霉素抗性基因外，四环素抗性基因，荧光蛋白基因等也可作为标记基因。 图1-1 4.★作为载体所具备的条件及原因 使外源基因在受体细胞中稳定存在并复制，以扩增外源基因的数量 ④无毒害作用 避免受体细胞受到损伤 真正被用作载体的质粒，都是在天然质粒的基础上进行过人工改造的。 考点梳理 考点一：基因工程的基本工具 小结 (1)获取目的基因和切割载体时, 通常使用同种限制酶,目的是为了： 。但是使用该法缺点是容易发生 以及 ， 为了避免上述情况发生，可采取的措施是 。 产生相同的黏性末端，便于连接 目的基因与质粒反向连接 目的基因、质粒的自身环化 分别使用两种限制酶（双酶切法）去切割目的基因和运载体 考点梳理 考点一：基因工程的基本工具 小结 不破坏目的基因 至少保留一个完整的标记基因，便于筛选 (2)选择限制酶切割位点的基本原则： ①切割目的基因时： 。 ②切割质粒时： 。 ③切割目的基因和质粒时： 。 理由：防止目的基因和质粒自身环化和目的基因反向连接 最好选用不同的限制酶切割 考点梳理 考点一：基因工程的基本工具 考点梳理 考点二：基因工程的操作程序 目的基因的筛选和获取 1 （1）人工合成:通过DNA合成仪用化学方法直接合成 （2）利用PCR获取和扩增目的基因： （3）从基因文库中获取 将含有某种生物不同基因的许多DNA片段，导入到受体菌的群体中 储存，各个受体菌分别含有这种生物的不同基因，称为基因文库。 DNA半保留复制，即在体外提供参与DNA复制的各种组分与反应条件，对目的基因的核苷酸序列进行大量复制的技术。 12 目的基因：能控制表达所需要的特殊性状 启动子： 位置：基因的上游 功能：RNA聚合酶识别和结合的部位，驱动基因转录出mRNA。 复制原点： DNA复制的起始位点 终止子： 位置：基因的下游 功能：终止转录 标记基因：便于重组DNA分子的筛选和鉴定。 注意：启动子≠密码子 目的基因插入到启动子和终止子之间 考点梳理 考点二：基因工程的操作程序 基因表达载体的构建(核心步骤) 2 启动子、终止子、起始密码子、终止密码子对比 项目 启动子 终止子 起始密码子 终止密码子 本质 位置 目的基因上游 目的基因下游 mRNA首端 mRNA尾端 功能 DNA DNA mRNA mRNA RNA聚合酶识别和结合的部位，驱动基因转录出mRNA 使转录在所需要的地方停下来 翻译的起始信号(编码氨基酸) 翻译的结束信号(不编码氨基酸) 考点梳理 考点二：基因工程的操作程序 基因表达载体的构建(核心步骤) 2 13 受体细胞 常用方法 操作过程 植物细胞(常用体细胞或受精卵) ____________(我国独创) 方法一：用微量注射器将含目的基因的DNA溶液直接注入子房； 方法二：将DNA溶液滴加在授粉后一定时间内的花柱切面上，使目的基因借助花粉管通道进入胚囊 ____________ 将目的基因插入Ti质粒的T－DNA上→农杆菌→感染植物细胞→T－DNA整合到受体细胞染色体的DNA上→表达 花粉管通道法 农杆菌转化法 考点梳理 考点二：基因工程的操作程序 将目的基因导入受体细胞 3 受体细胞 常用方法 操作过程 动物细胞(常用受精卵) ______________ 将含有目的基因的表达载体提纯→取卵(受精卵)→显微注射→受精卵发育→获得具有新性状的动物 微生物细胞 ______________ (感受态细胞法) Ca2＋处理细胞→感受态细胞→重组表达载体DNA分子与感受态细胞混合→感受态细胞吸收周围环境中的DNA分子 显微注射法 Ca2＋处理法 考点梳理 考点二：基因工程的操作程序 将目的基因导入受体细胞 3 (1)通过_________等技术检测目的基因是否导入或是否转录出mRNA。 (2)利用___________________技术检测目的基因是否翻译。 (3)进行个体生物学水平的抗虫、抗病、功能活性等鉴定。 