考前热点必看 同源重组小专题复习-备战2025年高考生物热点背练清单（新高考通用）

A B 八 o A A G: 八 0 竹+ P A B I 0入 B1 同源重组小专题复习 01 1.同源重组  1.1 同源重组的定义 所谓同源重组(homologous recombination)又被称为普遍性重组,是指联会(配对)的 DNA 同源序列之间相互交 换对等部分的过程。这个过程依赖于大范围的DNA同源序列的联会(配对),同源重组主要是利用DNA列的同源性来识 别重组对象。  1.2 同源重组的特点及影响因素 同源重组的最大特点在于它是发生在同源序列之间遗传物质的重新组合。同源重组是一个酶促的过程,在整个过程 中除了需要 DNA 聚合酶、核酸内切酶、外切酶以及连接酶等之外,还需要有重组酶的参与,以促进 DNA 双链的断裂、 连接和重组体的释放。另外,重组酶对于 DNA 的损伤修复、DNA的重组和基因转换等也有重要的作用。在基因组中, 相关酶可以利用任何一对同源序列作为底物发生重组过程。研究结果表明,同源区段的长度、不同的细胞类型、染色体 的结构组成、性别、年龄以及内外环境条件等因素对同源重组都有一定的影响。例如,总体的重组频率在男性与女性之 间是不同的,女性的重组频率是男性的两倍;而在异染色质区域附近遗传物质的交换因受到抑制作用而降低。  1.3 同源重组的分子机制 关于同源重组发生的机制,目前还没有统一的观点,这也可能是由于生物界本身就同时并存着多种重组机制的原因。 通过对重组遗传结果的分析、减数分裂早期染色体行为的观察与研究、离体重组系统(主要为原核生物)的分析以及对 2 DNA生化特性的认识等研究工作,现已提出了多种旨在解释双链 DNA 之间重组的模型。 1.3.1 同源重组时异源双链 DNA 断裂与重接的实验证据 应用许多研究手段,人们在细胞学水平上已经揭示出了在减数分裂前期,同源染色体发生配对,非姐妹染色单体之间 发生断裂,重接和交换现象,以及交换和交叉之间的相互关系。证明重组的发生是通过 DNA分子之间的物理断裂与再接 合而实现的。 以同位素标记不同的噬菌体突变体类型,突变型c,mi以13C和14N标记为重链,而野生型类型以12C和14N标记 为轻链,噬菌体杂交后出现 c+,+mi 类型,子代噬菌体 DNA 经过 CsCl密度梯度离心,结果显示除原有的两条带以外,在 中间还有杂交为C+/+mi 的类型。 3 1.3.2 同源重组的分子机制假说 Holliday 模型:Holliday 模型是由Holliday 于 1964 年提出的,又被称为异源 或杂种DNA模型。该模型是第一个被广泛接受的重组模型,也被称为双链侵人 模型,其示意图见图 7.5。 图中,每一条横线表示 DNA的一条单链,两条以细竖线相连的横线表示一 条DNA分子,竖线表示双链 DNA 之间配对的碱基。两条发生交换的单体上分 别带有A、B/a、b基因。具体步骤如下 1)联会配对; 2)在内切核酸酶的作用下,两 DNA 分子的相对应部位发生单链断裂,形成 缺口,这两条 DNA分子极性相同。 3~4)形成的单链游离端交换位置后重新连接,形成一个交联桥,或称之为 Holliday 中间体,它是所有重组模型的中心。 5) 交联桥的位置发生滑动,形成异源区段 6~7)交联桥的两臂发生旋转,形成一个中空的十字形。这一过程也称为异 构化,它能通过重排而改变链的彼此关系。在这一过程中没有键的断裂。异构化 过程不需要能量,所以可以很快发生，每种构象存在的概率为 50%。 8)以中间为出发点可以分为四条臂,其中两条对应单链发生断裂后交换位 置重新接合,另外两条单链保持完整。这样就有两种断裂重接方式,两侧的基因 A,B 和 a,b 基因有可能发生重新组合,也有可能不发生重新组合。但是总会形成 一段异源区段,而异源区段是不稳定的,不配对的核苷酸(碱基)在 DNA 分子中 造成歪斜,由外切核酸酶进行切割修复。 9)留下单链缺口,在 DNA 多聚酶的作用下,合成具有互补碱基的区段,填补缺口。 4 10)最后由连接酶作用,把新合成的短链以共价键结合形成连续的核苷酸链,完成修复过程。Holliday 模型认为交换的单链是在对应部位同时发生 断裂,这种概率较之于单链断裂的概率要低得多,并且在经典遗传学中,人们所观察到的同源重组现象通常是交互的,也就是说:当一对同源染色体分别 携带有等位基因A和a时,如果一条染色体把A交给它的同源染色体,则它的同源染色体必定把a回过来交给它,所以在真菌的四分子分析中,一个座位 上的两等位基因分离时,应表现出 2:2 或 4:4 的分离比。这就是典型的同源重组。 以上假说从不同角度对基因的互换进行了分析。其中以Holliday 模型更加受到人们的普遍重视和接受。 1.3.3 同源重组的分子机制假说用模型演示效果图，加深学生理解 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 02 2.同源重组高考真题和模考题练习 17（2023 天津高考真题）. 构建可利用纤维素产乙醇的转基因酿酒酵母菌株是解决能源危机的手段之一，为此设计表达载体，思路如下。 （1）外源基因的选择 纤维素常见生物降解途径如下。 酿酒酵母通常无法吸收纤维素、寡糖和纤维二糖，应向酿酒酵母转入上图中三种酶的基因，并使其表达产物在细胞________(内/外)发挥作用。 （2）外源基因的插入方法 同源重组是碱基序列基本相同的 DNA 区段通过配对、链断裂和再连接而产生片段交换的过程。通过同源重组将外源基因插入染色体的特定位点可获 得遗传稳定的工程菌株，如甲图所示。 酿酒酵母基因组有多个 AB 短序列。为通过同源重组将外源基因插入 AB 之间，在设计表达载体时，可采用 PCR 技术在外源基因两端分别引入 A和 B, 获得乙图所示长片段。PCR 时应选用的一对引物为________(从 P1~P6中选)。 （3）标记基因的选择 URA3是尿嘧啶合成关键酶基因，常被用作标记基因。另外，URA3编码的蛋白可将外源 5-氟乳清酸转化为有毒物质，导致 细胞死亡。 ①为得到成功插入酶 I基因的菌株 1，需将酶 I基因同 URA3 一起插入 URA3缺陷型酿酒酵母基因组 AB之间，并利用__________的培养基筛选存 15 活菌株。 ②在后续插入酶Ⅱ基因时，为继续利用 URA3 作为筛选标记，需切除菌株 1的 URA3。为此设计表达载体时，还应向 URA3 两端引入酿酒酵母基因组中 不存在的同源区段 C和 C´,并以下图方式______排列才能通过同源重组达到上述目的。 此后，需要将菌株 1在_________的培养基上培养，存活菌株即为 URA3 被成功切除的菌株 1´。 （4）表达载体的构建 综上，为将三种酶基因依次插入酿酒酵母基因组中，在构建表达载体时，A、B、C、C´、URA3 和酶基因应采用下图______ 的排布方式。 【答案】（1）外 （2）P1和 P6 （3） ①. 不含尿嘧啶 ②. 2 ③. 含有 5-氟乳清酸和尿嘧啶（只答含有 5-氟乳清酸得 2分） （4）4 【分析】 基因工程是指按照人们的愿望，进行严格的设计，通过体外DNA重组和转基因技术，赋予生物以新的遗传特性，创造出更符合人们需要 16 的新的生物类型和生物产品．基因工程是在DNA分子水平上进行设计和施工的，又叫做DNA重组技术。 【小问 1详解】由于酵母菌无法吸收纤维素、寡糖和纤维二糖，所以导入分解纤维素的酶发挥作用的场所在细胞外。 【小问 2详解】根据题干信息“当目的基因两侧的小段序列与基因表达载体上某序列相同时，就可以发生同源切割，将目的基因直接插入”，要保 证目的基因两侧的小段序列与基因表达载体上某序列相同，需要选择 P1和 P6这对引物进行 PCR。 【小问 3详解】 ①URA3 作为标记基因，其表达产物可以合成细胞代谢所必需的尿嘧啶，所以在筛选被转化的受体细胞时，需在培养基中去除尿密啶，无URA3(连 同目的基因)的酵母细胞将无法存活，因此可筛选出含有目的基因及 URA3 的受体细胞。 ②如题图所示，方式 1中 URA3 两侧 C、C’是反向同源序列，切出来的粘性末端在同一条链上，不方便连接。方式 2中 URA3 两侧 C、C’是同 向同源序列，切出来的粘性末端在两条链上，方便连接。在发生同源重组时，方式 1只是导致URA3 序列倒位，但不会切除 URA3；而方式 2将导 致 URA3 以环状小分子形式被切除，并在细胞分裂过程中因不能复制而丢失。故选方式 2。由于尿嘧啶可以使 5-氟乳清酸转化为对酵母菌有毒物 质，所以应该在含有 5-氟乳清酸的培养基上，如果切割成功，则不含尿嘧啶，形成菌落，如果切割不成功，则会产生有毒物质，不能形成菌落。 【小问 4详解】 在明确了表达载体整体构建思路后，最终的表达载体需要同 时满足两个条件：一是需要将UR43 标记基因与目的基因（酶基因）一起 插入酿酒酵 母基因组AB之间，所以A、B应置于标记基因与目的基因最 外侧；二是需要利用C、C片段切除URA3 标记基因，同时不能影响酶基因，所以C、 C应紧邻URA3 两侧。同时满足上述条件 的只有图 4。 17 一、单选题 1．（2024·广东广州·模拟预测）减数分裂是一个复杂的过程，染色体端粒（富含碱基 G的 DNA-蛋白质复合体）在核膜上的准确锚定，并沿着内核膜进行移动是减数 分裂能正确进行的前提。在此过程中，DNA会被多种酶剪切为局部单链，并完成同源染色体的配对联会和同源重组（过程如图所示，其中 a、b各表示一个DNA 分子）。 下列叙述错误的是（ ） A．a、b两个 DNA 分子上的基因相同或互为等位基因 B．端粒DNA 序列富含碱基 G的特点，有利于维持端粒结构的稳定 C．减数分裂中同源染色体的片段互换需要 DNA 连接酶的参与 D．端粒准确锚定在内核膜上发挥作用，发生于减数分裂Ⅱ的前期 二、非选择题 2．（24-25 高二下·河南南阳·阶段练习）土壤盐碱化问题已经成为全球性难题，我国土壤盐碱化问题也较为严峻。在我国，盐碱化土壤主要分布在西北、东北、华北 及滨海地区。在滨海地区，为了培育耐海水的水稻，科研人员通过全基因关联分析，确定了一个水稻盐碱响应通路中的关键基因 ATl，为研究水稻中 ATI 基因的作用， 研究人员拟构建 ATI 基因过表达植株(AT1-OE)和 ATI 基因敲除植株(AT1-KO)。请回答下列问题： (1)获取 ATI 基因：常用的获取目的基因的方法有 (答出 2种)。 (2)构建 AT1-OE 植株：将 AT1 基因与 Ti 质粒相连接构建重组质粒，将重组质粒转入 并与水稻愈伤组织共培养，筛选后经过 (填过程)获得完整植 株。 18 (3)构建 ATI-KO 植株：以图 1中 ATI 基因的上下游片段构建重组质粒(图 3)，然后通过同源重组(重组质粒中的上、下游片段分别与水稻基因组中 ATl 基因上、下游片段 配对，并发生交换)敲除水稻植株中的 ATl 基因。具体构建过程如下： ①以水稻基因组 DNA 为模板，选择图 1 中的引物 进行 PCR 扩增，用 (填限制酶)对 PCR 产物进行酶切后电泳，结果如图 2。回收片段 (填 字母)，再与 HindⅢ酶切后的质粒大片段连接，获得重组质粒。 ②将重组质粒转入水稻愈伤组织，最终获得水稻 AT1 -KO 植株。 ③初步鉴定：提取水稻植株的核 DNA，选择适当引物进行 PCR，若电泳获得 条条带，则对应植株为 ATl 基因敲除杂合子，通过自交获得敲除纯合子。 (4)检测植株在盐碱土壤中的幼苗长势和作物产量。与野生型植株相比，若实验结果为 ，则说明 ATl 基因在水稻盐 碱胁迫的响应过程中起负调控作用。 三、实验题 3．（24-25 高二下·江苏连云港·期中）为研究 L基因的功能，科研人员利用同源重组技术对大肠杆菌的 L基因进行敲除与回补，主要过程如下图。其中 S基因（2071bp） 是蔗糖致死基因，tetr是四环素抗性基因，ori 是复制原点，F1、R1、F2、R2 表示不同引物。请回答下列问题： 19 (1)ori 通常富含碱基 ，有利于解旋。 (2)插入 S基因前，应选择限制酶 和 切割质粒 1。已知 F1为下面的序列①，则 R1应选择的是 。 ①5′－GAATTCGCCACCATGGGAGTGGAAAACGCTGAA-3′ ②5′－AAGCTTACCATCGATAGCCACTGGCCTAACGCC-3′ ③5′－GGATCCGGCCGCTCACTCTAGCATCAAGACT-3′ ④5′－AGATCTACCATCGATAGCCACTGGCCTAACGCC-3′ (3)对质粒 2进行 PCR过程中，引物 F2的设计依据是 。除图中所示外，该 PCR体系中还需加入的成分有 。 (4)筛选 L基因敲除大肠杆菌时，需在培养基中添加 。下图是对转化菌落用引物 F2、R2 进行 PCR 验证时的产物电泳结果，泳道 对应的菌株可能转化成功。 20 (5)筛选 L基因回补菌株时，应在培养基中添加 。推测对 L基因回补的主要目的是 。 4．（2025·天津和平·一模）植物蔗糖转运蛋白（SUT）主要负责植物体内蔗糖的长距离运输，影响植物的生长和发育，决定作物的产量和品质。SUT基因家族中的 StSUT2 基因主要在花和老叶中表达，科学家借助 Gateway 克隆技术通过构建 StSUT2 植物超表达载体，为初探其功能提供基础。Gateway 克隆技术包括 TOPO 反应 和 LR反应（如图 1、图 2所示），ccdB 基因编码毒性蛋白，会导致细胞死亡。 (1)从植物的 细胞中提取总 mRNA，经过逆转录过程获得 cDNA，根据 StSUT2 基因两端的部分碱基序列设计引物进行 PCR扩增，即可获得大量的 StSUT2 基因。 (2)利用图 1中的 TOPO反应可以将目的基因 PCR 产物连入入门载体，该载体上的相应序列可被拓扑异构酶（TOPO）识别并在相应位点断开磷酸二酯键，形成一端为 平末端，一端为黏性末端的载体，并将其与拓扑异构酶酶切后的 StSUT2 基因进行连接。拓扑异构酶与基因工程的 酶功能相似。为确保 StSUT2 基因定向连 接入门载体，在扩增 StSUT2 基因时，可在引物中引入 5 3'序列。 (3)图 2 中 LR 反应可借助入门载体上的 attL 位点和目的载体上的 attR 位点，将入门载体中的目的基因与目的载体中的相应片段实现同源重组，得到含目的基因的目的载 体。然后与大肠杆菌混合培养，在培养基中添加适量Ca2+以促进目的基因转化。经上述处理培养后，可判断存活的大肠杆菌中导入的是含目的基因的目的载体，而不是 21 目的载体，原因是 。 (4)请结合图 2中的 LR反应过程，在图 3的方框中补全含 StSUT2 基因的超表达载体的示意图 。 (5)通过比较含 StSUT2 基因入门载体的转基因植物细胞、含 StSUT2 基因超表达载体的转基因植物细胞和非转基因植物细胞中的 ，从而确定 StSUT2 基因是否成 功超量表达。 5．（2025·江苏南通·二模）红斑丹毒丝菌是猪的病原性细菌（引起猪丹毒），其表面抗原 A蛋白（SpaA）和胆碱结合蛋白B（CbpB）能诱导猪等产生特异性抗体。 枯草芽孢杆菌是一种益生菌，为猪丹毒口服活载体疫苗的研发奠定基础。研究人员构建重组质粒（过程如图 1）导入枯草芽孢杆菌，一段时间后分别收集菌体和芽孢（抗 逆性强，适宜条件下能萌发形成菌体），制备在菌体表面表达 SpaA 的重组菌体活载体疫苗、芽孢表面表达 CbpB 的重组芽孢活载体疫苗，并通过小鼠免疫实验评价免疫 效果。请回答下列问题： 22 (1)已知引物 R1与引物 F2部分序列互补配对，以便合成融合基因 spoⅢJ-spaA。其中 R1的序列为 5'-GCTGCCGCCACCGCCGCTTCCGCCACCGCCGCTTCCACCGCCACCCTTTTTCT-3'，则 PCR2 过程中构建的引物 F2的序列为 。 ①5'-GAGGAGCGAAAACCGAGAGACTTAGGGCCTACGCTATATATCG-3' ②5'-CGCTGGCGGAACCGGCGGTGGCGGCAGCGATTCGAC-3' ③5'-GCCACCGCCTTCCCCCCCACCGCCGTCGCTAAGCTG-3' ④5'-TTGGCTATGTTTTACGATTAGGCAGCGATTCGAC-3' (2)已知过程⑦、⑧都用双酶切构建重组质粒，则设计 PCR1 时在引物 F1的 端添加的限制酶识别序列是 。