2025届高三一轮复习生物：基因工程的基本操作程序课件

考点二 胚胎工程技术及其应用 本节聚焦： 1.胚胎工程技术主要包括哪些内容？ 它们的原理分别是什么？ 2.胚胎工程在生产实践中有哪些应用？ 1982年世界首例“试管牛” 犊问世 “试管牛”是如何生产的？ 思考： 情景资料： 试管动物 通过人工操作使卵子在体外受精，经培养发育为早期胚胎后，再进行移植产生的个体。 体外受精 受体母牛 (代孕) 精子 卵子 早期胚胎发育 胚胎移植 受精卵 早期胚胎 试管牛 胚胎移植 体外受精 早期胚胎培养 有性生殖 生殖方式： 体细胞核移植 体外受精 早期胚胎培养 胚胎移植 克隆动物 试管动物 比较项目 试管动物 克隆动物 技术基础 生殖类型 后代性状 的继承特点 体外受精 早期胚胎培养 胚胎移植 动物细胞培养、动物细胞融合 动物体细胞核移植 早期胚胎培养、胚胎移植 有性生殖 无性生殖 继承双亲的的特性 与核供体亲本基本一样 重组细胞 受精卵 有性生殖 无性生殖 克隆动物与试管动物分别是怎样产生的？有啥区别？ 1.体外受精 (1)过程 (2)意义：①提高动物__________； ②为胚胎移植提供可用的______。 成熟培养 获能 繁殖能力 胚胎 体外受精 获能精子 受精卵培养 成熟培养 一、胚胎工程技术及其应用 5 2.胚胎移植 (1)概念 转基因、核移植和体外受精 同种的、生理状 态相同 遗传性状优良、生产能 力强 健康的体质和正常 繁殖能力 供体职能： 产生具有优良遗传特性的胚胎 承担繁重而漫长的妊娠和育仔任务 受体职能： (2)过程-P61 同期 发情 超数排卵 人工授精 妊娠 ②超数排卵使用的激素： 促性腺激素 ②胚胎移植的早期胚胎是： 桑葚胚或囊胚 目的： 蛋白质类，只能注射 ①同期发情处理：使供体和受体母牛处于相同的生理状态，保证胚胎移植前后生理环境一致。 使卵巢排出比自然情况下更多的卵子 根据书本P61图像思考回答以下问题： 1.在牛的胚胎移植过程中有两次使用激素、两次检查，其目的分别是什么？ 第一次用孕激素对受、供体进行同期发情处理，第二次用促性腺激素处理使供体超数排卵。 2.胚胎工程的最后一道“工序”？胚胎移植的优势是什么？ 胚胎移植 3.胚胎工程获得的良种牛的遗传特性是由谁决定的？ 供体公牛和供体母牛 4.冲卵是 。胚胎分割的次数不宜过多;但一次给受体动物 ，可增加双胞胎和多胞胎的比例. 把供体子宫内的胚胎冲洗出来 植入多个胚胎 5.胚胎移植主要包括：供体、受体的选择和处理，___________________，胚胎的收集、检查、培养或保存，______________以及________________等步骤。 配种或人工授精 胚胎的移植 移植后的检查 第一次是对收集的胚胎进行质量检查，第二次是对受体母牛是否妊娠进行检查。 可以发挥雌性优良个体的繁殖能力。 同种动物 生理变化 游离 免疫排斥 遗传特性 2、胚胎移植 ①可以充分发挥雌性优良个体的繁殖潜力。 ②大大缩短了供体本身的繁殖周期。 ①实质： 早期胚胎在相同生理环境条件下空间位置的转移。 ②意义： 三、胚胎分割 1. 胚胎分割概念： 早期胚胎细胞具有很强的分裂能力，并保持着细胞全能性。 2. 特点： 3. 生殖方式： 来自同一胚胎的后代具有相同的遗传物质，后代遗传性状相同。 无性繁殖或克隆 5.所需要的主要仪器： 分割工具： 体视显微镜、显微操作仪 分割针或分割刀 4. 理论依据： 采用___________将____________切割成___________________ __ 等，经移植获得__________________的技术 机械方法 早期胚胎 2等份、4等份或8等份 同卵双胎或多胎 可提高胚胎利用率 三、胚胎分割 【说明】 还可用分割针分割 ，做DNA分析，鉴定性别。 