串讲课件03 基因工程-2024-2025学年高二生物下学期期末考点大串讲（苏教版2019）

高二期末复习考点串讲 苏教版2019 •生物•高二•下学期 期末复习 复习专题三 基因工程 思维导图 一.基本工程的概念 (1)供体：提供 。 (2)操作环境： 。 (3)操作水平： 水平。 (4)原理： 。 (5)受体：表达目的基因。 (6)本质：性状在 体内的表达。 (7)优点：克服远缘杂交不亲和的障碍，定向改造生物的遗传性状 外源目的基因 体外 分子 基因重组 受体 基因工程 知识点1：基因工程的基本工具和基本操作程序 拓展 基因工程的理论基础 二.重组DNA技术的基本工具 (1)限制性内切核酸酶(也称“限制酶”) 特定脱氧核苷酸序列 磷酸二酯键 黏性末端（单链） 原核生物 数千 (1)原核生物中存在限制酶的意义是什么？ 原核生物中限制酶的作用是切割外源DNA以保证自身安全，防止外来病原物的危害。 (2)限制酶来源于原核生物，为什么不能切割自己的DNA分子？ 限制酶不切割自身DNA的原因是原核生物DNA分子中不存在该酶的识别序列或识别序列已经被修饰。 思考 延伸应用 (1)不破坏目的基因原则：如图甲中可选择PstⅠ，而不选择SmaⅠ。 (2)保留标记基因、启动子、终止子、复制原点原则：质粒作为载体必须具备标记基因，所以所选择的限制酶尽量不要破坏这些结构，如图乙中不选择SmaⅠ。 图解限制酶的选择原则 (3)确保出现相同黏性末端原则：通常选择与切割目的基因相同的限制酶，如图甲中PstⅠ；为避免目的基因和质粒自身环化和随意连接，也可使用不同的限制酶切割目的基因和质粒，如图甲也可选择PstⅠ和EcoRⅠ两种限制酶。 (2)DNA连接酶 磷酸二酯键 大肠杆菌 黏性末端 黏性末端 　与DNA有关的几种酶的比较 归纳拓展 酶种类 作用底物 作用部位 作用结果 限制酶 DNA分子 磷酸二酯键 将DNA切成两个或多个片段 DNA连接酶 DNA分子片段 磷酸二酯键 将两个DNA片段连接为一个DNA分子 DNA聚合酶 脱氧核苷酸 磷酸二酯键 以DNA单链为模板，将单个脱氧核苷酸依次连接到另一条短的单链末端 解旋酶 DNA分子 碱基对中的氢键 将双链DNA分子局部解旋为单链，形成两条长链 DNA水解酶 DNA分子 磷酸二酯键 将DNA片段水解为单个脱氧核苷酸 环状双链DNA分子 有一个至多个 自我复制（含有复制原点） 受体DNA 标记 (3)载体 λ噬菌体的衍生物 或鉴定 目的基因的 筛选与获取 基因表达载体的构建 将目的基因导入受体细胞 目的基因的检测与鉴定 三.基因工程的基本操作程序 (1)目的基因：在基因工程的设计和操作中，用于改变____________或获得 等的基因。主要是指___________的基因。 (2)目的基因的获取途径 ①化学合成法直接人工合成目的基因：一般为比较小的目的基因。 受体细胞性状 预期表达产物 1.目的基因的获取 编码蛋白质 依据某一蛋白质的氨基酸序列，推测出其基因序列，然后直接合成目的基因，其过程如下： ②筛选合适的目的基因（即基因文库获取目的基因）： 从相关的已知__________清晰的基因中进行筛选是较为有效的方法之一。 基因文库来源可分为 文库和 文库。 基因组文库：指含有某种生物体 基因片段的 的克隆群体。从基因组文库中筛选某种目的基因，一般采用 。 cDNA文库：从组织细胞中提取 ，逆转录成cDNA，与适当载体连接后转化宿主，包含着细胞全部 克隆集合称为该组织细胞的cDNA文库。 cDNA 基因组 全部 重组DNA 核酸探针杂交法 mRNA mRNA信息的cDNA 结构和功能 2.