注：若用报告基因，如绿色荧光蛋白基因与目的基因构建融合基因， 可根据荧光情况进行定性、定量和定位的研究分析。 PCR 抗原—抗体杂交 考点梳理 考点二：基因工程的操作程序 目的基因的检测与鉴定 4 体内DNA复制参与的组分 PCR中参与的组分 解旋酶 DNA母链 4种脱氧核苷酸 DNA聚合酶 引物（通常为小的单链RNA） 无需解旋酶，用高温代替 DNA（目的基因）模板 4种脱氧核苷酸（dNTP) 耐高温的DNA聚合酶(Taq酶） 引物（通常为小的单链DNA至少需要2种引物） 反应还需要其它条件，如控温系统、 缓冲液（一般添加Mg2+）---能够调节PH，激活真核细胞和细菌的DNA聚合酶。 考点梳理 考点三：PCR相关问题分析 PCR的进行需要的条件 1 A T C G A A T C G G T T T A C C T T A G C C A A DNA 聚合酶 引物 3′ 3′ 5′ 5′ 2.DNA复制过程需要引物的原因： 拓展：引物 1.定义：引物是一小段能与DNA母链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸。（长度通常为20-30个核苷酸）。 母链DNA 子链DNA 引物可以是DNA单链，也可以为RNA单链 ·细胞内通常以RNA单链为引物 ·细胞外（PCR）一般以DNA单链为引物 ①DNA聚合酶不能从头合成子链。②使DNA聚合酶能够从引物的3’端开始连接脱氧核苷酸 DNA复制时，子链延伸的方向是从5’→3’端。 考点梳理 考点三：PCR相关问题分析 引物小结 1、PCR扩增时至少需要______种引物. 2 2、PCR扩增的前提是： 根据一段已知目的基因两端的核苷酸序列合成引物 3、设计引物时必须依据： 目的基因两端的核苷酸序列 4、设计引物的要求：（或引物失效的原因） ①同种引物之间不能发生碱基互补配对，原因是：______________________________ ②2种引物之间不能发生碱基互补配对，原因是：______________________________。 防止引物自身折叠 防止引物之间配对，导致引物不能与模板链结合 可以在引物的 5’端添加不同限制酶识别序列，保证目的基因与载体链接 考点梳理 考点三：PCR相关问题分析 01 耐高温的DNA聚合酶(Taq酶） 4种脱氧核苷酸（DNTP） 引物 待扩增的DNA片段（模板） 5’ 5’ 变性 复性 延伸 温度上升到90℃以上，双链DNA解聚为单链 当温度下降到50℃左右时，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合。 温度上升72℃左右时，溶液中的4种脱氧核苷酸在TaqDNA聚合酶作用下合成新DNA链。 注意：复性温度过高会破坏引物与模板碱基互补配对。 过低，会造成引物与模板结合位点增加，导致非特异性产物增加。 复性温度的设定与引物长度、碱基组成有关，当长度相同，但G-C含量高，需更高温度。 2.PCR反应过程： 考点梳理 考点三：PCR相关问题分析 复制次数 1 2 3 n DNA分子数         含引物的DNA分子数         DNA链数目 共消耗引物的个数         含脱氧核苷酸链等长的DNA分子数         2 2 2 0 4 4 6 0 8 8 14 2 2n 2n 2n+1-2 2n-2n 4 8 16 2n+1 一 PCR扩增DNA规律 考点梳理 考点三：PCR相关问题分析 溶解度: 利用DNA、RNA、蛋白质和脂质等在物理和化学性质方面存在的差异，提取DNA，去除其他成分。 ②DNA在不同浓度的NaCl溶液中的溶解度不同，可提纯DNA。 ①DNA不溶于酒精，细胞中某些蛋白质溶于酒精，初步分离DNA和蛋白质。 0 DNA溶解度 NaCl浓度（mol/L） 0.14 2 考点梳理 考点四：DNA的粗提取与鉴定 提取原理 1 当NaCl的物质的浓度为0.14 mol/L时，DNA的溶解度 。