滋养层 人工控制动物性别 6.适合分割的胚胎: 发育良好的、形态正常的桑葚胚或囊胚。 注：分割囊胚时，要将内细胞团均等分割 若分割时不能均等分割，会出现 的部分正常发育的能力强，少的部分发育受阻或发育不良，甚至不能发育等问题。 含内细胞团多 桑葚胚或囊胚的内细胞团细胞具有发育的全能性 否则会影响分割后胚胎的恢复和进一步发育。 思考：1.做性别鉴定时为什么取滋养层细胞进行DNA分析？ 　原因：(1)内细胞团将来发育成胎儿的各种组织，如果取了内细胞团细胞，可能会影响胎儿以后的发育。 (2)滋养层细胞和内细胞团细胞都是由同一个受精卵经有丝分裂和细胞分化形成，具有相同的遗传物质。 2.为什么不能对原肠胚进行胚胎分割？ 因为原肠胚已分化出三个胚层，每个胚层细胞的分化方向已确定，只分割出一部分胚层细胞不可能发育为一个完整的幼体。 3.通过胚胎分割后移植培育出的动物，性别是否相同？ 相同。来自同一胚胎的后代具有相同的遗传物质，后代遗传性状相同。 三、胚胎分割 7.胚胎分割的意义 ①可以促进优良动物品种的繁殖。 ②产生的遗传性状相同的后代是进行遗传学研究的宝贵材料。 ③胚胎移植前进行性别鉴定、遗传病筛查等，对于人工控制动物性别、动物繁育健康后代具有重要意义。 8.局限性 ①存在一些问题，如刚出生动物体重偏低，毛色、斑纹可能存在差异等。 ②分割的份数越多，分割后胚胎成活的概率越小，目前仍然以二分胚胎的分割和移植效率最高。 第61课时 基因工程的基本操作程序 1.概念:按照人们的愿望，通过 等技术，赋予生物新的遗传特性。属于______ (定向/不定向)地改造生物的遗传性状。 2.别名: 。 3.原理: 。 4.操作对象: 。 5.操作水平: 。 6.操作环境: 生物 （体内/体外）进行 7.结果： 。 8.优点： （1） 。 （2） 等。 基因重组 DNA分子水平 重组DNA技术 基因 体外 创造出符合人们需要的生物类型和生物产品 转基因 定向 定向改造生物性状 克服远缘杂交不亲和的障碍 一.基因工程原理 鱼票月半出品，必是精品 回忆必修二学过的基因重组的概念，第一种：减数第一次分裂的后期，随着非同源染色体上的非等位基因的自由组合，第二种：四分体时期同源染色体的非姐妹染色单体的交叉互换。特点：随机的，不定向的 16 1.基因工程操作导致的基因重组与有性生殖中的基因重组的主要区别是什么？ 核心探讨 有性生殖中的基因重组是随机的，并且只能在同一物种间进行重组； 基因工程可以实现遗传物质在不同物种间进行重组，并且可以定向地改变生物的性状。 一. 基因工程的理论基础 1.不同生物的基因能够拼接的理论基础？ 2. 基因能够在不同生物细胞内表达的理论基础？ （1） 绝大多数生物的基因为DNA，DNA的基本单位和结构相同； （2） 碱基互补配对的方式相同 3.同一种基因在不同生物体内表达出来的蛋白质相同，因为： ① 基因是控制生物性状的独立遗传单位 ② 遗传信息的传递都遵循中心法则 ③ 生物界共同一套遗传密码 所有生物共用一套遗传密码 鱼票月半出品，必是精品 ①体外重组的质粒可以进入受体细胞； ②真核生物基因可在原核细胞中表达 [2018全国1卷] 博耶和科恩将非洲爪蟾核糖体蛋白基因与质粒重组后导入大肠杆菌细胞中进行了表达，该研究除证明了质粒可以作为载体外，还证明了 (答出两点即可)。 [2018全国1卷] 艾弗里肺炎链球菌转化实验对基因工程启示： DNA可从一种生物个体转移到另外一种生物 鱼票月半出品，必是精品 工具 工具酶 分子运输车：　　　。 （１）　　　　　　。 （２）　 　　　　　 。 ＤＮＡ连接酶 载体 质粒 噬菌体 动植物病毒 二.重组DNA技术的基本工具 限制酶 鱼票月半出品，必是精品 (1)限制性内切核酸酶（限制酶） 1’ 2’ 3’ 4’ 5’ G 1’ 2’ 3’ 4’ 5’ A 磷酸二酯键 T G C C G T A A 5' 3' 5' 3' 作用位点： 磷酸二酯键（同一条链上连接2个相邻核苷酸的键） 1.来源： 2.种类： 3.作用： 能识别双链DNA分子的特定核苷酸序列，并使每一条链中特定部位的磷酸二酯键断开。 主要来自原核生物 数千种（限制酶不是一种酶，而是一类酶） 氢键 旁栏思考: 请推测限制酶存在于原核生物中的主要作用是什么？ 背景：原核生物易受到自然界外源DNA的入侵，所以它在长期的进化过程中形成了套防御机制。限制酶就是它的一种防御性工具。 当外源DNA入侵时，它会利用限制酶来切割外源DNA，使之失效，以保证自身的安全。 限制酶为什么不会剪切原核生物本身的DNA? 原核生物中不存在该限制酶的识别序列, 或者识别序列已被修饰（甲基化），使限制酶不能将其切开 黏性末端 黏性末端 EcoRⅠ限制酶： 识别序列为-GAATTC-， 切割部位为GA之间的磷酸二酯键。 大多数限制酶的识别序列由6个核苷酸组成，也有少数限制酶的识别序列由4个、8个或其他数量的核苷酸组成。 限制酶在它识别序列的中轴线两侧将DNA分子的两条链分别切开，形成黏性末端 ①形成的黏性末端（从5’往3’读）为________ ②一个限制酶切割一次，断 个磷酸二酯键，断开时共消耗___分子水， 形成___个黏性末端，形成___个游离的磷酸基团。 AATT 2 2 5' 3' 3' 5' 2 ③获取一个目的基因需限制酶切割____次，共产生____个游离的磷酸基团 2 4 2 每个末端（5‘端）有个游离的磷酸基团 当限制酶在它识别序列的_____________将DNA分子的两条链分别切开时，产生的是__________； 当限制酶在它识别序列的_________切开时，产生的是_________； 中轴线两侧 黏性末端 中轴线处 平末端 核心归纳 5' 5' 3' 3' 在识别序列中，一条链从5’往3’读的碱基序列与另一条链从5’往3’读的碱基序列完全一致。 课堂练习1：写出下列限制酶切割形成的黏性末端 BamHⅠ____ EcoRⅠ___ HindⅢ___ BglⅡ ___ GATC AATT AGCT GATC 同尾酶：识别序列不同，但能切割产生相同黏性末端的限制酶 哪些限制酶切割后的黏性末端能连接在一起？ 、 。 BamHⅠ BglⅡ 黏性末端相同才可以相互连接 2.请判断：以下黏性末端是由　种限制酶作用产生的。 3 3.限制酶能切开RNA分子的磷酸二酯键吗？ 不能。 —G↓AATTC— —CTTAA↓G— 先找到中心轴线，中心轴线两侧碱基互补对称；再逆推识别序列 —C↓AATTG— —GTTAA↓C— —G↓TTAAC— —CAATT↓G— 只提供一个黏性末端（只知道一个切割位点的），要先找到中轴线， 练习4、已知限制酶Ⅰ的识别序列和切点是—GGATCC—，限制酶Ⅱ的识别序列和切点是—↓GATC—。 （1）则能被限制酶I切割的DNA，______（能/不能）被限制酶II切割； （2）能被限制酶II切割的DNA，____________（能/不能/不一定能）被限制酶I切割。二者产生的末端相同吗？ 能 不一定能 相同 限制酶Ⅰ的识别序列包含了限制酶Ⅱ的识别序列 1．限制酶的辨析 (1)限制酶是一类酶而不是一种酶。 (2)限制酶作用于磷酸二酯键，而不是氢键。 (3)不同种类的限制酶识别的序列与切割的位点不同，这与酶的专一性是一致的。 (4)在切割含目的基因的DNA分子时，需用限制酶切割2次，产生4个末端。只有这样，才能使目的基因的两端都有可连接的末端。 (5)限制酶的识别序列与被作用的DNA序列是不同的。前者一般由6个核苷酸组成，少数由4、5或8个核苷酸组成；后者是双链序列。 (6)判断两个末端是否为同一种限制酶切割产生的方法：将其中一个末端旋转180°，若与另一个完全相同，则说明这两个末端是由同一种限制酶切割产生的。 A.质粒用限制酶Ⅰ切割，目的基因用限制酶Ⅱ切割 B.用限制酶切割获得目的基因时，有四个磷酸二酯键被水解 C.限制酶Ⅰ和限制酶Ⅱ切割后获得的黏性末端相同 D.质粒中标记基因便于筛选出目的基因已经表达的细胞 D 1.在基因工程中，已知限制酶Ⅰ的识别序列和切点是—G↓GATCC—，限制酶Ⅱ的识别序列和切点是—↓GATC—。根据下图示判断下列操作错误的是 已导入目的基因，不一定表达 只有用限制酶Ⅱ才能将目的基因切割下来 当有2个标记基因时，只能破坏其中1个 鱼票月半出品，必是精品 2.某线性DNA分子含有3000个碱基对(bp)，先用限制酶a切割，再把得到的产物用限制酶b切割，得到的DNA片段大小如表所示。限制酶a和b的识别序列和切割位点如图所示。下列有关说法正确的是(　　) A.在该DNA分子中，a酶与b酶的识别序列分别有3个和2个 B.a酶与b酶切出的黏性末端不能相互连接 C.a酶与b酶切断的化学键不相同 D.经a、b酶处理后得到的重组质粒不能再被这两种酶所识别 D －AGATCC－ －TCTAGG－ 识别序列都是2个 黏性末端都是GATC，可相互连接 都是磷酸二酯键 －GGATCT－ －CCTAGA－ a酶切割产物(bp) b酶再次切割产物(bp) 1600；1100；300 800；300 b酶把1600的DNA切成800和800两个片段，把1100的DNA切成800和300两个片段 鱼票月半出品，必是精品 大本 考向一　辨析基因工程的基本工具 1.(2021·湖北，7)限制性内切核酸酶EcoRⅠ识别并切割 双 链DNA，用EcoRⅠ完全酶切果蝇基因组DNA，理论上得到DNA片段的平均长度(碱基对)约为 A.6 B.250 C.4 000 D.24 000 C EcoRⅠ的酶切位点有6个碱基对，由于DNA分子的碱基组成为A、T、G、C，则某一位点出现该序列的概率为1/4×1/4×1/4×1/4×1/4×1/4＝1/4 096，即4 096个碱基对可能出现一个限制酶EcoRⅠ的酶切位点，故理论上得到DNA片段的平均长度(碱基对)约为4 096，与4 000最接近，C符合题意。 1.用右图中的质粒和目的基因构建重组质粒时，不能 使用SmaⅠ切割，原因是： 。 2. 单酶切：目的基因和质粒都只用EcoRI，可能出现的问题： 3. 双酶切：构建重组质粒时， 选择限制酶 或 处理质粒、外源DNA，这样做的目的是 。 SmaⅠ会破坏质粒中的抗性基因以及破坏目的基因 防止质粒和目的基因自身环化、防止目的基因反向连接（确保目的基因与质粒的定向连接）、防止抗性基因破坏 BamHⅠ和HindⅢ 目的基因自身环化、质粒自身环化、目的基因反方向连接 EcoRI和HindⅢ 不能选EcoRI和BamHⅠ 鱼票月半出品，必是精品 磷酸二酯键 大肠杆菌 黏性末端 黏性末端 2.DNA连接酶 但缝合黏性末端的效率更高 鱼票月半出品，必是精品 （1）限制酶与DNA连接酶的关系(如下图)： （2）DNA连接酶与DNA聚合酶的关系(如下图)： 相同点—— 不同点—— DNA聚合酶 DNA连接酶 