专题02 基因工程和生物技术的安全性和伦理问题（山东专用）-【好题汇编】备战2024-2025学年高二生物下学期期末真题分类汇编（山东专用）

专题02 基因工程和生物技术的安全性和伦理问题（原卷版） 一、单选题 1．（23-24高二下·山东临沂·期末）关于生物技术伦理问题，下列观点错误的是（　　） A．可以对胚胎进行基因编辑获得抗艾滋病的孩子 B．清晰地了解转基因技术的原理和操作规程能更理性看待转基因技术 C．中国政府的态度是在任何情况下不发展、不生产、不储存生物武器 D．将玉米α-淀粉酶基因与目的基因一起转入植物使花粉失活，可以防止转基因花粉的传播 2．（23-24高二下·山东枣庄·期末）每出生5000名婴儿就有1人患有线粒体有害突变引起的疾病，可通过如下技术培育“三亲婴儿”，实现线粒体替代疗法阻断线粒体病的遗传，但这是一个充满了争议的技术。有关叙述正确的是（    ） A．该技术中的去核，其实是去除纺锤体—染色体复合物 B．利用该技术培育的“三亲婴儿”绝大多数性状与B个体一致 C．该“三亲婴儿”技术，婴儿的遗传物质来自三方，因此患遗传病的概率提升了 D．“三亲婴儿”技术涉嫌“设计”，容易引起类似“设计试管婴儿”的争议 3．（23-24高二下·山东聊城·期末）生物安全是指国家有效防范和应对危险生物因子及相关因素威胁，生物技术能够稳定健康发展，人民生命健康和生态系统相对处于没有危险和不受威胁的状态，生物领域具备维护国家安全和持续发展的能力。下列说法错误的是（    ） A．培养过微生物的培养基必须严格消毒后才能废弃，目的是防止微生物污染环境 B．我国禁止生殖性克隆人的实验，对治疗性克隆实验也进行严格审查 C．在转基因工作中科学家会采取很多方法防止基因污染，如阻断淀粉储藏使花粉失活 D．为避免可能产生的基因歧视，基因检测机构不能随意泄露基因检测的结果 4．（23-24高二下·山东济南·期末）下列有关基因工程应用的叙述错误的是（    ） A．因牲畜的胃液呈酸性，且消化道细胞无Bt抗虫蛋白的受体，转基因抗虫棉对牲畜的影响较害虫小 B．将外源生长激素基因导入鲤鱼受精卵获得的转基因鲤鱼生长速率显著提高 C．将乳糖酶基因导入奶牛基因组，使获得的转基因牛分泌的乳汁中乳糖含量增加，营养价值提高 D．重组人工干扰素α-1b，具有干扰病毒复制的作用，被广泛应用于治疗病毒感染性疾病 5．（23-24高二下·山东济南·期末）蛛丝蛋白有着超强的抗张强度，可制成防弹背心、降落伞绳等。下图是培育转基因蜘蛛羊生产蛛丝蛋白的方案。以下叙述错误的是（    ） A．通过逆转录得到蛛丝蛋白基因不含有启动子和内含子 B．构建含蛛丝蛋白基因的重组质粒是培育转基因蜘蛛羊的核心工作 C．过程②通常选用基因枪法将重组质粒导入山羊的受精卵中 D．可利用 PCR 检测山羊的染色体DNA 是否插入了蛛丝蛋白基因 6．（23-24高二下·山东威海·期末）某科研小组进行了如下实验：称取30g洋葱切碎，充分研磨后过滤得到滤液，将滤液放置几分钟后取上清液，加入酒精溶液，此时溶液中出现了白色丝状物，用玻璃棒搅拌后卷起丝状物，经二苯胺鉴定后得出丝状物是DNA的结论。下列说法正确的是（　　） A．新鲜的菠菜或鸡血按照上述实验操作也可以得到相同的实验结果 B．滤液应放于常温下静置几分钟后取上清液 C．上清液中应加入体积相等的、预冷的体积分数为95%的酒精溶液 D．鉴定时应将丝状物溶于0.4mol/L的NaCl溶液中，再加入二苯胺溶液后沸水浴 7．（23-24高二下·山东威海·期末）下图表示利用动物细胞工程和胚胎工程等技术获得三类不同动物的过程，下列说法错误的是（　　） A．过程①需将采集的精子和培养成熟的卵子置于培养液中共同培养完成受精 B．过程②需要去除MII期卵母细胞中的纺锤体—染色体复合物 C．过程③可以大幅改良动物的某些性状 D．图示3个过程获得的胚胎都需要经过胚胎移植才能获得后代 8．（23-24高二下·山东威海·期末）研究人员利用E.coli DNA连接酶将药用蛋白基因与一系列调控元件、质粒等构建成重组质粒后，将其导入哺乳动物的受精卵中，由该受精卵发育成的转基因动物进入泌乳期后，可通过分泌乳汁来生产药用蛋白。利用上述乳腺生物反应器，科学家已获得了种类繁多的医药产品。下列说法正确的是（　　） A．质粒是一种只存在于原核细胞拟核DNA外、具有自我复制能力的环状DNA分子 B．E.coli DNA连接酶能将具有互补黏性末端的DNA片段连接起来 C．构建重组质粒时使用的启动子应能启动药用蛋白基因在任意细胞中表达 D．“将重组质粒导入哺乳动物的受精卵中”是乳腺生物反应器制作的核心工作 9．（23-24高二下·山东威海·期末）DNA复制过程中，其中一条链作模板时不能连续合成新的子链，需要在子链的起始端先合成一段RNA引物，然后在DNA聚合酶催化下形成新的子链片段，这一过程不断重复，最终在相关酶的作用下将这些片段之间的RNA引物去除并补平缺口，使子链片段连接形成完整的DNA链。下列说法错误的是（　　） A．DNA复制时的解旋过程需要解旋酶和能量 B．DNA聚合酶沿3′→5′方向延伸子链 C．RNA水解酶和DNA连接酶也参与了DNA复制过程 D．DNA的复制不是完全连续的复制过程 10．（23-24高二下·山东泰安·期末）对基因进行编辑是生物学研究的重要手段，如图是对某生物B基因进行定点编辑的过程，该过程中用sgRNA(sgRNA大约有60～80个核苷酸，由单独的基因转录而成)指引Cas9蛋白结合到特定的切割位点，下列说法不正确的是（    ） A．通过观察破坏B基因后生物体的功能变化可推测B基因的功能 B．基因定点编辑时可能涉及sgRNA与B基因的碱基互补配对 C．Cas9蛋白可断裂脱氧核苷酸之间的化学键 D．被编辑后的B基因不能表达相关蛋白质 11．（23-24高二下·山东泰安·期末）dNTP（包括dATP、dTTP、dGTP、dCTP）的结构与ATP类似，除碱基不同外，dNTP含有脱氧核糖。与dNTP相比，ddNTP的五碳糖为双脱氧核糖，其3'碳位为-H且不能与磷酸形成化学键。现有甲~丁四个PCR反应体系，甲体系中含有放射性磷标记的ddATP（记作ddATP+）和DNA模板链。PCR完成后，经电泳（分子量小的DNA在电场中移动快）将甲体系中一组长度不等的DNA单链分离。丙、乙、丁三个PCR体系与甲相似，分别用于检测T、C、G的碱基序列，检测结果如图。下列相关叙述正确的是（　　） A．ddATP+中的放射性磷酸基团应位于ddATP的末端 B．模板DNA的碱基序列为3'CTGGACTGACAT5' C．甲体系中除含ddATP+外，还应含有dTTP、dGTP、dCTP D．ddNTP与dNTP竞争脱氧核苷酸链的3'末端和5'末端 12．（23-24高二下·山东临沂·期末）研究人员将OsG、EcC、EcG和TSR 四种酶的基因分别与叶绿体转运肽基因连接，构建多基因表达载体（载体部分序列如下图所示），然后利用农杆菌转化法转化水稻，在水稻叶绿体内构建了一条新代谢途径，提高了水稻的产量。下列叙述正确的是（　　）    A．转基因水稻的根细胞内不含有上述四种目的基因 B．可选用含卡那霉素或潮霉素的培养基筛选被转化的水稻细胞 C．图中叶绿体转运肽基因转录时都以 DNA 的同一条单链为模板 D．可用抗原—抗体杂交技术检测叶绿体中是否含有四种酶 13．（23-24高二下·山东临沂·期末）洋葱是一种常用的生物学实验材料，下列相关说法错误的是（　　） A．紫色洋葱鳞片叶外表皮细胞可用来观察细胞的吸水和失水 B．用斐林试剂检测白色洋葱鳞片叶中的还原糖需要水浴加热 C．可用预冷的体积分数95%酒精提取洋葱鳞片叶研磨液中的DNA D．可用无水乙醇分离洋葱叶片中叶绿体内的四种色素 14．（23-24高二下·山东日照·期末）关于采用琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR产物的实验，下列叙述错误的是（    ） A．琼脂糖凝胶浓度的选择需要考虑 待鉴定的DNA片段的大小 B．凝胶载样缓冲液中指示剂的作用是指示电泳过程中DNA分子的位置 C．可以在紫外灯下观察被凝胶中的核酸染料染色的DNA分子的位置 D．可以根据相同时间内DNA分子在凝胶中的迁移距离来判断其大小 15．（23-24高二下·山东青岛·期末）某研究小组构建了能表达 ACTA1-GFP 融合蛋白的重组质粒，该重组质粒的部分结构如下图所示。下列叙述错误的是（　　） 注：F1和F2表示上游引物，R1和R2表示下游引物 A．RNA 聚合酶与启动子结合，调控 ACTA1 基因和GFP基因的表达 B．使用F2和R2一对引物，可以确定ACTAl基因插入方向是否正确 C．ACTA1基因转录的模板链是a链，引物F1与b链的部分序列相同 D．为了减少PCR 中非特异性条带的产生，可以适当升高复性的温度 16．（23-24高二下·山东青岛·期末）某实验小组利用鸡血细胞进行DNA的粗提取及电泳鉴定，并对鸡的CHD基因进行PCR扩增。在进行提取时，实验人员向鸡血细胞液中加入一定量的蒸馏水并搅拌，过滤后所得滤液进行处理后再进行过滤，在得到的滤液中加入特定试剂后离心提取出纯度较高的DNA。下列相关叙述正确的是（    ） A．提取时的“处理”是加入与滤液体积相等的、体积分数为95%的冷却的酒精 B．PCR反应体系中必须含有CHD基因的引物、Ca2+、4种脱氧核糖核苷酸等成分 C．PCR实验中的微量离心管、枪头和蒸馏水等在使用前必须进行高压灭菌 D．DNA分子具有可解离的基团，在电场作用下这些基团可以带上正电荷或负电荷 17．（23-24高二下·山东济南·期末）干扰素是动物细胞受到病毒侵染后产生的一种糖蛋白，可用于对抗病毒的感染，但在体外难以保存。下图是利用蛋白质工程设计生产干扰素的流程图，正确的是（　　）    A．干扰素 X射线衍射的高级结构是构建新干扰素模型的主要依据 B．将新的干扰素基因插入启动子和终止子之间是其成功表达的条件之一 C．改造干扰素结构的实质是改造干扰素中氨基酸的排列顺序 D．新的干扰素基因在大肠杆菌体内正常表达即可得到预期的新的干扰素 18．（23-24高二下·山东济南·期末）肿瘤坏死因子（TNF-α）是一种抑制肿瘤细胞生长的蛋白质。科研人员将 TNF-α基因和质粒pPIC9K（部分结构如图所示）构建成重组质粒，并导入酵母菌 SD-TRP（色氨酸缺陷菌株）中，筛选得到了能分泌肿瘤坏死因子的工程菌株。下列有关叙述错误的是（　　）      A．构建重组质粒时可选用 HindⅢ和EcoR V 切割目的基因和质粒 pPIC9K B．由 TNF-α基因和质粒pPIC9K 构成的所有重组质粒都能用E. coliDNA 连接酶连接 C．色氨酸合成基因和四环素抗性基因都可以作为标记基因，筛选导入重组质粒的酵母菌细胞 D．用 PCR 技术检测 TNF-α基因是否插入到酵母菌的染色体上 19．（23-24高二下·山东济南·期末）关于“DNA的粗提取与鉴定”及“DNA片段的扩增及电泳鉴定”实验操作。下列叙述正确的是（　　） A．“DNA的粗提取与鉴定”中，用95%的酒精预冷后可以更好地溶解DNA，以利于获得 DNA B．“DNA的粗提取与鉴定”中，提取DNA时，将研磨液加入切碎的洋葱，充分研磨后过滤，弃去上清液 C．“DNA片段的扩增及电泳鉴定”中，电泳一段时间后，离加样孔越近的DNA分子越小 D．“DNA片段的扩增及电泳鉴定”中，可通过观察指示剂在凝胶中迁移的位置来判断何时停止电泳 20．（23-24高二下·山东德州·期末）滚环扩增技术的原理如图所示：两侧含有待扩增核酸的线性单链模板，在锁环探针和DNA 连接酶的帮助下，两端靠近并连接成环状成扩增模板。phi29 DNA 聚合酶催化子链合成的过程中，当遇到双链结构时可使双链分开，并继续子链的延伸，最终形成一条由数个重复序列串联而成的单链DNA。下列说法正确的是（    ） A．锁环探针与引物都必须与待扩增核酸序列互补 B．phi29 DNA 聚合酶催化氢键的断裂和磷酸二酯键的形成 C．该技术需通过改变温度以进行变性、复性和延伸的过程 D．该技术得到的重复序列即为待扩增核酸序列 21．（23-24高二下·山东济南·期末）下列关于DNA的粗提取、分离与鉴定技术的说法正确的是（    ） A．DNA 的溶解度与 NaCl溶液的浓度成正相关 B．在一定温度条件下，DNA 遇组胺试剂呈现蓝色 C．电泳时，DNA分子会向着与它所带电荷相反的电极移动 D．将电泳缓冲液加入电泳槽中，电泳缓冲液不能没过凝胶 二、多选题 22．（23-24高二下·山东菏泽·期末）下列有关酶的叙述，正确的是（    ） A．DNA连接酶以DNA的一条链为模板，将单个脱氧核苷酸连接起来 B．反转录酶是以RNA为模板指导脱氧核糖核苷酸连接合成DNA的酶 C．DNA聚合酶可将两个DNA分子片段间的缝隙连接起来 D．限制性内切核酸酶识别特定的核苷酸序列并在特定位点切割DNA分子 23．（23-24高二下·山东临沂·期末）dNTP（脱氧核糖核苷三磷酸）是dATP、dGTP、dTTP、dCTP四种物质的统称，常在PCR中做原料。ddNTP是双脱氧核苷三磷酸，有ddATP、ddGTP、ddTTP、ddCTP4种。DNA合成时，在DNA聚合酶作用下，ddNTP与dNTP竞争核苷酸链延长位点。若连接上的是双脱氧核苷酸，子链延伸终止；若连接上的是脱氧核苷酸，子链延伸继续。在4个试管中分别加入4种dNTP和1种ddNTP进行PCR，在4个试管中形成不同长度的DNA单链片段，这些片段随后可被电泳分开（过程如图所示）。下列说法中正确的是（　　） A．dNTP连接在核苷酸链的5'末端 B．电泳图谱中的箭头所指的DNA片段以鸟嘌呤结尾 C．未知序列的碱基序列为3'-CTAAGCTCGACT-5' D．ATP、dATP 和ddATP中A都由腺嘌呤和脱氧核糖组成 24．（23-24高二下·山东菏泽·期末）为了获得未知序列的碱基序列，可以通过利用已知序列设计的引物对未知序列进行扩增，再对其扩增产物进行测序，其过程如图。下列说法正确的是（　　）    A．图示过程中需要用到限制酶、DNA连接酶和耐高温的DNA聚合酶 B．环化阶段，可选用E.coliDNA连接酶或T4DNA连接酶 C．以环化的DNA为模板进行PCR时，应选择引物2和引物3 D．若1个DNA分子用PCR技术扩增n次，则需要2n+1-2个引物 25．（23-24高二下·山东青岛·期末）与传统的酶切再连法相比，无缝克隆技术构建重组质粒有不受限制酶切位点的限制等优点。无缝克隆技术连接DNA片段的机理如图所示，T5核酸外切酶能从DNA单链的末端逐个切割脱氧核苷酸，下列说法正确的是（    ） A．T5核酸外切酶与限制性内切核酸酶切割的化学键相同 B．T5核酸外切酶沿3¹→5'的方向水解DNA，形成黏性末端 C．图中过程②出现“缺口”的原因是过程①形成的黏性末端长于互补配对的区段 D．完成过程③需要用到的酶是DNA聚合酶 26．（23-24高二下·山东东营·期末）如图1所示，质粒pZHZ9上含有X 抗生素抗性基因（XR） 和Y 抗生素抗性基因（YR）。 其中XR 内部含有限制酶KasI识别序列，YR 内部含有限制酶FseI、HpaII、NaeI、NgoMIV 识别序列，五种酶的识别序列如图2（J 表示切割位点），且这些识别序列在整个质粒上均 仅有一处，目的基因内部不存在这些识别序列。利用合适的工具酶构建重组质粒pZHZ10.下列叙述错误的是    A．若要将结构如图3所示的目的基因直接插入到YR内形成重组质粒则 pZHZ9需用限制酶FseI切开 B．若同时用KasI和NaeI完全酶切重组质粒pZHZ10（只含单个目的基因），则可能产生的酶切片段数为2 C．一般先用Ca2+处理微生物细胞，然后再将重组质粒pZHZ10导入处理的细胞中 D．在含X抗生素的培养基和含Y抗生素的培养基上，均能生长的受体细胞即为成功导入 目的基因的细胞 27．（23-24高二下·山东济南·期末）目的基因的获取可以直接以细胞DNA为模板，通过PCR技术获取。但是因DNA中可能含有多区段与引物配对的碱基序列而失败。巢式PCR 可以避免以上问题，其原理为：先以比目的基因大的DNA 片段为模板，用一对引物进行扩增，获得大量含目的基因的中间产物，再以扩增后的中间产物为模板，用另一对引物扩增目的基因，过程如图所示。下列说法正确的是（　　） A．两对引物的碱基序列各不相同，且均为与模板DNA 配对的单链RNA片段: B．第一轮PCR 目的是缩小模板 DNA 的范围并增加第二轮 PCR 的模板数量 C．因模板 DNA 中与两套引物均互补的靶序列较少，该技术可大大提高扩增的特异性 D．第一轮 PCR 所需引物 F1 和 R1之间应尽量避免出现碱基互补配对序列 28．（23-24高二下·山东德州·期末）DNA足迹法常用来检测蛋白质在DNA上的结合位点，其原理如图所示。先将待测DNA一条链的一端用放射性同位素标记，加入 DNA 结合蛋白后，再用核酸内切酶DNase I 随机切割待测 DNA，被蛋白质结合的区域可免于切割。最后将酶切后的DNA 片段变性后电泳，放射性同位素标记的DNA经处理后会显示出条带。下列说法错误的是（    ）    A．核酸内切酶DNase I 和限制酶均可破坏磷酸二酯键 B．若通过PCR 标记 DNA 末端，仅需一种引物含有放射性同位素 C．电泳结果中显示的是经 DNase I切割后的所有 DNA片段 D．蛋白质的结合位点仅位于乙区域对应的DNA片段 29．（23-24高二下·山东泰安·期末）关于“DNA的粗提取与鉴定”实验，下列说法正确的是（  ） A．过滤液沉淀过程在4℃冰箱中进行是为了防止DNA降解 B．离心研磨液是为了加速DNA的沉淀 C．在一定温度下，DNA遇二苯胺试剂呈现蓝色 D．粗提取的DNA中可能含有蛋白质 30．（23-24高二下·山东淄博·期末）为研究一种双链DNA 分子 A的分子质量大小，用不同的限制酶对A进行切割，切割产物通过琼脂糖凝胶电泳进行分离，用大小已知的DNA片段的电泳结果作为分子质量大小的标记。下列说法正确的是（　　）    A．DNA 分子的迁移速率与凝胶浓度、DNA 分子大小和构象有关 B．凝胶中加入DNA染色剂，电泳后将凝胶放在紫外灯下观察 C．A为一个环状DNA分子，有一个 NotⅠ酶切位点和两个 EcoRI酶切位点 D．A的分子质量大小为10kb，NotI酶切位点与 EcoRI酶切位点的最大距离为2kb 三、解答题 31．（23-24高二下·山东临沂·期末）水中雌激素类污染物A会导致鱼类雌性化等异常。斑马鱼幼体透明且肌细胞和生殖细胞均存在雌激素受体。将ERE、UAS、Gal4基因和绿色荧光蛋白（GFP）基因共同转入斑马鱼，培育出转基因斑马鱼MO。MO可以经济且快速地监测水体中的A，原理如方案一。回答下列问题： 注:ERE和酵母来源的UAS是两种诱导型启动子，分别被A-受体复合物和酵母来源的Gal4蛋白特并性激活，启动下游基因表达。 (1)通过PCR 特异性扩增GFP基因需先设计引物，该引物应该是一小段 的短单链核酸。为使PCR产物能被特定限制酶切割，需在引物 （填“3’”或“5’”）端上添加相应的限制酶识别序列。 (2)A 进入幼体转基因斑马鱼 MO 的肌细胞后，促进Gal4 蛋白的合成，特异性激活UAS，使其与 结合，启动GFP基因的表达。与图中方案二相比，MO在监测 A方面的主要优势是 。 (3)科学家用上述转基因斑马鱼MO 和另一种转基因斑马鱼X 杂交制备一种不育的监测斑马鱼SM。成体斑马鱼X和SM在自身产生的雌激素诱导下引起生殖细胞凋亡，造成不育。欲获得X，需将生殖细胞凋亡基因和启动子 （填写相应序号：①ERE ②UAS ③使基因仅在生殖细胞表达的启动子）构建表达载体并转入野生型斑马鱼受精卵。选择该启动子的理由是 。 (4)将不育斑马鱼SM用于实际检测的目的是 。 32．（23-24高二下·山东聊城·期末）棉铃虫和蚜虫是常见的棉花害虫。已知基因cryIA的表达产物对棉铃虫有较强的毒性，基因gna的表达产物对蚜虫有较强的毒性。科研人员将基因cryIA与基因gna连接在一起，构建了含双抗虫基因的重组表达载体，并转入棉花细胞中，获得了具有双抗性的转基因棉花，其部分过程如图所示。回答下列问题： 注：Klenow能将黏性末端转变为平末端；图中不同限制酶切出的黏性末端均不同 (1)过程③中将基因cryIA与基因gna相连，可选用 （填“E.coliDNA连接酶”或“T4DNA连接酶”）。图中将目的基因导入棉花细胞采用了农杆菌转化法，该方法的原理是 。 (2)鉴定该转基因棉花是否被赋予相应的抗虫特性，请从个体生物学水平提供具体方法： 。 (3)针对上述转基因棉花的安全性，不同的人具有不同的观点。有人认为种植了这种转基因棉花的农田中的杂草一般不会出现抗虫性状，原因可能是 ,棉花很难与杂草进行杂交。为了防止抗虫基因通过花粉传播，科研小组考虑将抗虫基因导入棉花根尖细胞的 中，同时将抗虫棉花和普通棉花混合种植，请从生物进化的角度阐述混合种植的优点是 。 33．（23-24高二下·山东临沂·期末）赖氨酸是人体的必需氨基酸，而人类主要食物中的赖氨酸含量很低，我国首次利用转基因和体细胞核移植技术成功培育了高产赖氨酸的转基因克隆奶牛。