2026届高三一轮复习生物：基因工程课件

基因工程 目录 考点 三年考情分析 2025考向预测     基因工程 2024山东T13,2024广东T21, 2024全国甲T38, 2024全国新课标T35, 2024山东T25, 2024河北T22, 2024湖南21，2024江西12，   2023全国新课标T6,2023山东T25, 2023全国甲T38,2023全国乙T38, 2023江苏T22,2023广东T20, 2022山东T25,2022广东T22, 2022全国乙T38,2022全国乙T38, 1.考点预测：命题点是对遗传学、细胞工程、发酵工程等知识点的综合考查。主要包括PCR 技术、基因编辑技术、目的基因检测等。 2.考法预测：题目情境的呈现形式多样，基本以复杂情境为主，体现了课程理念，联系生产、生活 实践，注重考查解决实际问题的能力，考查的多是各大工程的基本原理、基本方法步骤、基本技 能及应用，体现了对知识综合运用、融会贯通的要求。基因工程多以最新基因工程研究成果为 载体，考查基因工程的工具与操作程序。大多以基因编辑为主线，通过模式图的形式呈现，部 分辅以电泳图进行结果检测。 在高考命题中，主要考查在特定情境下，通过设计合适的引物、利用特定限制酶剪切，进行基因编辑或基因拼接，达到改变特定基因、实现基因重组、获得融合蛋白等目的，操作过程复杂，所涉及的内容为当前最前沿的技术成果等。 蛋白质工程 2024天津T5，2022重庆T3， 生物技术安全性 2024浙江T1，2023浙江T2， 2022北京T21，   考情透视 目标导航 高频易错 查落实   1.(选择性必修3 P77)PCR反应需要在一定的缓冲溶液中才能进行，需提供 、 、 和耐高温的 。 2.(选择性必修3 P77)真核细胞和细菌的 都需要Mg2＋激活。因此，PCR反应缓冲液中一般要添加Mg2＋。引物是一小段______________ ，引物的作用是________________ 。 DNA模板 2种引物 4种脱氧核苷酸 DNA聚合酶 DNA聚合酶 能与DNA母链的 一段碱基序列互补配对的短单链核酸 使DNA聚合酶能 够从引物的3′端开始连接脱氧核苷酸 3.(选择性必修3 P80)基因表达载体的构建的目的：使目的基因__________ ，同时，使目的基因能够___________。 4.(选择性必修3 P81)转化：________________________________________ 。 在受体细胞 中稳定存在，并且遗传给下一代 表达和发挥作用 目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内 维持稳定和表达的过程 5.(选择性必修3 P82)目的基因的检测与鉴定：首先是分子水平的检测，包括通过 等技术检测棉花的染色体DNA上是否插入了Bt基因或检测Bt基因是否转录出了mRNA；从转基因棉花中提取 ，用相应的____进行 ，检测Bt基因是否翻译成Bt抗虫蛋白等。其次，还需要进行个体生物学水平的鉴定。例如，通过_______________________来确定Bt基因是否赋予了棉花抗虫特性以及抗性的程度。 PCR 蛋白质 抗体 抗原—抗体杂交 采摘抗虫棉的叶片饲喂棉铃虫 基因工程 蛋白质工程 结果 改造蛋白质 制造新蛋白质 操作对象：基因 均可连接 工具 特点：专一性 T4DNA连接酶 限制酶 结果 DNA连接酶 运载体 E.coliDNA连接酶 平末端 黏性末端 质粒 分子水平检测：PCR技术、抗原-抗体杂交技术 目的基因的检测与鉴定 DNA复制 目的基因的获取 基因表达载体的构建 常用方法：PCR扩增 核心步骤 操作程序 将目的基因导入受体细胞 植物：农杆菌转化法 动物：显微注射法 微生物：感受态细胞处理法 个体水平检测：接种实验 钙离子处理 抗原抗体特异性结合 建网络 疏主干 核心点1——PCR技术与应用 【真题引领】1.(2020·北京，12)为了对重金属污染的土壤进行生物修复，研究者将从杨树中克隆的重金属转运蛋白(HMA3)基因与外源高效启动子连接，导入杨树基因组中(如图)。为检测获得的转基因杨树苗中是否含有导入的HMA3基因，同时避免内源HMA3基因的干扰，在进行PCR扩增时，应选择的引物组合是（ ） A.