基因表达载体的构建 (1)目的：使目的基因进入________________________________________ 。 (2)基因表达载体的 组成及作用 受体细胞并有效表达，而且要能稳定存在且遗 传给后代 启动子 RNA聚合酶 标记基因 目的基因的插入位置是随意的吗？ 载体与基因表达载体的主要区别？ 载体 （质粒） DNA分子 （含目的基因） 限制酶处理 带有黏性末端或平末端的切口 带有相同黏性末端或平末端的目的基因片段 DNA连接酶 重组DNA分子 （重组质粒） 同一种 问题：该过程需要用到基因工程哪些工具？ (3)构建过程 易错提醒 启动子、终止子、起始密码子、终止密码子对比 项目 启动子 终止子 起始密码子 终止密码子 本质 ______ _____ _______ _________ 位置 目的基因上游 目的基因下游 mRNA首端 mRNA尾端 功能 RNA聚合酶识别和结合的部位，驱动基因转录出mRNA 使转录在所需要的地方停下来 翻译的起始信号(编码氨基酸) 翻译的结束信号(不编码氨基酸) DNA DNA mRNA mRNA 问题探讨： 1、使用一种DNA限制酶进行切割，是否只会得到目的基因与载体结合的这一种重组DNA？ 载体 目的基因 自连 片段间的连接 目的基因自连 质粒自连 目的基因与质粒连接 目的基因与目的基因连接 质粒与质粒连接 正向连接 反向连接 1 1’ 2 2’ 1 2 2’ 1’ 2 2’ 1’ 1 2.如何防止目的基因和质粒的自身环化以及目的基因的反向连接？ 选择两种不同的限制酶同时对目的基因和质粒切割 -G -CTTAA -A -TCTAG 问题探讨： -G -CTTAA 3.要保证目的基因能与载体相连接，还要对引物进行什么操作？ 要在两种引物的5′端分别添加上限制酶的识别序列。 3.将目的基因导入受体细胞 生物种类 植物 哺乳动物 微生物 常用方法 农杆菌转化法，花粉管通道法 显微注射法 处理法 受体细胞 ________________ ________ 原核细胞 转化过程 将目的基因插入Ti质粒的T－DNA中→农杆菌→导入植物细胞→整合到受体细胞的染色体DNA上→表达 取卵→将含有目的基因的表达载体注入→受精卵发育→获得具有新性状的动物 Ca2＋处理细胞→细胞处于一种容易接受外来DNA的生理状态→基因表达载体导入 体细胞或受精卵 受精卵 Ca2＋ 农杆菌转化法示意图 Ti质粒 目的基因 构建基因表达载体 含目的基因的重组Ti质粒 转入 农杆菌 导入 植物细胞 目的基因插入染色体DNA中 植物细胞 表现出新性状的植株 植物组织培养 辨析 (1)转化：目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持__________ 的过程。此处“转化”与肺炎链球菌转化实验中的“转化”含义相同，实质都是　　　　。 (2)农杆菌转化法中的两次拼接和两次导入 第一次拼接是将目的基因拼接到Ti质粒的 上，第二次拼接(非人工操作)是指插入目的基因的T－DNA拼接到受体细胞的 上；第一次导入是将含目的基因的Ti质粒导入 ，第二次导入(非人工操作)是指含目的基因的T－DNA导入 。 T－DNA 染色体DNA 农杆菌 受体细胞 稳定和表达 基因重组 (3)农杆菌特点 ①能在自然条件下侵染 和 ，而对大多数_____ 没有侵染能力。 ②农杆菌细胞内含有 ，当它侵染植物细胞后，能将Ti质粒上的T－DNA转移到被侵染的细胞，并且将其整合到该细胞的染色体DNA上。 辨析 双子叶植物 裸子植物 单子 叶植物 Ti质粒 4.