回答下列问题： (1)构建乳腺专一表达载体：将富含赖氨酸的酪蛋白基因（目的基因）与含有 的启动子的相应载体连接，构建出乳腺专一表达载体。 (2)核移植：将表达载体包裹到磷脂等构成的脂质体内，与牛胚胎成纤维细胞（BEF）膜融合，最终表达载体进入细胞核。将转基因的BEF作为核供体细胞，从牛卵巢获取卵母细胞，经体外培养至 期去核后作为受体细胞，通过 法使两种细胞融合形成重构胚，该融合法除了促进细胞融合，同时起到 的作用。 (3)重构胚的体外培养及胚胎移植：重构胚体外培养至 ，可进行 ，从而获得同卵多胎，然后植入代孕母牛子宫，直至小牛出生。 (4)目的基因的检测：分别从转基因牛乳汁中的脱落细胞和转基因牛耳组织细胞提取总RNA，经 形成cDNA1和cDNA2，检测是否有目的基因片段。若目的基因成功表达，检测结果是 ，原因是 。 34．（23-24高二下·山东菏泽·期末）半夏蛋白具有凝血和凝集细胞的生物活性，还具有抑菌、抗肿瘤等作用。以下是科研人员利用基因工程技术获得半夏蛋白的大致流程。回答下列问题： (1)科研人员猜测对半夏接种某种病菌可激发半夏蛋白基因表达，可在接种病菌后提取半夏块根细胞中总 RNA，再纯化获得相关mRNA，进而在 酶的作用下得到半夏蛋白基因。 (2)科研人员欲利用pET-28a质粒将上述筛选的半夏蛋白基因导入宿主菌大肠杆菌DH5a（缺乏DNA修饰，缺乏“免疫”机制，且对氨苄青霉素敏感）中，以构建高效表达半夏蛋白基因的菌株。pET-28a质粒上含有氨苄青霉素抗性基因（AmpR）、LacZ 基因和一些酶切位点，其结构如图。    PO： 启动子 ori： 复制原点 Amp*：氨苄青霉素抗性基因 LacZ： β—半乳糖苷酶基因 ①为获得更多的半夏蛋白基因，可利用 PCR 技术进行扩增。为保证半夏蛋白基因与pET-28a质粒的正向连接，在设计PCR 引物时，应在引物的 （填“3’”或“5’”）端添加限制酶 的识别序列。根据上述信息，写出目的基因上游引物的10个碱基序列：5' 3'。引物与DNA结合发生在PCR 的 阶段。 ②β-半乳糖苷酶可以分解 X-gaI 产生蓝色物质，使菌落呈现蓝色，否则菌落为白色。将基因表达载体导入宿主菌后（转化成功率并不是 100%），转化后的宿主菌在含有 的固体培养基上可以长出 色的菌落，以此筛选出成功导入重组 pET-28a质粒的宿主菌。 ③利用 技术检测宿主菌是否表达出半夏蛋白。 (3)为了满足人们对不同产品的应用需求，有时会在载体中人工构建诱导型启动子，当诱导物存在时，可以激活或抑制 。 35．（23-24高二下·山东青岛·期末）1965 年中国科学家人工合成了具有生物活性的结晶牛胰岛素，摘取了人工合成蛋白质的桂冠。此后科学家又提出了利用基因工程改造大肠杆菌生产人胰岛素的两种方法：“AB”法是根据胰岛素A、B 两条肽链的氨基酸序列人工合成两种DNA 片段，利用工程菌分别合成两条肽链后将其混合自然形成胰岛素；  “BCA”法是利用胰岛B 细胞中的 mRNA 得到胰岛素基因，利用工程菌获得胰岛素。这两种方法使用同一种质粒作为载体。请回答下列问题： (1)由于 ，“AB”法中人工合成的两种 DNA 片段均有多种可能的序列。 （填“AB”、“BCA”或“AB 和 BCA”） 法获取的目的基因中不含人胰岛素基因启动子。 (2)通过PCR技术扩增目的基因时，所需的酶为 ，该酶的最适温度是 ℃。对人工合成的胰岛素基因进行测序，发现其两端附近无限制酶EcoRI、BamHI 的酶切位点。已知胰岛素基因表达时以①链为模板，下图是利用基因工程生产人胰岛素过程中使用的质粒及目的基因的部分结构。为保证人胰岛素基因能正确连接到用限制酶EcoRI 和BamHI处理的图1所示质粒上，且利用表达载体上的启动子在受体菌中以①链为模板进行转录，则应在配对到②链的引物5'端添加6个碱基，序列为 5'- -3'。PCR 扩增过程中，最早经过 轮循环后，便可获得两端均携带限制酶识别序列的所需双链目的基因。 (3)若使用一种限制酶切割目的基因和载体后，会存在目的基因的正向或反向两种连接产物， （填“可以”或“不可以”）通过电泳来区分两种产物，在凝胶中 DNA 分子的迁移速率与 （列举两点）等有关。 (4)天然胰岛素制剂容易形成二聚体或六聚体，皮下注射胰岛素后往往要经历一个逐渐解离为单体的过程，这在一定程度上延缓了疗效。科学家希望利用蛋白质工程技术，对胰岛素进行改造，基本思路是：从预期的蛋白质功能出发→ → →找到并改变相对应的脱氧核苷酸序列（基因）或合成新的基因→获得所需要的蛋白质。 36．（23-24高二下·山东青岛·期末）酵母细胞中存在一种转录调节机制：基因的转录需要转录因子，转录因子包括BD蛋白和AD蛋白，两蛋白分开时不能激活转录。图1为用于研究外源X蛋白和Y蛋白能否相互结合的机制模式图。先将X蛋白、Y蛋白分别与BD蛋白、AD蛋白连接，若X蛋白和Y蛋白能相互结合，就能通过该机制驱动报告基因的转录。科研人员利用上述机制，研究水稻抗虫性状相关的两种重要调节蛋白R1蛋白与R2蛋白是否能相互结合，所利用的报告基因为荧光蛋白基因。 (1)欲将BD蛋白与R1蛋白连接，AD蛋白与R2蛋白连接，需将相关的基因连接形成融合基因，科研人员构建了图2所示的基因表达载体，要将R1蛋白基因和R2蛋白基因分别插入载体中，获得两种融合基因表达载体，共需要 种酶。 (2)科研人员先将上述两种融合基因表达载体分别导入大肠杆菌细胞，以获得 ，再将两种融合基因表达载体同时导入含有 的酵母细胞中，相关基因表达后，即可判断R1蛋白与R2蛋白能否相互结合。 (3)为排除融合基因不转录等因素引起的实验误差，可利用PCR技术检测受体酵母细胞中融合基因是否转录，大致思路是：提取待检测酵母细胞中的总RNA，再经 形成cDNA，并以此为模板，根据 设计引物进行PCR扩增，电泳鉴定，若有扩增产物说明融合基因已转录，反之，则说明融合基因未转录。 (4)为了得到符合预期的融合蛋白，BD基因序列的尾部不能含有 序列，经上述改造后，将融合基因表达载体导入酵母细胞后，融合基因转录出的mRNA序列正确，翻译出的融合蛋白中BD蛋白的氨基酸序列正确，但R1基因指导合成的氨基酸序列与R1蛋白不同。据图3分析，出现该问题的原因是 。为解决这一问题，可在扩增R1蛋白基因时将引物中的EcoRI识别序列 （填“3'端”或“5'端”）添加1个碱基。 37．（23-24高二下·山东东营·期末）研究发现基因L 能够调控大豆的逆境响应。利用基因工程技术编辑基因L，可培育耐盐碱大豆品系。在载体上的限制酶Bsa I切点处插入大豆基因L的向导DNA序列， 将载体导入大豆细胞后，其转录产物可引导核酸酶特异性结合基因组上的目标序列并发挥作用。载体信息、某些限制酶的识别序列及切割位点如图所示。    (1)目标基因L的向导DNA序列经限制酶 切割，形成的单链突出末端为黏性末端，与酶切后载体混合，再经 （ 填“T4DNA连接酶”、“E.coliDNA 连接酶”、“T4DNA连接酶或E.coliDNA连接酶”）高效作用后，可形成重组载体。基因L的向导DNA 序列经切割后插入图中载体时其左侧、右侧的黏性末端序列分别为5'- -3'和5'- -3'。 (2)根据农杆菌 的特点，将目的基因插入农杆菌特定的DNA序列中，就可将目的基因导入大豆细胞，进而培育出大豆植株甲。此过程中使用含氨苄霉素的培养基筛选转化的 细胞（填“大豆”或“农杆菌”或“大豆和农杆菌”）。根据导入质粒的情况， 筛选出的转化细胞有两种，在此培养基上不能区分这两种细胞的原因是 。 (3)以上述大豆植株甲的DNA 为模板，通过PCR扩增目标基因L， 假设起始的有效DNA模板数为n，在扩增过程中，第5次循环共形成 条目标基因L的单链。为了鉴定 基因编辑是否成功，再利用电泳等技术对PCR 扩增的产物进行鉴定。除上述分子水平的 检测外，还需进行个体生物学水平的鉴定，可采用的方法是 。 38．（23-24高二下·山东济南·期末）地衣芽孢杆菌产生的胞外多糖（EPS）通过促进大粒径土壤团聚体形成以改良土壤。研究者利用EPS合成酶基因（H基因）和含木糖诱导型启动子的p质粒（二者结构如图1所示）构建重组载体，以改造地衣芽孢杆菌并获取高产菌株。    (1)图1中H 基因以a链为转录模板链，由此可以推测H基因的转录是从其 （填“左侧”或“右侧”）开始的。H基因上的一段序列为：5´-ATCTCGAGCGGG-3´中包含 Xho识别序列（含有6个核苷酸），则这 6个核苷酸序列是 。构建重组质粒时，为保证 H基因与p质粒正确连接，p质粒位点1和2的所对应的酶分别是 ，酶切后加入 酶使它们形成重组质粒。 (2)将构建好的重组质粒转入经 处理后的地衣芽孢杆菌，经筛选获得到转基因地衣芽孢杆菌。对其进行工业培养时，添加木糖获取更多EPS的机理是 。 (3)质粒在细菌细胞中遗传不稳定，易丢失，研究者尝试将重组质粒进行改造，利用同源区段互换的方法将H基因插入地衣芽孢杆菌的拟核DNA中，得到整合型地衣芽孢杆菌F。若将三种地衣芽孢杆菌进行培养，结果如图3。其中D菌为不含有 H基因的地衣芽孢杆菌，E菌含有 H基因，但 H基因没有整合到地衣芽孢杆菌的拟核DNA 中。据图判断 最适宜改良土壤生产胞外多糖（EPS），请阐明理由 。    39．（23-24高二下·山东济南·期末）研究发现，大部分白血病患者细胞中存在异常的融合基因 UBA2-WTIP，可作为检测白血病的特异性分子标志物。科研人员通过 RT-PCR 方法克隆得到融合基因UBA2-WTIP，为了研究该基因的作用和致病机制，需要构建重组载体并把目的基因和FLAG标签基因序列连接起来，分别获得带有 FLAG 肽链的 UBA2-WTIP 融合蛋白和WTIP 蛋白。FLAG肽链由8个氨基酸残基组成，可作为基因工程中蛋白质是否表达的标记。 (1)科研人员以提取的某白血病人外周血细胞总 RNA为模板，经过 过程合成cDNA,设计 种引物,经RT-PCR扩增出融合基因 UBA2-WTIP,对测序结果进行数据分析,推测融合基因UBA2-WTIP 是在 UBA2基因的第16 外显子与 WTIP 基因的第2 外显子处拼接而成，如图1所示。为了验证该融合基因的产生是基因组DNA融合而不是不同的RNA 剪接后逆转录所产生的，可提取该病人的 (填“DNA”或“RNA”)为模板，使用图中F₁ 和 R₁ 引物进行PCR扩增，若出现 bp扩增片段，说明该融合基因的融合方式是基因组水平融合。 (2)为了构建重组载体，科研人员设计了以下2种引物，如图2所示：上游引物F2为:5’TATGGTACCATG①GCACTGTCGCGGGGG3’,GGTACC 为 KpnI酶切位点；下游引物R2为:5’TAT②TCA③GAGCTCAGTGACGTG3’;FLAG标签基因编码链序列可以插入目的基因编码区的首端或者末端。已知引物中 ATG对应起始密码。若UBA2-WTIP融合基因编码的蛋白质前端有一段信号肽，则 FLAG 标签基因序列一般不能插入①位置，原因是 ；已知引物中 TCA 对应终止密码，则FLAG 标签基因序列和EcoRⅠ酶切位点应分别插入在下游引物 、 处。 (3)制备的重组载体体外转染人类白血病细胞株 KG-1a细胞，提取各组细胞总蛋白，用FLAG 单克隆抗体检测蛋白表达情况，并分别测定转染空质粒的对照细胞、转录 UBA2-WTIP 融合基因及转录 WTIP 基因的KG-1a细胞增殖情况，结果分别如图3所示。 检测相关蛋白质是否表达的方法是 ；上述生长曲线结果说明 。 一、单选题 1．（23-24高二下·山东威海·期末）拟南芥中RGL1酶作为E3泛素连接酶（AtRZF1）的抑制因子在响应植物干旱胁迫中发挥着重要作用。研究发现，AtRZF1功能丧失突变体比野生型拟南芥具有更高的耐旱性。研究人员采用融合PCR技术（原理如下图所示）将RGL1酶基因和AtRZF1基因连接起来构建融合基因以研究两种基因的相互作用。下列说法正确的是（　　）    A．RGL1酶在植物干旱胁迫响应中起到正调控作用 B．图中第一阶段经过1次PCR循环即可获得双链等长的DNA C．图中第二阶段构建融合基因时能够起到“搭桥融合”作用的引物有4种 D．融合PCR技术操作过程中的每个阶段都需经历两次降温和一次升温 2．（23-24高二下·山东菏泽·期末）科学家将某病毒抗原蛋白的部分编码序列（RBD）拼接成融合基因2RBD和3RBD，探究RBD的二聚体蛋白和三聚体蛋白能否模拟RBD的天然构象并获得高效免疫原性。为鉴定重组质粒是否构建成功，将重组质粒用NcoI和SacI双酶切处理后电泳，结果如图，其中泳道1为双酶切pNZ8149-2RBD，两个条带大小分别为2507bp和2020bp。将构建好的重组质粒分别导入工程菌中进行表达产物的检测。下列说法不正确的是（    ） A．PCR扩增融合基因时，在引物的3′端添加相应限制酶的识别序列 B．据图可知，融合基因3RBD的长度为2686bp C．泳道2呈现一个条带的原因是酶切pNZ8149﹣3RBD产生的两个片段大小相近 D．从工程菌细胞表面提取蛋白质进行检测，从而进一步比较两者的免疫原性 3．（23-24高二下·山东青岛·期末）目前用于治疗人类疾病的单克隆抗体大多数是鼠源单抗。研究人员根据抗体的特点，利用蛋白质工程将鼠源单抗进行改造，思路如图所示，下列说法正确的是（    ） A．图中所示的思路不涉及基因工程的相关操作 B．通过此项研究改造后获得的性状不能遗传给后代 C．上述改造过程中需要明确人源恒定区的基因的碱基序列 D．鼠源单抗易引发人体免疫排斥反应与其可变区有关 4．（23-24高二下·山东青岛·期末）研究人员利用定点诱变技术对ALDH2（乙醛脱氢酶2）基因进行改造，使其在大肠杆菌中表达，所用质粒和操作过程如图。改造后的ALDH2基因编码区首端到末端（其中一条链）的序列为5'-ATCCATGCGCTC…（中间核苷酸序列）CAGTGAGTAGCG-3'。 注:Ampr为氨苄青霉素抗性基因 Tetr为四环素抗性基因 BamHⅠ的识别序列及切点:5'G↓GATCC3'   PstI的识别序列及切点:5'C↓TGCAG3' XhoⅠ的识别序列及切点:5'C↓TCGAG3' XbaI的识别序列及切点:5'T↓CTAGA3' 为扩增上图中改造的ALDH2基因，某同学设计了如下四种PCR引物，其中可选用的一对引物是（    ） ②5'-TCTAGAATCCATGCGCTC-3' ①5'-TCTAGACGCTACTCACTG-3' ③5'-GGATCCATCCATGCGCTC-3' ④5'-GGATCCCGCTACTCACTG-3' A．②③ B．①④ C．②④ D．①③ 5．（23-24高二下·山东东营·期末）具核梭杆菌（Fn）侵入肠黏膜后可导致结直肠癌。图为荧光标记滚环扩增法检测Fn的 过 程 ，nusG 基因为Fn 的特异性基因序列，只有当环境中存在该基因序列时，过程②中 锁式探针才能环化；检测探针的荧光基团（FAM）距离淬灭基团（BHQ-1）比较近时，荧 光会被淬灭。图中④为滚环扩增技术（RCA）， 此过程中以环化的锁式探针为模板，以nusG 基因单链为相关引物，通过类似于PCR 的过程，获得了长重复单链DNA．下列叙述错误的是（　　） A．与常规PCR相比RCA缺乏变性步骤，推测所用DNA聚合酶可能不具有耐高温的特性 B．由图推测，应根据nusG 基因的序列设计锁式探针两端的检测臂 C．若检测样品存在Fn， 检测探针的FAM与BHQ-1距离增大，荧光基团发出荧光 D．利用荧光标记滚环扩增法检测肠黏膜中的Fn时需获取大量样品 6．（23-24高二下·山东滨州·期末）我国科研人员借助CRISPR/Cas9技术对小麦的基因进行编辑，获得了抗白粉病小麦。CRISPR/Cas9基因编辑工作原理如图所示。下列说法错误的是（　　）    A．基因编辑过程中通过Cas9特异性识别目标DNA的碱基序列 B．Cas9-sgRNA复合物与限制酶均可断开特定部位的磷酸二酯键 C．基因编辑小麦没有引入外源基因，理论上来说其安全性高于传统转基因作物 D．sgRNA序列越短，进行基因编辑的过程中“脱靶”的风险越大 二、解答题 7．（23-24高二下·山东威海·期末）种子活力的高低是衡量种子品质的重要指标，对作物的高产、稳产至关重要。种子在贮藏期间易发生老化劣变，造成种子活力降低从而影响作物产量。研究表明，玉米的ZmRap2.7基因（编码转录因子ZmRap2.7）与种子贮藏后的活力显著相关。 (1)与正常玉米植株相比，敲除了ZmRap2.7基因的突变体种子发芽率显著降低且易老化，由此推知，ZmRap2.7基因 （填“正调控”或“负调控”）玉米种子的耐贮性。 (2)为了探究ZmRap2.7基因的作用机理，科研人员利用PCR技术在体外扩增ZmRap2.7基因，加入的引物需满足的条件是 ；扩增产物可通过琼脂糖凝胶电泳来鉴定，其原理是 ；鉴定过程中，除了将扩增得到的PCR产物与凝胶载样混合注入凝胶加样孔外，还应留一个加样孔加入 。 (3)科研人员采用DNA阻滞实验探究发现：转录因子ZmRap2.7通过与某些特定DNA分子（ABA信号传导基因ZmPYL3、ZmPP2C、ZmABI5的启动子）结合从而发挥调控作用。该实验方法的原理是：当被荧光标记的待测DNA与蛋白质（如转录因子ZmRap2.7）结合后，由于形成的复合物分子量显著增大，电泳后通过荧光检测可显示出明显 （填“领先”或“滞后”）于游离待测DNA的条带。由此推测转录因子ZmRap2.7通过直接结合到ABA信号传导基因ZmPYL3、ZmPP2C、ZmABI5的启动子上，影响了 ，从而抑制上述基因的转录，最终导致ABA无法对种子发挥作用。 (4)科研人员利用DNA阻滞实验进一步探究基因ZmPYL3、ZmPP2C、ZmABI5的启动子序列中能与ZmRap2.7特异性结合的关键序列，分析发现，X1~X6是三者都具备的相似序列。已知X1能结合ZmRap2.7，为探究X2~X6与ZmRap2.7的结合能力，科研小组利用荧光标记的X1作为指示探针，大量无荧光标记的X2~X6序列作为竞争探针，加入相应泳道进行实验。当竞争探针的量远多于指示探针，ZmRap2.7会与结合能力较强的竞争探针结合，指示探针则多数处于自由状态，放射自显影图上阻滞条带的放射性就会显著 。实验中每个泳道添加的物质及荧光检测结果如右图所示：图中“？”是指加入 ，阻滞条带的宽窄代表 。据图分析可知，X2~X6序列中， 与ZmRap2.7的结合能力最强。 8．（23-24高二下·山东日照·期末）科研人员将除草剂草甘膦抗性基因转入甘蓝植株，获得抗草甘膦转基因甘蓝植株。培育过程如图1所示。 (1)为便于PCR扩增后的草甘膦抗性基因与质粒连接，需在两个引物的 （填“”或“”）端添加限制的识别序列。扩增产物经酶切后形成的黏性末端（单链突出末端）序列为 和 。 (2)若目的基因用BamHⅠ和BglⅡ剪切，质粒用BamHⅠ剪切，酶切后的目的基因存在正向与反向两种连接方式，可用 酶对两种重组质粒进行剪切。通过琼脂糖凝胶电泳技术对产物分别进行分析，结果如图2所示，样品1和样品2中小片段的长度分别为 kb，图中 （填“样品1”或“样品2”）为所需的基因表达载体。 (3)在过程④的培养基中添加的抗生素为 ，以便筛选出含目的基因的甘蓝植株。鉴定时发现，该过程获得的转基因甘蓝植株有一部分具有草甘膦抗性基因，但没有表现出抗草甘膦性状，原因可能是 （答出1点即可）。 9．（23-24高二下·山东枣庄·期末）某动物体内含有研究者感兴趣的目的基因，研究者欲将该基因导入大肠杆菌的质粒中保存和表达。该质粒含有氨苄青霉素抗性基因（AmpR）、LacZ基因及一些酶切位点，其结构和简单的操作步骤如图所示。 请根据以上信息回答下列问题： (1)若要用PCR技术获取目的基因，需要知道的信息是 ，依据该信息可合成引物。为确保目的基因能与质粒连接，还需要在引物的 （填“3′”或“5′”）端额外添加一段序列5′ 3′。 (2)③过程需要加入 ，磷酸二酯键重新形成后，可能形成的产物有 （回答两种）。 (3)将质粒导入大肠杆菌后，为选择转化成功的大肠杆菌，需要在⑤过程的培养基中添加 ，一段时间后选择 色菌落，即为导入重组质粒的大肠杆菌，原因是 。 10．（23-24高二下·山东德州·期末）小麦的D1b基因是调控光周期的重要基因，当小麦细胞接受足够时长的短日照刺激后，细胞中的A 蛋白就会与D1b基因启动子区中的光周期响应序列结合，进而启动该基因的表达，小麦表现为延迟开花。 (1)D1b基因启动子区位于基因的上游，它除了可接受短日照刺激传递来的信号，还具有的作用是 。 (2)与D1b基因相比，D1a 基因的启动子区缺失了含光周期响应序列的片段（长度约2089bp），但其他序列相同，因此D1a基因会使小麦表现为提前开花。欲利用PCR 扩增出D1b和D1a基因的启动子区，科研人员设计了图1中的引物DF 和DR，引物的作用是 。若D1a基因启动子区扩增产物为 709bp，则D1b基因启动子区扩增产物为 bp。 (3)为找到光周期响应序列的位置，将通过引物F1~F9扩增得到的9种片段、D1b启动子区和D1a启动子区分别与报告基因连接成基因表达载体，如图2 所示。为正确构建基因表达载体，引物DR 的序列应为 （5,-3,写出10个碱基）。将构建成功的11组基因表达载体分别转入拟南芥后，用短日照处理，检测不同组的报告基因开始表达的时间。