此时DNA （溶解或析出）。 当NaCl的物质的量浓度为2mol/L时，DNA的溶解度最大。 最小 析出 0 DNA溶解度 NaCl浓度（mol/L） 0.14 2 2.鉴定原理： 二苯胺有毒，现配现用并用棕色瓶存放 在一定温度下，DNA遇二苯胺试剂会呈现蓝色。 考点梳理 考点四：DNA的粗提取与鉴定 提取原理 1 注意: 富含DNA的材料(如新鲜洋葱、香蕉、菠菜和猪肝等)、研磨液、体积分数为95％的酒精、2 mol/L的NaCl溶液、二苯胺试剂和蒸馏水等。 以血液为实验材料时，每100 mL血液中需要加入3 g柠檬酸钠，防止血液凝固。 利用动物细胞提取DNA破碎细胞的方法：动物细胞无细胞壁，可直接吸水涨破。 不能用哺乳动物成熟的红细胞中无细胞核和线粒体，几乎不含DNA 。 考点梳理 考点四：DNA的粗提取与鉴定 材料用具 2 （1）通过研磨释放 DNA 称取约30g 洋葱，切碎，然后放入研钵中，倒入10 mL 研磨液，充分研磨（可加入少量石英砂助研）。 ①研磨的目的： ②研磨时间不宜太长： ③有条件的可以在材料处理的过程中加入纤维素酶、果胶酶： ④研磨不宜太用力 破碎细胞，使核物质容易溶解在研磨液中 防止研磨时产生的热量影响DNA的提取量 研磨效果好（有利于充分研磨） 研磨液成分 作用 SDS 使蛋白质变性 EDTA 抑制DNA酶 Tris-HCl缓冲液 稳定DNA 考点梳理 考点四：DNA的粗提取与鉴定 方法步骤 3 （2）过滤获取含DNA的上清液 可能含有核蛋白、多糖等杂质 在漏斗中垫上纱布，将洋葱研磨液过滤到烧杯中，在4℃冰箱中放置几分钟后，再取上清液。 过滤能用滤纸代替吗？ ①可抑制核酸水解酶的活性，进而抑制DNA降解； ②抑制DNA分子运动，使DNA易形成沉淀析出； ③低温有利于增加DNA的柔韧性，减少其断裂。 不可以，因为DNA会被吸附到滤纸上而大量损失。 低温放置几分钟的作用： 考点梳理 考点四：DNA的粗提取与鉴定 方法步骤 3 在上清液中加入体积相等的、预冷的酒精溶液(体积分数为95%),静置2~3 min,溶液中出现的白色丝状物就是粗提取的DNA。用玻璃棒沿一个方向搅拌,卷起丝状物,并用滤纸吸去上面的水分;或者将溶液倒入塑料离心管中,在10000r/min的转速下离心5min,弃上清液,将管底的沉淀物(粗提取的DNA)晾干。 减少DNA断裂，以便获得较完整的DNA分子。 ①抑制核酸水解酶活性，防止DNA降解； ②低温有利于增加DNA分子柔韧性，减少断裂。 ③使蛋白质溶解在酒精中，DNA不溶于酒精而析出。 （3）冷却酒精析出DNA 考点梳理 考点四：DNA的粗提取与鉴定 方法步骤 3 取两支20mL的试管，各加入2mol/L的NaCl溶液5mL。将丝状物或沉淀物溶于其中一支试管的NaCI溶液中。向两支试管中各加入4mL的二苯胺试剂。混合均匀后，将试管置于沸水中加热5min。待试管冷却后，比较两支试管中溶液颜色的变化。 加入2mol/L氯化钠溶液 不加入丝状物 加入4mL二苯胺试剂 加入2mol/L氯化钠溶液 加入丝状物 加入4mL二苯胺试剂 实验组 水浴加热 对照组 溶液蓝色的深浅与溶液中DNA的含量的多少有关 考点梳理 考点四：DNA的粗提取与鉴定 DNA的鉴定 4 1. 实验原理： （1）DNA 片段的扩增 PCR 利用了 DNA 的热变性原理，通过调节温度来控制 DNA 双链的解聚与结合。一次 PCR 一般要经历 30 次循环。 （2）DNA 片段的电泳鉴定 DNA 在一定的 pH 下会带上电荷，带电的 DNA 会在电场的作用下向所带电荷相反的电极移动，即电泳。PCR 产物一般用琼脂糖凝胶电泳鉴定，其在凝胶中的迁移速率与凝胶浓度、DNA 分子大小和构象（如链状和环状）等有关。 凝胶中的 DNA 通过染色，可在 300 nm 紫外灯下被检测出来。 