目的基因及其表达产物的检测鉴定 ①制作出与目的基因序列相同的有同位素标记的DNA片段，并用PCR扩增（基因探针） ②提取受体细胞全部DNA或mRNA，与基因探针置于同一培养液。 ③高温变性处理，使之全部变为单链，观察是否出现杂交DNA片段。 核酸分子杂交技术 抗原-抗体杂交技术 若出现杂交带，则目的基因成功翻译出蛋白质。 苏云金芽孢杆菌 提取 Bt毒蛋白 注射小鼠体内 抗体 标记抗体 提取蛋白 电泳分离 抗原 抗体 杂交 脱分化 转基因生物 检测方法 成功标志 抗虫植物 抗病毒(菌)植物 抗盐植物 抗除草剂植物 获取目的基因产物的转基因生物 常见转基因生物在个体水平上鉴定、检测的方法（列举如下表） 个体水平的检测 饲喂害虫（抗虫接种实验） 害虫死亡 病毒（菌）感染（抗病接种实验） 未出现病斑 盐水浇灌 正常生长 喷洒除草剂 提取细胞产物与天然产品进行功能活性比较 正常生长 功能、活性正常 1.PCR原理：利用了_____________原理，通过调节温度来控制DNA双链的解聚与结合。 2.电泳：DNA分子具有可解离的基团，在一定的pH下，这些基团可以带上正电荷或负电荷。在电场的作用下，这些带电分子会向着与它所带电荷_____的电极移动，这个过程就是电泳。 3.PCR的产物一般通过_______________来鉴定。在凝胶中DNA分子的迁移速率与凝胶的浓度、DNA分子的___________等有关。 DNA的热变性 相反 琼脂糖凝胶电泳 大小和构象 基础原理 梳理归纳 夯实必备知识 原理：DNA复制。 条件：DNA模板、2种引物、Taq酶、四种脱氧核苷酸，含Mg2+的缓冲液。 扩增过程 过程 说明 图解 变性 温度超过94 ℃，双链DNA解聚为单链 复性（退火） 温度下降到50 ℃左右，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合 延伸 温度上升到72 ℃左右，溶液中的4种脱氧核苷酸在耐高温的DNA聚合酶（Taq酶）的作用下，根据碱基互补配对原则合成新的DNA子链 1.PCR技术（聚合酶链式反应：扩增DNA片段） 激活Taq酶 dNTP 思考：预变性和再延伸的作用？ 思考分析 ①在PCR过程中实际加入的为dNTP(即dATP、dGTP、dTTP、dCTP)，既可作为合成 的原料，又可为DNA的合成提供 。 ②引物既可以是DNA单链，也可以为 。细胞内的DNA进行复制时，也需要 ，一般为RNA片段。 ③真核细胞和细菌的DNA聚合酶都需要 激活。因此，PCR反应缓冲溶液中一般要添加 。 DNA子链 能量 RNA单链 引物 Mg2＋ Mg2＋ 思考分析 ④PCR扩增过程中的循环图示与规律 PCR技术中的数量关系 物质(复制) 1次 2次 3次 n次 DNA分子数 2 4 8 2n 含引物的DNA分子数 2 4 8 2n 含引物A(或B)的DNA分子 1＝21－1 3＝22－1 7＝23－1 2n－1 同时含引物A、B的DNA分子数 0＝21－2 2＝22－2 6＝23－2 2n－2 共消耗的引物数量 2＝22－2 6＝23－2 14＝24－2 2n＋1－2 含与脱氧核苷酸链等长的DNA分子数 0＝21－2 0＝22－4 2＝23－6 2n－2n DNA分子种类 2 4 5 5 使用的两种引物的序列不相同 两种引物都结合在DNA模板链的_____端 引物长度要适宜（20-30个脱氧核苷酸） 引物GC含量要适宜 引物自身不应存在互补序列 两条引物之间不应存在互补序列 退火温度要适宜 需在引物的____端加 上限制酶的酶切位点 PCR引物设计原则 ⑤ 3’ 5’ 重点剖析 核心归纳 未出现扩增条带的原因主要有： ①Taq酶失活。 ②引物出现质量问题。 ③Mg2＋浓度过低。 ④变性时的温度低，变性时间短。 出现非特异性扩增条带的原因主要有： ①模板DNA出现污染。 ②引物特异性不强或形成引物二聚体。 ③Mg2＋浓度过高。 ④退火时的温度过低等。 PCR异常扩增的原因分析 比较项目 RCR 细胞核内DNA复制 场所 试管中 细胞内 解旋 解旋 解旋 方式 半保留 局部区域复制 半保留 全链复制 起始位点 引物 端 复制起始位点 酶 仅一种DNA聚合酶( 酶) 解旋酶、DNA聚合酶、DNA连接酶 反应条件 温度变幅大 温和 引物 片段， 在复制的子链中 片段， 在复制的子链中 产物 引物界定的片段(DNA片段) 核基因组(完整DNA分子) 相同点 均需提供DNA双链模板； 4种脱氧核苷酸作原料；能量；子链延伸的方向都是从5′端到3′端 全连续 半不连续 3′ Taq 高温 解旋酶 DNA 保留 RNA 不保留 (2)PCR技术和DNA复制的比较 (3)DNA的电泳鉴定 微量取液器 波长300 nm 2.DNA的粗提取和鉴定 (1)基本原理 ①原理：利用DNA、RNA、蛋白质和脂质等在物理和化学性质方面的差异，提取DNA，去除其他成分。 ②DNA的性质：DNA不溶于 ，但某些蛋白质溶于 ；DNA能溶于2 mol·L－1的 。 ③DNA的鉴定：在一定温度下，DNA遇 试剂会呈现蓝色。 酒精 酒精 NaCl溶液 二苯胺 蒸馏水 NaCl 同一方向 沸水浴 轻轻 (2)过程 洋葱、猪肝、猪血、菜花、香蕉都可以作为提取DNA材料吗？ 制备鸡血细胞液为什么要加入质量浓度为0.1g/mL的柠檬酸钠溶？ 将DNA溶于2mol/LNaCl溶液中，加入等体积体积分数为95%的冷却酒精，作用是什么？ 1.PCR原理：利用了_____________原理，通过调节温度来控制DNA双链的解聚与结合。 2.电泳：DNA分子具有可解离的基团，在一定的pH下，这些基团可以带上正电荷或负电荷。在电场的作用下，这些带电分子会向着与它所带电荷_____的电极移动，这个过程就是电泳。 3.PCR的产物一般通过_______________来鉴定。在凝胶中DNA分子的迁移速率与凝胶的浓度、DNA分子的___________等有关。 DNA的热变性 相反 琼脂糖凝胶电泳 大小和构象 基础原理 四.PCR技术、电泳鉴定 原理：DNA复制。 条件：DNA模板、2种引物、Taq酶、四种脱氧核苷酸，含Mg2+的缓冲液。 扩增过程 过程 说明 图解 变性 温度超过94 ℃，双链DNA解聚为单链 复性（退火） 温度下降到50 ℃左右，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合 延伸 温度上升到72 ℃左右，溶液中的4种脱氧核苷酸在耐高温的DNA聚合酶（Taq酶）的作用下，根据碱基互补配对原则合成新的DNA子链 1.PCR技术（聚合酶链式反应：扩增DNA片段） 激活Taq酶 dNTP 思考：预变性和再延伸的作用？ 思考分析 ①在PCR过程中实际加入的为dNTP(即dATP、dGTP、dTTP、dCTP)，既可作为合成 的原料，又可为DNA的合成提供 。 ②引物既可以是DNA单链，也可以为 。细胞内的DNA进行复制时，也需要 ，一般为RNA片段。 ③真核细胞和细菌的DNA聚合酶都需要 激活。因此，PCR反应缓冲溶液中一般要添加 。 