质粒 pDC中 BamHⅠ和 EcoRⅠ之间的长度 （填“大于”、“小于”或“等于”）MfeⅠ和 BelⅠ之间的长度。过程⑦、⑧不能同时在同一体系中进行的主要原因是 ，若同时进行，酶切后的连接产物多。 (3)将重组质粒 pDG-CBJA 导入枯草芽孢杆菌，将发生如图 2所示的同源重组过程，pDG中的序列 A、序列 B的设计依据是 。 23 (4)对转化的枯草芽孢杆菌进行筛选时，应将菌种接种在含壮观霉素和 的平板上，37℃培养 24h，加碘液，3min 后弃去碘液，观察菌落周围有无透明圈产生，选 择 的菌落来制备疫苗。 (5)科研人员研究了不同疫苗体液免疫应答的效果，结果如图 3，A 组为磷酸缓冲液，B组为野生型枯草芽孢杆菌菌体，C组为野生型枯草芽孢杆菌芽孢，D组为重组枯 草芽孢杆菌菌体活载体疫苗，E 组为重组枯草芽孢杆菌芽孢活载体疫苗。 24 ①五组实验中， 组为对照组。 ②小鼠口服菌体活载体疫苗（表达 SpaA）后，血清抗 SpaA 抗体低；芽孢活载体疫苗不表达 SpaA，但小鼠口服芽孢活载体疫苗后血清抗 SpaA 抗体较高，其原因是 。 四、解答题 6．（2025·江苏淮安·二模）构建可利用纤维素产乙醇的转基因酿酒酵母菌是解决能源危机的手段之一，思路如下。 Ⅰ.目的基因的选择与获取纤维素降解途径如下 纤维素 Ⅰ 酶 Ⅰ→ 寡糖 酶 Ⅱ→ 纤维素二糖 酶Ⅲ→ 葡萄糖 (1)提取总 RNA 后需在 催化下，在引物的 端进行DNA 链的延伸得到上图中三 种酶的基因，转入酿酒酵母中，其表达产物在细胞 （填“内”或“外”） 发挥作用。 Ⅱ.目的基因的整合方法 同源重组是碱基序列基本相同的 DNA 区段通过配对、链断裂和再连接而产生片段交换的过程。通过同源重组将外源基因整合到染色体的特定位点可获得遗传稳定的工 25 程菌株，如图 1 所示。 注：图 1 中 PCR 产物 3′端在酶的作用下会多一个“A”碱基 (2)以酶Ⅰ基因为例构建基因表达载体的过程如图 1，由图推测，T4DNA 聚合酶的作用是 ，此方法构建基因表达载体的优点是 。 (3)图 1 中空白处“？”应使用限制酶将构建好的基因表达载体进行 处理，转入酵母菌进行整合。 Ⅲ.标记基因的选择 URA3 是尿嘧啶合成关键酶基因，常被用作标记基因。另外，URA3 编码的蛋白可将外源 5-氟乳清 酸转化为有毒物质，导致细胞死亡。 (4)为得到成功插入酶Ⅰ基因的菌株 1，需将酶Ⅰ基因同 URA3 一起插入 URA3 缺陷型酿酒酵母基因 组 rDNA 内部，并利用 的培养基筛选存活菌株。 (5)在后续插入酶Ⅱ基因时，为继续利用 URA3 作为筛选标记，需切除菌株 1 的 URA3 。为此需改 进表达载体，还应向 URA3 两端引入酿酒酵母基因组中不存在的 同源区段 loxP（如图 2），该序列 由反向重复序列和间隔序列组成（如图 2），决定其方向的是 ，该序列以下图方式 排列才能通过同源重组达到上述目的。 26 (6)此后，需要将菌株 1 在 的培养基上培养，存活菌株即为 URA3 被成功切除的菌株 1。 7．（24-25 高三上·湖南长沙·阶段练习）金黄色葡萄球菌（简称 Sa）可引起皮肤伤口感染、败血症、细菌性肺炎等疾病。不规范使用抗生素易出现多重抗药性 Sa。 (1)A、B、C、D 四种抗生素均可治疗由 Sa 引起的肺炎，为选出最佳疗效的抗生素，研究者分别将含等剂量抗生素 A、B、C、D的四张大小相同的滤纸片 a、b、c、d 置于均匀分布 Sa 的平板培养基上，在适宜条件下培养 48h，结果如图 1。配制培养基时，需要加入的营养成分除了水和无机盐外，还应包括 ；A、B、C、D 四 种抗生素中，抑菌效果最佳的是 。 (2)Sa 产生抗药性可遗传变异的来源有基因突变、 （答出 2点）。 (3)推测 Sa 产生头孢霉素抗性与其 R基因有关。为验证该推测，以图 2中 R基因的上、下游片段和质粒 1构建质粒 2，然后通过同源重组（质粒 2中的上、下游片段分 别与 Sa 基因组中 R 基因上、下游片段配对，并发生交换）敲除 Sa 的 R基因。 27 注 1：1kb=1000 碱基对 2：Y是可被脱水四环素（不作为抗生素起作用）诱导表达的 Sa 致死基因 ①根据图 2信息，质粒 2的构建过程中需选择限制酶 对 PCR 产物进行酶切，然后回收上、下游片段，再与 SacⅡ酶切质粒 1所得大片段连接，获得质粒 2。 ②用质粒 2转化临床分离的具有头孢霉素抗性、对氯霉素敏感的 Sa，然后涂布在含氯霉素的平板上，经培养获得含质粒 2的 Sa 单菌落。 ③将②获得的单菌落多次传代以增加同源重组敲除 R基因的概率，随后稀释涂布在含 的平板上，筛选并获得不再含有质粒 2的菌落。从这些菌落中分别挑取少 许菌体，依次接种到含 的平板上，若无法增殖，则对应菌落中细菌的 R基因可能被敲除。 ④以③获得的菌株基因组为模板，采用不同引物组合进行 PCR 扩增，电泳检测结果如图 3，表明 R基因已被敲除的是 。 28 8．（2025·黑龙江哈尔滨·一模）金黄色葡萄球菌（简称 Sa）可能引发从轻微皮肤感染到严重的全身感染，尤其对免疫力低下者危害更大。预防感染的关键在于良好 的卫生习惯和合理使用抗生素。但不规范使用抗生素易出现抗药性 Sa。推测 Sa 产生头孢霉素抗性与其 R基因有关。为验证该推测，以下图中 R基因的上、下游片段及 质粒 1共同构建质粒 2，然后通过同源重组（质粒 2中的上、下游片段分别与 Sa 基因组中 R基因上、下游片段配对，并发生交换）敲除 Sa 的 R基因。 (1)操作步骤如下： ①根据图 1信息，质粒 2的构建过程中用引物 （填数字）进行 PCR 扩增，每次循环一般可以分为 三步，n次循环后可以得到等长的目的基因 个。然后 29 选择限制酶 对扩增产物进行酶切，然后回收上、下游片段，再与 SacII 酶切质粒 1所得大片段连接，获得质粒 2。 ②用质粒 2转化临床分离的具有头孢霉素抗性、对氯霉素敏感的 Sa，然后涂布在含氯霉素的平板上，经培养获得含质粒 2的 Sa 单菌落。 ③将步骤②获得的单菌落多次传代以增加同源重组敲除 R基因的概率，随后稀释涂布在含 的平板上，筛选并获得不再含有质粒 2的菌落。从这些菌落中分别挑取少 许菌体，依次接种到含 的平板上，若无法增殖，则对应菌落中细菌的 R 基因可能被敲除。 (2)以③获得的菌株基因组为模板，采用不同引物组合进行 PCR扩增，产物一般通过 （技术名称）来鉴定。检测结果如下图所示，表明 R基因已被敲除的是 。 30 《同源重组练习》参考答案 1．D 【分析】减数分裂过程：（1）减数分裂前间期：染色体的复制。（2）减数第一次分裂：①前期：联会，同源染色体上的非姐妹染色单体交叉互换；②中期：同源染色体 成对的排列在赤道板上；③后期：同源染色体分离，非同源染色体自由组合；④末期：细胞质分裂。（3）减数第二次分裂：①前期：核膜、核仁逐渐解体消失，出现纺 锤体和染色体；②中期：染色体形态固定、数目清晰；③后期：着丝点（着丝粒）分裂，姐妹染色单体分开成为染色体，并均匀地移向两极；④末期：核膜、核仁重建、 纺锤体和染色体消失。 【详解】A、等位基因是位于同源染色体相同位置控制相对性状的基因，相同基因是同源染色体相同位置控制相同性状的基因，位于 a、b两个 DNA 分子上的基因相同 或互为等位基因，A正确； B、DNA 分子中G与 C之间有 3个氢键，A 与 T之间有 2个氢键，端粒 DNA 序列富含碱基 G的特点，稳定性高，有利于维持端粒结构的稳定，B正确； C、减数分裂中同源染色体的片段互换需要 DNA 连接酶的参与，该酶作用的位点是磷酸二酯键，C正确； D、染色体端粒（富含碱基G的 DNA-蛋白质复合体）在核膜上的准确锚定，而减数分裂Ⅱ的前期核膜已经消失，D错误。 故选 D。 2．