当实验结果为 时，说明光周期响应序列位于引物F7~F8结合的DNA片段之间。 (4)为找到小麦细胞中的A蛋白，科研人员利用组氨酸和亮氨酸双营养缺陷型酵母菌为受体菌，进行了两次转化实验得到双转化的酵母菌，如图3所示。 ①将含光周期响应序列的诱导型启动子与组氨酸合成酶基因连接，构建成诱饵载体，用该载体转化酵母菌后，其会自主整合到酵母菌基因组中。 ②提取小麦总mRNA，通过 得到不同的cDNA，以这些 cDNA 片段为目的基因，以亮氨酸合成酶基因为 基因，构建成猎物载体转化上述酵母菌。 ③将双转化后的酵母菌接种到 的选择培养基上培养，若 ，则说明该组酵母菌中 cDNA 指导合成的是 A 蛋白。 11．（23-24高二下·山东淄博·期末）隐花色素（CRY2蛋白）是拟南芥中一种蓝光受体蛋白，激活后将信号传递到下游，调控植物的光形态建成。为探究蓝光下CRY2蛋白与下游蛋白SPA1间的作用机制，某研究团队将基因SPA1与基因AD（AD 为转录因子1）融合构建了 AD重组载体，将基因CRY2与基因BD（BD 为转录因子2）融合构建了BD 重组载体，将两重组质粒导入带有报告基因His的酵母菌（缺少Trp、Leu合成基因）。酵母菌内报告基因 His的表达产物为组氨酸，转录时需要AD和BD共同作用于转录因子结合序列，两蛋白分开时不能激活 His基因的转录。    (1)研究SPA1蛋白与CRY2蛋白的相互作用时，先提取拟南芥细胞中总 RNA，再通过PCR分别扩增出基因SPA1和基因CRY2，PCR过程需要的酶是 ，加入dNTP 可为PCR 过程提供 。 (2)为正确构建AD—SPA1融合基因，扩增基因SPA1时，与a链结合的引物为 ，需要在其 （填“3’”或“5’”）端添加的限制酶识别序列是 。构建BD—CRY2基因表达载体时，切割基因CRY2时，应选择的限制酶是 ，理由是 。 (3)将两种重组质粒导入前，需先用无菌的Ca2+溶液处理酵母菌，目的是 。为保证两目的基因表达的蛋白具有正常的结构和功能，选择酵母菌而不是细菌作为受体细胞，原因是 。 (4)将导入不同载体组合的酵母菌，在不同类型的培养基上对比培养，蓝光照射下培养结果如图。其中，培养基①是缺乏Trp（色氨酸）和Leu（亮氨酸）的基本培养基，导入不同载体组合的酵母菌在该培养基上都能生长，原因是 。培养基②应为缺乏 的培养基，菌落e能在该培养基上生长的原因是 。    2+ 12．（23-24高二下·山东滨州·期末）牛乳铁蛋白肽（LF）具有很强的抗菌性。使用增强型荧光蛋白基因（EGFP）与LF基因构建重组表达载体然后将其导入到毕赤酵母中可解决LF分子量小而难以提纯的问题，最终实现LF的高效生产与提纯。 (1)通过PCR得到EGFP基因及构建基因表达载体的过程需要使用的酶有 。除图3中标出的结构外，作为载体还需具备的结构有 。 (2)为构建基因表达载体，已通过PCR在EGFP基因的两端引入相应的限制酶识别序列。为将EGFP 基因定向的插入图3所示载体中，据图分析不能选择限制酶组合 （填编号）（①BamHI、EcoRI ②BgtII、BamHI、③BgtⅡ、EcoRI）限制酶切割质粒，理由是 。 (3)提取到融合蛋白后需要将EGFP蛋白去除才能得到生产所需的LF，为方便除去EGFP蛋白，可引入甲酸裂解位点（天冬氨酸—脯氨酸，对应的mRNA序列为：5＇-GAC-CCA-3＇PCR扩增EGFP基因时需将甲酸裂解位点的对应序列引入到 （填“引物1”或“引物2”）的 端，甲酸裂解位点在引物中对应的序列为5'- 3'。    试卷第1页，共3页 试卷第1页，共3页 学科网（北京）股份有限公司 $$ 专题02 基因工程和生物技术的安全性和伦理问题（解析版） 一、单选题 1．（23-24高二下·山东临沂·期末）关于生物技术伦理问题，下列观点错误的是（　　） A．可以对胚胎进行基因编辑获得抗艾滋病的孩子 B．清晰地了解转基因技术的原理和操作规程能更理性看待转基因技术 C．中国政府的态度是在任何情况下不发展、不生产、不储存生物武器 D．将玉米α-淀粉酶基因与目的基因一起转入植物使花粉失活，可以防止转基因花粉的传播 【答案】A 【难度】0.85 【知识点】禁止生物武器、生物技术中的伦理问题、转基因生物安全性、生物技术的安全性和伦理问题综合 【分析】1、转基因生物的安全性问题：食物安全（滞后效应、过敏源、营养成分改变）、生物安全（对生物多样性的影响）、环境安全（对生态系统稳定性的影响）。 2、中国在《禁止生物武器公约》中重申了中国在任何情况下不发展、不生产、不储存生物武器，并反对生物武器及其技术和设备的扩散， 【详解】A、对胚胎进行基因编辑获得抗艾滋病的孩子，可能存在安全性问题，A错误； B、理性看待转基因技术不是人云亦云，更不是诋毁科学、造谣惑众，而是需要完备的相关科学知识为基础，即清晰地了解转基因技术的原理和操作规程能更理性看待转基因技术，B正确； C、中国在《禁止生物武器公约》中重申了中国政府的态度是在任何情况下不发展、不生产、不储存生物武器，C正确； D、将玉米a-淀粉酶基因与目的基因一起转入植物，是由于a-淀粉酶基因可以阻断淀粉储藏使花粉失去活行，因此可以防止转基因花粉的传然，D正确。 故选A。 2．（23-24高二下·山东枣庄·期末）每出生5000名婴儿就有1人患有线粒体有害突变引起的疾病，可通过如下技术培育“三亲婴儿”，实现线粒体替代疗法阻断线粒体病的遗传，但这是一个充满了争议的技术。有关叙述正确的是（    ） A．该技术中的去核，其实是去除纺锤体—染色体复合物 B．利用该技术培育的“三亲婴儿”绝大多数性状与B个体一致 C．该“三亲婴儿”技术，婴儿的遗传物质来自三方，因此患遗传病的概率提升了 D．“三亲婴儿”技术涉嫌“设计”，容易引起类似“设计试管婴儿”的争议 【答案】AD 【难度】0.65 【知识点】动物细胞的培养和核移植技术、生物技术的安全性和伦理问题综合 【分析】动物细胞核移植技术是将动物一个细胞的细胞核移入去核的卵母细胞中，使这个重新组合的细胞发育成新胚胎，继而发育成动物个体的技术。原理是动物细胞核具有全能性。 【详解】A、核移植的受体细胞处于MII期，捐赠者的卵子去核实质是指去掉细胞中的纺锤体染色体复合物，A正确； B、利用该技术培育的“三亲婴儿”的染色体来自B和C，绝大多数性状与B和C个体一致，B错误； C、通过培育“三亲婴儿”，实现线粒体替代疗法阻断线粒体病的遗传，则“三亲婴儿”技术，婴儿的遗传物质来自三方，因此患遗传病的概率降低了，C错误； D、此技术之所以存在较大争议是因为孩子同时拥有自己父亲、母亲，和卵母细胞捐赠者的部分基因的伦理问题，还存在技术尚不完备、仍需要更充足的检验等原因，D正确。 故选AD。 3．（23-24高二下·山东聊城·期末）生物安全是指国家有效防范和应对危险生物因子及相关因素威胁，生物技术能够稳定健康发展，人民生命健康和生态系统相对处于没有危险和不受威胁的状态，生物领域具备维护国家安全和持续发展的能力。下列说法错误的是（    ） A．培养过微生物的培养基必须严格消毒后才能废弃，目的是防止微生物污染环境 B．我国禁止生殖性克隆人的实验，对治疗性克隆实验也进行严格审查 C．在转基因工作中科学家会采取很多方法防止基因污染，如阻断淀粉储藏使花粉失活 D．为避免可能产生的基因歧视，基因检测机构不能随意泄露基因检测的结果 【答案】A 【难度】0.65 【知识点】无菌技术、转基因生物安全性 【分析】转基因生物的安全性问题：食物安全（滞后效应、过敏源、营养成分改变）、生物安全（对生物多样性的影响）、环境安全（对生态系统稳定性的影响），对待转基因技术的利弊，正确的做法应该是趋利避害，不能因噎废食。 【详解】A、培养过微生物的培养基必须严格灭菌后才能废弃，目的是防止微生物污染环境，A错误； B、当今社会的普遍观点是禁止克隆人的实验，特别是生殖性克隆，但不反对治疗性克隆，应对治疗性克隆实验也进行严格审 查，B正确； C、在转基因工作中科学家会采取很多方法防止基因污染，如阻断淀粉储藏使花粉失活，C正确； D、为避免可能产生的基因歧视，基因检测机构不能随意泄露基因检测的结果，D正确。 故选A。 4．（23-24高二下·山东济南·期末）下列有关基因工程应用的叙述错误的是（    ） A．因牲畜的胃液呈酸性，且消化道细胞无Bt抗虫蛋白的受体，转基因抗虫棉对牲畜的影响较害虫小 B．将外源生长激素基因导入鲤鱼受精卵获得的转基因鲤鱼生长速率显著提高 C．将乳糖酶基因导入奶牛基因组，使获得的转基因牛分泌的乳汁中乳糖含量增加，营养价值提高 D．重组人工干扰素α-1b，具有干扰病毒复制的作用，被广泛应用于治疗病毒感染性疾病 【答案】C 【难度】0.85 【知识点】基因工程在农牧业、制药及环境等方面的应用 【分析】基因工程又称基因拼接技术和DNA重组技术，是以分子遗传学为理论基础，以分子生物学和微生物学的现代方法为手段，将不同来源的基因按预先设计的蓝图，在体外构建杂种的DNA分子，然后导入活细胞，以改变生物原有的遗传特性、获得新品种、生产新产品。 【详解】A、因牲畜的胃液呈酸性（Bt抗虫蛋白会失活），且消化道细胞无Bt抗虫蛋白的受体（Bt抗虫蛋白对牲畜起不到作用），因此转基因抗虫棉对牲畜的影响较害虫小，A正确； B、将外源生长激素基因导入鲤鱼受精卵，发育成的转基因鲤鱼能表达出生长激素，使转基因鲤鱼生长速率显著提高，B正确； C、将肠乳糖酶基因导入奶牛基因组，肠乳糖酶基因表达产物是乳糖酶，可分解乳糖，使乳糖含量降低，C错误； D、重组人工干扰素α-1b具有干扰病毒复制的作用，能抑制病毒遗传物质的复制，故被广泛应用于治疗病毒感染性疾病，D正确。 故选C。 5．（23-24高二下·山东济南·期末）蛛丝蛋白有着超强的抗张强度，可制成防弹背心、降落伞绳等。下图是培育转基因蜘蛛羊生产蛛丝蛋白的方案。以下叙述错误的是（    ） A．通过逆转录得到蛛丝蛋白基因不含有启动子和内含子 B．构建含蛛丝蛋白基因的重组质粒是培育转基因蜘蛛羊的核心工作 C．过程②通常选用基因枪法将重组质粒导入山羊的受精卵中 D．可利用 PCR 检测山羊的染色体DNA 是否插入了蛛丝蛋白基因 【答案】C 【难度】0.85 【知识点】基因表达载体的构建、将目的基因导入受体细胞、目的基因的检测与鉴定、筛选、获取合适的目的基因 【分析】基因工程是指按照人们的愿望，进行严格的设计，通过体外DNA重组和转基因技术，赋予生物以新的遗传特性，创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品．基因工程是在DNA分子水平上进行设计和施工的，又叫做DNA重组技术 【详解】A、启动子和终止子不会转录形成mRNA，所以提取mRNA再经过逆转录形成的蛛丝蛋白基因不含有启动子和内含子，A正确； B、基因工程的核心工作是构建基因表达载体，所以构建含蛛丝蛋白基因的重组质粒是培育转基因蜘蛛羊的核心工作，B正确； C、将重组质粒导入动物细胞受精卵常用显微注射技术，C错误； D、在分子水平的检测，可以使用PCR等技术检测山羊的染色体DNA是否插入了丝蛋白基因，D正确。 故选C。 6．（23-24高二下·山东威海·期末）某科研小组进行了如下实验：称取30g洋葱切碎，充分研磨后过滤得到滤液，将滤液放置几分钟后取上清液，加入酒精溶液，此时溶液中出现了白色丝状物，用玻璃棒搅拌后卷起丝状物，经二苯胺鉴定后得出丝状物是DNA的结论。下列说法正确的是（　　） A．新鲜的菠菜或鸡血按照上述实验操作也可以得到相同的实验结果 B．滤液应放于常温下静置几分钟后取上清液 C．上清液中应加入体积相等的、预冷的体积分数为95%的酒精溶液 D．鉴定时应将丝状物溶于0.4mol/L的NaCl溶液中，再加入二苯胺溶液后沸水浴 【答案】C 【难度】0.65 【知识点】DNA的粗提取及鉴定的方法 【分析】DNA粗提取和鉴定的原理：（1）DNA的溶解性：DNA和蛋白质等其他成分在不同浓度NaCl溶液中溶解度不同；DNA不溶于酒精溶液，但细胞中的某些蛋白质溶于酒精；DNA对酶、高温和洗涤剂的耐受性。（2）DNA的鉴定：在沸水浴的条件下，DNA遇二苯胺会被染成蓝色。 【详解】A、鸡血做实验材料提取DNA时，应将鸡血放置于蒸馏水中，让鸡血细胞吸水涨破，同时用玻璃棒搅拌，过滤后收集滤液，与题干中获取细胞内物质的方法有所差异，A错误； B、滤液应放于4℃冰箱下静置几分钟后取上清液，B错误； C、在上清液中加入体积相等的、预冷的体积分数为95%的酒精溶液，静置2～3min，溶液中出现的白色丝状物就是粗提取的DNA，C正确； D、鉴定时应将丝状物溶于2mol/L的NaCl溶液中，再加入二苯胺溶液后沸水浴，D错误。 故选C。 7．（23-24高二下·山东威海·期末）下图表示利用动物细胞工程和胚胎工程等技术获得三类不同动物的过程，下列说法错误的是（　　） A．过程①需将采集的精子和培养成熟的卵子置于培养液中共同培养完成受精 B．过程②需要去除MII期卵母细胞中的纺锤体—染色体复合物 C．过程③可以大幅改良动物的某些性状 D．图示3个过程获得的胚胎都需要经过胚胎移植才能获得后代 【答案】A 【难度】0.65 【知识点】基因工程在农牧业、制药及环境等方面的应用、克隆、动物的体外受精、胚胎移植技术 【分析】动物核移植是将动物的一个细胞的细胞核移入一个已经去掉细胞核的卵母细胞中，使其重组并发育成一个新的胚胎，这个胚胎最终发育为动物。 【详解】A、过程①代表体外受精，可将获能的精子和培养成熟的卵子置于适当的培养液中共同培养一段时间，来促使它们完成受精，A错误； B、过程②需要去除MII期卵母细胞中的纺锤体—染色体复合物，以保证遗传物质更多来自供体细胞，B正确； C、过程③是转基因过程，可将外源基因导入受体细胞，该过程可以大幅改良动物的某些性状，C正确； D、胚胎移植是胚胎工程的最后一道工序，图示3个过程获得的胚胎都需要经过胚胎移植才能获得后代，D正确。 故选A。 8．（23-24高二下·山东威海·期末）研究人员利用E.coli DNA连接酶将药用蛋白基因与一系列调控元件、质粒等构建成重组质粒后，将其导入哺乳动物的受精卵中，由该受精卵发育成的转基因动物进入泌乳期后，可通过分泌乳汁来生产药用蛋白。利用上述乳腺生物反应器，科学家已获得了种类繁多的医药产品。下列说法正确的是（　　） A．质粒是一种只存在于原核细胞拟核DNA外、具有自我复制能力的环状DNA分子 B．E.coli DNA连接酶能将具有互补黏性末端的DNA片段连接起来 C．构建重组质粒时使用的启动子应能启动药用蛋白基因在任意细胞中表达 D．“将重组质粒导入哺乳动物的受精卵中”是乳腺生物反应器制作的核心工作 【答案】B 【难度】0.65 【知识点】基因工程在农牧业、制药及环境等方面的应用 【分析】科学家将药用蛋白基因与乳腺中特异表达的基因的启动子等调控元件重组在一起，通过显微注射的方法导入哺乳动物的受精卵中，由这个受精卵发育成的转基因动物在进入泌乳期后，可以通过分泌乳汁来生产所需要的药物，这称为乳腺生物反应器或乳房生物反应器。 【详解】A、质粒是一种独立于真核细胞(如酵母菌)的细胞核或原核细胞(如细菌)拟核之外，并具有自我复制能力的环状双链DNA分子，A错误； B、E.coli DNA连接酶能将具有互补黏性末端的DNA片段连接起来，B正确； C、构建重组质粒时使用的启动子应能启动药用蛋白基因在乳腺细胞中表达，C错误； D、基因表达载体的构建是乳腺生物反应器制作的核心工作，D错误。 故选B。 9．（23-24高二下·山东威海·期末）DNA复制过程中，其中一条链作模板时不能连续合成新的子链，需要在子链的起始端先合成一段RNA引物，然后在DNA聚合酶催化下形成新的子链片段，这一过程不断重复，最终在相关酶的作用下将这些片段之间的RNA引物去除并补平缺口，使子链片段连接形成完整的DNA链。下列说法错误的是（　　） A．DNA复制时的解旋过程需要解旋酶和能量 B．DNA聚合酶沿3′→5′方向延伸子链 C．RNA水解酶和DNA连接酶也参与了DNA复制过程 D．DNA的复制不是完全连续的复制过程 【答案】B 【难度】0.65 【知识点】DNA重组技术的基本工具、DNA分子的复制过程、特点及意义 【分析】DNA复制是一个边解旋边复制的过程。DNA分子利用细胞提供的能量，在解旋酶的作用下，进行解旋。然后，DNA聚合酶等以解开的每一条母链为模板，以细胞中游离的4种脱氧核苷酸为原料，按照碱基互补配对原则，各自合成与母链互补的一条子链。随着模板链解旋过程的进行，新合成的子链也在不断延伸。同时，每条新链与其对应的模板链盘绕成双螺旋结构。 【详解】A、DNA复制开始时，DNA分子首先利用细胞提供的能量，在解旋酶的作用下，把两条螺旋的双链解开，这个过程叫解旋，A正确； B、RNA引物与解开的每条模板链的3′ 端部分碱基通过碱基互补配对而结合在一起，DNA聚合酶沿引物的5′ 端→3′ 端方向延伸子链，B错误； C、由题意可知：将子链片段之间的RNA引物去除，离不开RNA水解酶的催化，将子链片段连接形成完整的DNA链，需要DNA连接酶参与催化，C正确； D、DNA复制过程中，其中一条链作模板时不能连续合成新的子链，而另一条链作模板时能连续合成新的子链，因此DNA的复制不是完全连续的复制过程，D正确。 故选B。 10．（23-24高二下·山东泰安·期末）对基因进行编辑是生物学研究的重要手段，如图是对某生物B基因进行定点编辑的过程，该过程中用sgRNA(sgRNA大约有60～80个核苷酸，由单独的基因转录而成)指引Cas9蛋白结合到特定的切割位点，下列说法不正确的是（    ） A．通过观察破坏B基因后生物体的功能变化可推测B基因的功能 B．基因定点编辑时可能涉及sgRNA与B基因的碱基互补配对 C．Cas9蛋白可断裂脱氧核苷酸之间的化学键 D．被编辑后的B基因不能表达相关蛋白质 【答案】D 【难度】0.65 【知识点】基因编辑技术、DNA重组技术的基本工具 【分析】分析题图：用sgRNA可指引核酸内切酶Cas9结合到特定的切割位点并进行切割，进而将基因Ⅱ切除，连接基因Ⅰ和Ⅲ，形成新的B基因。 【详解】A、通过观察破坏B基因后生物体的功能变化可推测B基因的功能，A正确； B、sgRNA可指引限制性核酸内切酶结合到特定的切割位点，因此基因定点编辑时可能涉及sgRNA与B基因的碱基互补配对，B正确； C、限制性核酸内切酶可断裂脱氧核糖核苷酸之间的化学键——磷酸二酯键，C正确； D、被编辑后的B基因可能表达出相关蛋白质，D错误。 故选D。 11．（23-24高二下·山东泰安·期末）dNTP（包括dATP、dTTP、dGTP、dCTP）的结构与ATP类似，除碱基不同外，dNTP含有脱氧核糖。与dNTP相比，ddNTP的五碳糖为双脱氧核糖，其3'碳位为-H且不能与磷酸形成化学键。现有甲~丁四个PCR反应体系，甲体系中含有放射性磷标记的ddATP（记作ddATP+）和DNA模板链。PCR完成后，经电泳（分子量小的DNA在电场中移动快）将甲体系中一组长度不等的DNA单链分离。丙、乙、丁三个PCR体系与甲相似，分别用于检测T、C、G的碱基序列，检测结果如图。下列相关叙述正确的是（　　） A．ddATP+中的放射性磷酸基团应位于ddATP的末端 B．模板DNA的碱基序列为3'CTGGACTGACAT5' C．甲体系中除含ddATP+外，还应含有dTTP、dGTP、dCTP D．ddNTP与dNTP竞争脱氧核苷酸链的3'末端和5'末端 【答案】B 【难度】0.65 【知识点】DNA分子的结构和特点、DNA分子的复制过程、特点及意义、PCR扩增的原理与过程、电泳鉴定 【分析】PCR是聚合酶链式反应的缩写。它是一项根据DNA半保留复制的原理，在体外提供参与DNA复制的各种组分与反应条件，对目的基因的核苷酸序列进行大量复制的技术。PCR反应需要在一定的缓冲液中才能进行，需提供DNA模板，分别与两条模板链结合的2种引物，4种脱氧核苷酸和耐高温的DNA聚合酶，同时通过控制温度使DNA复制在体外反复进行。 【详解】A、ddNTP的3'碳位为-H且不能与磷酸形成化学键，因此在PCR的原料中加入ddNTP，若ddNTP参与子链的合成，则子链的延伸停止。据此可知，ddNTP可用于标记不同长短的DNA片段，因此ddATP+中的放射性磷酸基团应位于ddATP中与A最接近的位置，A错误； B、若ddNTP参与子链的合成，则子链的延伸停止，因此DNA合成链可能随机停止在任何碱基处。 PCR扩增时，子链由5'端向3'端延伸，则根据电泳图及分子量小的DNA在电场中移动快可知，该DNA片段的待测碱基序列阅读方向由上往下为5'GACCTGACTGTA3'，因此模板DNA的碱基序列为3'CTGGACTGACAT5'，B正确； C、甲体系中除含ddATP+外，还应含有dATP、dTTP、dGTP、dCTP，C错误； D、DNA复制过程中，子链的延伸方向由5'至3'，因此，ddNTP与dNTP竞争脱氧核苷酸链的3'末端，D错误。 故选B。 12．（23-24高二下·山东临沂·期末）研究人员将OsG、EcC、EcG和TSR 四种酶的基因分别与叶绿体转运肽基因连接，构建多基因表达载体（载体部分序列如下图所示），然后利用农杆菌转化法转化水稻，在水稻叶绿体内构建了一条新代谢途径，提高了水稻的产量。下列叙述正确的是（　　）    A．转基因水稻的根细胞内不含有上述四种目的基因 B．