①＋③　　　B.①＋②　　　C.③＋②　　　D.③＋④ B 强化练P263 变式：(1)(2020·山东，25节选)通过PCR技术可在总cDNA中专一性的扩增出Wx基因的cDNA，原因是_____________________________________________________。 引物是根据Wx基因的一段已知序列设计合成的 (或引物能与Wx基因的cDNA特异性结合) 一、PCR技术“引物”归类分析 讲义P123 (2)(经典高考题节选)设计引物时需要避免引物之间发生_____________，而造成引物自连。同理也要避免引物之间的互补。复性温度的设定与引物长度、碱基组成有关，长度相同且____________的引物需要设定更高的复性温度。 碱基互补配对 G、C含量高 (3)科学设计引物是PCR能否成功的关键，若引物的碱基过多或引物的G、C含量过高，会造成PCR的效率偏低，收获的目的基因较少，原因是_______________________________________________________________。 若对PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，结果发现有两个或多个条带，从引物角度分析，原因可能是_____________________________。 引物与模板链结合过于紧密，变性时引物不易与模板链脱离(影响变性) 引物过短导致引物的特异性下降 核心提炼1. 引物与复性温度 (1)复性温度：复性温度高，扩增特异性强；复性温度低，扩增效率高。 (2)引物：①引物长度越长，越容易形成氢键，为避免出现错配，需要适当提高复性温度； ②引物GC含量越高，容易出现非特异性结合，需要适当提高复性温度。 【真题引领】2.（1）(2022·山东，25节选)某种类型的白血病由蛋白P引发，蛋白UBC可使P被蛋白酶识别并降解，药物A可通过影响这一过程对该病起到治疗作用。为探索药物A治疗该病的机理，需构建重组载体以获得融合蛋白FLAG－P和FLAG－PΔ。PΔ是缺失特定氨基酸序列的P，FLAG是一种短肽，连接在P或PΔ的氨基端，使融合蛋白能与含有FLAG抗体的介质结合，但不影响P或PΔ的功能。 ①为构建重组载体，需先设计引物，通过PCR特异性扩增P基因。用于扩增P基因的引物需满足的条件是_________________________________________________________，为使PCR产物能被限制酶切割，需在引物上添加相应的限制酶识别序列，该限制酶识别序列应添加在引物的______(填“3′端”或“5′端”)。 ②PCR扩增得到的P基因经酶切连接插入载体后，与编码FLAG的序列形成一个融合基因，如图所示，其中“ATGTGCA”为P基因编码链起始序列。将该重组载体导入细胞后，融合基因转录出的mRNA序列正确，翻译出的融合蛋白中FLAG的氨基酸序列正确，但P基因对应的氨基酸序列与P不同。据图分析，出现该问题的原因是 能板链3′端的一段碱基序列互补配对的短单链核酸 5′端 ___________________________________ __________________________________________。修改扩增P基因时使用的带有EcoR Ⅰ识别序列的引物来解决该问题，具体修改方案是__________________________________________。 P基因编码链的第一个碱基与EcoR Ⅰ识 别序列的最后两个碱基编码一个氨基酸，导致mRNA的密码子被错位读取 在引物中的EcoR Ⅰ识别序列3′端添加1个碱基 讲义P124 (2)引物用PCR技术将DNA分子中的A1片段进行扩增，设计了引物Ⅰ、Ⅱ，其连接部位如图所示，X为某限制酶识别序列。扩增后得到的绝大部分DNA片段是图中的 D 核心提炼2.引物的设计 为了使经PCR扩增的目的基因能与载体正常结合，需要在2种引物的5′端添加不同的限制酶的识别序列。其目的是 。 保证目的基因定向插入载体并避免目的基因自身环化 引物长度适宜，引物GC含量适宜，引物自身及引物之间不应存在互补序列、引物5'端修饰，3’端不可以修饰等 【真题引领】3.