考点梳理 考点五：利用PCR技术扩增DNA片段并电泳鉴定 2.实验步骤（PCR） 用微量移液器按照PCR反应体系配方或PCR试剂盒的说明书，在微量移液管中依次加入各组分。 待所有组分都加入后，盖严离心管的盖子。将微量离心管放入离心机里，离心约10s，使反应液集中在离心管的底部。 参照下表的参数，设置好PCR仪的循环程序。将装有反应液的微量离心管放入PCR仪中进行反应。 移液 离心 扩增 Ⅰ.预变性的目的？ Ⅱ.最后一个循环结束后通常还需在 72℃维持几分钟，目的是？ 使子链充分延伸 使模板 DNA 充分变性 考点梳理 考点五：利用PCR技术扩增DNA片段并电泳鉴定 2、实验步骤（电泳鉴定） 根据待分离DNA片段的大小，用电泳缓冲液配制琼脂糖溶液，一般配制质量体积比0.8%-1.2%的琼脂糖溶液。在沸水浴或微波炉内加热至琼脂糖熔化。稍冷却后，加入适量的核酸染料混匀。 将温热的琼脂糖溶液迅速倒入模具，并插入合适大小的梳子，以形成加样孔。凝胶溶液完全凝固，小心拔出梳子，取出凝胶放入电泳槽内。将电泳缓冲液加入电泳槽中，电泳缓冲液没过凝胶1mm为宜。 配制琼脂糖溶液 制备凝胶 考点梳理 考点五：利用PCR技术扩增DNA片段并电泳鉴定 将扩增得到的PCR产物与凝胶载样缓冲液（内含指示剂）混合，再用微量移液器将混合液缓慢注入凝胶的加样孔内。留一个加样孔加入指示分子大小的标准参照物（Marker）。 加样 电泳、观察 接通电源，根据电泳槽阳极至阴极之间的距离来设定电压，一般为1～5V/cm。待指示剂前沿迁移接近凝胶边缘时，停止电泳。取出凝胶置于紫外灯下观察和照相。 2、实验步骤（电泳鉴定） 考点梳理 考点五：利用PCR技术扩增DNA片段并电泳鉴定 1.为避免外源DNA等因素的污染，PCR实验中使用的微量离心管、枪头和蒸馏水等在使用前必须进行高压灭菌处理。 2.该实验所需材料可以直接从公司购买，缓冲液和酶应分装成小份，并在-20℃储存。使用前，将所需试剂从冰箱拿出，放在冰块上缓慢融化。 3.在向微量离心管中添加反应组分时，每吸取一种试剂后，移液器上的枪头都必须更换。 4.在进行操作时，一定要戴好一次性手套。 5.PCR扩增不能随意加大试剂用量。 注意： 考点梳理 考点五：利用PCR技术扩增DNA片段并电泳鉴定 （1）未出现扩增条带的主要原因 ① Taq DNA 聚合酶失活。② 引物出现质量问题。 ③ Mg2＋浓度过低。④ 变性时的温度低，变性时间短。 （2）出现非特异性扩增条带的主要原因 ① 模板 DNA 出现污染。 ② 引物特异性不强或形成引物二聚体。 ③ Mg2＋浓度过高。 ④ 复性时的温度过低等。 关键点拨： 考点梳理 考点五：利用PCR技术扩增DNA片段并电泳鉴定 考点梳理 考点六：基因工程的应用 减数分裂 1 分类 导入目的基因 转基因生物实例 植物 转基因抗虫植物 外源______基因 抗虫棉花、玉米等 转基因抗病植物 某些病毒、真菌等的______基因 抗病毒甜椒、番木瓜等 转基因抗除草剂植物 降解或抵抗某种_________的基因 抗除草剂玉米、大豆等 抗虫 抗病 除草剂 考点梳理 考点六：基因工程的应用 基因工程在农牧业方面的应用 1 分类 导入目的基因 转基因生物实例 植物 改良植物的品质 富含__________________的蛋白质的基因 富含赖氨酸的玉米 与植物________代谢相关的基因 颜色变异的矮牵牛 动物 提高动物的生长速率 外源____________的基因 转生长激素基因的鲤鱼 改善畜产品的品质 ____________的基因 转肠乳糖酶基因的奶牛 某些必需氨基酸 花青素 生长激素 肠乳糖酶 考点梳理 考点六：基因工程的应用 基因工程在农牧业方面的应用 1 1.实例： 转基因动物进入泌乳期后，可以通过分泌的乳汁来生产所需药品。 