可选用含卡那霉素或潮霉素的培养基筛选被转化的水稻细胞 C．图中叶绿体转运肽基因转录时都以 DNA 的同一条单链为模板 D．可用抗原—抗体杂交技术检测叶绿体中是否含有四种酶 【答案】D 【难度】0.65 【知识点】基因表达载体的构建、将目的基因导入受体细胞、目的基因的检测与鉴定 【分析】线粒体和叶绿体的DNA，都能够进行半自主自我复制，并通过转录和翻译控制某些蛋白质的合成，但同时受到细胞核基因的控制。标记基因：便于重组DNA分子的筛选。 【详解】A、转基因水稻的根细胞内有可能含有上述四种目的基因，A错误； B、卡那霉素抗性基因不在T-DNA上，应用潮霉素培养基筛选被农杆菌转化的水稻细胞，B错误； C、四个基因转录时不一定都以DNA的同一条单链为模板，C错误； D、可用抗原-抗体杂交技术检测是否有相应的蛋白质产生，从而检测四种酶在转基因水稻中的表达情况，D正确。 故选D。 13．（23-24高二下·山东临沂·期末）洋葱是一种常用的生物学实验材料，下列相关说法错误的是（　　） A．紫色洋葱鳞片叶外表皮细胞可用来观察细胞的吸水和失水 B．用斐林试剂检测白色洋葱鳞片叶中的还原糖需要水浴加热 C．可用预冷的体积分数95%酒精提取洋葱鳞片叶研磨液中的DNA D．可用无水乙醇分离洋葱叶片中叶绿体内的四种色素 【答案】D 【难度】0.65 【知识点】DNA的粗提取及鉴定的方法、绿叶中色素的提取和分离实验、质壁分离及其复原实验、检测生物组织中的糖类、脂肪和蛋白质 【分析】观察细胞有丝分裂实验的步骤：解离（解离液由盐酸和酒精组成，目的是使细胞分散开来）、漂洗（洗去解离液，便于染色）、染色（用龙胆紫、醋酸洋红等碱性染料）、制片（该过程中压片是为了将根尖细胞压成薄层，使之不相互重叠影响观察）和观察（先低倍镜观察，后高倍镜观察）。 【详解】A、紫色洋葱鳞片叶的外表皮具有紫色的大液泡，所以在“探究植物细胞的吸水和失水”实验中，可选用紫色洋葱外表皮细胞为 材料，A正确； B、洋葱中含有还原糖，还原糖与斐林试剂发生作用会生成砖红色沉淀，选用白皮洋葱不会影响实验效果。实验时先向组织样 液中加入斐林试剂，然后水浴加热，B正确； C、加入预冷的体积分数为95%的酒精溶液后要用玻璃棒轻轻搅拌，使DNA析出，可粗提取出溶液中的DNA白色丝状物，C正确； D、可用层析液分离洋葱叶片中叶绿体内的四种色素，D错误。 故选D。 14．（23-24高二下·山东日照·期末）关于采用琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR产物的实验，下列叙述错误的是（    ） A．琼脂糖凝胶浓度的选择需要考虑 待鉴定的DNA片段的大小 B．凝胶载样缓冲液中指示剂的作用是指示电泳过程中DNA分子的位置 C．可以在紫外灯下观察被凝胶中的核酸染料染色的DNA分子的位置 D．可以根据相同时间内DNA分子在凝胶中的迁移距离来判断其大小 【答案】B 【难度】0.65 【知识点】电泳鉴定、PCR扩增的原理与过程 【分析】琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR产物的原理主要基于DNA分子在电场作用下的迁移行为以及琼脂糖凝胶的特性。 【详解】A、琼脂糖凝胶的浓度会影响DNA分子在凝胶中的迁移率和分辨率，琼脂糖凝胶的浓度通常是根据所需分离的DNA片段大小来选择的。对于较大的DNA片段，比如基因组DNA或质粒DNA，通常选择较低浓度的琼脂糖凝胶，因为它们需要更大的孔径来有效迁移。而对于较小的DNA片段，比如PCR产物或酶切片段，则需要选择较高浓度的琼脂糖凝胶，以提供更好的分辨率和分离效果，A正确； B、 凝胶载样缓冲液指示剂通常是一种颜色较深的染料，可以作为电泳进度的指示分子， 当溴酚蓝到凝胶2/3处时(可看蓝色条带)，则停止电泳，B错误； C、琼脂糖凝胶中的DNA分子需被凝胶中的核酸染料染色后，才可在波长为300nm的紫外灯下被检测出来，C正确； D、在琼脂糖凝胶电泳中，DNA片段的迁移速率与其大小成反比，即DNA片段越长，迁移速率越慢，根据相同时间内DNA分子在凝胶中的迁移距离可以来判断其大小，D正确。 故选B。 15．（23-24高二下·山东青岛·期末）某研究小组构建了能表达 ACTA1-GFP 融合蛋白的重组质粒，该重组质粒的部分结构如下图所示。下列叙述错误的是（　　） 注：F1和F2表示上游引物，R1和R2表示下游引物 A．RNA 聚合酶与启动子结合，调控 ACTA1 基因和GFP基因的表达 B．使用F2和R2一对引物，可以确定ACTAl基因插入方向是否正确 C．ACTA1基因转录的模板链是a链，引物F1与b链的部分序列相同 D．为了减少PCR 中非特异性条带的产生，可以适当升高复性的温度 【答案】B 【难度】0.65 【知识点】基因表达载体的构建、PCR扩增的原理与过程 【分析】基因工程的关键步骤是构建基因表达载体，基因表达载体主要由启动子、目的基因、标记基因和终止子组成，其中标记基因用于筛选重组DNA分子，可以是四环素、氨苄青霉素等抗性基因，也可以是荧光蛋白基因或产物能显色的基因。 【详解】A、据图可知，ACTA1基因和GFP基因位于启动子和终止子之间，故RNA聚合酶与启动子结合，调控ACTA1基因和GFP基因的表达，A正确； B、据图甲、可知，引物F1、R2或F2、R1结合部位包含ACTAl基因的碱基序列，因此推测为了确定ACTAl基因连接到质粒中且插入方向正确，进行PCR检测时，若用一对引物，应选择图中的引物F1、R2或F2、R1，B错误； C、ACTA1基因转录的模板链是a链，引物F1与b链均可以和a链互补配对，二者部分序列相同，C正确； D、非特异条带增加的原因可能是复性温度过低，造成引物与模板的结合位点增加，故可通过提高复性的温度来减少反应中非特异性条带的产生，D正确。 故选B。 16．（23-24高二下·山东青岛·期末）某实验小组利用鸡血细胞进行DNA的粗提取及电泳鉴定，并对鸡的CHD基因进行PCR扩增。在进行提取时，实验人员向鸡血细胞液中加入一定量的蒸馏水并搅拌，过滤后所得滤液进行处理后再进行过滤，在得到的滤液中加入特定试剂后离心提取出纯度较高的DNA。下列相关叙述正确的是（    ） A．提取时的“处理”是加入与滤液体积相等的、体积分数为95%的冷却的酒精 B．PCR反应体系中必须含有CHD基因的引物、Ca2+、4种脱氧核糖核苷酸等成分 C．PCR实验中的微量离心管、枪头和蒸馏水等在使用前必须进行高压灭菌 D．DNA分子具有可解离的基团，在电场作用下这些基团可以带上正电荷或负电荷 【答案】C 【难度】0.65 【知识点】DNA的粗提取及鉴定的方法、PCR扩增的原理与过程 【分析】PCR技术：1、概念：PCR全称为聚合酶链式反应，是一项在生物体外复制特定DNA的核酸合成技术。2、原理：DNA复制。3、前提条件：要有一段已知目的基因的核苷酸序列以便合成一对引物。4、条件：模板DNA、四种脱氧核苷酸、一对引物、热稳定DNA聚合酶（Taq酶）。5、过程：①高温变性：DNA解旋过程（PCR扩增中双链DNA解开不需要解旋酶，高温条件下氢键可自动解开）；低温复性：引物结合到互补链DNA上；③中温延伸：合成子链。 【详解】A、实验人员向鸡血细胞液中加入一定量的蒸馏水并搅拌，过滤后所得滤液在4°C冰箱中放置几分钟再取上清液，在上清液中再加入与滤液体积相等的、体积分数为95%的冷却的酒精，以析出DNA，因此提取时的“处理”是将过滤后所得滤液在4°C冰箱中放置几分钟，A错误； B、PCR反应体系中必须含有CHD基因、CHD基因的引物、Mg2+、4种脱氧核糖核苷酸、热稳定DNA聚合酶（Taq酶）等成分，B错误； C、为避免外源DNA等因素的污染，PCR实验中的微量离心管、枪头和蒸馏水等在使用前必须进行高压灭菌，C正确； D、DNA分子具有可解离的基团，在一定的pH下，这些基团可以带上正电荷或负电荷，D错误。 故选C。 17．（23-24高二下·山东济南·期末）干扰素是动物细胞受到病毒侵染后产生的一种糖蛋白，可用于对抗病毒的感染，但在体外难以保存。下图是利用蛋白质工程设计生产干扰素的流程图，正确的是（　　）    A．干扰素 X射线衍射的高级结构是构建新干扰素模型的主要依据 B．将新的干扰素基因插入启动子和终止子之间是其成功表达的条件之一 C．改造干扰素结构的实质是改造干扰素中氨基酸的排列顺序 D．新的干扰素基因在大肠杆菌体内正常表达即可得到预期的新的干扰素 【答案】B 【难度】0.65 【知识点】基因表达载体的构建、将目的基因导入受体细胞、蛋白质工程原理及操作流程、蛋白质工程的应用及实例分析 【分析】蛋白质工程是将控制蛋白质的基因进行修饰改造或合成新的基因，然后运用基因工程合成新的蛋白质。蛋白质工程的过程：预期蛋白质功能→设计预期的蛋白质结构→推测应有氨基酸序列→找到对应的脱氧核苷酸序列（基因）。蛋白质工程得到的蛋白质一般不是天然存在的蛋白质。 【详解】A、由题干可知，题图是利用蛋白质工程设计生产干扰素的流程图，而蛋白质工程的主要依据是蛋白质的预期功能，因此蛋白质的预期功能是构建新干扰素模型的主要依据，而不是干扰素 X射线衍射的高级结构，A错误； B、启动子是RNA聚合酶识别和结合的位点，从而驱动转录，而终止子提供转录终止的信号，因此将新的干扰素基因插入启动子和终止子之间是其成功表达的条件之一，B正确； C、蛋白质工程的实质是对基因进行操作，操作简单，且能遗传给后代，即图中改造干扰素结构的实质是改造干扰素基因的结构，C错误； D、大肠杆菌细胞是原核细胞，只有核糖体这一种细胞器，没有内质网和高尔基体，无法对干扰素进行加工，因此新的干扰素基因在大肠杆菌体内正常表达不可得到预期的新的干扰素，D错误。 故选B。 18．（23-24高二下·山东济南·期末）肿瘤坏死因子（TNF-α）是一种抑制肿瘤细胞生长的蛋白质。科研人员将 TNF-α基因和质粒pPIC9K（部分结构如图所示）构建成重组质粒，并导入酵母菌 SD-TRP（色氨酸缺陷菌株）中，筛选得到了能分泌肿瘤坏死因子的工程菌株。下列有关叙述错误的是（　　）      A．构建重组质粒时可选用 HindⅢ和EcoR V 切割目的基因和质粒 pPIC9K B．由 TNF-α基因和质粒pPIC9K 构成的所有重组质粒都能用E. coliDNA 连接酶连接 C．色氨酸合成基因和四环素抗性基因都可以作为标记基因，筛选导入重组质粒的酵母菌细胞 D．用 PCR 技术检测 TNF-α基因是否插入到酵母菌的染色体上 【答案】B 【难度】0.65 【知识点】PCR扩增的原理与过程、DNA重组技术的基本工具、基因表达载体的构建、目的基因的检测与鉴定 【分析】E. coliDNA 连接酶只能连接黏性末端，而T4DNA 连接酶既能连接平末端，也能连接黏性末端。 【详解】A、据图可知，Xba Ⅰ会破坏目的基因，Spe Ⅰ会破坏启动子，因此构建重组质粒时可选用 Hind Ⅲ和EcoR V 切割目的基因和质粒 pPIC9K，A正确； B、E. coliDNA 连接酶只能连接黏性末端，不能连接平末端，而据图可知，EcoR V 切割产生的是平末端，B错误； C、因为导入的酵母菌 SD-TRP菌株为色氨酸缺陷菌株，故色氨酸合成基因和四环素抗性基因都可以作为标记基因，筛选导入重组质粒的酵母菌细胞，C正确； D、可用 PCR 技术检测目的基因是否插入到受体细胞的染色体上，D正确。 故选B。 19．（23-24高二下·山东济南·期末）关于“DNA的粗提取与鉴定”及“DNA片段的扩增及电泳鉴定”实验操作。下列叙述正确的是（　　） A．“DNA的粗提取与鉴定”中，用95%的酒精预冷后可以更好地溶解DNA，以利于获得 DNA B．“DNA的粗提取与鉴定”中，提取DNA时，将研磨液加入切碎的洋葱，充分研磨后过滤，弃去上清液 C．“DNA片段的扩增及电泳鉴定”中，电泳一段时间后，离加样孔越近的DNA分子越小 D．“DNA片段的扩增及电泳鉴定”中，可通过观察指示剂在凝胶中迁移的位置来判断何时停止电泳 【答案】D 【难度】0.65 【知识点】DNA的粗提取及鉴定的方法、DNA的粗提取与鉴定的实验设计、电泳鉴定 【分析】1、DNA、RNA、蛋白质和脂质等在物理和化学性质方面存在差异，可以利用这些差异，选用适当的物理或化学方法对它们进行提取。DNA不溶于酒精，但某些蛋白质溶于酒精，利用这一原理，可以初步分离DNA与蛋白质。DNA在不同浓度的NaCl溶液中溶解度不同，它能溶于2 mol/L的NaCl溶液。 2、DNA分子具有可解离的基团，在一定的pH下，这些基团可以带上正电荷或负电荷。在电场的作用下，这些带电分子会向着与它所带电荷相反的电极移动，这个过程就是电泳。在凝胶中DNA分子的迁移速率与凝胶的浓度、DNA分子的大小和构象等有关。 【详解】A、DNA不溶于酒精，用95%的酒精预冷后可以更好地析出DNA，A错误； B、“DNA的粗提取与鉴定”中，提取DNA时，将研磨液加入切碎的洋葱，充分研磨后过滤，收集上清液，因为DNA主要存在上清液中，B错误； C、“DNA片段的扩增及电泳鉴定”中，电泳一段时间后，离加样孔越近的DNA分子越大，离加样孔越远的DNA分子越小，C错误； D、“DNA片段的扩增及电泳鉴定”中，可通过观察指示剂在凝胶中迁移的位置来判断何时停止电泳，待指示剂前沿迁移接近凝胶边缘时，停止电泳，D正确。 故选D。 20．（23-24高二下·山东德州·期末）滚环扩增技术的原理如图所示：两侧含有待扩增核酸的线性单链模板，在锁环探针和DNA 连接酶的帮助下，两端靠近并连接成环状成扩增模板。phi29 DNA 聚合酶催化子链合成的过程中，当遇到双链结构时可使双链分开，并继续子链的延伸，最终形成一条由数个重复序列串联而成的单链DNA。下列说法正确的是（    ） A．锁环探针与引物都必须与待扩增核酸序列互补 B．phi29 DNA 聚合酶催化氢键的断裂和磷酸二酯键的形成 C．该技术需通过改变温度以进行变性、复性和延伸的过程 D．该技术得到的重复序列即为待扩增核酸序列 【答案】B 【难度】0.65 【知识点】DNA分子的结构和特点、DNA分子的复制过程、特点及意义、PCR扩增的原理与过程 【分析】DNA分子的复制时间：有丝分裂和减数分裂前的间期；条件：模板（DNA的双链）、能量（ATP水解提供）、酶（解旋酶和DNA聚合酶等）、原料（游离的脱氧核苷酸）；过程：边解旋边复制；结果：一条DNA复制出两条DNA；特点：半保留复制。 【详解】A、由图可知，引物不需与待扩增核酸序列互补，A错误； B、phi29 DNA 聚合酶催化子链合成的过程中，当遇到双链结构时可使双链分开，使氢键断裂，并继续子链的延伸，促进磷酸二酯键的形成，B正确； C、由图可知，该过程大部分均为单链，不需要进行变性，C错误； D、由图可知，该技术得到的重复序列中有一部分不是待扩增核酸序列，D错误。 故选B。 21．（23-24高二下·山东济南·期末）下列关于DNA的粗提取、分离与鉴定技术的说法正确的是（    ） A．DNA 的溶解度与 NaCl溶液的浓度成正相关 B．在一定温度条件下，DNA 遇组胺试剂呈现蓝色 C．电泳时，DNA分子会向着与它所带电荷相反的电极移动 D．将电泳缓冲液加入电泳槽中，电泳缓冲液不能没过凝胶 【答案】C 【难度】0.65 【知识点】DNA的粗提取及鉴定的方法 【分析】DNA粗提取和鉴定的原理：（1）DNA的溶解性：DNA和蛋白质等其他成分在不同浓度NaCl溶液中溶解度不同；DNA不溶于酒精溶液，但细胞中的某些蛋白质溶于酒精；DNA对酶、高温和洗涤剂的耐受性。（2）DNA的鉴定：在沸水浴的条件下，DNA遇二苯胺会被染成蓝色。 【详解】A、DNA在2mol/L的氯化钠溶液中溶解度最高，并不是DNA 的溶解度与 NaCl溶液的浓度成正相关，A错误； B、在一定温度（沸水浴）条件下，DNA遇二苯胺会被染成蓝色，B错误； C、电泳是指带电粒子在电场的作用下，向与其携带电荷相反的电极迁移的过程，因此电泳时，DNA分子会向着与它所带电荷相反的电极移动，C正确； D、将电泳缓冲液加入电泳槽中，电泳缓冲液需要没过凝胶，D错误。 故选C。 二、多选题 22．（23-24高二下·山东菏泽·期末）下列有关酶的叙述，正确的是（    ） A．DNA连接酶以DNA的一条链为模板，将单个脱氧核苷酸连接起来 B．反转录酶是以RNA为模板指导脱氧核糖核苷酸连接合成DNA的酶 C．DNA聚合酶可将两个DNA分子片段间的缝隙连接起来 D．限制性内切核酸酶识别特定的核苷酸序列并在特定位点切割DNA分子 【答案】BD 【难度】0.65 【知识点】DNA重组技术的基本工具、DNA分子的复制过程、特点及意义 【分析】1、“分子手术刀”--限制性核酸内切酶（限制酶）：能够识别双链DNA分子的某种特定的核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开，因此具有专一性；“分子缝合针”--DNA连接酶与DNA聚合酶作用的异同：DNA聚合酶只能将单个核苷酸加到已有的核苷酸片段的末端，形成磷酸二酯键，DNA连接酶是连接两个DNA片段的末端，形成磷酸二酯键。 【详解】A、DNA连接酶将两个DNA片段连接起来，形成磷酸二酯键，DNA聚合酶是将单个脱氧核苷酸加到已有的脱氧核苷酸片段的末端，形成磷酸二酯键，A错误； B、反转录酶是反转录过程需要的酶，反转录的结果是合成DNA，所以是以RNA为模板指导脱氧核糖核苷酸连接并合成DNA的酶，B正确； C、DNA连接酶可将两个DNA分子片段间的缝隙连接起来，形成磷酸二酯键，C错误； D、限制性核酸内切酶能够识别双链DNA分子的某种特定的核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开，即在特定位点切割DNA分子，D正确。 故选BD。 23．（23-24高二下·山东临沂·期末）dNTP（脱氧核糖核苷三磷酸）是dATP、dGTP、dTTP、dCTP四种物质的统称，常在PCR中做原料。ddNTP是双脱氧核苷三磷酸，有ddATP、ddGTP、ddTTP、ddCTP4种。DNA合成时，在DNA聚合酶作用下，ddNTP与dNTP竞争核苷酸链延长位点。若连接上的是双脱氧核苷酸，子链延伸终止；若连接上的是脱氧核苷酸，子链延伸继续。在4个试管中分别加入4种dNTP和1种ddNTP进行PCR，在4个试管中形成不同长度的DNA单链片段，这些片段随后可被电泳分开（过程如图所示）。下列说法中正确的是（　　） A．dNTP连接在核苷酸链的5'末端 B．电泳图谱中的箭头所指的DNA片段以鸟嘌呤结尾 C．未知序列的碱基序列为3'-CTAAGCTCGACT-5' D．ATP、dATP 和ddATP中A都由腺嘌呤和脱氧核糖组成 【答案】BC 【难度】0.65 【知识点】ATP的结构、DNA分子的结构和特点、DNA分子的复制过程、特点及意义、PCR扩增的原理与过程 【分析】PCR是聚合酶链式反应的缩写。它是一项根据DNA半保留复制的原理，在体外提供参与DNA复制的各种组分与反应条件，对目的基因的核苷酸序列进行大量复制的技术。PCR反应需要在一定的缓冲液中才能进行，需提供DNA模板，分别与两条模板链结合的2种引物，4种脱氧核苷酸和耐高温的DNA聚合酶，同时通过控制温度使DNA复制在体外反复进行。 【详解】A、DNA复制时，子链由5'至3'方向延伸。因此，dNTP 连接在核苷酸链的3'末端，A错误； B、依题意，ddNTP 与dNTP 竞争核苷酸链延长位点，若连接上的是双脱氧核苷酸，子链延伸终止。据图可知，箭头所指的实验组中加入了ddGTP，箭头侧为3'端，因此，电泳图谱中的箭头所指的 DNA 片段以鸟嘌呤结尾，B正确； C、据电泳图谱可知，引物后所连接的核苷酸上碱基依次为：5'-GATTCGAGCTGA-3'，引物位于的链与模板链互补，因此，未知序列的碱基序列为：3'-CTAAGCTCGACT-5'，C正确； D、ATP是腺苷三磷酸，其中的A由核糖和腺嘌呤组成，D错误。 故选BC。 24．（23-24高二下·山东菏泽·期末）为了获得未知序列的碱基序列，可以通过利用已知序列设计的引物对未知序列进行扩增，再对其扩增产物进行测序，其过程如图。下列说法正确的是（　　）    A．图示过程中需要用到限制酶、DNA连接酶和耐高温的DNA聚合酶 B．环化阶段，可选用E.coliDNA连接酶或T4DNA连接酶 C．以环化的DNA为模板进行PCR时，应选择引物2和引物3 D．若1个DNA分子用PCR技术扩增n次，则需要2n+1-2个引物 【答案】ABD 【难度】0.65 【知识点】PCR扩增的原理与过程 【分析】1、PCR只能扩增两端序列已知的基因片段，反向PCR可扩增一段已知序列的两端未知序列。反向PCR的目的在于扩增一段已知序列旁侧的DNA，也就是说这一反应体系不是在一对引物之间而是在引物外侧合成DNA。 2、如图所示，DNA分子被限制酶切割，然后环化并加入已知序列合成的引物，再通过PCR扩增得到中间是未知序列两侧是已知序列的DNA分子。 【详解】A、整个过程需用到限制酶、DNA连接酶和耐高温DNA聚合酶，A正确； B、T4DNA连接酶既可以连接平末端也可以连接黏性末端，所以环化阶段，可选E.coliDNA连接酶也能选T4DNA连接酶，B正确； C、需添加方向相对的引物1和4以便DNA聚合酶从引物的3'端延伸子链，从而获得未知序列的PCR产物，C错误； D、PCR技术的原理是DNA复制，根据DNA分子半保留复制特点可知，共有2n-1对引物参与子代DNA分子的合成，每对引物包含2个，即则需要2n+1-2个引物，D正确。 