DNA子链 能量 RNA单链 引物 Mg2＋ Mg2＋ 思考分析 ④PCR扩增过程中的循环图示与规律 PCR技术中的数量关系 物质(复制) 1次 2次 3次 n次 DNA分子数 2 4 8 2n 含引物的DNA分子数 2 4 8 2n 含引物A(或B)的DNA分子 1＝21－1 3＝22－1 7＝23－1 2n－1 同时含引物A、B的DNA分子数 0＝21－2 2＝22－2 6＝23－2 2n－2 共消耗的引物数量 2＝22－2 6＝23－2 14＝24－2 2n＋1－2 含与脱氧核苷酸链等长的DNA分子数 0＝21－2 0＝22－4 2＝23－6 2n－2n DNA分子种类 2 4 5 5 使用的两种引物的序列不相同 两种引物都结合在DNA模板链的_____端 引物长度要适宜（20-30个脱氧核苷酸） 引物GC含量要适宜 引物自身不应存在互补序列 两条引物之间不应存在互补序列 退火温度要适宜 需在引物的____端加 上限制酶的酶切位点 PCR引物设计原则 ⑤ 3’ 5’ 重点剖析 核心归纳 未出现扩增条带的原因主要有： ①Taq酶失活。 ②引物出现质量问题。 ③Mg2＋浓度过低。 ④变性时的温度低，变性时间短。 出现非特异性扩增条带的原因主要有： ①模板DNA出现污染。 ②引物特异性不强或形成引物二聚体。 ③Mg2＋浓度过高。 ④退火时的温度过低等。 PCR异常扩增的原因分析 比较项目 RCR 细胞核内DNA复制 场所 试管中 细胞内 解旋 解旋 解旋 方式 半保留 局部区域复制 半保留 全链复制 起始位点 引物 端 复制起始位点 酶 仅一种DNA聚合酶( 酶) 解旋酶、DNA聚合酶、DNA连接酶 反应条件 温度变幅大 温和 引物 片段， 在复制的子链中 片段， 在复制的子链中 产物 引物界定的片段(DNA片段) 核基因组(完整DNA分子) 相同点 均需提供DNA双链模板； 4种脱氧核苷酸作原料；能量；子链延伸的方向都是从5′端到3′端 全连续 半不连续 3′ Taq 高温 解旋酶 DNA 保留 RNA 不保留 (2)PCR技术和DNA复制的比较 (3)DNA的电泳鉴定 微量取液器 波长300 nm 2.DNA的粗提取和鉴定 (1)基本原理 ①原理：利用DNA、RNA、蛋白质和脂质等在物理和化学性质方面的差异，提取DNA，去除其他成分。 ②DNA的性质：DNA不溶于 ，但某些蛋白质溶于 ；DNA能溶于2 mol·L－1的 。 ③DNA的鉴定：在一定温度下，DNA遇 试剂会呈现蓝色。 酒精 酒精 NaCl溶液 二苯胺 蒸馏水 NaCl 同一方向 沸水浴 轻轻 (2)过程 洋葱、猪肝、猪血、菜花、香蕉都可以作为提取DNA材料吗？ 制备鸡血细胞液为什么要加入质量浓度为0.1g/mL的柠檬酸钠溶？ 将DNA溶于2mol/LNaCl溶液中，加入等体积体积分数为95%的冷却酒精，作用是什么？ 1.蛋白质工程的概念 蛋白质分子的 结构规律 以 满足人类生产和生活 的需要 目的基因的设计改造 四．DNA的粗提取和鉴定 2.过程 (1)流程图 A. ，B. ，C. ，D. ，E. 。 转录 翻译 分子设计 氨基酸序列 预期功能 注意：对天然蛋白质进行改造，通过对基因的操作来实现的。 ①任何一种天然蛋白质都是由基因编码的，改造了基因即对蛋白质进行了改造，而且改造过的蛋白质可以遗传下去。如果对蛋白质直接改造，即使改造成功，被改造过的蛋白质分子还是无法遗传的。 ②对基因进行改造比对蛋白质直接改造要容易操作，难度要小得多。 (2)首先要获取目的基因和蛋白质的 。 (3)通过基因改造生产目标蛋白质。针对相关基因进行改造，即基因的体外定向突变。