乳腺生物反应器或乳房生物反应器 目前已经在牛、山羊等动物的乳腺生物反应器中，获得了抗凝血酶、 血清白蛋白、生长激素和α-抗胰蛋白酶等重要医药产品。 2.应用： 我的奶不是一般的奶！ 喝牛奶可以代替打针吃药吗？ 让转基因哺乳动物批量生产药物 2 考点梳理 考点六：基因工程的应用 38 药用蛋白基因 乳腺中特异表达的基因的启动子等调控元件 基因表达载体 显微注射 受精卵 泌乳期分泌乳汁 转基因动物 药物 胚胎移植 早期胚胎培养 早期胚胎 1.培育过程： (1)动物乳腺有完整的蛋白质翻译后修饰系统，生产的蛋白质活性高，更稳定。 (2)产物直接经乳汁分泌，易提取。 2.优点： 胚胎移植前应做DNA分析，鉴定性别，保留雌性。 让转基因哺乳动物批量生产药物 2 考点梳理 考点六：基因工程的应用 1.利用乳腺生物反应器的动物性别是 。 2.利用乳腺生物反应器生产药物时受体细胞是 ________ ，原因是____________________________________________________。 3.目的基因可在乳腺细胞中表达，其他组织细胞中含有该目的基因吗？ 。 理由是： 4.要使目的基因在乳腺组织中特异性表达，在构建基因表达载体时要在目的基因序列前加上乳腺组织中特异表达的启动子： 。 雌性 受精卵 受精卵具有全能性，可使外源基因在相应的组织细胞中表达 含有 因为它们都是由同一个受精卵分裂、分化而来的 乳腺蛋白基因的启动子 易错点拨 考点梳理 考点六：基因工程的应用 动物基因工程还有另外一个作用，就是用转基因动物生产药物，也就是我们之前提过的乳腺生物反应器，那么什么是乳腺生物反应器呢？那我们知道，正常动物。。。那么我们应该怎样做，才能使这个动物的乳汁含有所需的药品呢？也就是我们应该如何实现用乳房生物反应器来生产药物？那同学们再思考一下，为什么我们要用这个乳腺来作为基因药物的表达产所，用血液不行吗？ 1. 融合基因 (1)基因工程中构建融合基因，可以实现两个或更多不同来源的DNA分子组合，置于同一套调控序列控制之下进行表达。表达产物为融合蛋白。 (2)可分为四大类：①由报告基因和功能基因构成的融合基因。 常用的报告基因有GFP(绿色荧光蛋白)基因、GUS基因、LacZ基因等，主 要目的是对功能基因进行示踪； ②由信号肽或单体蛋白的序列与功能基因构成的融合基因，其主要目的是 利用信号肽或单体序列携带目的基因高效表达，从而提取纯化目的蛋白； ③功能基因与功能基因的融合，包括相同功能基因的融合(目的是增强基 因的功能)和不同功能基因的融合； ④报告基因与抗药性基因的融合，用于构建融合载体，以利于插入大片段 的cDNA或作为双功能标记。 融合基因与无缝克隆 3 考点梳理 考点六：基因工程的应用 2. 无缝克隆 (1)原理：使载体末端和引物末端具有15～20个同源碱基，由此得到的PCR产物两端便分别带上了15～20个与载体序列同源性的碱基。通过相关酶试剂处理，同时除去载体与目的DNA上同源片段的双链中的一条链，这样载体和目的DNA两端就露出了能够互补配对的序列，依靠同源序列碱基间的配对能使载体和目的DNA较为紧密地连在一起。 (2)优点：无缝克隆不需要任何限制性内切酶和连接酶，突破传统的双酶切后再连接，只需要一步重组法，即可得到高效率克隆的重组载体。 融合基因与无缝克隆 3 考点梳理 考点六：基因工程的应用 新蛋白质预期功能 改造或合成 分子设计 转录 翻译 折叠 基因 DNA 新蛋白质新功能 氨基酸序列多肽链 蛋白质 三维结构 mRNA 起点： 目的： 终点： 实质： 前提： 蛋白质的预期功能 了解蛋白质结构和功能的关系 获得大量的改造后的蛋白质 改造基因结构 生产出符合人们生活需要的蛋白质 关键技术：基因工程 又称第二代基因工程 1.