故选ABD。 25．（23-24高二下·山东青岛·期末）与传统的酶切再连法相比，无缝克隆技术构建重组质粒有不受限制酶切位点的限制等优点。无缝克隆技术连接DNA片段的机理如图所示，T5核酸外切酶能从DNA单链的末端逐个切割脱氧核苷酸，下列说法正确的是（    ） A．T5核酸外切酶与限制性内切核酸酶切割的化学键相同 B．T5核酸外切酶沿3¹→5'的方向水解DNA，形成黏性末端 C．图中过程②出现“缺口”的原因是过程①形成的黏性末端长于互补配对的区段 D．完成过程③需要用到的酶是DNA聚合酶 【答案】AC 【难度】0.65 【知识点】DNA重组技术的基本工具、基因表达载体的构建 【分析】限制酶能够识别双链DNA分子的某种特定核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断裂，形成黏性末端。 【详解】A、T5核酸外切酶能从DNA单链的末端逐个切割脱氧核苷酸，说明其断裂的也是磷酸二酯键，与限制性内切核酸酶切割的化学键相同，A正确； B、根据图中切割后变短的链可知，T5核酸外切酶沿5¹→3'的方向水解DNA，形成黏性末端，B错误； C、由图可知，由于过程①形成的黏性末端长度不同，形成的黏性末端长于互补配对的区段，因此导致过程②出现“缺口”，C正确； D、过程③缺口处DNA链的补齐，可以看作DNA分子的复制过程，所需的酶有DNA聚合酶（DNA聚合酶将单个脱氧核苷酸加到子链3′-OH末端）和DNA连接酶（将两个DNA片段进行连接），D错误。 故选AC。 26．（23-24高二下·山东东营·期末）如图1所示，质粒pZHZ9上含有X 抗生素抗性基因（XR） 和Y 抗生素抗性基因（YR）。 其中XR 内部含有限制酶KasI识别序列，YR 内部含有限制酶FseI、HpaII、NaeI、NgoMIV 识别序列，五种酶的识别序列如图2（J 表示切割位点），且这些识别序列在整个质粒上均 仅有一处，目的基因内部不存在这些识别序列。利用合适的工具酶构建重组质粒pZHZ10.下列叙述错误的是    A．若要将结构如图3所示的目的基因直接插入到YR内形成重组质粒则 pZHZ9需用限制酶FseI切开 B．若同时用KasI和NaeI完全酶切重组质粒pZHZ10（只含单个目的基因），则可能产生的酶切片段数为2 C．一般先用Ca2+处理微生物细胞，然后再将重组质粒pZHZ10导入处理的细胞中 D．在含X抗生素的培养基和含Y抗生素的培养基上，均能生长的受体细胞即为成功导入 目的基因的细胞 【答案】ABD 【难度】0.65 【知识点】DNA重组技术的基本工具、基因表达载体的构建、将目的基因导入受体细胞、目的基因的检测与鉴定 【分析】至少需要三种“分子工具”，即准确切割DNA分子的 “分子手术刀”、将DNA片段再连接起来的“分子缝合针” 和将体外重组好的DNA分子导入受体细胞的“分子运输车”。DNA分子经限制酶切割产生的DNA片段末端通常有 两种形式—黏性末端和平末端。当限制酶在它识别序列的中心轴线两侧将DNA分子的两条链分别切开时，产生的是黏性末端；当限制酶在它识别序列的中心轴线处切开时，产生的是平末端。 【详解】A、由图3可知，目的基因经限制酶切割后，产生黏性末端，其序列为，所以目的基因插入到YR内时，也必须用相同的酶或者能产生相同黏性末端的酶切割，根据图2分析NgoMIV切割后能产生相同的黏性末端，A错误； B、根据A选项选用的是NgoMIV作为限制酶同时切割目的基因和pZHZ9,构建处理重组质粒pZHZ10。构建好的重组质粒含有的序列（该序列是NaeI的酶切位点），如果用Kas I和Nae I完全酶切重组质粒pZHZ10，相当于重组质粒pZHZ10的序列中有一个Kas I的酶切位点，有2个Nae I的酶切位点，所以切割后，能产生的酶切片段为3段，B错误； C、一般先用Ca2+处理微生物细胞，获得感受态细胞，然后再将重组质粒pZHZ10导入处理的细胞中，C正确； D、在含X抗生素的培养基能生长，在含Y抗生素的培养基不生长的受体细胞即为成功导入目的基因的细胞，D错误。 故选ABD。 27．（23-24高二下·山东济南·期末）目的基因的获取可以直接以细胞DNA为模板，通过PCR技术获取。但是因DNA中可能含有多区段与引物配对的碱基序列而失败。巢式PCR 可以避免以上问题，其原理为：先以比目的基因大的DNA 片段为模板，用一对引物进行扩增，获得大量含目的基因的中间产物，再以扩增后的中间产物为模板，用另一对引物扩增目的基因，过程如图所示。下列说法正确的是（　　） A．两对引物的碱基序列各不相同，且均为与模板DNA 配对的单链RNA片段: B．第一轮PCR 目的是缩小模板 DNA 的范围并增加第二轮 PCR 的模板数量 C．因模板 DNA 中与两套引物均互补的靶序列较少，该技术可大大提高扩增的特异性 D．第一轮 PCR 所需引物 F1 和 R1之间应尽量避免出现碱基互补配对序列 【答案】BCD 【难度】0.65 【知识点】PCR扩增的原理与过程 【分析】PCR技术的原理是细胞内DNA复制，需要模板、原料、能量、酶、引物等条件。PCR一般要经历三十多次循环，每次循环可以分为变性、复性、延伸三步。从第二轮循环开始，上一次循环的产物也作为模板参与反应。引物是一小段DNA或RNA，它能与DNA母链的一段碱基序列互补配对。 【详解】A、PCR扩增时两对引物的碱基序列不相同，但均应为单链DNA片段，以便与模板互补配对，A错误； B、巢式PCR 原理为：先以比目的基因大的DNA 片段为模板，用一对引物进行扩增，获得大量含目的基因的中间产物，再以扩增后的中间产物为模板，用另一对引物扩增目的基因，缩小了模板 DNA 的范围并增加第二轮 PCR 的模板数量，B正确； C、由于和两套引物同时都互补的靶序列较少，该技术可大大提高扩增的特异性 ，将需要的目的基因扩增出来，C正确； D、第一轮PCR 所需引物 F1 和 R1之间应尽量避免出现碱基互补配对序列，如果二者出现碱基互补配对序列，二者之间会发生局部碱基互补配对而失效，D正确。 故选BCD。 28．（23-24高二下·山东德州·期末）DNA足迹法常用来检测蛋白质在DNA上的结合位点，其原理如图所示。先将待测DNA一条链的一端用放射性同位素标记，加入 DNA 结合蛋白后，再用核酸内切酶DNase I 随机切割待测 DNA，被蛋白质结合的区域可免于切割。最后将酶切后的DNA 片段变性后电泳，放射性同位素标记的DNA经处理后会显示出条带。下列说法错误的是（    ）    A．核酸内切酶DNase I 和限制酶均可破坏磷酸二酯键 B．若通过PCR 标记 DNA 末端，仅需一种引物含有放射性同位素 C．电泳结果中显示的是经 DNase I切割后的所有 DNA片段 D．蛋白质的结合位点仅位于乙区域对应的DNA片段 【答案】BC 【难度】0.65 【知识点】PCR扩增的原理与过程、DNA重组技术的基本工具 【分析】PCR原理：在解旋酶作用下，打开DNA双链，每条DNA单链作为母链，以4中游离脱氧核苷酸为原料，合成子链，在引物作用下，DNA聚合酶从引物3'端开始延伸DNA链，即DNA的合成方向是从子链的5'端自3'端延伸的。 【详解】A、核酸内切酶DNase I 可切割DNA，限制酶也能切割DNA，破坏的键均是磷酸二酯键，A正确； B、DNA分子利用PCR技术扩增，需要两种引物，若通过PCR 标记 DNA 末端，两种引物均需要含有放射性同位素，B错误； C、将酶切后的DNA 片段变性后电泳，放射性同位素标记的DNA经处理后会显示出条带，电泳结果中显示的是并不是经 DNase I切割后的所有 DNA片段，C错误； D、待测DNA一条链的一端用放射性同位素标记，加入 DNA 结合蛋白后，再用核酸内切酶DNase I 随机切割待测 DNA，被蛋白质结合的区域可免于切割，由图可知，加入DNA结合蛋白的一组乙区域没有条带，其他区域的条带与未加入DNA结合蛋白的一组吻合，故蛋白质的结合位点仅位于乙区域对应的DNA片段，D正确。 故选BC。 29．（23-24高二下·山东泰安·期末）关于“DNA的粗提取与鉴定”实验，下列说法正确的是（  ） A．过滤液沉淀过程在4℃冰箱中进行是为了防止DNA降解 B．离心研磨液是为了加速DNA的沉淀 C．在一定温度下，DNA遇二苯胺试剂呈现蓝色 D．粗提取的DNA中可能含有蛋白质 【答案】ACD 【难度】0.65 【知识点】DNA的粗提取及鉴定的方法 【分析】1、DNA的溶解性：DNA和蛋白质等其他成分在不同浓度NaCl溶液中溶解度不同；DNA不溶于酒精溶液，但细胞中的某些蛋白质溶于酒精。 2、DNA的鉴定：在沸水浴的条件下，DNA遇二苯胺会被染成蓝色。 【详解】A、过滤液沉淀过程在4℃冰箱中进行可以使酶的活性降低，可以防止DNA降解，A正确； B、离心研磨液是为了加速细胞膜、细胞器、一些较大杂质等的沉淀，不是加速DNA沉淀，B错误； C、在沸水浴条件下，DNA遇二苯胺试剂呈现蓝色，C正确； D、粗提取的DNA中可能含有蛋白质：若提取的丝状物为黄色，说明提取的DNA纯度不高，可能含有蛋白质等杂质成分，D正确。 故选ACD。 30．（23-24高二下·山东淄博·期末）为研究一种双链DNA 分子 A的分子质量大小，用不同的限制酶对A进行切割，切割产物通过琼脂糖凝胶电泳进行分离，用大小已知的DNA片段的电泳结果作为分子质量大小的标记。下列说法正确的是（　　）    A．DNA 分子的迁移速率与凝胶浓度、DNA 分子大小和构象有关 B．凝胶中加入DNA染色剂，电泳后将凝胶放在紫外灯下观察 C．A为一个环状DNA分子，有一个 NotⅠ酶切位点和两个 EcoRI酶切位点 D．A的分子质量大小为10kb，NotI酶切位点与 EcoRI酶切位点的最大距离为2kb 【答案】ABC 【难度】0.65 【知识点】PCR扩增的原理与过程、DNA重组技术的基本工具 【分析】根据题意可知，通过与分子量标记比较可知，单用EcoRI处理后产生了4kb和6kb两条带；而利用EcoRI和NotI双酶切时产生了6kb、3kb、1kb三条带，即4kb的片段进一步被NotI酶切为3kb和1kb的片段，因此DNA含有一个NotI酶切位点，因为用NotI处理只产生了一个10kb的条带，所以该分子必须是环状的，长度一定是10kb。 【详解】A、在凝胶中，DNA 分子的迁移速率与凝胶的浓度、DNA 分子的大小和构象等有关，A正确； B、凝胶中加入DNA染色剂，电泳后将凝胶放在波长为300nm的紫外灯下观察，B正确； C、因为用NotⅠ处理只产生了一个10kb的条带，说明①该DNA是环状的，②该环状DNA上含有一个NotⅠ切割位点；单用EcoRⅠ处理后产生了4kb和6kb两条带，说明该环状DNA上含有2个EcoRⅠ切割位点，C正确； D、用EcoRⅠ处理后产生的4kb的片段，进一步被NotⅠ酶切为3kb和1kb的片段，可以得知NotⅠ切点与EcoRⅠ切点的最短距离为1kb，最大距离为3kb，D错误。 故选ABC。 三、解答题 31．（23-24高二下·山东临沂·期末）水中雌激素类污染物A会导致鱼类雌性化等异常。斑马鱼幼体透明且肌细胞和生殖细胞均存在雌激素受体。将ERE、UAS、Gal4基因和绿色荧光蛋白（GFP）基因共同转入斑马鱼，培育出转基因斑马鱼MO。MO可以经济且快速地监测水体中的A，原理如方案一。回答下列问题： 注:ERE和酵母来源的UAS是两种诱导型启动子，分别被A-受体复合物和酵母来源的Gal4蛋白特并性激活，启动下游基因表达。 (1)通过PCR 特异性扩增GFP基因需先设计引物，该引物应该是一小段 的短单链核酸。为使PCR产物能被特定限制酶切割，需在引物 （填“3’”或“5’”）端上添加相应的限制酶识别序列。 (2)A 进入幼体转基因斑马鱼 MO 的肌细胞后，促进Gal4 蛋白的合成，特异性激活UAS，使其与 结合，启动GFP基因的表达。与图中方案二相比，MO在监测 A方面的主要优势是 。 (3)科学家用上述转基因斑马鱼MO 和另一种转基因斑马鱼X 杂交制备一种不育的监测斑马鱼SM。成体斑马鱼X和SM在自身产生的雌激素诱导下引起生殖细胞凋亡，造成不育。欲获得X，需将生殖细胞凋亡基因和启动子 （填写相应序号：①ERE ②UAS ③使基因仅在生殖细胞表达的启动子）构建表达载体并转入野生型斑马鱼受精卵。选择该启动子的理由是 。 (4)将不育斑马鱼SM用于实际检测的目的是 。 【答案】(1) 能与DNA母链的一段碱基序列互补配对 5’ (2) RNA聚合酶 监测灵敏度更高 (3) ② MO是方案一获得，所以启动子选择UAS (4)避免转基因斑马鱼逃逸带来生物安全问题 【难度】0.65 【知识点】PCR扩增的原理与过程、基因表达载体的构建、转基因生物安全性 【分析】启动子是一段有特殊序列结构的DNA片段，位于基因的上游紧挨转录的起始位点，它是RNA聚合酶识别和结合的部位。有了它才能驱动基因转录出mRNA，最终表达出人类需要的蛋白质。 【详解】（1）引物应该是一小段能与DNA母链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸。由于子链的延伸从引物的3’端开始，因此为使PCR产物能被特定限制酶切割，需在引物5’端上添加相应的限制酶识别序列。 （2）由图中方案一可知，A 进入幼体转基因斑马鱼 MO 的肌细胞后，促进Gal4 蛋白的合成，特异性激活UAS（一种诱导型启动子），使其与RNA聚合酶结合，启动GFP基因的表达。由图可知，方案二中A-受体复合物激活ERE，使GFP基因表达，方案一中A-受体复合物先激活ERE获得Gal4蛋白，然后Gal4蛋白激活UAS启动子，使GFP基因表达，因此与图中方案二相比，MO在监测 A方面的主要优势是GFP蛋白表达量大，监测灵敏度更高。 （3）MO 和另一种转基因斑马鱼X 杂交获得SM，MO是方案一获得，所以启动子选择UAS。要获得SM是不育个体，而MO是可育的，所以X必须有仅导致生殖细胞凋亡的基因。 （4）监测鱼属于转基因生物，目前安全性不确定，为了避免转基因斑马鱼逃逸带来生物安全问题，需要SM不育。 32．（23-24高二下·山东聊城·期末）棉铃虫和蚜虫是常见的棉花害虫。已知基因cryIA的表达产物对棉铃虫有较强的毒性，基因gna的表达产物对蚜虫有较强的毒性。科研人员将基因cryIA与基因gna连接在一起，构建了含双抗虫基因的重组表达载体，并转入棉花细胞中，获得了具有双抗性的转基因棉花，其部分过程如图所示。回答下列问题： 注：Klenow能将黏性末端转变为平末端；图中不同限制酶切出的黏性末端均不同 (1)过程③中将基因cryIA与基因gna相连，可选用 （填“E.coliDNA连接酶”或“T4DNA连接酶”）。图中将目的基因导入棉花细胞采用了农杆菌转化法，该方法的原理是 。 (2)鉴定该转基因棉花是否被赋予相应的抗虫特性，请从个体生物学水平提供具体方法： 。 (3)针对上述转基因棉花的安全性，不同的人具有不同的观点。有人认为种植了这种转基因棉花的农田中的杂草一般不会出现抗虫性状，原因可能是 ,棉花很难与杂草进行杂交。为了防止抗虫基因通过花粉传播，科研小组考虑将抗虫基因导入棉花根尖细胞的 中，同时将抗虫棉花和普通棉花混合种植，请从生物进化的角度阐述混合种植的优点是 。 【答案】(1) T4DNA连接酶 农杆菌侵染植物细胞时能将Ti质粒上的T-DNA转移到被侵染的细胞，并且将其整合到该细胞的染色体DNA上 (2)采摘转基因棉花的叶片喂饲棉铃虫和蚜虫（或将适量的棉铃虫和蚜虫接种到转基因棉花植株上），观察两种害虫的存活情况 (3) 不同物种之间存在生殖隔离 线粒体基因组 可有效延缓害虫抗性基因频率增加的速度 【难度】0.65 【知识点】目的基因的检测与鉴定、将目的基因导入受体细胞、基因表达载体的构建、基因频率的改变与生物进化 【分析】基因工程的工具： （1）限制酶：能够识别双链DNA分子的某种特定核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断裂； （2）DNA连接酶：连接的是两个核苷酸之间的磷酸二酯键。E.coli DNA 连接酶只能连接具有黏性末端的DNA片段，T4DNA连接酶既能连接具有黏性末端的DNA片段，又能连接具有平末端的DNA片段； （3）运载体：常用的运载体：质粒、噬菌体的衍生物、动植物病毒。 【详解】（1）由图可知基因cryIA与基因gna都被Klenow处理，黏性末端转变为平末端，能连接具有平末端DNA片段的酶是T4DNA连接酶。将目的基因导入棉花细胞采用农杆菌转化法原理是农杆菌侵染植物细胞时能将Ti质粒上的T-DNA转移到被侵染的细胞，并且将其整合到该细胞的染色体DNA上。 （2）鉴定该转基因棉花是否被赋予相应的抗虫特性，需要进行抗虫接种实验，具体方法为采摘转基因棉花的叶片喂饲棉铃虫和蚜虫（或将适量的棉铃虫和蚜虫接种到转基因棉花植株上），观察两种害虫的存活情况。 （3）转基因棉花的农田中的杂草一般不会出现抗虫性状，原因可能是不同物种之间存在生殖隔离，棉花很难与杂草进行杂交，不能进行基因交流，因此杂草不会出现抗虫性状。防止抗虫基因通过花粉传播，可以将抗虫基因导入棉花根尖细胞的线粒体基因组，因为花粉中几乎不含细胞质，细胞质基因不会通过花粉遗传给后代。将抗虫棉花和普通棉花混合种植的优点是可有效延缓害虫抗性基因频率增加的速度。 33．（23-24高二下·山东临沂·期末）赖氨酸是人体的必需氨基酸，而人类主要食物中的赖氨酸含量很低，我国首次利用转基因和体细胞核移植技术成功培育了高产赖氨酸的转基因克隆奶牛。回答下列问题： (1)构建乳腺专一表达载体：将富含赖氨酸的酪蛋白基因（目的基因）与含有 的启动子的相应载体连接，构建出乳腺专一表达载体。 (2)核移植：将表达载体包裹到磷脂等构成的脂质体内，与牛胚胎成纤维细胞（BEF）膜融合，最终表达载体进入细胞核。将转基因的BEF作为核供体细胞，从牛卵巢获取卵母细胞，经体外培养至 期去核后作为受体细胞，通过 法使两种细胞融合形成重构胚，该融合法除了促进细胞融合，同时起到 的作用。 (3)重构胚的体外培养及胚胎移植：重构胚体外培养至 ，可进行 ，从而获得同卵多胎，然后植入代孕母牛子宫，直至小牛出生。 (4)目的基因的检测：分别从转基因牛乳汁中的脱落细胞和转基因牛耳组织细胞提取总RNA，经 形成cDNA1和cDNA2，检测是否有目的基因片段。若目的基因成功表达，检测结果是 ，原因是 。 【答案】(1)乳腺中特异性表达的基因的 (2) 减数第二次分裂中 电刺激 激活重构胚 (3) 桑椹胚或早期囊胚 胚胎分割 (4) 逆转录 目的基因在转基因牛乳汁中的脱落细胞内表达，而不在牛耳组织细胞内表达 构建的表达载体只含有乳腺特异性启动子，只能在乳腺细胞中启动转录，而在牛耳细胞中不能表达 【难度】0.65 【知识点】胚胎分割技术、胚胎移植技术、目的基因的检测与鉴定、基因表达载体的构建 【分析】基因工程技术的基本步骤：(1)目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成；(2)基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等；(3)将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样.将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法；(4)目的基因的检测与鉴定：分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA是否插入目的基因-DNA分子杂交技术；②检测目的基因是否转录出了mRNA-分子杂交技术；③检测目的基因是否翻译成蛋白质抗原抗体杂交技术.个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。 【详解】（1）培育高产赖氨酸转基因克隆奶牛，属于乳腺生物反应器，需要将获得的目的基因与含有乳腺中特异性表达的基因的启动子的相应载体连接，构建出乳腺专一表达载体。 （2）将转基因的BEF作为核供体细胞，从牛卵巢获取卵母细胞，经体外培养至减数第二次分裂中期去核后作为受体细胞，通过电刺激的方法使两种细胞融合形成重构胚，该融合法除了促进细胞融合，同时起到激活重构胚的作用。 （3）重构胚体外培养至桑椹胚或早期囊胚，可通过胚胎分割，从而获得同卵多胎，然后植入代孕母牛子宫，直至小牛出生。 （4）分别从转基因牛乳汁中的脱落细胞和转基因牛耳组织细胞提取总RNA，经逆转录形成cDNA1和cDNA2，检测是否有目的基因片段。由于构建的表达载体只含有乳腺特异性启动子，只能在乳腺细胞中启动转录，而在牛耳细胞中不能表达，因此检测结果是目的基因在转基因牛乳汁中的脱落细胞内表达，而不在牛耳组织细胞内表达。 34．（23-24高二下·山东菏泽·期末）半夏蛋白具有凝血和凝集细胞的生物活性，还具有抑菌、抗肿瘤等作用。