(1)PCR 扩增法、基因文库筛选法 (2) 农杆菌 再分化 (3) 1 和 4 NotⅠ和 HindⅢ b和 c 2/二/两 (4)AT1-KO 植株幼苗长势好、作物产量高，AT1-OE 植株表型相反 【分析】基因工程技术的基本步骤：（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用 PCR技术扩增和人工合成。（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步 同源重组小专题复习 1.同源重组 1.1同源重组的定义 所谓同源重组(homologous recombination)又被称为普遍性重组,是指联会(配对)的 DNA 同源序列之间相互交换对等部分的过程。这个过程依赖于大范围的DNA同源序列的联会(配对),同源重组主要是利用DNA列的同源性来识别重组对象。 1.2 同源重组的特点及影响因素 同源重组的最大特点在于它是发生在同源序列之间遗传物质的重新组合。同源重组是一个酶促的过程,在整个过程中除了需要 DNA 聚合酶、核酸内切酶、外切酶以及连接酶等之外,还需要有重组酶的参与,以促进 DNA 双链的断裂、连接和重组体的释放。另外,重组酶对于DNA的损伤修复、DNA的重组和基因转换等也有重要的作用。在基因组中,相关酶可以利用任何一对同源序列作为底物发生重组过程。研究结果表明,同源区段的长度、不同的细胞类型、染色体的结构组成、性别、年龄以及内外环境条件等因素对同源重组都有一定的影响。例如,总体的重组频率在男性与女性之间是不同的,女性的重组频率是男性的两倍;而在异染色质区域附近遗传物质的交换因受到抑制作用而降低。 1.3 同源重组的分子机制 关于同源重组发生的机制,目前还没有统一的观点,这也可能是由于生物界本身就同时并存着多种重组机制的原因。通过对重组遗传结果的分析、减数分裂早期染色体行为的观察与研究、离体重组系统(主要为原核生物)的分析以及对 DNA生化特性的认识等研究工作,现已提出了多种旨在解释双链 DNA 之间重组的模型。 1.3.1同源重组时异源双链 DNA 断裂与重接的实验证据 应用许多研究手段,人们在细胞学水平上已经揭示出了在减数分裂前期,同源染色体发生配对,非姐妹染色单体之间发生断裂,重接和交换现象,以及交换和交叉之间的相互关系。证明重组的发生是通过 DNA分子之间的物理断裂与再接合而实现的。 以同位素标记不同的噬菌体突变体类型,突变型c,mi以13C和14N标记为重链,而野生型类型以12C和14N标记为轻链,噬菌体杂交后出现 c+,+mi 类型,子代噬菌体 DNA 经过 CsCl密度梯度离心,结果显示除原有的两条带以外,在中间还有杂交为C+/+mi的类型。 1.3.2同源重组的分子机制假说 Holliday 模型:Holliday 模型是由Holliday于1964年提出的,又被称为异源或杂种DNA模型。该模型是第一个被广泛接受的重组模型,也被称为双链侵人模型,其示意图见图7.5。 图中,每一条横线表示 DNA的一条单链,两条以细竖线相连的横线表示一条DNA分子,竖线表示双链 DNA 之间配对的碱基。两条发生交换的单体上分别带有A、B/a、b基因。具体步骤如下 1)联会配对; 2)在内切核酸酶的作用下,两DNA分子的相对应部位发生单链断裂,形成缺口,这两条 DNA分子极性相同。 3~4)形成的单链游离端交换位置后重新连接,形成一个交联桥,或称之为Holliday中间体,它是所有重组模型的中心。 5) 交联桥的位置发生滑动,形成异源区段 6~7)交联桥的两臂发生旋转,形成一个中空的十字形。这一过程也称为异构化,它能通过重排而改变链的彼此关系。在这一过程中没有键的断裂。异构化过程不需要能量,所以可以很快发生，每种构象存在的概率为 50%。 8)以中间为出发点可以分为四条臂,其中两条对应单链发生断裂后交换位置重新接合,另外两条单链保持完整。这样就有两种断裂重接方式,两侧的基因A,B和a,b基因有可能发生重新组合,也有可能不发生重新组合。但是总会形成一段异源区段,而异源区段是不稳定的,不配对的核苷酸(碱基)在 DNA分子中造成歪斜,由外切核酸酶进行切割修复。 9)留下单链缺口,在 DNA 多聚酶的作用下,合成具有互补碱基的区段,填补缺口。 10)最后由连接酶作用,把新合成的短链以共价键结合形成连续的核苷酸链,完成修复过程。Holliday 模型认为交换的单链是在对应部位同时发生断裂,这种概率较之于单链断裂的概率要低得多,并且在经典遗传学中,人们所观察到的同源重组现象通常是交互的,也就是说:当一对同源染色体分别携带有等位基因A和a时,如果一条染色体把A交给它的同源染色体,则它的同源染色体必定把a回过来交给它,所以在真菌的四分子分析中,一个座位上的两等位基因分离时,应表现出2:2或4:4的分离比。这就是典型的同源重组。 以上假说从不同角度对基因的互换进行了分析。其中以Holliday模型更加受到人们的普遍重视和接受。 1.3.3同源重组的分子机制假说用模型演示效果图，加深学生理解 2.同源重组高考真题和模考题练习 17（2023天津高考真题）. 构建可利用纤维素产乙醇的转基因酿酒酵母菌株是解决能源危机的手段之一，为此设计表达载体，思路如下。 （1）外源基因的选择 纤维素常见生物降解途径如下。 酿酒酵母通常无法吸收纤维素、寡糖和纤维二糖，应向酿酒酵母转入上图中三种酶的基因，并使其表达产物在细胞________(内/外)发挥作用。 （2）外源基因的插入方法 同源重组是碱基序列基本相同的DNA区段通过配对、链断裂和再连接而产生片段交换的过程。通过同源重组将外源基因插入染色体的特定位点可获得遗传稳定的工程菌株，如甲图所示。 酿酒酵母基因组有多个AB短序列。为通过同源重组将外源基因插入AB之间，在设计表达载体时，可采用PCR技术在外源基因两端分别引入A和B,获得乙图所示长片段。PCR时应选用的一对引物为________(从P1~P6中选)。 （3）标记基因的选择 URA3是尿嘧啶合成关键酶基因，常被用作标记基因。另外，URA3编码的蛋白可将外源5-氟乳清酸转化为有毒物质，导致细胞死亡。 ①为得到成功插入酶I基因的菌株1，需将酶I基因同URA3一起插入URA3缺陷型酿酒酵母基因组AB之间，并利用__________的培养基筛选存活菌株。 ②在后续插入酶Ⅱ基因时，为继续利用URA3作为筛选标记，需切除菌株1的URA3。为此设计表达载体时，还应向URA3两端引入酿酒酵母基因组中不存在的同源区段C和C´,并以下图方式______排列才能通过同源重组达到上述目的。 此后，需要将菌株1在_________的培养基上培养，存活菌株即为URA3被成功切除的菌株1´。 （4）表达载体的构建 综上，为将三种酶基因依次插入酿酒酵母基因组中，在构建表达载体时，A、B、C、C´、URA3和酶基因应采用下图______的排布方式。 【答案】（1）外 （2）P1和P6 （3） ①. 不含尿嘧啶 ②. 2 ③. 含有5-氟乳清酸和尿嘧啶（只答含有5-氟乳清酸得2分） （4）4 【分析】 基因工程是指按照人们的愿望，进行严格的设计，通过体外DNA重组和转基因技术，赋予生物以新的遗传特性，创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品．基因工程是在DNA分子水平上进行设计和施工的，又叫做DNA重组技术。 【小问1详解】由于酵母菌无法吸收纤维素、寡糖和纤维二糖，所以导入分解纤维素的酶发挥作用的场所在细胞外。 【小问2详解】根据题干信息“当目的基因两侧的小段序列与基因表达载体上某序列相同时，就可以发生同源切割，将目的基因直接插入”，要保证目的基因两侧的小段序列与基因表达载体上某序列相同，需要选择P1和P6这对引物进行PCR。 【小问3详解】 ①URA3 作为标记基因，其表达产物可以合成细胞代谢所必需的尿嘧啶，所以在筛选被转化的受体细胞时，需在培养基中去除尿密啶，无URA3(连同目的基因)的酵母细胞将无法存活，因此可筛选出含有目的基因及 URA3 的受体细胞。 ②如题图所示，方式1中URA3 两侧C、C’是反向同源序列，切出来的粘性末端在同一条链上，不方便连接。方式2中URA3 两侧C、C’是同向同源序列，切出来的粘性末端在两条链上，方便连接。在发生同源重组时，方式1只是导致URA3序列倒位，但不会切除 URA3；而方式2将导致 URA3 以环状小分子形式被切除，并在细胞分裂过程中因不能复制而丢失。故选方式 2。由于尿嘧啶可以使5-氟乳清酸转化为对酵母菌有毒物质，所以应该在含有5-氟乳清酸的培养基上，如果切割成功，则不含尿嘧啶，形成菌落，如果切割不成功，则会产生有毒物质，不能形成菌落。 【小问4详解】 在明确了表达载体整体构建思路后，最终的表达载体需要同 时满足两个条件：一是需要将UR43标记基因与目的基因（酶基因）一起 插入酿酒酵母基因组AB之间，所以A、B应置于标记基因与目的基因最 外侧；二是需要利用C、C片段切除URA3 标记基因，同时不能影响酶基因，所以C、 C应紧邻URA3两侧。同时满足上述条件 的只有图4。 一、单选题 1．（2024·广东广州·模拟预测）减数分裂是一个复杂的过程，染色体端粒（富含碱基G的DNA-蛋白质复合体）在核膜上的准确锚定，并沿着内核膜进行移动是减数分裂能正确进行的前提。在此过程中，DNA会被多种酶剪切为局部单链，并完成同源染色体的配对联会和同源重组（过程如图所示，其中a、b各表示一个DNA分子）。下列叙述错误的是（    ） A．a、b两个DNA分子上的基因相同或互为等位基因 B．端粒DNA序列富含碱基G的特点，有利于维持端粒结构的稳定 C．减数分裂中同源染色体的片段互换需要DNA连接酶的参与 D．端粒准确锚定在内核膜上发挥作用，发生于减数分裂Ⅱ的前期 二、非选择题 2．（24-25高二下·河南南阳·阶段练习）土壤盐碱化问题已经成为全球性难题，我国土壤盐碱化问题也较为严峻。在我国，盐碱化土壤主要分布在西北、东北、华北及滨海地区。在滨海地区，为了培育耐海水的水稻，科研人员通过全基因关联分析，确定了一个水稻盐碱响应通路中的关键基因ATl，为研究水稻中ATI 基因的作用，研究人员拟构建ATI 基因过表达植株(AT1-OE)和ATI基因敲除植株(AT1-KO)。请回答下列问题： (1)获取ATI 基因：常用的获取目的基因的方法有 (答出2种)。 (2)构建AT1-OE 植株：将AT1 基因与 Ti 质粒相连接构建重组质粒，将重组质粒转入 并与水稻愈伤组织共培养，筛选后经过 (填过程)获得完整植株。 (3)构建ATI-KO植株：以图1中ATI 基因的上下游片段构建重组质粒(图3)，然后通过同源重组(重组质粒中的上、下游片段分别与水稻基因组中ATl 基因上、下游片段配对，并发生交换)敲除水稻植株中的ATl 基因。具体构建过程如下： ①以水稻基因组 DNA 为模板，选择图1 中的引物 进行 PCR 扩增，用 (填限制酶)对PCR产物进行酶切后电泳，结果如图2。回收片段 (填字母)，再与HindⅢ酶切后的质粒大片段连接，获得重组质粒。 ②将重组质粒转入水稻愈伤组织，最终获得水稻AT1 -KO 植株。 ③初步鉴定：提取水稻植株的核 DNA，选择适当引物进行 PCR，若电泳获得 条条带，则对应植株为ATl 基因敲除杂合子，通过自交获得敲除纯合子。 (4)检测植株在盐碱土壤中的幼苗长势和作物产量。与野生型植株相比，若实验结果为 ，则说明ATl 基因在水稻盐碱胁迫的响应过程中起负调控作用。 三、实验题 3．（24-25高二下·江苏连云港·期中）为研究L基因的功能，科研人员利用同源重组技术对大肠杆菌的L基因进行敲除与回补，主要过程如下图。其中S基因（2071bp）是蔗糖致死基因，tetr是四环素抗性基因，ori是复制原点，F1、R1、F2、R2表示不同引物。请回答下列问题： (1)ori通常富含碱基 ，有利于解旋。 (2)插入S基因前，应选择限制酶 和 切割质粒1。已知F1为下面的序列①，则R1应选择的是 。 ①5′－GAATTCGCCACCATGGGAGTGGAAAACGCTGAA-3′ ②5′－AAGCTTACCATCGATAGCCACTGGCCTAACGCC-3′ ③5′－GGATCCGGCCGCTCACTCTAGCATCAAGACT-3′ ④5′－AGATCTACCATCGATAGCCACTGGCCTAACGCC-3′ (3)对质粒2进行PCR过程中，引物F2的设计依据是 。除图中所示外，该PCR体系中还需加入的成分有 。 (4)筛选L基因敲除大肠杆菌时，需在培养基中添加 。下图是对转化菌落用引物F2、R2进行PCR验证时的产物电泳结果，泳道 对应的菌株可能转化成功。 (5)筛选L基因回补菌株时，应在培养基中添加 。推测对L基因回补的主要目的是 。 4．（2025·天津和平·一模）植物蔗糖转运蛋白（SUT）主要负责植物体内蔗糖的长距离运输，影响植物的生长和发育，决定作物的产量和品质。SUT基因家族中的StSUT2基因主要在花和老叶中表达，科学家借助Gateway克隆技术通过构建StSUT2植物超表达载体，为初探其功能提供基础。Gateway克隆技术包括TOPO反应和LR反应（如图1、图2所示），ccdB基因编码毒性蛋白，会导致细胞死亡。 (1)从植物的 细胞中提取总mRNA，经过逆转录过程获得cDNA，根据StSUT2基因两端的部分碱基序列设计引物进行PCR扩增，即可获得大量的StSUT2基因。 (2)利用图1中的TOPO反应可以将目的基因PCR产物连入入门载体，该载体上的相应序列可被拓扑异构酶（TOPO）识别并在相应位点断开磷酸二酯键，形成一端为平末端，一端为黏性末端的载体，并将其与拓扑异构酶酶切后的StSUT2基因进行连接。拓扑异构酶与基因工程的 酶功能相似。为确保StSUT2基因定向连接入门载体，在扩增StSUT2基因时，可在引物中引入5 3'序列。 (3)图2中LR反应可借助入门载体上的attL位点和目的载体上的attR位点，将入门载体中的目的基因与目的载体中的相应片段实现同源重组，得到含目的基因的目的载体。然后与大肠杆菌混合培养，在培养基中添加适量Ca2+以促进目的基因转化。经上述处理培养后，可判断存活的大肠杆菌中导入的是含目的基因的目的载体，而不是目的载体，原因是 。 (4)请结合图2中的LR反应过程，在图3的方框中补全含StSUT2基因的超表达载体的示意图 。 (5)通过比较含StSUT2基因入门载体的转基因植物细胞、含StSUT2基因超表达载体的转基因植物细胞和非转基因植物细胞中的 ，从而确定StSUT2基因是否成功超量表达。 5．（2025·江苏南通·二模）红斑丹毒丝菌是猪的病原性细菌（引起猪丹毒），其表面抗原A蛋白（SpaA）和胆碱结合蛋白B（CbpB）能诱导猪等产生特异性抗体。枯草芽孢杆菌是一种益生菌，为猪丹毒口服活载体疫苗的研发奠定基础。研究人员构建重组质粒（过程如图1）导入枯草芽孢杆菌，一段时间后分别收集菌体和芽孢（抗逆性强，适宜条件下能萌发形成菌体），制备在菌体表面表达SpaA的重组菌体活载体疫苗、芽孢表面表达CbpB的重组芽孢活载体疫苗，并通过小鼠免疫实验评价免疫效果。请回答下列问题： (1)已知引物R1与引物F2部分序列互补配对，以便合成融合基因spoⅢJ-spaA。其中R1的序列为5'-GCTGCCGCCACCGCCGCTTCCGCCACCGCCGCTTCCACCGCCACCCTTTTTCT-3'，则PCR2过程中构建的引物F2的序列为 。 ①5'-GAGGAGCGAAAACCGAGAGACTTAGGGCCTACGCTATATATCG-3' ②5'-CGCTGGCGGAACCGGCGGTGGCGGCAGCGATTCGAC-3' ③5'-GCCACCGCCTTCCCCCCCACCGCCGTCGCTAAGCTG-3' ④5'-TTGGCTATGTTTTACGATTAGGCAGCGATTCGAC-3' (2)已知过程⑦、⑧都用双酶切构建重组质粒，则设计PCR1时在引物F1的 端添加的限制酶识别序列是 。质粒pDC中BamHⅠ和EcoRⅠ之间的长度 （填“大于”、“小于”或“等于”）MfeⅠ和BelⅠ之间的长度。