蛋白质工程的一般过程 逆中心法则 考点梳理 考点七：蛋白质工程的原理和应用 ❖定点诱变法的过程示意图 引物 突变 DNA聚合酶 DNA连接酶 受体细胞 转录 突变 考点梳理 考点七：蛋白质工程的原理和应用 归纳总结定点诱变技术 项目 内容 条件 原料 酶 引物 操作方法 结果 适用范围 特点 4种脱氧核苷酸 DNA聚合酶和DNA连接酶 含突变位点的DNA分子片段 先通过PCR扩增已获得定点突变的基因，再通过基因工程将突变基因导入受体细胞，经过转录和翻译合成所需的蛋白质 后代中半数为诱变的DNA分子 空间结构完全清楚的蛋白质，进行“小改” 定点诱变有目的性和针对性 考点梳理 考点七：蛋白质工程的原理和应用 项目 蛋白质工程 基因工程 区别 起点 过程 实质 结果 应用及现状 联系 预期蛋白质功能 目的基因 预期蛋白质功能→设计蛋白质结构→推测氨基酸序列→推测脱氧核苷酸序列→合成DNA→表达出蛋白质 获取目的基因→构建基因表达载体→导入受体细胞→目的基因的检测与鉴定 通过改造相应的基因达到对蛋白质的改造 基因重组 可以创造出自然界不存在的蛋白质 生产自然界已存在的蛋白质 ①主要集中在对现有蛋白质进行改造，②对创造新的蛋白质还有许多技术难题未突破，因为蛋白质高级结构非常复杂，人们对此知之甚少 ①已被广泛应用，如转基因植物、动物、药品生产等已商业化 ①蛋白质工程获得目的基因后，需要通过基因工程获得预期蛋白质 ②蛋白质工程是在基因工程的基础上，延伸出来的第二代基因工程 考点梳理 考点七：蛋白质工程的原理和应用 1. 某小组通过PCR(假设引物长度为8个碱基，短于实际长度)获得了含有目的基因的DNA片段，并用限制酶进行酶切(下图)，再用所得片段成功构建了基因表达载体。下列叙述错误的是(　 　) 考向　基因工程中工具酶的选择和利用 真 题 检 测 A．其中一个引物序列为5′－TGCGCAGT－3′ B．步骤①所用的酶是SpeⅠ和CfoⅠ C．用步骤①的酶对载体进行酶切，至少获得了2个片段 D．酶切片段和载体连接时，可使用E.coli DNA连接酶或T4 DNA连接酶 B NheⅠ和CfoⅠ 2. (多选)根据用途可将基因工程中常用的载体分为克隆载体和表达载体两种，克隆载体的目的是复制出更多的目的基因，而表达载体的目的是使外源基因在受体中高效表达。下列有关叙述错误的是(　 　) A．克隆载体必须具备的元件是复制原点、启动子和终止子 B．两种载体都要具有一个或多个限制酶切点，以便目的基因的插入 C．表达载体的元件中必须含有标记基因，不一定有复制原点 D．质粒、动植物病毒、噬菌体均可作为克隆载体或表达载体 AC 考向　基因载体和标记基因 真 题 检 测 复制原点、 标记基因 必须含有标记基因(用来筛选表达载体)，也需要复制原点，保证表达载体能在受体细胞中自我复制 3.用氨苄青霉素抗性基因(AmpR)、四环素抗性基因(TetR)作为标记基因构建的质粒如图所示。用含有目的基因的DNA片段和用不同限制酶酶切后的质粒，构建基因表达载体(重组质粒)，并转化到受体菌中。下列叙述错误的是( ) 考向　基因表达载体的构建 A．若用HindⅢ酶切，目的基因转录的产物可能不同 B．若用PvuⅠ酶切，在含Tet(四环素)培养基中的菌落，不一定含有目的基因 C．若用SphⅠ酶切，可通过DNA凝胶电泳技术鉴定重组质粒构建成功与否 D．若用SphⅠ酶切，携带目的基因的受体菌在含Amp(氨苄青霉素)和Tet的培养基中能形成菌落 D 在含Tet的培养基中不能形成菌落 真 题 检 测 4.图1是某基因工程中构建重组质粒的过程示意图，载体质粒P0具有四环素抗性基因(TetR)和氨苄青霉素抗性基因(AmpR)。请回答下列问题： (1)用Taq DNA聚合酶进行PCR扩增获得的目的基因片段，其两端各自带有一个腺嘌呤脱氧核苷酸。载体P1用酶处理，在两端各添加了一个碱基为______________的脱氧核苷酸，形成P2；P2和目的基因片段在___________酶作用下，形成重组质粒P3。 