（2023山东.25）科研人员构建了可表达J-V5融合蛋白的重组质粒并进行了检测，该质粒的部分结构如图甲所示，其中V5编码序列表达标签短肽V5。 （1）与图甲中启动子结合的酶是____________。除图甲中标出的结构外，作为载体，质粒还需具备的结构有________________________________________（答出2个结构即可）。 （2）构建重组质粒后，为了确定J基因连接到质粒中且插入方向正确，需进行PCR检测，若仅用一对引物，应选择图甲中的引物________________。已知J基因转录的模板链位于b链，由此可知引物F1与图甲中J基因的_____________（填“a链”或“b链”）相应部分的序列相同。 （3）重组质粒在受体细胞内正确表达后，用抗J蛋白抗体和抗V5抗体分别检测相应蛋白是否表达以及表达水平，结果如图乙所示。其中，出现条带1证明细胞内表达了______________，条带2所检出的蛋白______________（填“是”或“不是”）由重组质粒上的J基因表达的。 J-V5融合蛋白 不是 RNA聚合酶 标记基因、复制原点、限制酶切割位点等 F2和R1或F1与R2  a链 PCR技术不仅可以精准地鉴定受体细胞是否转入目的基因，还可以通过引物的巧妙设计鉴定目的基因的连接方式。 核心提炼3.引物的选择 讲义P124 (2024·长沙高三模拟)PCR引物的3′端有结合模板DNA的关键碱基，5′端无严格限制，可用于添加限制酶切点等序列。下列相关叙述错误的是（ ） A.图中两条子链合成一定都是从5′端向3′端延伸 B.图示表示复性阶段，该过程的温度与引物的长短有关 C.用图示引物扩增5次后，可以产生22个目标产物 D.PCR每次循环都消耗引物和原料，在实验过程中需要及时补充 D 强化练P263 5’ 3’ 5’ 5’ 第一次循环 第二次循环 3’ 5’ 第三次循环 3’ 3’ 思考： PCR技术获取目的基因时至少要经过几次循环才能从DNA分子中分离出目的基因？ 小结：引物的数量计算 5.引物的数量计算 (1)如图：一个DNA分子n次扩增，则： ①子代DNA分子中等长链的DNA分子数 为________个； ②子代DNA分子中不等长链的DNA分子数为_____个； ③子代DNA分子中含模板链DNA分子数为_____个； ④子代DNA分子中含引物A(或B)的DNA分子数为________个； ⑤复制过程中共需引物________个； ⑥第n次复制需要引物______个。 2n－2n 2n 2 2n－1 2n＋1－2 2n (2)已知引物1及引物2之间的序列为目的序列，若引物与DNA的结合位点如图所示，在第_____轮循环产物中开始出现两条单链等长的目的片段。 2 二、常用PCR技术“及原理 1.利用重叠延伸PCR技术引导基因定点突变 例1.如图为利用重叠延伸PCR的方法在蛋白a基因中部引入定点突变(A/T碱基对变为G/C)的过程。该过程需设计四种引物，其中引物A、D与蛋白a基因的两端完全配对，引物B、C虽与蛋白a基因中部配对，但在欲引入突变的位置替换为突变后的碱基。通过多次独立的PCR达到目的。下列说法不正确的是（ ） A.PCR1所用引物应为引物A和B B.PCR2至PCR4依次以PCR1至PCR3的产物为模板 C.PCR3无需额外加入引物 D.PCR4的作用是大量扩增突变基因 B 讲义P125 2.利用重叠延伸PCR技术构造融合基因 例2.融合PCR技术是采用具有互补末端的引物，将不同来源的扩增片段连接起来的方法，其过程如图1所示。图2是中间载体1和中间载体2(利用融合PCR技术构建成)构建成叶绿体定点整 合表达载体示意图(限制酶酶切位点标注于载体外侧)，叶绿体定点整合表达载体通过与叶绿体基因的同源重组，将目的基因整合于叶绿体DNA上的特定位点上。请据图回答下列问题： (1)图1第一阶段中PCR至少进行______次循环，才能获得双链等长的DNA，第二阶段中引物2与引物3部分碱基的____________关系使得两DNA能成功“搭桥”连接起来。 2 互补配对 (2)若通过融合PCR技术将启动子、标记基因、目的基因、终止子拼接起来，需要设计_____种引物，其中能够起着“搭桥”作用的引物有____种。 