以下是科研人员利用基因工程技术获得半夏蛋白的大致流程。回答下列问题： (1)科研人员猜测对半夏接种某种病菌可激发半夏蛋白基因表达，可在接种病菌后提取半夏块根细胞中总 RNA，再纯化获得相关mRNA，进而在 酶的作用下得到半夏蛋白基因。 (2)科研人员欲利用pET-28a质粒将上述筛选的半夏蛋白基因导入宿主菌大肠杆菌DH5a（缺乏DNA修饰，缺乏“免疫”机制，且对氨苄青霉素敏感）中，以构建高效表达半夏蛋白基因的菌株。pET-28a质粒上含有氨苄青霉素抗性基因（AmpR）、LacZ 基因和一些酶切位点，其结构如图。    PO： 启动子 ori： 复制原点 Amp*：氨苄青霉素抗性基因 LacZ： β—半乳糖苷酶基因 ①为获得更多的半夏蛋白基因，可利用 PCR 技术进行扩增。为保证半夏蛋白基因与pET-28a质粒的正向连接，在设计PCR 引物时，应在引物的 （填“3’”或“5’”）端添加限制酶 的识别序列。根据上述信息，写出目的基因上游引物的10个碱基序列：5' 3'。引物与DNA结合发生在PCR 的 阶段。 ②β-半乳糖苷酶可以分解 X-gaI 产生蓝色物质，使菌落呈现蓝色，否则菌落为白色。将基因表达载体导入宿主菌后（转化成功率并不是 100%），转化后的宿主菌在含有 的固体培养基上可以长出 色的菌落，以此筛选出成功导入重组 pET-28a质粒的宿主菌。 ③利用 技术检测宿主菌是否表达出半夏蛋白。 (3)为了满足人们对不同产品的应用需求，有时会在载体中人工构建诱导型启动子，当诱导物存在时，可以激活或抑制 。 【答案】(1)逆转录 (2) 5′ Hind Ⅲ和Xho I AAGCTTATGC 复性 氨苄青霉素和X-gal 白 抗原一抗体杂交 (3)目的基因的表达 【难度】0.65 【知识点】筛选、获取合适的目的基因、目的基因的检测与鉴定、基因表达载体的构建、PCR扩增的原理与过程 【分析】基因工程的基本操作程序是：目的基因的筛选与获取、基因表达载体的构建、将目的基因导入受体细胞、目的基因的检测与鉴定。 【详解】（1）半夏蛋白基因是有遗传效应的DNA片段。欲利用相关mRNA得到半夏蛋白基因，需要以mRNA为模板，在逆转录酶的催化作用下，通过逆转录过程形成cDNA。 （2）①由于游离的脱氧核苷酸需要连接在引物的3'端，从而延伸出子链，因此在设计PCR引物时，应在引物的5′端添加限制酶，图中目的基因转录的方向向右，因此目的基因的左端应连接在靠近启动子的位置，右端应连接在靠近终止子的位置。由于目的基因中含有SalⅠ和NheⅠ的酶切位点，因此不能在目的基因的两端连接SalⅠ和NheⅠ的识别序列，结合图示可知，若用EcoR Ⅰ酶切割会破坏氨苄青霉素抗性基因，因此应在目的基因左右两端的引物上分别连接HindⅢ和XhoI的识别序列。目的基因上游（左端）引物应以目的基因下面一条链为模板，而且目的基因上游的引物上应带有Hind Ⅲ的识别序列。可见，目的基因上游引物的10个碱基序列为5′ AAGCTTATGC 3′。引物与DNA结合发生在PCR的复性阶段。 ②宿主菌大肠杆菌DH5a对氨苄青霉素敏感，图示中质粒含有的标记基因是氨苄青霉素抗性基因，因此将基因表达载体导入宿主菌后，转化后的宿主菌能在含有氨苄青霉素的培养基上生长。由于目的基因的插入导致LacZ 基因被破坏，不能形成β-半乳糖苷酶，不能分解 X-gaI 产生蓝色物质，因此培养基上需要添加氨苄青霉素和X-gaI，能在该培养基上生长且长出白色的菌落，其菌体为成功导入重组 pET-28a质粒的宿主菌。 ③欲检测宿主菌是否表达出半夏蛋白，可以利用抗原一抗体杂交技术。 （3）启动子是RNA聚合酶识别和结合的部位，驱动基因转录出mRNA。基因表达过程包括转录和翻译。据此可推知：在载体中人工构建的诱导型启动子，当诱导物存在时，可以激活或抑制目的基因的表达。 35．（23-24高二下·山东青岛·期末）1965 年中国科学家人工合成了具有生物活性的结晶牛胰岛素，摘取了人工合成蛋白质的桂冠。此后科学家又提出了利用基因工程改造大肠杆菌生产人胰岛素的两种方法：“AB”法是根据胰岛素A、B 两条肽链的氨基酸序列人工合成两种DNA 片段，利用工程菌分别合成两条肽链后将其混合自然形成胰岛素；  “BCA”法是利用胰岛B 细胞中的 mRNA 得到胰岛素基因，利用工程菌获得胰岛素。这两种方法使用同一种质粒作为载体。请回答下列问题： (1)由于 ，“AB”法中人工合成的两种 DNA 片段均有多种可能的序列。 （填“AB”、“BCA”或“AB 和 BCA”） 法获取的目的基因中不含人胰岛素基因启动子。 (2)通过PCR技术扩增目的基因时，所需的酶为 ，该酶的最适温度是 ℃。对人工合成的胰岛素基因进行测序，发现其两端附近无限制酶EcoRI、BamHI 的酶切位点。已知胰岛素基因表达时以①链为模板，下图是利用基因工程生产人胰岛素过程中使用的质粒及目的基因的部分结构。为保证人胰岛素基因能正确连接到用限制酶EcoRI 和BamHI处理的图1所示质粒上，且利用表达载体上的启动子在受体菌中以①链为模板进行转录，则应在配对到②链的引物5'端添加6个碱基，序列为 5'- -3'。PCR 扩增过程中，最早经过 轮循环后，便可获得两端均携带限制酶识别序列的所需双链目的基因。 (3)若使用一种限制酶切割目的基因和载体后，会存在目的基因的正向或反向两种连接产物， （填“可以”或“不可以”）通过电泳来区分两种产物，在凝胶中 DNA 分子的迁移速率与 （列举两点）等有关。 (4)天然胰岛素制剂容易形成二聚体或六聚体，皮下注射胰岛素后往往要经历一个逐渐解离为单体的过程，这在一定程度上延缓了疗效。科学家希望利用蛋白质工程技术，对胰岛素进行改造，基本思路是：从预期的蛋白质功能出发→ → →找到并改变相对应的脱氧核苷酸序列（基因）或合成新的基因→获得所需要的蛋白质。 【答案】(1) 绝大多数氨基酸都有几个密码子（或密码子具有简并性，或一种氨基酸可能对应多种密码子） AB和BCA (2) 耐高温的DNA聚合酶 72 GGATCC 3/三 (3) 不可以 凝胶的浓度、DNA分子的大小和构象 (4) 设计预期的蛋白质结构 推测应有的氨基酸序列 【难度】0.65 【知识点】遗传信息的翻译、PCR扩增的原理与过程、基因表达载体的构建、蛋白质工程原理及操作流程 【分析】利用一对引物进行PCR时，根据半保留复制特点可知，前两轮循环产生的四个DNA分子的两条链均不等长，第三轮循环产生的DNA分子存在等长的两条核苷酸链，即两个引物之间的碱基序列。 【详解】（1）根据题干信息可知，AB法是先根据胰岛素A、B两条肽链的氨基酸序列推测得到mRNA，再由mRNA推测出DNA，由于绝大多数氨基酸都有几个密码子（或密码子具有简并性，或一种氨基酸可能对应多种密码子），所以得到的mRNA就会有多种可能，从而使AB法中人工合成的两种DNA片段均有多种可能的序列。结合题干BCA法是通过从人体胰岛B细胞中的mRNA得到胰岛素基因，以及题干“AB法是根据胰岛素A、B两条肽链的氨基酸序列人工合成两种 DNA片段”，而在基因的结构中，启动子在非编码区，是不会被转录和翻译的，则根据相应mRNA或者氨基酸序列反向推知的DNA序列都不含启动子部分，因此AB和BCA法获取的目的基因中不含人胰岛素基因启动子。 （2）通过PCR技术扩增目的基因时，为了适应高温，所需的酶为耐高温的DNA聚合酶，该酶的最适温度是72℃。人胰岛素基因表达时以①链为模板进行转录，且其3'端存在启动子，图1所示质粒上的ampR为氨苄青霉素 抗性基因，tetR为四环素抗性基因，为保证人胰岛素基因能正确连接到用限制酶EcoRI和BamH处理的图1所示质粒上，且利用表达载体上的启动子在受体菌中以①链为模板进行转录，应在配对到②链的引物5'端添加6个碱基，序列为5'-GGATCC-3'。PCR扩增过程中，每次循环可以分为变性、复性和延伸三步，最早经过3轮循环后，便可获得两端均携带限制酶识别序列的所需双链目的基因。 （3）琼脂糖凝胶电泳可对DNA分子大小进行鉴定，凝胶中DNA分子的迁移速率与凝胶的浓度、DNA分子的大小和构象等有关，目的基因的正向或反向两种连接产物分子大小一致，无法通过电泳区分。 （4）蛋白质工程的思路是：从预期的蛋白质功能出发→设计预期的蛋白质结构→推测应有的氨基酸序列→找到并改变相对应的脱氧核苷酸序列（基因）或合成新的基因→获得所需要的蛋白质。 36．（23-24高二下·山东青岛·期末）酵母细胞中存在一种转录调节机制：基因的转录需要转录因子，转录因子包括BD蛋白和AD蛋白，两蛋白分开时不能激活转录。图1为用于研究外源X蛋白和Y蛋白能否相互结合的机制模式图。先将X蛋白、Y蛋白分别与BD蛋白、AD蛋白连接，若X蛋白和Y蛋白能相互结合，就能通过该机制驱动报告基因的转录。科研人员利用上述机制，研究水稻抗虫性状相关的两种重要调节蛋白R1蛋白与R2蛋白是否能相互结合，所利用的报告基因为荧光蛋白基因。 (1)欲将BD蛋白与R1蛋白连接，AD蛋白与R2蛋白连接，需将相关的基因连接形成融合基因，科研人员构建了图2所示的基因表达载体，要将R1蛋白基因和R2蛋白基因分别插入载体中，获得两种融合基因表达载体，共需要 种酶。 (2)科研人员先将上述两种融合基因表达载体分别导入大肠杆菌细胞，以获得 ，再将两种融合基因表达载体同时导入含有 的酵母细胞中，相关基因表达后，即可判断R1蛋白与R2蛋白能否相互结合。 (3)为排除融合基因不转录等因素引起的实验误差，可利用PCR技术检测受体酵母细胞中融合基因是否转录，大致思路是：提取待检测酵母细胞中的总RNA，再经 形成cDNA，并以此为模板，根据 设计引物进行PCR扩增，电泳鉴定，若有扩增产物说明融合基因已转录，反之，则说明融合基因未转录。 (4)为了得到符合预期的融合蛋白，BD基因序列的尾部不能含有 序列，经上述改造后，将融合基因表达载体导入酵母细胞后，融合基因转录出的mRNA序列正确，翻译出的融合蛋白中BD蛋白的氨基酸序列正确，但R1基因指导合成的氨基酸序列与R1蛋白不同。据图3分析，出现该问题的原因是 。为解决这一问题，可在扩增R1蛋白基因时将引物中的EcoRI识别序列 （填“3'端”或“5'端”）添加1个碱基。 【答案】(1)4/四 (2) BD蛋白基因与R1蛋白基因、AD蛋白基因与R2蛋白基因融合成功的基因表达载体 荧光蛋白基因 (3) 逆转录 R1基因、R2基因 (4) -GAATTC- EcoRⅠ在切割R1基因时，把编码Leu的密码子对应的DNA上碱基切割了，破坏了相应的mRNA结构 5'端 【难度】0.65 【知识点】基因表达载体的构建、DNA重组技术的基本工具、PCR扩增的原理与过程、遗传信息的翻译 【分析】基因工程中，在构建基因表达载体时，需使用同种限制酶切割目的基因与载体，使其形成相同末端以便使用DNA连接酶进行连接。可通过标记基因的作用来检测受体细胞是否含有目的基因。 【详解】（1）根据图2可知，R1蛋白基因插入位点存在EcoRⅠ和BamHⅠ两种限制酶的识别序列，因此R1蛋白基因插入时需要用上述两种限制酶将载体切出黏性末端，同理，R2蛋白基因插入时需要用EcoRⅠ和XhoⅠ将载体切出黏性末端，另外构建基因表达载体时还需要DNA连接酶连接，因此要将R1蛋白基因和R2蛋白基因分别插入载体中，获得两种融合基因表达载体，共需要EcoRⅠ、BamHⅠ、XhoⅠ和DNA连接酶共4种酶。 （2）科研人员先将上述两种融合基因表达载体分别导入大肠杆菌细胞，目的是扩增上述两种融合基因表达载体，以获得更多的BD蛋白基因与R1蛋白基因、AD蛋白基因与R2蛋白基因融合成功的基因表达载体。根据题意可知，所利用的报告基因为荧光蛋白基因，故再将两种融合基因表达载体同时导入含有荧光蛋白基因的酵母细胞中，若X蛋白和Y蛋白能相互结合，就能通过该机制驱动报告基因的转录，因此相关基因表达后，即可判断R1蛋白与R2蛋白能否相互结合。 （3）提取待检测酵母细胞中的总RNA，再经逆转录形成cDNA，并以此为模板，根据插入的R1基因、R2基因设计引物进行PCR扩增，电泳鉴定，若有扩增产物说明融合基因已转录，反之，则说明融合基因未转录。 （4）为了得到符合预期的融合蛋白，BD基因序列的尾部不能含有-GAATTC-序列，防止构建基因表达载体时EcoRⅠ将BD基因破坏。若要融合基因表达形成融合蛋白，需要保证两个基因中间的碱基数量是3的倍数，根据图3可知，EcoRⅠ在切割R1基因时，把编码Leu的密码子对应的DNA上碱基切割了，破坏了相应的mRNA结构，因此导致翻译出的融合蛋白中BD蛋白的氨基酸序列正确，但R1基因指导合成的氨基酸序列与R1蛋白不同。为解决这一问题，可在扩增R1蛋白基因时将引物中的EcoRI识别序列5'端添加1个碱基，保证转录后两个基因对应的mRNA序列之间的碱基数为3的倍数。 37．（23-24高二下·山东东营·期末）研究发现基因L 能够调控大豆的逆境响应。利用基因工程技术编辑基因L，可培育耐盐碱大豆品系。在载体上的限制酶Bsa I切点处插入大豆基因L的向导DNA序列， 将载体导入大豆细胞后，其转录产物可引导核酸酶特异性结合基因组上的目标序列并发挥作用。载体信息、某些限制酶的识别序列及切割位点如图所示。    (1)目标基因L的向导DNA序列经限制酶 切割，形成的单链突出末端为黏性末端，与酶切后载体混合，再经 （ 填“T4DNA连接酶”、“E.coliDNA 连接酶”、“T4DNA连接酶或E.coliDNA连接酶”）高效作用后，可形成重组载体。基因L的向导DNA 序列经切割后插入图中载体时其左侧、右侧的黏性末端序列分别为5'- -3'和5'- -3'。 (2)根据农杆菌 的特点，将目的基因插入农杆菌特定的DNA序列中，就可将目的基因导入大豆细胞，进而培育出大豆植株甲。此过程中使用含氨苄霉素的培养基筛选转化的 细胞（填“大豆”或“农杆菌”或“大豆和农杆菌”）。根据导入质粒的情况， 筛选出的转化细胞有两种，在此培养基上不能区分这两种细胞的原因是 。 (3)以上述大豆植株甲的DNA 为模板，通过PCR扩增目标基因L， 假设起始的有效DNA模板数为n，在扩增过程中，第5次循环共形成 条目标基因L的单链。为了鉴定 基因编辑是否成功，再利用电泳等技术对PCR 扩增的产物进行鉴定。除上述分子水平的 检测外，还需进行个体生物学水平的鉴定，可采用的方法是 。 【答案】(1) Bsa I T4DNA连接酶或E.coliDNA连接酶 ATTG AAAC (2) Ti质粒上的T-DNA可转移并整合到细胞染色体DNA上 农杆菌 这两种细胞均含氨苄霉素抗性基因 (3) 30n 将上述大豆与普通大豆种植于盐碱地，观察比较生长情况 【难度】0.65 【知识点】目的基因的检测与鉴定、将目的基因导入受体细胞、基因表达载体的构建、PCR扩增的原理与过程 【分析】1、基因工程的基本操作程序包括目的基因的筛选与获取，基因表达载体的构建，将目的基因导入受体细胞和目的基因的检测与鉴定。 2、PCR是一项根据DNA半保留复制的原理，在体外提供参与DNA复制的各种组分与反应条件，对目的基因的核苷酸序列进行大量复制的技术，利用PCR可以快速的获取和扩增目的基因。 【详解】（1）由题干信息可知，在载体上的限制酶Bsa I切点处插入大豆基因L的向导DNA序列，所以目标基因L的向导DNA序列经限制酶Bsa I切割，形成的单链突出末端为黏性末端，由于T4DNA连接酶和E.coliDNA连接酶都能连接黏性末端，所以与酶切后载体混合，再经T4DNA连接酶或E.coliDNA连接酶高效作用后，可形成重组载体。由图可知，限制酶Bsa I的识别序列中N代表任一碱基，所以切割时主要以基因L的向导DNA序列上的碱基为主，故基因L的向导DNA序列经切割后插入图中载体时其左侧、右侧的黏性末端序列分别为5'-ATTG-3'和5'-AAAC-3'。 （2）根据农杆菌Ti质粒上的T-DNA可转移并整合到细胞染色体DNA上的特点，将目的基因插入农杆菌特定的DNA序列中，就可将目的基因导入大豆细胞，进而培育出大豆植株甲。此过程中使用含氨苄霉素的培养基筛选转化的农杆菌细胞。根据导入质粒的情况， 筛选出的转化细胞有两种，一种是导入了重组质粒的细胞，一种是导入了只含质粒的细胞，在此培养基上不能区分这两种细胞的原因是这两种细胞均含氨苄霉素抗性基因，在该培养基上均能生长。 （3）DNA复制的方式是半保留复制，在PCR扩增过程中，第5次循环共形成25-1=16个DNA分子，其中有两条链是亲本的，所以新合成的DNA有15个，而每个DNA分子有2条链，起始的有效DNA模板数为n，故第5次循环共形成30n条目标基因L的单链。为了鉴定基因编辑是否成功，除上述分子水平的检测外，还需进行个体生物学水平的鉴定，可采用的方法是将上述大豆与普通大豆种植于盐碱地，观察比较生长情况。 38．（23-24高二下·山东济南·期末）地衣芽孢杆菌产生的胞外多糖（EPS）通过促进大粒径土壤团聚体形成以改良土壤。研究者利用EPS合成酶基因（H基因）和含木糖诱导型启动子的p质粒（二者结构如图1所示）构建重组载体，以改造地衣芽孢杆菌并获取高产菌株。    (1)图1中H 基因以a链为转录模板链，由此可以推测H基因的转录是从其 （填“左侧”或“右侧”）开始的。H基因上的一段序列为：5´-ATCTCGAGCGGG-3´中包含 Xho识别序列（含有6个核苷酸），则这 6个核苷酸序列是 。构建重组质粒时，为保证 H基因与p质粒正确连接，p质粒位点1和2的所对应的酶分别是 ，酶切后加入 酶使它们形成重组质粒。 (2)将构建好的重组质粒转入经 处理后的地衣芽孢杆菌，经筛选获得到转基因地衣芽孢杆菌。对其进行工业培养时，添加木糖获取更多EPS的机理是 。 (3)质粒在细菌细胞中遗传不稳定，易丢失，研究者尝试将重组质粒进行改造，利用同源区段互换的方法将H基因插入地衣芽孢杆菌的拟核DNA中，得到整合型地衣芽孢杆菌F。若将三种地衣芽孢杆菌进行培养，结果如图3。其中D菌为不含有 H基因的地衣芽孢杆菌，E菌含有 H基因，但 H基因没有整合到地衣芽孢杆菌的拟核DNA 中。据图判断 最适宜改良土壤生产胞外多糖（EPS），请阐明理由 。    【答案】(1) 右侧 5´-CTCGAG-3´ Xho、BsaI(顺序不可颠倒) DNA连接 (2) Ca2+ p质粒上是木糖诱导型启动子，在培养基中需要添加木糖，才能诱导H基因表达出产物胞外多糖（EPS） (3) F菌 D菌不能产生胞外多糖（EPS），F菌比E菌生长迅速，胞外多糖（EPS）产量高，H基因整合到细菌DNA上，不易丢失 【难度】0.65 【知识点】DNA重组技术的基本工具、基因表达载体的构建、将目的基因导入受体细胞、基因工程的操作程序综合 【分析】1、DNA连接酶和DNA聚合酶是两种不同的酶，主要的区别就在于它们的底物是不一样的，DNA连接酶和DNA聚合酶都是形成磷酸二酯键，但是DNA连接酶连接的是DNA片段，DNA聚合酶主要就是将单个脱氧核糖核苷酸按照顺序连接到DNA链上。 2、转录是从DNA链的3'端开始，mRNA自身的延伸方向为5'→3'。 【详解】（1）转录是从DNA链的3'端开始，mRNA自身的延伸方向为5'→3'，由此可以推测H基因的转录是从其右侧开始的。限制酶切割DNA ，须两条链都有识别位点（即识别片段两条链序列成倒序），选5'-CTCGAG-3'片段，则另一条链为3'-GAGCTC-5'，两条链都有识别位点，故推测该序列进行剪切的Xho识别的核苷酸序列（6个核苷酸）最可能为5'-CTCGAG-3'。 H基因以a链为转录模板链，转录时mRNA自身的延伸方向为5′→3′，即转录是从DNA链的3′开始，启动子是RNA聚合酶识别和结合部位，能够驱动基因的转录，再结合质粒中启动子的方向可知，图1中p质粒位点1和2所对应的酶分别是Xho酶和BsaⅠ酶。DNA连接酶连接的是DNA片段，DNA聚合酶主要就是将单个脱氧核糖核苷酸按照顺序连接到DNA链上，所以酶切后加入DNA连接酶使它们形成重组质粒。 （2）目的基因导人微生物细胞常用Ca2+处理法，Ca2+处理受体细胞，可使其处于一种能吸收周围环境中DNA分子生理状态，这种细胞叫感受态细胞。 经筛选获得到转基因地衣芽孢杆菌，对其进行工业培养时，添加木糖获取更多EPS的机理是：p质粒上是木糖诱导型启动子，在培养基中需要添加木糖，才能诱导H基因表达出产物胞外多糖（EPS）。 （3）由图3可知，F菌最适宜改良土壤生产胞外多糖（EPS）原因是：D菌不能产生胞外多糖（EPS），F菌比E菌生长迅速，胞外多糖（EPS）产量高，H基因整合到细菌DNA上，不易丢失。 39．（23-24高二下·山东济南·期末）研究发现，大部分白血病患者细胞中存在异常的融合基因 UBA2-WTIP，可作为检测白血病的特异性分子标志物。科研人员通过 RT-PCR 方法克隆得到融合基因UBA2-WTIP，为了研究该基因的作用和致病机制，需要构建重组载体并把目的基因和FLAG标签基因序列连接起来，分别获得带有 FLAG 肽链的 UBA2-WTIP 融合蛋白和WTIP 蛋白。FLAG肽链由8个氨基酸残基组成，可作为基因工程中蛋白质是否表达的标记。 (1)科研人员以提取的某白血病人外周血细胞总 RNA为模板，经过 过程合成cDNA,设计 种引物,经RT-PCR扩增出融合基因 UBA2-WTIP,对测序结果进行数据分析,推测融合基因UBA2-WTIP 是在 UBA2基因的第16 外显子与 WTIP 基因的第2 外显子处拼接而成，如图1所示。