大面积的定向突变一般采用 的方法，而含有单一或少数几个突变位点的基因定向突变则可采用多种策略，如_________ 法。 基因全合成 引物定点 引入 结构数据 3.蛋白质工程的设计思路与应用 (1)提高 。 (2)改善酶的 。 (3)消除酶的 。 蛋白质(酶)的稳定性 催化活性 被抑制特性 (4)在医药工业方面 ①研发速效胰岛素类似物已经在临床上广泛应用 ②人鼠嵌合抗体 人鼠嵌合抗体 既保持抗体的特异性和亲和力，又大大减少了在人体内的免疫原性。 4.蛋白质工程与基因工程的比较 项目 蛋白质工程 基因工程 区别 原理 中心法则的逆推、中心法则 基因重组 实质 定向改造或生产人类所需的蛋白质 定向改造生物的遗传特性，以获得人类所需的生物类型或生物产品(基因的异体表达) 结果 可生产自然界没有的蛋白质 生产自然界已有的蛋白质 联系 (1)蛋白质工程是在基因工程基础上延伸出来的第二代基因工程，对现有蛋白质的改造或制造新的蛋白质，必须通过基因修饰或基因合成实现； (2)基因工程所利用的某些酶需要通过蛋白质工程进行修饰、改造 $$ 思维导图 一.基本工程的概念 (1)供体：提供 。 (2)操作环境： 。 (3)操作水平： 水平。 (4)原理： 。 (5)受体：表达目的基因。 (6)本质：性状在 体内的表达。 (7)优点：克服远缘杂交不亲和的障碍，定向改造生物的遗传性状 外源目的基因 体外 分子 基因重组 受体 基因工程 知识点1：基因工程的基本工具和基本操作程序 拓展 基因工程的理论基础 二.重组DNA技术的基本工具 (1)限制性内切核酸酶(也称“限制酶”) 特定脱氧核苷酸序列 磷酸二酯键 黏性末端（单链） 原核生物 数千 (1)原核生物中存在限制酶的意义是什么？ 原核生物中限制酶的作用是切割外源DNA以保证自身安全，防止 外来病原物的危害。 (2)限制酶来源于原核生物，为什么不能切割自己的DNA分子？ 限制酶不切割自身DNA的原因是原核生物DNA分子中不存在该酶 的识别序列或识别序列已经被修饰。 思考 延伸 应用 (1)不破坏目的基因原则：如图甲中可选择PstⅠ，而不选择SmaⅠ。 (2)保留标记基因、启动子、终止子、复制原点原则：质粒作为载体必须具备标记基因，所以所选择的限 制酶尽量不要破坏这些结构，如图乙中不选择SmaⅠ。 图解限制酶的选择原则 (3)确保出现相同黏性末端原则：通常选择与切割目的基因相同的限制酶，如图甲中PstⅠ；为避免目的 基因和质粒自身环化和随意连接，也可使用不同的限制酶切割目的基因和质粒，如图甲也可选择PstⅠ和 EcoRⅠ两种限制酶。 (2)DNA连接酶 磷酸二酯键 大肠杆菌 黏性末端 黏性末端 　与DNA有关的几种酶的比较 归纳 拓展 酶种类 作用底物 作用部位 作用结果 限制酶 DNA分子 磷酸二酯键 将DNA切成两个或多个片段 DNA连接酶 DNA分子片段 磷酸二酯键 将两个DNA片段连接为一个DNA分子 DNA聚合酶 脱氧核苷酸 磷酸二酯键 以DNA单链为模板，将单个脱氧核苷 酸依次连接到另一条短的单链末端 解旋酶 DNA分子 碱基对中的氢键 将双链DNA分子局部解旋为单链，形 成两条长链 DNA水解酶 DNA分子 磷酸二酯键 将DNA片段水解为单个脱氧核苷酸 环状双链DNA分子 有一个至多个 自我复制（含有复制原点） 受体DNA 标记 (3)载体 λ噬菌体的衍生物 或鉴定 目的基因的 筛选与获取 基因表达载 体的构建 将目的基因导 入受体细胞 目的基因的 检测与鉴定 三.基因工程的基本操作程序 (1)目的基因：在基因工程的设计和操作中，用于改变____________ 或获得 等的基因。