8 6 讲义P126 3.利用反向PCR技术扩增未知基因序列 例3.如果已知一小段DNA的序列，可采用PCR方法，简捷地分析出已知序列两侧的序列，具体流程如图(以EcoR Ⅰ酶切为例)。 请据图回答问题： (1)如表所列为已知的DNA序列和设计的一些PCR引物，步骤Ⅲ选用的引物必须是________(从表格引物①②③④中选择，填编号)。 ②④ 讲义P126 例4.(不定项)(2024·长沙高三模拟)荧光定量PCR是一种定量计算待测样品的初始模板量的方法。在PCR反应体系中加入特异性的荧光探针，荧光探针可以掺入新合成的DNA链中，每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，通过对扩增反应中的荧光强度进行实时检测，最后通过标准曲线定量计算初始模板量。如图为某荧光定量PCR的标准曲线。下列说法正确的是 A.一定范围内，荧光强度与扩增出的DNA量呈正相关 B.每个反应管内荧光探针的量相同 C.样品甲的初始模板量大于样品乙 D.荧光强度不再变化时PCR反应停止 ABC 4.实时荧光定量PCR 强化练P265 5.“双脱氧法”基因测序 例5.(不定项)(2024·湖南，15)最早的双脱氧测序法是在PCR反应体系中，分别再加入一种少量的双脱氧核苷三磷酸(ddATP、ddCTP、ddGTP或ddTTP)，子链延伸时，双脱氧核苷三磷酸也遵循碱基互补配对原则，以加入ddATP的体系为例：若配对的为ddATP，延伸终止；若配对的为脱氧腺苷三磷酸(dATP)，继续延伸；PCR产物变性后电泳检测。通过该方法测序某疾病患者及对照个体的一段序列，结果如图所示。下列叙述正确的是 A.上述PCR反应体系中只加入一种引物 B.电泳时产物的片段越小，迁移速率越慢 C.5′-CTACCCGTGAT-3′为对照个体的 一段序列 D.患者该段序列中某位点的碱基C突变为G AC (1)双脱氧核苷三磷酸(ddNTP)缺乏PCR延伸所需的3′-OH，因此每当DNA链加入分子ddNTP时，延伸便终止。 (2)每一次DNA测序是由4个独立的PCR反应组成的，4个PCR反应体系均加入模板、引物、dNTP、DNA聚合酶，唯一不同的是4个反应体系分别加入不同的含有标记的ddATP、ddCTP、ddGTP、ddTTP。 (3)PCR反应后，在反应体系中就形成了大量起始点相同、终止点不同的DNA片段，经聚丙烯酰胺凝胶电泳分离出来，得到放射性同位素自显影条带，依据电泳条带读取DNA双链的碱基序列。 “双脱氧法”基因测序原理解读 5.(2024·湖南，21节选)百合具有观赏、食用和药用等多种价值，科研人员对其进行了多种育种技术研究。研究人员从野生百合中获得一个抵抗尖孢镰刀菌侵染的基因L，该基因及其上游的启动子pL和下游的终止子结构如图a。图b是一种Ti质粒的结构示意图，其中基因gus编码GUS酶，GUS酶活性可反映启动子活性。 (1)研究病原微生物对L的启动子pL活性的影响。从图a所示结构中获取pL，首先选用_________________酶切，将其与相同限制酶酶切的Ti质粒连接，再导入烟草。随机选取3组转基因成功的烟草(P1、P2和P3)进行病原微生物胁迫，结果如图c。由此可知：三种病原微生物都能诱导pL的活性增强，其中_________的诱导作用最强。 Hind Ⅲ、BamH Ⅰ 交链格孢 (2)现发现栽培种百合B中也有L，但其上游的启动子与野生百合不同，且抗病性弱。若要提高该百合中L的表达量，培育具有高抗病原微生物能力的百合新品种，简要写出实验思路：_____________________________ ________________________________________。 PCR扩增基因L及其PL；插入TI质粒；利用农杆菌转化法导入百合B体细胞，经培养获得转基因植株；筛选L表达量提高的转基因百合；用病原微生物侵染转基因百合，检测百合抗病能力。 核心提炼：限制酶的选择原则 1、根据目的基因两端的限制酶切点确定限制酶的种类：不破坏目的基因原则，同种限制酶、同尾酶不同限制酶， 2、根据载体的特点确定限制酶的种类：所选限制酶要与切割目的基因的限制酶相一致，以确保具有相同的黏性末端②保留标记基因、启动子、终止子、复制原点原则 变式.