胸腺嘧啶(T)　 DNA连接　 真 题 检 测 (2)为鉴定筛选出的菌落中是否含有正确插入目的基因的重组质粒，拟设计引物进行PCR鉴定。图2为甲、乙、丙 3条引物在正常重组质粒中的相应位置，PCR鉴定时应选择的一对引物是__________。某学生尝试用图中另外一对引物从某一菌落的质粒中扩增出了400 bp 片段，原因是____________________。 乙、丙　 图2 目的基因反向连接　 考向　基因表达载体的构建 真 题 检 测 5.NK603是能耐草甘膦(一种除草剂)的转基因玉米，这种玉米因导入了抗草甘膦基因，对草甘膦具有抗药性。请回答下列问题： (1)基因工程的操作程序主要包括四个步骤，其核心步骤是_______________ _________；PCR可以特异性地快速扩增抗草甘膦基因，扩增抗草甘膦基因时，需要用到从嗜热菌中提取出的_____________________________________，还要合成一小段能与抗草甘膦基因碱基互补配对的片段，即________。 基因表达载体　 的构建　 耐高温的DNA聚合酶(Taq DNA聚合酶)　 引物　 考向　基因表达载体的构建 真 题 检 测 (2)为促进农杆菌吸收含抗草甘膦基因的重组Ti质粒，一般先用______________处理农杆菌细胞；当含有重组Ti质粒的农杆菌侵染玉米细胞后，抗草甘膦基因随Ti质粒的________转移到玉米细胞中，并整合到__________DNA上。 (3)培育转基因动物一般是将目的基因注入动物的受精卵，而不是体细胞，原因是__________________________________________________。 (4)在个体水平上鉴定耐草甘膦的转基因玉米培育是否成功的措施是 ________ ________________________________________。 钙离子(Ca2+)　 T－DNA　 染色体　 动物的受精卵具有全能性，动物体细胞不具有全能性　 转基因玉米喷施草甘膦，观察它们抗草甘膦效果 真 题 检 测 6.下列关于“DNA 粗提取与鉴定”实验的叙述，错误的是(　 　) A．实验中如果将研磨液更换为蒸馏水，DNA提取的效率会降低 B．利用DNA和蛋白质在酒精中的溶解度差异，可初步分离DNA C．DNA在不同浓度NaCl溶液中溶解度不同，该原理可用于纯化DNA粗提物 D．将溶解的DNA粗提物与二苯胺试剂反应，可检测溶液中是否含有蛋白质杂质 考向　DNA 粗提取与鉴定 真 题 检 测 不能检测溶液中是否含有蛋白质杂质 D 7.关于采用琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR产物的实验，下列叙述正确的是(　 　) A．琼脂糖凝胶浓度的选择需考虑待分离DNA片段的大小 B．凝胶载样缓冲液中指示剂的作用是指示DNA分子的具体位置 C．在同一电场作用下，DNA片段越长，向负极迁移速率越快 D．琼脂糖凝胶中的DNA分子可在紫光灯下被检测出来 A 考向　利用PCR技术扩增DNA片段并电泳鉴定 真 题 检 测 当指示剂前沿接近凝胶边缘时(可看蓝色条带)，则停止电泳 迁移速率越慢 需染色后，才可在波长为300 nm的紫外灯下被检测出来 8.扰素在体外保存非常困难。干扰素由166个氨基酸组成，如果将其分子上第17位的一个半胱氨酸变成丝氨酸，那么在70 ℃的条件下可以保存半年。若利用蛋白质工程的原理和方法生产新型干扰素，下列思路最可行的是(　　) A．用DNA合成仪合成新的干扰素基因 B．利用基因定点突变技术改造干扰素基因 C．直接改造mRNA，进行密码子的替换 D．生产正常干扰素，再进行氨基酸的替换 B　 蛋白质工程的目的是改造蛋白质，但其方法是通过改造或合成基因来实现的，而不是直接改造氨基酸；若直接改造mRNA，可获得改造后的蛋白质，但不能遗传、不能复制。 考向　蛋白质工程的原理和应用 真 题 检 测 $$