过程⑦、⑧不能同时在同一体系中进行的主要原因是 ，若同时进行，酶切后的连接产物多。 (3)将重组质粒pDG-CBJA导入枯草芽孢杆菌，将发生如图2所示的同源重组过程，pDG中的序列A、序列B的设计依据是 。 (4)对转化的枯草芽孢杆菌进行筛选时，应将菌种接种在含壮观霉素和 的平板上，37℃培养24h，加碘液，3min后弃去碘液，观察菌落周围有无透明圈产生，选择 的菌落来制备疫苗。 (5)科研人员研究了不同疫苗体液免疫应答的效果，结果如图3，A组为磷酸缓冲液，B组为野生型枯草芽孢杆菌菌体，C组为野生型枯草芽孢杆菌芽孢，D组为重组枯草芽孢杆菌菌体活载体疫苗，E组为重组枯草芽孢杆菌芽孢活载体疫苗。 ①五组实验中， 组为对照组。 ②小鼠口服菌体活载体疫苗（表达SpaA）后，血清抗SpaA抗体低；芽孢活载体疫苗不表达SpaA，但小鼠口服芽孢活载体疫苗后血清抗SpaA抗体较高，其原因是 。 四、解答题 6．（2025·江苏淮安·二模）构建可利用纤维素产乙醇的转基因酿酒酵母菌是解决能源危机的手段之一，思路如下。 Ⅰ.目的基因的选择与获取纤维素降解途径如下 纤维素 Ⅰ 酶 Ⅰ→ 寡糖   酶 Ⅱ→ 纤维素二糖   酶Ⅲ→ 葡萄糖 (1)提取总RNA 后需在 催化下，在引物的 端进行DNA 链的延伸得到上图中三 种酶的基因，转入酿酒酵母中，其表达产物在细胞 （填“内”或“外”）发挥作用。 Ⅱ.目的基因的整合方法 同源重组是碱基序列基本相同的 DNA 区段通过配对、链断裂和再连接而产生片段交换的过程。通过同源重组将外源基因整合到染色体的特定位点可获得遗传稳定的工程菌株，如图 1 所示。    注：图 1 中 PCR 产物 3′端在酶的作用下会多一个“A”碱基 (2)以酶Ⅰ基因为例构建基因表达载体的过程如图 1，由图推测，T4DNA 聚合酶的作用是 ，此方法构建基因表达载体的优点是 。 (3)图 1 中空白处“？”应使用限制酶将构建好的基因表达载体进行 处理，转入酵母菌进行整合。 Ⅲ.标记基因的选择 URA3 是尿嘧啶合成关键酶基因，常被用作标记基因。另外，URA3 编码的蛋白可将外源 5-氟乳清 酸转化为有毒物质，导致细胞死亡。 (4)为得到成功插入酶Ⅰ基因的菌株 1，需将酶Ⅰ基因同 URA3 一起插入 URA3 缺陷型酿酒酵母基因 组 rDNA 内部，并利用 的培养基筛选存活菌株。 (5)在后续插入酶Ⅱ基因时，为继续利用 URA3 作为筛选标记，需切除菌株 1 的 URA3 。为此需改 进表达载体，还应向 URA3 两端引入酿酒酵母基因组中不存在的同源区段 loxP（如图2），该序列 由反向重复序列和间隔序列组成（如图2），决定其方向的是 ，该序列以下图方式 排列才能通过同源重组达到上述目的。    (6)此后，需要将菌株 1 在 的培养基上培养，存活菌株即为 URA3 被成功切除的菌株 1。 7．（24-25高三上·湖南长沙·阶段练习）金黄色葡萄球菌（简称Sa）可引起皮肤伤口感染、败血症、细菌性肺炎等疾病。不规范使用抗生素易出现多重抗药性Sa。 (1)A、B、C、D四种抗生素均可治疗由Sa引起的肺炎，为选出最佳疗效的抗生素，研究者分别将含等剂量抗生素A、B、C、D的四张大小相同的滤纸片a、b、c、d置于均匀分布Sa的平板培养基上，在适宜条件下培养48h，结果如图1。配制培养基时，需要加入的营养成分除了水和无机盐外，还应包括 ；A、B、C、D四种抗生素中，抑菌效果最佳的是 。 (2)Sa产生抗药性可遗传变异的来源有基因突变、 （答出2点）。 (3)推测Sa产生头孢霉素抗性与其R基因有关。为验证该推测，以图2中R基因的上、下游片段和质粒1构建质粒2，然后通过同源重组（质粒2中的上、下游片段分别与Sa基因组中R基因上、下游片段配对，并发生交换）敲除Sa的R基因。 注1：1kb=1000碱基对 2：Y是可被脱水四环素（不作为抗生素起作用）诱导表达的Sa致死基因    ①根据图2信息，质粒2的构建过程中需选择限制酶 对PCR产物进行酶切，然后回收上、下游片段，再与SacⅡ酶切质粒1所得大片段连接，获得质粒2。 ②用质粒2转化临床分离的具有头孢霉素抗性、对氯霉素敏感的Sa，然后涂布在含氯霉素的平板上，经培养获得含质粒2的Sa单菌落。 ③将②获得的单菌落多次传代以增加同源重组敲除R基因的概率，随后稀释涂布在含 的平板上，筛选并获得不再含有质粒2的菌落。从这些菌落中分别挑取少许菌体，依次接种到含 的平板上，若无法增殖，则对应菌落中细菌的R基因可能被敲除。 ④以③获得的菌株基因组为模板，采用不同引物组合进行PCR扩增，电泳检测结果如图3，表明R基因已被敲除的是 。 8．（2025·黑龙江哈尔滨·一模）金黄色葡萄球菌（简称Sa）可能引发从轻微皮肤感染到严重的全身感染，尤其对免疫力低下者危害更大。预防感染的关键在于良好的卫生习惯和合理使用抗生素。但不规范使用抗生素易出现抗药性Sa。推测Sa产生头孢霉素抗性与其R基因有关。为验证该推测，以下图中R基因的上、下游片段及质粒1共同构建质粒2，然后通过同源重组（质粒2中的上、下游片段分别与Sa基因组中R基因上、下游片段配对，并发生交换）敲除Sa的R基因。 (1)操作步骤如下： ①根据图1信息，质粒2的构建过程中用引物 （填数字）进行PCR扩增，每次循环一般可以分为 三步，n次循环后可以得到等长的目的基因 个。然后选择限制酶 对扩增产物进行酶切，然后回收上、下游片段，再与SacII酶切质粒1所得大片段连接，获得质粒2。 ②用质粒2转化临床分离的具有头孢霉素抗性、对氯霉素敏感的Sa，然后涂布在含氯霉素的平板上，经培养获得含质粒2的Sa单菌落。 ③将步骤②获得的单菌落多次传代以增加同源重组敲除R基因的概率，随后稀释涂布在含 的平板上，筛选并获得不再含有质粒2的菌落。从这些菌落中分别挑取少许菌体，依次接种到含 的平板上，若无法增殖，则对应菌落中细菌的R基因可能被敲除。 (2)以③获得的菌株基因组为模板，采用不同引物组合进行PCR扩增，产物一般通过 （技术名称）来鉴定。检测结果如下图所示，表明R基因已被敲除的是 。 试卷第1页，共3页 1 学科网（北京）股份有限公司 《同源重组练习》参考答案 1．D 【分析】减数分裂过程：（1）减数分裂前间期：染色体的复制。（2）减数第一次分裂：①前期：联会，同源染色体上的非姐妹染色单体交叉互换；②中期：同源染色体成对的排列在赤道板上；③后期：同源染色体分离，非同源染色体自由组合；④末期：细胞质分裂。（3）减数第二次分裂：①前期：核膜、核仁逐渐解体消失，出现纺锤体和染色体；②中期：染色体形态固定、数目清晰；③后期：着丝点（着丝粒）分裂，姐妹染色单体分开成为染色体，并均匀地移向两极；④末期：核膜、核仁重建、纺锤体和染色体消失。 【详解】A、等位基因是位于同源染色体相同位置控制相对性状的基因，相同基因是同源染色体相同位置控制相同性状的基因，位于a、b两个DNA分子上的基因相同或互为等位基因，A正确； B、DNA分子中G与C之间有3个氢键，A与T之间有2个氢键，端粒DNA序列富含碱基G的特点，稳定性高，有利于维持端粒结构的稳定，B正确； C、减数分裂中同源染色体的片段互换需要DNA连接酶的参与，该酶作用的位点是磷酸二酯键，C正确； D、染色体端粒（富含碱基G的DNA-蛋白质复合体）在核膜上的准确锚定，而减数分裂Ⅱ的前期核膜已经消失，D错误。 故选D。 2．(1)PCR扩增法、基因文库筛选法 (2) 农杆菌 再分化 (3) 1和4 NotⅠ和HindⅢ b和c 2/二/两 (4)AT1-KO植株幼苗长势好、作物产量高，AT1-OE植株表型相反 【分析】基因工程技术的基本步骤：（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。（4）目的基因的检测与鉴定。 【详解】（1）常用的获取目的基因的方法有： 从相应的基因文库中筛选得到；以生物的总RNA为模板，逆转录得到cDNA后，再通过PCR扩增获得（“直接以基因组DNA为模板，利用PCR扩增”或“人工合成”等）。 （2）Ti质粒是农杆菌中的一种质粒，根据题意“目的基因与Ti质粒相连接”，故应将重组质粒导入农杆菌；携带重组质粒的农杆菌侵染愈伤组织，经再分化得到完整植株。 （3）①引物需要 与模板的3'端结合，结合图示可知，以高粱基因组DNA为模板，选择引物1和4进行PCR扩增，获得ATI基因及其上、下游片段；据图2可知，用NotⅠ和HindⅢ对PCR产物进行酶切后电泳，可得到三种不同大小的片段，上游片段、下游片段和AT1基因片段；根据片段大小，回收片段b(下游片段)和c(上游片段)，再与HindⅢ酶切后的质粒大片段连接，获得重组质粒。 ③选择引物1和引物4进行PCR，在PCR鉴定中，若电泳结果显示两条条带(2.7 kb和1.1 kb)，说明植株中既有野生型基因，又有敲除型基因，即为杂合子带。 （4）如果AT1基因过表达(AT1-OE)导致植株在盐碱胁迫下的长势和产量下降，说明AT1基因可能抑制了水稻对盐碱胁迫的耐受性，如果AT1基因敲除(AT1-KO)后植株在盐碱胁迫下的长势和产量提高，进一步证明AT1基因在水稻盐碱胁迫的响应过程中起负调控作用，故检测植株在盐碱土壤中的幼苗长势和作物产量。与野生型植株相比，若实验结果为AT1-KO植株幼苗长势好、作物产量高，AT1-OE植株表型相反 。 3．(1)A和T (2) EcoRⅠ BamHⅠ ④ (3) L基因上游同源序列以及tetr上游部分序列 dNTP、TaqDNA聚合酶（缓冲液、Mg2+等） (4) 四环素 4、7 (5) 蔗糖 作为阳性对照，确保相应功能的变化是由L基因缺失引起 【分析】基因工程技术的基本步骤：（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法。（4）目的基因的检测与鉴定：分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA是否插入目的基因--DNA分子杂交技术；②检测目的基因是否转录出了mRNA--分子杂交技术；③检测目的基因是否翻译成蛋白质--抗原-抗体杂交技术。个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。 【详解】（1）G与C之间形成3个氢键，破坏氢键需要能量，A与T之间只有2个氢键，ori通常富含碱基A和T，有利于解旋。 （2） 选择限制酶时，不能破坏目的基因、标记基因、复制原点，所以可选择BamHⅠ和EcoRⅠ对载体进行切割，由于目的基因两端没有相应的酶切位点，则设计引物时在引物5＇端分别添加的碱基序列是GGATCC和GAATTC，作为BamHⅠ和EcoRⅠ的识别序列。已知F1为下面的序列①，F1端加入的酶序列为EcoRⅠ的序列，S基因的左侧含有BamHⅠ，目的基因R1引物中不能含有BamHⅠ序列，但目的基因切割后形成的黏性末端应与质粒被BamHⅠ切割后相同，因此在R1的5，端加入Bgl Ⅱ的序列，以产生相同的黏性末端，R1应选择的是5′－AGATCTACCATCGATAGCCACTGGCCTAACGCC-3′，故选④。 （3）结合右侧图可知，利用上游同源序列将L基因与tetr进行进行替换，实现L基因的敲除，因此F2应根据L基因上游同源序列以及tetr上游部分序列来设计。 （4）tetr是四环素抗性基因，同源替换了L基因，筛选L基因敲除大肠杆菌时，需在培养基中添加四环素，能在其上生长的即为L基因敲除成功的大肠杆菌；F2、R2作为引物扩增时，L基因被替换，重组质粒上含tetr和S基因，S基因为2071bp，大于1000bp，4、7泳道接近活大于2071bp，对应的菌株可能转化成功。 （5）S基因是蔗糖致死基因，则添加蔗糖起到选择作用；对L基因回补是作为阳性对照，确保相应功能的变化是由L基因缺失引起。 4．(1)花或老叶 (2) 限制酶和DNA连接酶 CACC (3)目的载体中含有ccdB基因，导入目的载体的大肠杆菌会死亡 (4) (5)StSUT2转运蛋白含量 【分析】1、基因工程是指按照人们的愿望，进行严格的设计，通过体外DNA重组和转基因技术，赋予生物以新的遗传特性，创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品；基因工程是在DNA分子水平上进行设计和施工的，又叫做DNA重组技术； 2、基因工程技术的基本步骤： （1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成； （2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等，标记基因可便于目的基因的鉴定和筛选； （3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法； （4）目的基因的检测与鉴定： 分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA是否插入目的基因；②检测目的基因是否转录出了mRNA；③检测目的基因是否翻译成蛋白质——抗原-抗体杂交技术； 个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。 【详解】（1）为获得大量StSUT2基因，应首先从植物的花或老叶细胞中提取总mRNA，通过逆转录过程获得cDNA，然后根据StSUT2基因两端的序列设计两种引物进行PCR扩增，进而获得大量的StSUT2基因； （2）载体上的相应序列可被拓扑异构酶（TOPO）识别并在相应位点断开磷酸二酯键，形成一端为平末端，一端为黏性末端的载体，并将其与拓扑异构酶酶切后的StSUT2基因进行连接。因此拓扑异构酶与基因工程的限制酶和 DNA 连接酶功能相似。由于目的基因左侧碱基序列为GTGG，因此在扩增StSUT2基因时，可在引物中引入5'—CACC—3'序列，以确保StSUT2基因定向连接入门载体； （3）据题干信息可知，目的载体中含有ccdB基因，ccdB基因编码毒性蛋白，会导致细胞死亡，因此若将大肠杆菌导入目的载体，大肠杆菌会死亡； （4）因为LR反应可借助入门载体上的attL位点和超表达载体上的attR位点，将入门载体中的目的基因与超表达载体中的相应片段实现同源重组，因此StSUT2基因的超表达载体为：； （5）为确定StSUT2基因是否成功超量表达，可通过比较含StSUT2基因入门载体的转基因植物细胞、含StSUT2基因超表达载体的转基因植物细胞和非转基因植物细胞中的StSUT2 转运蛋白含量。 5．(1)② (2) 5， CAATTG 等于 BamHI和BclI是同尾酶，EcoRI和MfeI是同尾酶，过程⑦、⑧形成的黏性末端相同，易导致融合基因错误连接 (3)amyE基因两端的部分序列 (4) 淀粉 周围没有透明圈 (5) ABC 芽孢抗逆性强，芽孢能顺利通过胃肠道进入内环境；适宜条件下芽孢萌发成菌体并表达SpaA， 激活体液免疫 【分析】基因工程的基本操作步骤主要包括四步：①目的基因的获取；②基因表达载体的构建；③将目的基因导入受体细胞；④目的基因的检测与表达。其中，基因表达载体的构建是基因工程的核心。 【详解】（1）已知引物R1与引物F2部分序列互补配对，②中5，GGTGGCGG 3，序列与R1的序列5，CCGCCACC 3，互补配对，PCR后可以合成融合基因spoⅢJ-spaA，因此引物F2的序列为②对应的序列。故选②。 （2）融合基因spoⅢJ-spaA两端的引物为F1和R2，结合接入质粒的位置，两边的限制酶序列对应为MfeⅠ和Bel Ⅰ，因此F1的5'端应加上MfeⅠ的识别序列，R2的5'端应加上Bel Ⅰ的识别序列，接入融合基因spoⅢJ-spaA，同理在BamH Ⅰ和EcoR Ⅰ之间接入catC-cbpB融合基因。质粒pDC中BamHⅠ和EcoRⅠ之间的长度为7602-（9876-2295）=21bp，MfeⅠ和BelⅠ之间的长度为9876-（11377-1522）=21bp，二者相等；BamH Ⅰ和Bel Ⅰ形成的黏性末端均为5，GATC 3，，EcoR Ⅰ和Mfe Ⅰ形成的黏性末端均为5，AATT 3，，会导致两种融合基因错接入质粒，酶切后的连接产物多，因此过程⑦、⑧不能同时在同一体系中进行。 （3）将重组质粒pDG-CBJA导入枯草芽孢杆菌，与序列A、B所在的地方发生同源重组，即融合基因的两侧与序列A、B的基因序列相同，发生同源替换，故序列A应与amyE基因两端的部分序列相同。 （4）转化的枯草芽孢杆菌含有壮观霉素抗性基因和不完整的淀粉酶基因，应将菌种接种在含壮观霉素和淀粉的平板上进行筛选；由于淀粉酶基因被破坏，因此不能降解淀粉，菌落周围无透明圈。 （5）①红斑丹毒丝菌表面抗原A蛋白（SpaA）和胆碱结合蛋白B（CbpB）能诱导猪等产生特异性抗体，为研究不同疫苗体液免疫应答的效果，ABC均为对照组，DE为实验组。②菌体疫苗在消化道内易死亡，而芽孢是细菌休眠体，芽孢抗逆性强，芽孢能顺利通过胃肠道进入内环境；适宜条件下芽孢萌发成菌体并表达SpaA， 激活体液免疫。 6．(1) 逆转录酶 3' 外 (2) 加入特定的脱氧核苷酸，形成黏性末端 此方法构建基因表达载体的优点是将外源基因整合到染色体的特定位点，不影响被转入细胞的原有基因的表达，并提高外源基因表达的稳定性 (3)线性化 (4)缺乏尿嘧啶 (5) 同源区段loxP与URA3基因的连接方式 二 (6)含有5-氟乳清酸 【分析】基因工程是指按照人们的愿望，进行严格的设计，通过体外DNA重组和转基因技术，赋予生物以新的遗传特性，创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品．基因工程是在DNA分子水平上进行设计和施工的，又叫做DNA重组技术。 【详解】（1）提取总RNA经逆转录得到cDNA，需要逆转录酶的催化，DNA合成是从5'到3'进行的，因此在引物的3'端进行DNA链的延伸； 由于酵母菌无法吸收纤维素、寡糖和纤维二糖，所以导入分解纤维素的酶发挥作用的场所在细胞外。 （2） 由图推测，T4DNA聚合酶的作用是为合成的目的基因加入特定的脱氧核苷酸，形成黏性末端，此方法构建基因表达载体的优点是将外源基因整合到染色体的特定位点，不影响被转入细胞的原有基因的表达，并提高外源基因表达的稳定性。 （3）根据图示，环状的质粒变为了线性的基因，因此图1中空白处“？”应使用限制酶将构建好的基因表达载体线性化处理，转入酵母菌进行整合。 （4）由于选择了尿嘧啶合成基因（UGA）作标记基因，则应该将酵母菌放在缺乏尿嘧啶的培养基上培养。 （5）同源区段loxP（如图2），该序列由反向重复序列和间隔序列组成（如图2），决定其方向的是同源区段loxP与URA3基因的连接方式，方式一，loxP方向相反，如果切割，则末端在一条链上，不能连接，所以选择方式二，连接方向相同，切割后形成末端，便于连接。 （6）由于尿嘧啶可以使5-氟乳清酸转化为对酵母菌有毒物质，所以应该在含有5-氟乳清酸的培养基上，如果切割成功，则不含尿嘧啶，形成菌落，如果切割不成功，则会产生有毒物质，不能形成菌落。 7．(1) 碳源、氮源 抗生素A (2)基因重组、表观遗传（甲基化等） (3) SacⅡ和EcoRⅠ 脱水四环素 头孢霉素 D 【分析】可遗传变异来源有：基因突变、基因重组、染色体变异及表观遗传。Sa是原核生物，没有染色体。基因表达载体构建过程，利用PCR扩增目的基因时，需要目的基因两端的一段已知序列构建引物，质粒1及Sa的基因组中都含有SacII酶识别位点，还有质粒2上含有R基因上下游片段。筛选含质粒2的Sa菌落，用标记基因筛选目的菌，已知质粒2上有氯霉素抗性基因，筛选并获得不再含有质粒2的菌落，用标记基因筛选目的菌质粒2中的上、下游片段分别与Sa基因组中R基因上、下游片段配对，并发生交换，R基因被交换至质粒2上，则Sa的基因组中没有了R基因；Sa产生头孢霉素抗性与其R基因有关，失去R基因，Sa没有头孢霉素抗性；质粒2上含有的Y是可被脱水四环素诱导表达的Sa致死基因，则含质粒2的Sa在含脱水四环素的培养基中会死亡。筛选R基因被敲除的Sa，PCR扩增目的基因时需要目的基因两端的一段已知序列构建引物，发生同源重组时，质粒2中的上、下游片段分别与Sa基因组中R基因上、下游片段配对，并发生交换，敲除Sa的R基因，但R基因两端的上、下游片段仍在Sa基因组中。 【详解】（1）配制培养基时，需要加入的营养成分除了水和无机盐外，还应包括碳源、氮源，这是培养基的基本成分；A、B、C、D四种抗生素中，抑菌效果最佳的是抗生素A，因为滤纸片a的抑菌圈最大； （2）Sa为原核生物产生抗药性可遗传变异的来源有基因突变、基因重组、表观遗传等； （3）①由图1可知，质粒2上依次接有SacⅡ、EcoRⅠ、SacⅡ三个酶切位点，而质粒1上只有SacⅡ酶切位点，R基因的上下游依次含有SacⅡ、EcoRⅠ、EcoRⅠ、SacⅡ酶切位点，若要构建质粒2，可以采用引物1和4进行PCR扩增可得到整个R基因，以及上下游片段（或采用引物1和3以及引物2和4分别进行PCR扩增），用SacⅡ和EcoRⅠ对PCR产物进行酶切，然后回收上、下游片段，再与SacII酶切质粒1所得大片段连接，获得质粒2。②用质粒2转化临床分离的具有头孢霉素抗性、对氯霉素敏感的Sa，因为重组的质粒2上含有氯霉素抗性基因，所以可以将重组后的含质粒2的菌落涂布在含氯霉素（或氯霉素+头孢霉素）的平板上，能生存下来的菌落就是，含质粒2的Sa单菌落。③推测Sa产生头孢霉素抗性与其R基因有关。为验证该推测需要敲除R基因，因为质粒2上含有Y可被脱水四环素又到表达的Sa致死基因，所以将②获得的单菌落多次传代以增加同源重组敲除R基因的几率，随后稀释涂布在含脱水四环素的平板上，可诱导R基因死亡，若无法增殖，则对应菌落中细菌的R基因疑似被敲除。④以③获得的菌株基因组为模板，采用不同引物组合进行PCR扩增，电泳检测结果如图2，表明R基因已被敲除的是D组，由图1可知，R基因两侧含有的引物为2和3，所以扩增后含有引物2或3，或者2和3的可能含有R基因，所以表明R基因已被敲除的是D组。 8．(1) 1、4 变性、复性、延伸 2n-2n Sac Ⅱ 和 EcoRI 脱水四环素 头孢霉素 (2) (琼脂糖凝胶)电泳 D 【分析】PCR原理：在解旋酶作用下，打开DNA双链，每条DNA单链作为母链，以4种游离脱氧核苷酸为原料，合成子链，在引物作用下，DNA聚合酶从引物3'端开始延伸DNA链，即DNA的合成方向是从子链的5'端自3'端延伸的。实际上就是在体外模拟细胞内DNA的复制过程。DNA的复制需要引物，其主要原因是DNA聚合酶只能从3′端延伸DNA链。PCR反应过程是：变性→复性→延伸。 【详解】（1）①由图1可知，质粒2上依次接有SacⅡ、EcoRⅠ、SacⅡ三个酶切位点，而质粒1上只有SacⅡ酶切位点，R基因的上下游依次含有SacⅡ、EcoRⅠ、EcoRⅠ、SacⅡ酶切位点，若要构建质粒2，可以采用引物1和4进行PCR扩增可得到整个R基因，PCR反应过程是：变性→复性→延伸，n次循环后可以得到等长的目的基因2n-2n。用SacⅡ和EcoRⅠ对PCR产物进行酶切，然后回收上、下游片段，再与SacII酶切质粒1所得大片段连接，获得质粒2。 ②用质粒2转化临床分离的具有头孢霉素抗性、对氯霉素敏感的Sa，因为重组的质粒2上含有氯霉素抗性基因，所以可以将重组后的含质粒2的菌落涂布在含氯霉素的平板上，能生存下来的菌落就是，含质粒2的Sa单菌落。 ③为验证该推测需要敲除R基因，因为质粒2上含有Y可被脱水四环素诱导表达的Sa致死基因，所以将②获得的单菌落多次传代以增加同源重组敲除R基因的几率，随后稀释涂布在含脱水四环素的平板上，可诱导R基因死亡，推测Sa产生头孢霉素抗性与其R基因有关，因此可从这些菌落中分别挑取少许菌体，依次接种到含头孢霉素的平板上，若无法增殖，则对应菌落中细菌的R基因疑似被敲除。 （2）以③获得的菌株基因组为模板，采用不同引物组合进行PCR扩增，产物一般通过琼脂糖凝胶电泳来鉴定。电泳检测结果如图2，表明R基因已被敲除的是D组，由图1可知，R基因两侧含有的引物为2和3，所以扩增后含有引物2或3，或者2和3的可能含有R基因，所以表明R基因已被敲除的是D组。 $$