主要是指___________的基因。 (2)目的基因的获取途径 ①化学合成法直接人工合成目的基因：一般为比较小的目的基因。 受体细胞性状 预期表达产物 1.目的基因的获取 编码蛋白质 依据某一蛋白质的氨基酸序列，推测出其基因序列，然后直接合 成目的基因，其过程如下： ②筛选合适的目的基因（即基因文库获取目的基因）： 从相关的已知__________清晰的基因中进行筛选是较为有效的方法之一。 基因文库来源可分为 文库和 文库。 Ø 基因组文库：指含有某种生物体 基因片段的 的克隆群 体。从基因组文库中筛选某种目的基因，一般采用 。 Ø cDNA文库：从组织细胞中提取 ，逆转录成cDNA，与适当载体 连接后转化宿主，包含着细胞全部 克隆集合称为 该组织细胞的cDNA文库。 cDNA基因组 全部 重组DNA 核酸探针杂交法 mRNA mRNA信息的cDNA 结构和功能 2.基因表达载体的构建 (1)目的：使目的基因进入________________________________________ 。 (2)基因表达载体的 组成及作用 受体细胞并有效表达，而且要能稳定存在且遗 传给后代 启动子 RNA聚合酶 标记基因 目的基因的插入位 置是随意的吗？ 载体与基因表达载 体的主要区别？ 载体 （质粒） DNA分子 （含目的基因） 限制酶处理 带有黏性末端或 平末端的切口 带有相同黏性末端或平 末端的目的基因片段 DNA连接酶 重组DNA分子 （重组质粒） 同一种 问题：该过程需要用到基因工程哪些工具？ (3)构建过程 易错 提醒 启动子、终止子、起始密码子、终止密码子对比 项目 启动子 终止子 起始密码子 终止密码子 本质 ______ _____ _______ _________ 位置 目的基因上游 目的基因下游 mRNA首端 mRNA尾端 功能 RNA聚合酶识 别和结合的部 位，驱动基因 转录出mRNA 使转录在所需要 的地方停下来 翻译的起始 信号(编码氨 基酸) 翻译的结束信 号(不编码氨 基酸) DNA DNA mRNA mRNA 问题探讨： 1、使用一种DNA限制酶进行切割，是否只会得到目的基因与载体结合的这一种重组DNA？ 载体 目的基因 自连 片段间的连接 目的基因自连 质粒自连 目的基因与质粒连接 目的基因与目的基因连接 质粒与质粒连接 正向连接 反向连接 1 1’ 2 2’ 12 2’ 1’ 2 2’ 1’ 1 2.如何防止目的基因和质粒的自身环化以及目的基因的反向连接？ 选择两种不同的限制酶同时对目的基因和质粒切割 -G -CTTAA -A -TCTAG 问题探讨： -G -CTTAA 3.要保证目的基因能与载体相连接，还要对引物进行什么操作？ 要在两种引物的5′端分别添加上限制酶的识别序列。 3.将目的基因导入受体细胞 生物种类 植物 哺乳动物 微生物 常用方法 农杆菌转化法，花粉管通道法 显微注射法 处理法 受体细胞 ________________ ________ 原核细胞 转化过程 将目的基因插入Ti质粒的 T－DNA中→农杆菌→导 入植物细胞→整合到受体 细胞的染色体DNA上→表 达 取卵→将含有目 的基因的表达载 体注入→受精卵 发育→获得具有 新性状的动物 Ca2＋处理细胞→ 细胞处于一种容 易接受外来DNA 的生理状态→基 因表达载体导入 体细胞或受精卵 受精卵 Ca2＋ 农杆菌转化法示意图 Ti质粒 目的基因 构建基因表达载体 含目的基因的重组Ti质粒 转入 农杆菌 导入 植物细胞 目的基因插入染色体DNA中 植物细胞 表现出新性状的植株 植物组织培养 辨析 (1)转化：目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持__________ 的过程。