为了验证该融合基因的产生是基因组DNA融合而不是不同的RNA 剪接后逆转录所产生的，可提取该病人的 (填“DNA”或“RNA”)为模板，使用图中F₁ 和 R₁ 引物进行PCR扩增，若出现 bp扩增片段，说明该融合基因的融合方式是基因组水平融合。 (2)为了构建重组载体，科研人员设计了以下2种引物，如图2所示：上游引物F2为:5’TATGGTACCATG①GCACTGTCGCGGGGG3’,GGTACC 为 KpnI酶切位点；下游引物R2为:5’TAT②TCA③GAGCTCAGTGACGTG3’;FLAG标签基因编码链序列可以插入目的基因编码区的首端或者末端。已知引物中 ATG对应起始密码。若UBA2-WTIP融合基因编码的蛋白质前端有一段信号肽，则 FLAG 标签基因序列一般不能插入①位置，原因是 ；已知引物中 TCA 对应终止密码，则FLAG 标签基因序列和EcoRⅠ酶切位点应分别插入在下游引物 、 处。 (3)制备的重组载体体外转染人类白血病细胞株 KG-1a细胞，提取各组细胞总蛋白，用FLAG 单克隆抗体检测蛋白表达情况，并分别测定转染空质粒的对照细胞、转录 UBA2-WTIP 融合基因及转录 WTIP 基因的KG-1a细胞增殖情况，结果分别如图3所示。 检测相关蛋白质是否表达的方法是 ；上述生长曲线结果说明 。 【答案】(1) 逆（反）转录 2 DNA 239 (2) 蛋白质前端的信号肽一般会在蛋白质成熟时被切割掉，所以不能得到带有FLAG肽链的蛋白质 R2② R2③ (3) 抗原—抗体杂交 UBA2—WTIP融合基因能在体外促进白血病细胞增殖，WTIP基因能抑制白血病细胞的增殖 【难度】0.65 【知识点】PCR扩增的原理与过程、基因表达载体的构建、目的基因的检测与鉴定、动物细胞融合与单克隆抗体的制备 【分析】基因工程的基本操作程序有四步：（1）目的基因的获取；（2）基因表达载体的构建；（3）将目的基因导入受体细胞，（4）目的基因的检测与鉴定。 【详解】（1）科研人员以提取的某白血病人外周血细胞总RNA为模板，经过逆（反）转录过程合成cDNA。DNA分子是双链，PCR时以每一条为模板，合成子代DNA，因此需要2种引物。据图1可知，如果融合基因UBA2—WTIP是在UBA2基因的第16外显子与WTIP基因的第2外显子处拼接而成，那么该基因长度为239bp，能以F1和R1引物进行PCR扩增，因此如果提取该病人的DNA，使用图中F1和R1引物进行PCR扩增，若出现239bp扩增片段，该融合基因的融合方式是基因组水平融合。 （2）PCR时，在引物作用下，DNA聚合酶从引物3'端开始延伸DNA链，即DNA的合成方向是从子链的5'端向3'端延伸的，①位置前面为ATG，是翻译的起始位置，若FLAG标签基因序列插入①位置，UBA2—WTIP融合基因编码的蛋白质前端有一段信号肽，蛋白质前端的信号肽一般会在蛋白质成熟时被切割掉，不能得到带有FLAG肽链的蛋白质，因此一般不能插入①位置。已知引物中 TCA 对应终止密码，标签基因序列本身含有启动子和终止子序列，不需要在目的基因中的启动子和终止子之间，因此可在下游引物R2②③处分别插入FLAG标签基因序列和EcoR Ⅰ酶切位点。 （3）检测相关蛋白质是否表达的方法是抗原—抗体杂交。据图3结果可知，与转染空质粒的对照细胞相比，转录WTIP基因的KG-la细胞增殖较少，转录UBA2—WTIP融合基因的KG-la细胞增殖较多，据此可知，UBA2—WTIP融合基因能在体外促进白血病细胞增殖，WTIP基因能抑制白血病细胞的增殖。 一、单选题 1．（23-24高二下·山东威海·期末）拟南芥中RGL1酶作为E3泛素连接酶（AtRZF1）的抑制因子在响应植物干旱胁迫中发挥着重要作用。研究发现，AtRZF1功能丧失突变体比野生型拟南芥具有更高的耐旱性。研究人员采用融合PCR技术（原理如下图所示）将RGL1酶基因和AtRZF1基因连接起来构建融合基因以研究两种基因的相互作用。下列说法正确的是（　　）    A．RGL1酶在植物干旱胁迫响应中起到正调控作用 B．图中第一阶段经过1次PCR循环即可获得双链等长的DNA C．图中第二阶段构建融合基因时能够起到“搭桥融合”作用的引物有4种 D．融合PCR技术操作过程中的每个阶段都需经历两次降温和一次升温 【答案】A 【难度】0.4 【知识点】PCR扩增的原理与过程 【分析】1、PCR是利用DNA在体外摄氏95℃高温时变性会变成单链，低温(经常是60℃左右)时引物与单链按碱基互补配对的原则结合，再调温度至DNA聚合酶最适反应温度(72℃左右)，DNA聚合酶沿着磷酸到五碳糖(5'-3')的方向合成互补链，基于聚合酶制造的PCR仪实际就是一个温控设备，能在变性温度，复性温度，延伸温度之间很好地进行控制。 2、融合PCR技术采用具有互补末端的引物，形成具有重叠链的PCR产物，通过PCR产物重叠链的延伸，从而将不同来源的任意DNA片段连接起来。 【详解】A、据题意，AtRZF1功能丧失突变体比野生型拟南芥具有更高的耐旱性，说明AtRZF1在干旱胁迫响应中起抑制作用，而RGL1酶作为E3泛素连接酶（AtRZF1）的抑制因子，所以RGL1酶在植物干旱胁迫响应中起到正调控作用，A正确； B、由图可知，引物2和引物3的一端都添加了一段序列，所以经过1次PCR循环得到的是含有引物2、引物3的产物，其DNA双链不等长，该产物继续进行第二次扩增（循环），才能获得双链等长的DNA，B错误； C、由图可知，融合PCR中是通过在引物2和引物3的一端添加能碱基互补配对的序列，从而在第二阶段利用这两段互补序列形成具有重叠链的PCR引物。所以能够起到“搭桥融合”作用的引物有2种，即引物2和引物3，C错误； D、PCR技术操作过程中，每轮循环是需要一次降温和两次升温，D错误； 故选A。 2．（23-24高二下·山东菏泽·期末）科学家将某病毒抗原蛋白的部分编码序列（RBD）拼接成融合基因2RBD和3RBD，探究RBD的二聚体蛋白和三聚体蛋白能否模拟RBD的天然构象并获得高效免疫原性。为鉴定重组质粒是否构建成功，将重组质粒用NcoI和SacI双酶切处理后电泳，结果如图，其中泳道1为双酶切pNZ8149-2RBD，两个条带大小分别为2507bp和2020bp。将构建好的重组质粒分别导入工程菌中进行表达产物的检测。下列说法不正确的是（    ） A．PCR扩增融合基因时，在引物的3′端添加相应限制酶的识别序列 B．据图可知，融合基因3RBD的长度为2686bp C．泳道2呈现一个条带的原因是酶切pNZ8149﹣3RBD产生的两个片段大小相近 D．从工程菌细胞表面提取蛋白质进行检测，从而进一步比较两者的免疫原性 【答案】A 【难度】0.4 【知识点】PCR扩增的原理与过程、基因表达载体的构建 【分析】基因工程技术的基本步骤：（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成；（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等；（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样；（4）目的基因的检测与鉴定。 【详解】A、引物使DNA聚合酶能够从引物的3'端开始连接脱氧核苷酸，PCR扩增融合基因时，在引物的5'端添加相应限制酶的识别序列，A错误； B、由图可知pNZ8149-2RBD和pNZ8149-3RBD的碱基对分别为4527bp和5193bp，所以RBD长度为5193-4527=666bp，泳道1为双酶切pNZ8149-2RBD，两个条带大小分别为2507bp和2020bp，结合图中泳道2只有一个条带的信息可推测，融合基因3RBD的长度为666+2020=2686bp，B正确； C、由图可知，泳道2呈现一个条带，其原因是双酶切pNZ8149-3RBD后产生的两个片段大小相近，C正确； D、根据题目信息可知，该实验的目的是“探究RBD的二聚体蛋白和三聚体蛋白能否模拟RBD的天然构象并获得高效免疫原性”，U-M为信号肽-细胞壁锚定蛋白序列，据图可知，RBD与U-M相连，因此可以从工程菌细胞表面提取蛋白质进行检测，从而进一步比较两者的免疫原性，D正确。 故选A。 3．（23-24高二下·山东青岛·期末）目前用于治疗人类疾病的单克隆抗体大多数是鼠源单抗。研究人员根据抗体的特点，利用蛋白质工程将鼠源单抗进行改造，思路如图所示，下列说法正确的是（    ） A．图中所示的思路不涉及基因工程的相关操作 B．通过此项研究改造后获得的性状不能遗传给后代 C．上述改造过程中需要明确人源恒定区的基因的碱基序列 D．鼠源单抗易引发人体免疫排斥反应与其可变区有关 【答案】C 【难度】0.4 【知识点】蛋白质工程原理及操作流程、蛋白质工程的应用及实例分析 【分析】蛋白质工程是指以蛋白质分子的结构规律及其与生物功能的关系作为基础，通过基因修饰或基因合成，对现有蛋白质进行改造，或制造一种新的蛋白质，以满足人类的生产和生活的需求。 【详解】A 、蛋白质工程是以蛋白质分子的结构规律及其与生物功能的关系作为基础，通过基因修饰或基因合成，对现有蛋白质进行改造，或制造一种新的蛋白质，以满足人类的生产和生活的需求。而基因工程是蛋白质工程的关键技术之一，蛋白质工程的实施必然涉及基因工程的相关操作，A 错误； B、通过基因工程改造后获得的性状可以遗传给后代，B 错误； C 、 要将鼠源恒定区改为人源恒定区，需要明确人源恒定区的基因的碱基序列，C 正确； D 、 鼠源单抗易引发人体免疫排斥反应主要与其恒定区有关，恒定区是抗体分子中相对较为保守的区域，在不同物种间的差异较大。当鼠源单抗的恒定区进入人体后，人体的免疫系统会将其识别为外来异物，从而引发免疫排斥反应。而可变区主要负责识别和结合抗原，在不同物种间的相似性相对较高，不是引发免疫排斥的主要原因，D 错误。 故选C。 4．（23-24高二下·山东青岛·期末）研究人员利用定点诱变技术对ALDH2（乙醛脱氢酶2）基因进行改造，使其在大肠杆菌中表达，所用质粒和操作过程如图。改造后的ALDH2基因编码区首端到末端（其中一条链）的序列为5'-ATCCATGCGCTC…（中间核苷酸序列）CAGTGAGTAGCG-3'。 注:Ampr为氨苄青霉素抗性基因 Tetr为四环素抗性基因 BamHⅠ的识别序列及切点:5'G↓GATCC3'   PstI的识别序列及切点:5'C↓TGCAG3' XhoⅠ的识别序列及切点:5'C↓TCGAG3' XbaI的识别序列及切点:5'T↓CTAGA3' 为扩增上图中改造的ALDH2基因，某同学设计了如下四种PCR引物，其中可选用的一对引物是（    ） ②5'-TCTAGAATCCATGCGCTC-3' ①5'-TCTAGACGCTACTCACTG-3' ③5'-GGATCCATCCATGCGCTC-3' ④5'-GGATCCCGCTACTCACTG-3' A．②③ B．①④ C．②④ D．①③ 【答案】D 【难度】0.4 【知识点】PCR扩增的原理与过程、基因表达载体的构建 【分析】PCR 即聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction），是一种用于放大扩增特定的 DNA 片段的分子生物学技术。   它具有极高的灵敏度和特异性，能够在短时间内将微量的 DNA 扩增至可以检测和分析的水平。   PCR 的基本步骤包括：   1. 变性：通过加热使 DNA 双链解开成为单链。 2. 退火：降低温度，使引物与单链 DNA 模板结合。 3. 延伸：在 DNA 聚合酶的作用下，以引物为起点合成新的 DNA 链。 【详解】PCR过程需要两种引物，能分别与目的基因两条链的3'端通过碱基互补配对结合。根据ALDH2基因编码区首端到末端的序列为5′-ATCCATGCGGCTC…（中间核苷酸序列）…CAGTGTAGCG-3′，图中用四环素抗性基因来筛选，因此引物5'端需要添加BamHⅠ、XabI的识别序列，可推测引物链为5′-TCTAGACGCTACTCACTG-3′，5′-GGATCCATCCATGCGCTC-3′ ，即①③符合题意，D正确，ABC错误。 故选D。 5．（23-24高二下·山东东营·期末）具核梭杆菌（Fn）侵入肠黏膜后可导致结直肠癌。图为荧光标记滚环扩增法检测Fn的 过 程 ，nusG 基因为Fn 的特异性基因序列，只有当环境中存在该基因序列时，过程②中 锁式探针才能环化；检测探针的荧光基团（FAM）距离淬灭基团（BHQ-1）比较近时，荧 光会被淬灭。图中④为滚环扩增技术（RCA）， 此过程中以环化的锁式探针为模板，以nusG 基因单链为相关引物，通过类似于PCR 的过程，获得了长重复单链DNA．下列叙述错误的是（　　） A．与常规PCR相比RCA缺乏变性步骤，推测所用DNA聚合酶可能不具有耐高温的特性 B．由图推测，应根据nusG 基因的序列设计锁式探针两端的检测臂 C．若检测样品存在Fn， 检测探针的FAM与BHQ-1距离增大，荧光基团发出荧光 D．利用荧光标记滚环扩增法检测肠黏膜中的Fn时需获取大量样品 【答案】D 【难度】0.4 【知识点】PCR扩增的原理与过程、目的基因的检测与鉴定 【分析】PCR是体外模拟DNA复制的过程，其原理是DNA双链复制。体内DNA复制过程中需要模板、原料、能量、引物和酶等，PCR过程中原料和能量由dNTP提供，酶是热稳定DNA聚合酶（Taq酶）。 【详解】A、由于模板是单链DNA，因此扩增时不需要解旋形成单链，故与常规PCR相比，RCA缺乏变性环节，即该扩增过程不需要在高温条件下进行，因此可说明RCA扩增过程中所使用的DNA聚合酶不具有耐高温特性，A正确； B、过程②为锁式探针进行连接以实现环化，即在nusG基因一条链与锁式探针碱基互补配对的前提下，通过DNA连接酶形成磷酸二酯键将锁式探针连接形成环状，在设计锁式探针时需保证检测臂中含nusG基因的特异性序列，B正确； C、若检测样品存在具核酸杆菌，经图2中②-④过程得到的长重复单链DNA与检测探针特异性结合，导致探针两端的FAM与BHQ-1距离增大，发出荧光，C正确； D、由于长重复单链DNA中可同时结合多个检测探针从而使荧光强度增加，因此提高了该检测方法的灵敏度，无需获取大量样品，D错误。 故选D。 6．（23-24高二下·山东滨州·期末）我国科研人员借助CRISPR/Cas9技术对小麦的基因进行编辑，获得了抗白粉病小麦。CRISPR/Cas9基因编辑工作原理如图所示。下列说法错误的是（　　）    A．基因编辑过程中通过Cas9特异性识别目标DNA的碱基序列 B．Cas9-sgRNA复合物与限制酶均可断开特定部位的磷酸二酯键 C．基因编辑小麦没有引入外源基因，理论上来说其安全性高于传统转基因作物 D．sgRNA序列越短，进行基因编辑的过程中“脱靶”的风险越大 【答案】A 【难度】0.4 【知识点】DNA重组技术的基本工具、转基因生物安全性 【分析】基因工程中的操作工具及其作用：①“分子手术刀”——限制性核酸内切酶（限制酶），能够识别双链DNA分子的某种特定的核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开，因此具有专一性。②“分子缝合针”——DNA连接酶，E•coliDNA连接酶，只能将双链DNA片段互补的黏性末端之间的磷酸二酯键连接起来；而T4DNA连接酶能缝合黏性末端和平末端。③“分子运输车”——载体。 【详解】A、在对不同目标DNA进行编辑时，应使用Cas9蛋白和“不同”的sgRNA结合进而实现对不同基因的编辑，A错误； B、sgRNA可引导Cas9蛋白到特定基因位点进行切割，所以sgRNA可以特异性识别目标DNA分子，Cas9蛋白作用于磷酸二酯键，B正确； C、相较于转基因，基因编辑技术的优势是，可以不引入外源基因，只是在农作物本身的基因上“做手术”，切去一些基因等，提高作物食味品质、改变颜色、增加营养元素，赋予作物抗逆性、抗旱性、抗病性、提高肥料养分利用率等，理论上来说其安全性更高，C正确； D、CRISPR/Cas9技术编辑基因有时会因SgRNA错误结合而出现“脱靶”现象，SgRNA的序列越短，可识别的DNA上的特定碱基序列越短，越容易发生脱靶现象，即脱靶率越高，“脱靶”的风险越大，D正确。 故选A。 二、解答题 7．（23-24高二下·山东威海·期末）种子活力的高低是衡量种子品质的重要指标，对作物的高产、稳产至关重要。种子在贮藏期间易发生老化劣变，造成种子活力降低从而影响作物产量。研究表明，玉米的ZmRap2.7基因（编码转录因子ZmRap2.7）与种子贮藏后的活力显著相关。 (1)与正常玉米植株相比，敲除了ZmRap2.7基因的突变体种子发芽率显著降低且易老化，由此推知，ZmRap2.7基因 （填“正调控”或“负调控”）玉米种子的耐贮性。 (2)为了探究ZmRap2.7基因的作用机理，科研人员利用PCR技术在体外扩增ZmRap2.7基因，加入的引物需满足的条件是 ；扩增产物可通过琼脂糖凝胶电泳来鉴定，其原理是 ；鉴定过程中，除了将扩增得到的PCR产物与凝胶载样混合注入凝胶加样孔外，还应留一个加样孔加入 。 (3)科研人员采用DNA阻滞实验探究发现：转录因子ZmRap2.7通过与某些特定DNA分子（ABA信号传导基因ZmPYL3、ZmPP2C、ZmABI5的启动子）结合从而发挥调控作用。该实验方法的原理是：当被荧光标记的待测DNA与蛋白质（如转录因子ZmRap2.7）结合后，由于形成的复合物分子量显著增大，电泳后通过荧光检测可显示出明显 （填“领先”或“滞后”）于游离待测DNA的条带。由此推测转录因子ZmRap2.7通过直接结合到ABA信号传导基因ZmPYL3、ZmPP2C、ZmABI5的启动子上，影响了 ，从而抑制上述基因的转录，最终导致ABA无法对种子发挥作用。 (4)科研人员利用DNA阻滞实验进一步探究基因ZmPYL3、ZmPP2C、ZmABI5的启动子序列中能与ZmRap2.7特异性结合的关键序列，分析发现，X1~X6是三者都具备的相似序列。已知X1能结合ZmRap2.7，为探究X2~X6与ZmRap2.7的结合能力，科研小组利用荧光标记的X1作为指示探针，大量无荧光标记的X2~X6序列作为竞争探针，加入相应泳道进行实验。当竞争探针的量远多于指示探针，ZmRap2.7会与结合能力较强的竞争探针结合，指示探针则多数处于自由状态，放射自显影图上阻滞条带的放射性就会显著 。实验中每个泳道添加的物质及荧光检测结果如右图所示：图中“？”是指加入 ，阻滞条带的宽窄代表 。据图分析可知，X2~X6序列中， 与ZmRap2.7的结合能力最强。 【答案】(1)正调控 (2) 能与ZmRap2.7基因母链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸 DNA分子在一定pH条件下可带上正电荷或负电荷，在电场作用下会向相反方向移动，不同DNA分子大小不同，在电场作用下迁移速率不同 指示分子大小的标准参照物 (3) 滞后 RNA聚合酶识别和结合启动子 (4) 减弱 指示探针X1 X1与ZmRap2.7的结合量 X4 【难度】0.4 【知识点】PCR扩增的原理与过程、电泳鉴定 【分析】PCR全称为聚合酶链式反应，是一项在生物体外复制特定的DNA片段的核酸合成技术，利用的原理是DNA复制，需要条件有模板DNA、四种脱氧核苷酸、一对引物、热稳定DNA聚合酶（Taq酶），过程包括：①高温变性：DNA解旋过程（PCR扩增中双链DNA解开不需要解旋酶，高温条件下氢键可自动解开）；②低温复性：引物结合到互补链DNA上；③中温延伸：合成子链。 【详解】（1）与正常玉米植株相比，敲除了ZmRap2.7基因的突变体种子发芽率显著降低且易老化，说明ZmRap2.7基因编码转录因子ZmRap2.7能提高种子贮藏后的活力，即ZmRap2.7基因正调控玉米种子的耐贮性。 （2）引物是一小段能与DNA母链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸，科研人员利用PCR技术在体外扩增ZmRap2.7基因，加入的引物需满足的条件是能与ZmRap2.7基因母链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸。 DNA分子的琼脂糖凝胶电泳 是指DNA分子中具有可解离的基团，在一定的pH下，这些基团可以带上正电荷或负电荷。在电场的作用下，这些带电分子会向着与它所带电荷相反的电极移动。扩增产物可通过琼脂糖凝胶电泳来鉴定，其原理是DNA分子在一定pH条件下可带上正电荷或负电荷，在电场作用下会向相反方向移动，不同DNA分子大小不同，在电场作用下迁移速率不同。鉴定过程中，除了将扩增得到的PCR产物与凝胶载样混合注入凝胶加样孔外，还应留一个加样孔加入指示分子大小的标准参照物，用于检测PCR的产物是否合格。 （3）在凝胶中DNA分子的迁移速率与凝胶的浓度、DNA分子的大小和构象等有关。由于形成的复合物分子量显著增大，电泳后通过荧光检测可显示出明显滞后于游离待测DNA的条带。