DNA连接酶 ①DNA聚合酶：把单个脱氧核苷酸连接到DNA片段 ②DNA连接酶：DNA片段与DNA片段的连接 ③DNA聚合酶作用需要模板，而DNA连接酶不需要 作用位点都在磷酸二酯键 鱼票月半出品，必是精品 比较与DNA相关的五种酶 名称 作用部位 作用结果 限制酶 DNA连接酶 DNA聚合酶 DNA水解酶 解旋酶 磷酸二酯键 磷酸二酯键 磷酸二酯键 磷酸二酯键 碱基对之间的氢键 切割DNA分子，将DNA切成两个或多个片段 将两个DNA片段连接成新的DNA分子 将单个脱氧核苷酸依次连接到单链末端 将DNA片段水解为单个脱氧核苷酸 将双链DNA分子局部解旋为单链 1.根据所学知识，完成以下填空： ①限制酶 ②解旋酶 ③DNA连接酶 ④DNA聚合酶 ⑤RNA聚合酶 b a A.能断裂a处的酶为_______ B.能连接a处的酶为_______ C.能断裂b处的酶为_______ ① 考点训练　 磷酸二酯键 氢键 ③④ ② 2.下列关于如图所示黏性末端的叙述，正确的是 A.①与③是由相同限制酶切割产生的 B.DNA连接酶可催化①与③的连接 C.经酶切形成④需要脱去2分子水 D.DNA连接酶与DNA聚合酶均能作用于上述黏性末端 B ①与③的黏性末端相同 消耗2分子水 不同，①与③的识别序列不同 －CAATTG－ －GTTAAC－ －GAATTC－ －CTTAAG－ DNA聚合酶无法作用于黏性末端，作用于单个脱氧核苷酸 3.下列有关限制酶和DNA连接酶的叙述正确的是 A.用限制酶酶切获得一个外源基因时得到两个切口，有2个磷酸二酯键 　被断开 B.限制酶识别序列越短，则该序列在DNA中出现的概率就越大 C.序列—CATG↓—和—G↓GATCC—被限制酶切出的黏性末端碱基数不同 D.T4 DNA连接酶和E.coli DNA连接酶都能催化平末端和黏性末端的连接 B 限制酶每切割一次断开2个磷酸二酯键，两个切口断开4个磷酸二酯键 —CATG↓— —↓GTAC— —G↓GATCC— —CCTAG↓G— 都是4个 1) 化学本质： 2) 种类：质粒、噬菌体、动植物病毒等 3) 条件 ① 能在受体细胞中自我复制，或整合到受体DNA上，随受体DNA同步复制。 ② 具有一个或多个限制酶切割位点,供目的基因插入。 ③ 带有标记基因,便于重组DNA分子的筛选。 4) 作用： 质粒是一种裸露的、结构简单、独立于真核细胞细胞核或原核细胞拟核DNA之外 ，并具有自我复制能力的环状双链DNA分子。 3.载体 将目的基因导入到受体细胞。 ④对受体细胞无毒害。 DNA分子 鱼票月半出品，必是精品 (1)在进行基因工程操作中，真正被用作载体的质粒，都是在天然质粒的基础上进行过人工改造的 (2)噬菌体或某些动植物病毒作为载体利用的原理是 。病毒对宿主细胞的侵染具有 性。 利用病毒对宿主细胞的侵染性 特异 高考题.若用家蚕作为某基因表达载体的受体细胞，在噬菌体和昆虫病毒两种载体中，不选用 作为载体，其原因是 。 噬菌体 噬菌体的宿主细胞是细菌，而不是家蚕 （3）根据标记基因的作用，有同学认为在含有某种抗生素的培养基中筛选存活的受体细胞不一定是导入目的基因的受体细胞，这种说法是否合理？并说明理由。 合理；因为仅导入载体的和导入含有目的基因的载体的受体细胞均能在该培养基中存活。 鱼票月半出品，必是精品 (1)质粒与拟核中的DNA有哪些相同点：（至少写出两点） ① 。 ② 。 ③ 。 (2)质粒 （是/不是）一种细胞器，载体 （是/不是）工具酶。 (3)细胞膜上的载体蛋白与基因工程中的载体的区别 ①化学本质不同：细胞膜上的载体： 。基因工程中的载体可能是物质，如 ；也可是生物，如 。 ②功能不同：细胞膜上的载体功能是 ;基因工程中的载体是一种“分子运输车”,把 。 基本组成单位和结构相同 能够自我复制 具有遗传效应或都能够指导蛋白质的合成等 不是 蛋白质 质粒 噬菌体、动植物病毒 协助细胞膜控制物质进出细胞 目的基因导入受体细胞 总结：易错点拨 不是 鱼票月半出品，必是精品 例题3：[2016年新课标I卷] 某一质粒载体如图所示，外源DNA插入到Ampr或Tetr中会导致相应的基因失活（Ampr表示氨苄青霉素抗性基因，Tetr表示四环素抗性基因）。有人将此质粒载体用SamI酶切后，与用SamHI酶切获得的目的基因混合 ，加入DNA连接酶进行连接反应，用得到的混合物直接转化大肠杆菌，结果大肠杆菌有的未被转化，有的被转化。被转化的大肠杆菌有三种，分别是含有环状目的基因、含有质粒载体、含有插入了目的基因的重组质粒的大肠杆菌。回答下列问题： 1）载体作为基因工程的工具，应具备的基本条件有（答出两点即可）___________________________________________________________（答出两点即可）。而基因表达载体除满足上述基本条件外，还需具有 。 能自我复制、有标记基因、有一个至多个限制酶切割位点 启动子和终止子 基因表达载体的组成：启动子+目的基因+终止子+标记基因 鱼票月半出品，必是精品 目的基因 未转化 大肠杆菌类型 氨苄青霉素抗性 四环素抗性 未被转化 仅含有目的基因 含普通质粒 含重组质粒 × × × × √ √ √ × 鱼票月半出品，必是精品 2）如果用含有氨苄青霉素的培养基进行筛选， 在上述四种大肠杆菌细胞中，未被转化的和仅 含有环状目的基因的细胞是不能区分的，其原因是 _______________________________________________________；并且_______________和_________________________________的细胞也是不能区分的，其原因是_____________________________________________________。在上述筛选的基础上，若要筛选含有插入了目的基因的重组质粒的大肠杆菌的单菌落，还需使用含有____________的固体培养基。 二者均不含氨苄青霉素抗性基因，在该培养基上都不能生长 含有普通质粒 含有插入了目的基因的重组质粒 二者都含氨苄青霉素抗性基因，在该培养基上均能生长 四环素 （若插入了目的基因，则四环素抗性基因结构被破坏，因此不能生存) 鱼票月半出品，必是精品 A.质粒的复制原点上有RNA聚合酶的结合位点 B.①②③三种重组后细菌的外源基因插入点①是a，②是c，③是b C.质粒被一种限制酶切开时，被水解的磷酸二酯键有2个 D.将外源基因与质粒连接时需用DNA聚合酶 项目 细菌在含氨苄青霉素的培养基上生长情况 细菌在含四环素的培养基上生长情况 ① 能生长 不能生长 ② 能生长 能生长 ③ 不能生长 能生长 C 大本2.(2024·阳江高三调研)质粒是基因工程中最常用的载体，质粒有标记基因(如图所示)，通过标记基因可以推知外源基因(目的基因)是否转移成功。质粒上箭头表示三种限制酶的酶切位点。外源基因插入的位置不同，细菌在培养基上的生长情况不同。如表是外源基因插入(插入点有a、b、c)后细菌的生长情况。下列有关叙述正确的是 DNA聚合酶（催化DNA复制） ①是b，②是c，③是a DNA连接酶 5．科学家将人的生长激素基因与大肠杆菌的DNA分子进行重组，并成功地在大肠杆菌中得以表达。