此处“转化”与肺炎链球菌转化实验中的“转化”含义相同， 实质都是　　　　。 (2)农杆菌转化法中的两次拼接和两次导入 第一次拼接是将目的基因拼接到Ti质粒的 上，第二次拼接(非人 工操作)是指插入目的基因的T－DNA拼接到受体细胞的 上； 第一次导入是将含目的基因的Ti质粒导入 ，第二次导入(非人工操 作)是指含目的基因的T－DNA导入 。 T－DNA 染色体DNA 农杆菌 受体细胞 稳定和表达 基因重组 (3)农杆菌特点 ①能在自然条件下侵染 和 ，而对大多数_____ 没有侵染能力。 ②农杆菌细胞内含有 ，当它侵染植物细胞后，能将Ti质粒上 的T－DNA转移到被侵染的细胞，并且将其整合到该细胞的染色体 DNA上。 辨析 双子叶植物 裸子植物 单子 叶植物 Ti质粒 4.目的基因及其表达产物的检测鉴定 ①制作出与目的基因序列相同的有同位素标记的DNA片段，并用PCR扩增（基因探针） ②提取受体细胞全部DNA或mRNA，与基因探针置于同一培养液。 ③高温变性处理，使之全部变为单链，观察是否出现杂交DNA片段。 核酸分子杂交技术 抗原-抗体杂交技术 若出现杂交带，则目的 基因成功翻译出蛋白质。 苏云金芽孢杆 菌 提取 Bt毒蛋白 注射小鼠体内 抗体 标记抗体 提取蛋白 电泳分离 抗 原 抗 体 杂交 脱分化 转基因生物 检测方法 成功标志 抗虫植物 抗病毒(菌)植物 抗盐植物 抗除草剂植物 获取目的基因产物 的转基因生物 常见转基因生物在个体水平上鉴定、检测的方法（列举如下表） 个体水平的检测 饲喂害虫（抗虫接种实验） 害虫死亡 病毒（菌）感染（抗病接种实验） 未出现病斑 盐水浇灌 正常生长 喷洒除草剂 提取细胞产物与天然产 品进行功能活性比较 正常生长 功能、活性 正常 1.PCR原理：利用了_____________原理，通过调节温度来控制 DNA双链的解聚与结合。 2.电泳：DNA分子具有可解离的基团，在一定的pH下，这些基团 可以带上正电荷或负电荷。在电场的作用下，这些带电分子会向着与 它所带电荷_____的电极移动，这个过程就是电泳。 3.PCR的产物一般通过_______________来鉴定。在凝胶中DNA分 子的迁移速率与凝胶的浓度、DNA分子的___________等有关。 DNA的热变性 相反 琼脂糖凝胶电泳 大小和构象 基础原理 梳理归纳 夯实必备知识 原理：DNA复制。 条件：DNA模板、2种引物、Taq酶、四种脱氧核苷酸，含Mg2+的缓冲液。 扩增过程 过程 说明 图解 变性 温度超过94 ℃，双链DNA解聚为单链 复性 （退火） 温度下降到50 ℃左右，两种引物通过碱基互 补配对与两条单链DNA结合 延伸 温度上升到72 ℃左右，溶液中的4种脱氧核苷 酸在耐高温的DNA聚合酶（Taq酶）的作用下， 根据碱基互补配对原则合成新的DNA子链 1.PCR技术（聚合酶链式反应：扩增DNA片段） 激活Taq酶 dNTP 思考：预变性和再延伸的作用？ 思考 分析 ①在PCR过程中实际加入的为dNTP(即dATP、dGTP、dTTP、dCTP)， 既可作为合成 的原料，又可为DNA的合成提供 。 ②引物既可以是DNA单链，也可以为 。细胞内的DNA进 行复制时，也需要 ，一般为RNA片段。 ③真核细胞和细菌的DNA聚合酶都需要 激活。因此，PCR反 应缓冲溶液中一般要添加 。 DNA子链 能量 RNA单链 引物 Mg2＋ Mg2＋