(2022·福建，13节选)载体和CD14片段的酶切位点及相应的酶切抗性基因序列如图所示。用XhoⅠ和SalⅠ分别酶切CD14和图中载体连接，CD14接入载体时会形成正向连接和反向连接的两种重组DNA。可进一步用这两种限制酶对CD14的连接方向进行鉴定，理由是_______________________________________________________________ __________________________________________________________________________________________________________________________。 正向连接的重组DNA有这两种酶切位点(限制酶的识别序列)；而反向连接的重组DNA会形成新的序列，没有这两种酶的酶切位点(没有限制酶的识别序列) 4.(2024·新课标，35节选)某研究小组将纤维素酶基因(N)插入某种细菌(B1)的基因组中，构建高效降解纤维素的菌株(B2)。该小组在含有N基因的质粒中插入B1基因组的M1与M2片段；再经限制酶切割获得含N基因的片段甲，片段甲两端分别为M1与M2；利用CRISPR/Cas9基因组编辑技术将片段甲插入B1的基因组，得到菌株B2。酶切位点(Ⅰ～Ⅳ)、引物(P1～P4)的结合位置、片段甲替换区如图所示，→表示引物5′→3′方向。回答下列问题： (1)限制酶切割的化学键是____________。为保证N基因能在菌株B2中表达，在构建片段甲时，应将M1与M2片段分别插入质粒的Ⅰ和Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ酶切位点之间，原因是_________________________________________ _________________________________。 磷酸二酯键 不破坏N基因，使M1与M2之间有启动子、N基因、终止子，能保证N基因正常表达 (2)CRISPR/Cas9技术可以切割细菌B1基因组中与向导RNA结合的DNA。向导RNA与B1基因组DNA互补配对可以形成的碱基对有G－C和____________________。 C－G、A－T、U－A 7.(2024·山东，25)研究发现基因L能够通过脱落酸信号途径调控大豆的逆境响应。利用基因工程技术编辑基因L，可培育耐盐碱大豆品系。在载体上的限制酶BsaⅠ切点处插入大豆基因L的向导DNA序列，将载体导入大豆细胞后，其转录产物可引导核酸酶特异性结合基因组上的目标序列并发挥作用。载体信息、目标基因L部分序列及相关结果等如图所示。 LB/RB：T－DNA的边界序列；Kan r：卡那霉素抗性基因；Amp r 氨苄青霉素抗性基因。 甲　载体信息 (1)用PCR技术从大豆基因组DNA中扩增目标基因L时，所用的引物越短，引物特异性越____(填“高”或“低”)。限制酶在切开DNA双链时，形成的单链突出末端为黏性末端，若用BsaⅠ酶切大豆基因组DNA，理论上可产生的黏性末端最多有_________种。载体信息如图甲所示，经BsaⅠ酶切后，载体上保留的黏性末端序列应为5′－______________－3′和5′－______________－3′。 低 256(或44) GTTT(或CAAT) CAAT(或GTTT) (2)重组载体通过农杆菌导入大豆细胞，使用抗生素_________筛选到具有该抗生素抗性的植株①～④。为了鉴定基因编辑是否成功，以上述抗性植株的DNA为模板，通过PCR扩增目标基因L，部分序列信息及可选用的酶切位点如图乙所示，PCR产物完全酶切后的电泳结果如图丙所示。据图可判断选用的限制酶是_______，其中纯合的突变植株是______(填序号)。 卡那霉素 SacⅠ ④ 丙　限制酶识别序列、切割位点及电泳结果 (3)实验中获得1株基因L成功突变的纯合植株，该植株具有抗生素抗性，检测发现其体细胞中只有1条染色体有T－DNA插入。用抗生素筛选这个植株的自交子代，其中突变位点纯合且对抗生素敏感的植株所占比例为_____，筛选出的敏感植株可用于后续的品种选育。 1/4 $$