启动子是一段有特殊结构的DNA片段，位于基因的首端，是RNA聚合酶识别和结合的部位，能驱动基因转录出mRNA，最终获得所需的蛋白质。转录因子ZmRap2.7通过直接结合到ABA信号传导基因ZmPYL3、ZmPP2C、ZmABI5的启动子上，影响了RNA聚合酶识别和结合启动子，从而抑制上述基因的转录，最终导致ABA无法对种子发挥作用。 （4）X1能结合ZmRap2.7，利用荧光标记的X1作为指示探针，阻滞条带是指X1与ZmRap2.7结合后的放射性强度，当竞争探针的量远多于指示探针，ZmRap2.7会与结合能力较强的竞争探针结合，指示探针则多数处于自由状态，不能与ZmRap2.7结合，放射自显影图上阻滞条带的放射性就会显著减弱。由图可知，泳道1中只加入“？”，其荧光检测结果只含有指示探针X1，说明图中“？”是指加入指示探针X1。阻滞条带是指X1与ZmRap2.7结合后的放射性强度，因此阻滞条带的宽窄代表X1与ZmRap2.7的结合量。据图分析可知，X2~X6序列中，X4与ZmRap2.7的结合能力最强，导致指示探针则多数处于自由状态，放射自显影图上阻滞条带的放射性最低。 8．（23-24高二下·山东日照·期末）科研人员将除草剂草甘膦抗性基因转入甘蓝植株，获得抗草甘膦转基因甘蓝植株。培育过程如图1所示。 (1)为便于PCR扩增后的草甘膦抗性基因与质粒连接，需在两个引物的 （填“”或“”）端添加限制的识别序列。扩增产物经酶切后形成的黏性末端（单链突出末端）序列为 和 。 (2)若目的基因用BamHⅠ和BglⅡ剪切，质粒用BamHⅠ剪切，酶切后的目的基因存在正向与反向两种连接方式，可用 酶对两种重组质粒进行剪切。通过琼脂糖凝胶电泳技术对产物分别进行分析，结果如图2所示，样品1和样品2中小片段的长度分别为 kb，图中 （填“样品1”或“样品2”）为所需的基因表达载体。 (3)在过程④的培养基中添加的抗生素为 ，以便筛选出含目的基因的甘蓝植株。鉴定时发现，该过程获得的转基因甘蓝植株有一部分具有草甘膦抗性基因，但没有表现出抗草甘膦性状，原因可能是 （答出1点即可）。 【答案】(1) 5′ GATC GATC (2) BamHI和EcoRI 20kb、45kb 样品2 (3) 潮霉素 草甘膦抗性基因没有表达 【难度】0.4 【知识点】PCR扩增的原理与过程、DNA重组技术的基本工具、基因表达载体的构建 【分析】1、基因工程的基本操作步骤主要包括四步：①目的基因的获取，②基因表达载体的构建，③将目的基因导入受体细胞，④目的基因的检测与鉴定。2、分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA是否插入目的基因：DNA分子杂交技术；②检测目的基因是否转录出了mRNA：分子杂交技术；③检测目的基因是否翻译成蛋白质：抗原-抗体杂交技术。 【详解】（1）PCR扩增后的草甘膦抗性基因包含引物，切割的时候也要包含引物，需要把限制酶识别序列加在5′ 端，扩增产物用BamHI酶到BglII酶进行切割，产生的黏性末端分别是5′−GATC−3′和5′−GATC−3′。 （2）用BamHI酶到BglII酶切割产生相同的黏性末端，保证正向连接用的是EcoRI酶和BamHI酶。正向连接的重组质粒会被切去20+25=45kb长度的片段，反向连接的重组质粒会被切去20kb长度的片段，电泳凝胶中，DNA分子量越大，在凝胶中收到的阻力越大，迁移距离越短，正向连接的重组质粒被切割后两个片段的大小介于反向连接的重组质粒被切割后两个片段的大小之间，说明样品2是所需的基因表达载体。 （3）由图可知，卡那霉素抗性基因不在T-DNA片段中，潮霉素抗性基因在T-DNA片段中，可随T-DNA转移并整合到被侵染的细胞的染色体DNA上，从而使含目的基因的甘蓝植株有抗潮霉素的抗性，所以能在含潮霉素的培养基上筛选含目的基因的甘蓝植株，故步骤④的培养基中添加潮霉素，以便筛选出含目的基因的甘蓝植株。转基因甘蓝植株有一部分具有草甘膦抗性基因，但没有表现出抗草甘膦性状，原因可能是草甘膦抗性基因没有表达，从而使得相应性状没有表现出来。 9．（23-24高二下·山东枣庄·期末）某动物体内含有研究者感兴趣的目的基因，研究者欲将该基因导入大肠杆菌的质粒中保存和表达。该质粒含有氨苄青霉素抗性基因（AmpR）、LacZ基因及一些酶切位点，其结构和简单的操作步骤如图所示。 请根据以上信息回答下列问题： (1)若要用PCR技术获取目的基因，需要知道的信息是 ，依据该信息可合成引物。为确保目的基因能与质粒连接，还需要在引物的 （填“3′”或“5′”）端额外添加一段序列5′ 3′。 (2)③过程需要加入 ，磷酸二酯键重新形成后，可能形成的产物有 （回答两种）。 (3)将质粒导入大肠杆菌后，为选择转化成功的大肠杆菌，需要在⑤过程的培养基中添加 ，一段时间后选择 色菌落，即为导入重组质粒的大肠杆菌，原因是 。 【答案】(1) 要有一段已知目的基因的核苷酸序列 5' 5′GAATTC3′ (2) DNA连接酶 质粒与质粒连接物、目的基因与目的基因连接物、质粒与目的基因连接物等 (3) 青霉素、X-gal 白 重组质粒含AmpR基因可以抵 抗氨苄青霉素；重组质粒的LacZ基因在插入目的基因时被破坏，不能分解X-gal，只能形成白色菌落 【难度】0.4 【知识点】PCR扩增的原理与过程、基因表达载体的构建、将目的基因导入受体细胞、目的基因的检测与鉴定 【分析】1、基因工程是指按照人们的意愿，进行严格的设计，并通过体外DNA重组和转基因等技术，赋予生物以新的遗传特性，从而创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品； 2、基因工程技术的基本步骤：目的基因的获取；基因表达载体的构建；将目的基因导入受体细胞；目的基因的检测与鉴定； 3、基因工程的工具： （1）限制酶：能够识别双链DNA分子的某种特定核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断裂； （2）DNA连接酶：连接的是两个核苷酸之间的磷酸二酯键； （3）载体：常用的载体有质粒、噬菌体、动植物病毒。 【详解】（1）利用PCR技术获取目的基因的前提是要有一段已知目的基因的核苷酸序列以便合成一对引物；由于引物的作用是引导子链的延伸,将脱氧核苷酸连接到引物上时,是与3'端相连的，由此确定需要在引物的5'端加上限制性酶切位点，由题意可知，需要额外添加一段序列5′GAATTC3′； （2）③过程是目的基因与质粒连接，需要加入DNA连接酶，磷酸二酯键重新形成后，可能形成的产物有质粒-质粒连接物、目的基因-目的基因连接物、质粒-目的基因连接物等； （3）标记基因AmpR基因可用于检测质粒是否导入了大肠杆菌，一般只有导入了质粒的大肠杆菌才能在添加了青霉素的培养基上生长。而由于LacZ基因的效应，这些生长的菌落可能出现两种颜色：含有空质粒(没有连接目的基因的质粒)的大肠杆菌菌落呈蓝色；含有重组质粒的大肠杆菌可以抵抗青霉素，但插入目的基因时破坏了LacZ基因，因此菌落呈白色。根据这种生长差异性，可以筛选出含有目的基因的大肠杆菌。因此，第⑤步中，培养基中除了加入大肠杆菌所必需的营养物质外，还需要添加青霉素、X-gal，以便筛选导入目的基因的大肠杆菌。含有重组质粒的大肠杆菌菌落呈白色；因为含AmpR基因可以抵抗氨苄青霉素，同时目的基因的插入破坏了LacZ基因的结构，使其不能正常表达β-半乳糖苷酶，底物X-gal也就不会被分解，进而表现为白色。 10．（23-24高二下·山东德州·期末）小麦的D1b基因是调控光周期的重要基因，当小麦细胞接受足够时长的短日照刺激后，细胞中的A 蛋白就会与D1b基因启动子区中的光周期响应序列结合，进而启动该基因的表达，小麦表现为延迟开花。 (1)D1b基因启动子区位于基因的上游，它除了可接受短日照刺激传递来的信号，还具有的作用是 。 (2)与D1b基因相比，D1a 基因的启动子区缺失了含光周期响应序列的片段（长度约2089bp），但其他序列相同，因此D1a基因会使小麦表现为提前开花。欲利用PCR 扩增出D1b和D1a基因的启动子区，科研人员设计了图1中的引物DF 和DR，引物的作用是 。若D1a基因启动子区扩增产物为 709bp，则D1b基因启动子区扩增产物为 bp。 (3)为找到光周期响应序列的位置，将通过引物F1~F9扩增得到的9种片段、D1b启动子区和D1a启动子区分别与报告基因连接成基因表达载体，如图2 所示。为正确构建基因表达载体，引物DR 的序列应为 （5,-3,写出10个碱基）。将构建成功的11组基因表达载体分别转入拟南芥后，用短日照处理，检测不同组的报告基因开始表达的时间。当实验结果为 时，说明光周期响应序列位于引物F7~F8结合的DNA片段之间。 (4)为找到小麦细胞中的A蛋白，科研人员利用组氨酸和亮氨酸双营养缺陷型酵母菌为受体菌，进行了两次转化实验得到双转化的酵母菌，如图3所示。 ①将含光周期响应序列的诱导型启动子与组氨酸合成酶基因连接，构建成诱饵载体，用该载体转化酵母菌后，其会自主整合到酵母菌基因组中。 ②提取小麦总mRNA，通过 得到不同的cDNA，以这些 cDNA 片段为目的基因，以亮氨酸合成酶基因为 基因，构建成猎物载体转化上述酵母菌。 ③将双转化后的酵母菌接种到 的选择培养基上培养，若 ，则说明该组酵母菌中 cDNA 指导合成的是 A 蛋白。 【答案】(1)RNA聚合酶识别和结合的部位，能驱动基因转录mRNA (2) 使DNA聚合酶能够从引起的3，端开始连接脱氧核苷酸 2798 (3) 5，GGATCCCATG3， 将F1~F7结合的DNA片段与报告基因构建的基因表达载体转入拟南芥后，用短日照处理，F1到F7为引物时，报告基因提前表达，F8、F9为引物时，报告基因不表达 (4) 逆转录 标记 不含亮氨酸，含组氨酸 培养基上有菌落出现 【难度】0.4 【知识点】PCR扩增的原理与过程、基因表达载体的构建 【分析】基因表达载体的组成 （1）目的基因：主要指编码蛋白质的基因，也可以是一些具有调控作用的因子。 （2）启动子：是一段有特殊序列结构的DNA片段，位于基因的上游，是RNA聚合酶识别和结合的部位，能驱动基因转录出mRNA。 （3）终止子：一段有特殊序列结构的DNA片段，位于基因的下游，RNA聚合酶脱离的部位，使转录过程停止。 （4）标记基因：作用是为了鉴别受体细胞中是否含有目的基因，从而将含有目的基因的细胞筛选出来。 【详解】（1）启动子是一段有特殊序列结构的DNA片段，位于基因的上游，是RNA聚合酶识别和结合的部位，能驱动基因转录出mRNA。因此D1b基因启动子除了可接受日照刺激传递来的信号，还具有的作用是RNA聚合酶识别和结合的部位，能驱动基因转录出mRNA。 （2）PCR中引物的作用是使DNA聚合酶能够从引物的3，端开始连接脱氧核苷酸。由题意可知，D1a基因启动子区缺失了含光周期响应序列的片段长度约2089 bp，且D1a基因启动子区扩增产物为709 bp，则D1b基因启动子区扩增产物应为2089+709=2789 bp。 （3）为正确构建基因表达载体，需要在引物DR的5，端添加限制酶的识别序列，根据转录的方向需要在引物DR的5，端添加BamH Ⅰ的识别序列；然后根据碱基互补配对得出引物DR的部分序列为5，CATGA3，，因此引物DR的序列应为5，GGATCC CATG3，。D1b启动子区与报告基因连接成基因表达载体，因其中含有光周期序列，将其转入拟南芥后，用短日照处理，检测到拟南芥表现出延迟开花；D1a启动子区与报告基因连接成基因表达载体，因其中不含有光周期序列，将其转入拟南芥后，用短日照处理，检测到拟南芥表现出提前开花。若光周期响应序列位于引物F7~F8结合的DNA片段之间，则F1~F7结合的DNA片段上含光周期序列，因此将F1~F7结合的DNA片段与报告基因构建的基因表达载体转入拟南芥后，用短日照处理，F1到F7为引物时，报告基因提前表达，F8、F9为引物时，报告基因不表达。 （4）①以RNA为模板合成DNA的过程为逆转录。 ②基因表达载体的组成有目的基因、标记基因、启动子和终止子，由图可知，该猎物载体中有启动子、终止子，目的基因（cDNA），还缺少标记基因，因此亮氨酸合成酶基因应为标记基因。 ③若该组酵母菌中的cDNA指导合成的是A蛋白，则A蛋白能和光周期相应序列结合，进而启动基因的表达，即能启动组氨酸合成酶基因的表达，则该酵母菌能利用组氨酸。因此应将转化后的酵母菌接种到不含亮氨酸，含组氨酸的选择培养基上培养，若培养基中出现菌落，则说明该组酵母菌中cDNA指导合成的是A蛋白。 11．（23-24高二下·山东淄博·期末）隐花色素（CRY2蛋白）是拟南芥中一种蓝光受体蛋白，激活后将信号传递到下游，调控植物的光形态建成。为探究蓝光下CRY2蛋白与下游蛋白SPA1间的作用机制，某研究团队将基因SPA1与基因AD（AD 为转录因子1）融合构建了 AD重组载体，将基因CRY2与基因BD（BD 为转录因子2）融合构建了BD 重组载体，将两重组质粒导入带有报告基因His的酵母菌（缺少Trp、Leu合成基因）。酵母菌内报告基因 His的表达产物为组氨酸，转录时需要AD和BD共同作用于转录因子结合序列，两蛋白分开时不能激活 His基因的转录。    (1)研究SPA1蛋白与CRY2蛋白的相互作用时，先提取拟南芥细胞中总 RNA，再通过PCR分别扩增出基因SPA1和基因CRY2，PCR过程需要的酶是 ，加入dNTP 可为PCR 过程提供 。 (2)为正确构建AD—SPA1融合基因，扩增基因SPA1时，与a链结合的引物为 ，需要在其 （填“3’”或“5’”）端添加的限制酶识别序列是 。构建BD—CRY2基因表达载体时，切割基因CRY2时，应选择的限制酶是 ，理由是 。 (3)将两种重组质粒导入前，需先用无菌的Ca2+溶液处理酵母菌，目的是 。为保证两目的基因表达的蛋白具有正常的结构和功能，选择酵母菌而不是细菌作为受体细胞，原因是 。 (4)将导入不同载体组合的酵母菌，在不同类型的培养基上对比培养，蓝光照射下培养结果如图。其中，培养基①是缺乏Trp（色氨酸）和Leu（亮氨酸）的基本培养基，导入不同载体组合的酵母菌在该培养基上都能生长，原因是 。培养基②应为缺乏 的培养基，菌落e能在该培养基上生长的原因是 。    【答案】(1) 逆转录酶、Taq酶 原料和能量 (2) S1 5︐ GAATTC EcoRI、BamHI salI会破坏质粒上的标记基因Leu，所以质粒应选Sau3AI和EcoRI进行酶切，CPY2基因上BamHI序列与质粒上Sau3AI序列切割后形成的黏性末端序列一样，CPY2基因的b链为模板链，其—OH端应插入质粒中靠近启动子端的位点，因此，选择EcoRI、BamHI (3) 使酵母菌细胞处于一种能吸收周围环境中DNA的生理状态 有内质网和高尔基体对蛋白质进行加工 (4) AD载体和AD重组载体均带有Trp合成基因，BD载体和BD重组载体均带有Leu合成基因，图中4种组合的酵母菌细胞中，都可以表达Trp和Leu，在其缺乏的培养上生长 His、Trp、Leu CRY2蛋白接受蓝光，与SPA1蛋白结合，将BD蛋白和AD蛋白组成转录因子，启动报告基因His的转录，表达出His，在其缺乏的培养基上生长 【难度】0.4 【知识点】PCR扩增的原理与过程、基因表达载体的构建、将目的基因导入受体细胞、目的基因的检测与鉴定 【分析】基因工程中，在构建基因表达载体时，需使用同种限制酶切割目的基因与载体，使其形成相同末端以便使用DNA连接酶进行连接。可通过标记基因的作用来检测受体细胞是否含有目的基因。 【详解】（1）因为先提取拟南芥细胞中总 RNA，再通过PCR分别扩增出基因SPA1和基因CRY2，因为 RNA，最终需要的是DNA，PCR过程需要的酶是逆转录酶、Taq酶；加入dNTP 可为PCR 过程提供原料和能量； （2）为正确构建AD—SPA1融合基因，扩增基因SPA1时，a链上从左到右，左端连接的是羟基，所以是3’端，所以从左到右为结合的引物为3’到5’，引物与模板链的3’互补配对，所以与a链结合的引物为S1， 引物的作用是使DNA聚合酶能够从引物的3’端开始连接脱氧核苷酸，所以需要在引物的5’端添加的限制酶识别序列，因为最终需要使AD重组载体和BD 重组载体连接到一块，当中连接的为EcoRI，所以需要添加的限制酶的识别序列为GAATTC；构建BD—CRY2基因表达载体时，切割基因CRY2时，salI会破坏质粒上的标记基因Leu，所以质粒应选Sau3AI和EcoRI进行酶切，CPY2基因上BamHI序列与质粒上Sau3AI序列切割后形成的黏性末端序列一样，CPY2基因的b链为模板链，其—OH端应插入质粒中靠近启动子端的位点，因此，选择EcoRI、BamHI； （3）将两种重组质粒导入前，需先用无菌的Ca2+溶液处理酵母菌，使酵母菌细胞处于一种能吸收周围环境中DNA的生理状态；为保证两目的基因表达的蛋白具有正常的结构和功能，选择酵母菌而不是细菌作为受体细胞，原因是为保证两目的基因表达的蛋白具有正常的结构和功能，选择酵母菌而不是细菌作为受体细胞，原因是有内质网和高尔基体对蛋白质进行加工，可以是蛋白质有活性，效果更好； （4）培养基①是缺乏Trp（色氨酸）和Leu（亮氨酸）的基本培养基，导入不同载体组合的酵母菌在该培养基上都能生长，原因是AD载体和AD重组载体均带有Trp合成基因，BD载体和BD重组载体均带有Leu合成基因，图中4种组合的酵母菌细胞中，都可以表达Trp和Leu，在其缺乏的培养上生长； 培养基②上只有AD重组载体和BD重组载体同时存在时，才能生存，所以应为缺乏的His、Trp、Leu培养基，菌落e能在该培养基上生长的原因是CRY2蛋白接受蓝光，与SPA1蛋白结合，将BD蛋白和AD蛋白组成转录因子，启动报告基因His的转录，表达出His，在其缺乏的培养基上生长。 12．（23-24高二下·山东滨州·期末）牛乳铁蛋白肽（LF）具有很强的抗菌性。使用增强型荧光蛋白基因（EGFP）与LF基因构建重组表达载体然后将其导入到毕赤酵母中可解决LF分子量小而难以提纯的问题，最终实现LF的高效生产与提纯。 (1)通过PCR得到EGFP基因及构建基因表达载体的过程需要使用的酶有 。除图3中标出的结构外，作为载体还需具备的结构有 。 (2)为构建基因表达载体，已通过PCR在EGFP基因的两端引入相应的限制酶识别序列。为将EGFP 基因定向的插入图3所示载体中，据图分析不能选择限制酶组合 （填编号）（①BamHI、EcoRI ②BgtII、BamHI、③BgtⅡ、EcoRI）限制酶切割质粒，理由是 。 (3)提取到融合蛋白后需要将EGFP蛋白去除才能得到生产所需的LF，为方便除去EGFP蛋白，可引入甲酸裂解位点（天冬氨酸—脯氨酸，对应的mRNA序列为：5＇-GAC-CCA-3＇PCR扩增EGFP基因时需将甲酸裂解位点的对应序列引入到 （填“引物1”或“引物2”）的 端，甲酸裂解位点在引物中对应的序列为5'- 3'。 【答案】(1) 耐高温的DNA聚合酶(Taq DNA聚合酶)、限制酶、DNA连接酶 标记基因(和复制原点) (2) ② BgtII与BamHI会产生相同的黏性末端而无法防止目的基因反向连接(反向连接、BgtII与BamHI会产生相同的黏性末端) (3) 引物2 5' TGGGTC 【难度】0.4 【知识点】PCR扩增的原理与过程、DNA重组技术的基本工具、基因表达载体的构建 【分析】基因工程技术的基本步骤： （1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成； （2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等； （3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样．将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法； （4）目的基因的检测与鉴定： 分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA是否插入目的基因--DNA分子杂交技术；②检测目的基因是否转录出了mRNA--分子杂交技术；③检测目的基因是否翻译成蛋白质--抗原-抗体杂交技术； 个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。 【详解】（1）PCR得到EGFP基因需要TaqDNA聚合酶（耐高温的DNA聚合酶），构建基因表达载体的过程需要使用的酶限制酶和DNA连接酶；基因表达载体除图3中标出的结构外，还需具备的结构有标记基因、复制原点等； （2）由图2可知，BgtII与BamHI会产生相同的黏性末端，从而无法防止目的基因的反向连接，因此不能选择限制酶组合为 ②BgtII、BamHI； （3）PCR扩增EGFP基因时需将甲酸裂解位点（天冬氨酸—脯氨酸，对应的mRNA序列为：5＇-GAC-CCA-3＇）的对应序列引入到引物2的5'端，根据碱基互补配对可知，甲酸裂解位点在引物中对应的序列为5'-TGGGTC-3'。    试卷第1页，共3页 试卷第1页，共3页 学科网（北京）股份有限公司 $$