过程如图所示，据图回答： (1)人的基因之所以能与大肠杆菌的DNA分子进行重组，原因是______________________________________________________________________。(2)过程①表示的是采取____________的方法来获取目的基因。(3)如果把已经导入了普通质粒A或重组质粒的大肠杆菌，放在含有四环素的培养基上培养，发生的现象是____________________________，原因是_____________________________________________________________________________________________________________________________________________。 人的基因与大肠杆菌DNA的基本组成单位和结构相同，并且具有相同的黏性末端 逆转录 有的能生长，有的不能生长 导入普通质粒A的细菌能生长，因为普通质粒A上有四环素抗性基因；导入重组质粒的细菌不能生长，因为目的基因插在四环素抗性基因中，破坏了其结构和功能 考点二 基因工程的基本操作程序 鱼票月半出品，必是精品 苏云金杆菌 与载体拼接 棉花细胞 抗虫棉 提取 表达Bt基因 导入 Bt基因 重组DNA分子 1.目的基因的筛选与获取 2.基因表达载体的构建 3.将目的基因导入受体细胞 4.目的基因的 检测与鉴定 培育转基因抗虫棉一般需要哪些步骤？ 1.目的基因的获取 2.基因表达载体的构建（核心） 3.将目的基因导入受体细胞 4.目的基因的检测与鉴定 基因表达载体的组成：启动子+目的基因+终止子+标记基因 植物细胞： 动物细胞（受精卵）： 微生物细胞： 检测方法：①分子水平：DNA分子杂交、DNA-RNA分子杂交、抗原－抗体杂交； ②个体水平：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等 一.基因工程的基本操作程序 农杆菌转化法(常用）、基因枪法、花粉管通道法 显微注射法 感受态细胞法（Ca2+处理法） 鱼票月半出品，必是精品 （1）目的基因指：主要是 ；也可以是 ； 例如与生物抗性相关的基因、与优良品质相关的基因等。 编码蛋白质的基因 具有调控作用的因子 获取方法 ①从基因文库中获得 ②利用PCR技术扩增 ③人工合成法 A.逆转录法 B.化学合成法 1.目的基因的获取 （2）获取目的基因的常用方法： 与生物抗逆性相关的基因（Bt抗虫基因） 与生物药物相关的基因（胰岛素、干扰素基因） 与毒物降解相关的基因 与工业用酶相关的基因等 鱼票月半出品，必是精品 (1)从基因文库中获取目的基因 ①基因文库的概念: 将含有某种生物不同基因的许多DNA片断，导入到受体菌的群体中，各个受体菌分别含有这种生物的不同基因。 ②基因文库的种类: 。 基因组文库： 部分基因文库： 含有一种生物的全部基因 只包含了一种生物的部分基因， 如：cDNA文库 基因组文库和部分基因文库 鱼票月半出品，必是精品 基因组：就是一个物种的个体或细胞所含的全套基因的总和 (2)人工合成法： ①逆转录法：即以 作为模板，在 酶的作用下合成 。 若要运用该方法获得人的胰岛素基因，则只能从人的 细胞中提取到胰岛素的mRNA进行逆转录获取胰岛素基因；原因是 。 逆转录法获得的胰岛素基因（cDNA）在基因结构上的特点是 。 mRNA 逆转录 cDNA 胰岛B 胰岛素基因只会在胰岛B细胞中表达，其他细胞中不表达 基因只包括了编码区中的外显子序列，而没有非编码区和内含子序列 以mRNA为模板, 逆转录产生的目的基因中没有内含子、非编码区。 ②化学合成法 目的基因比较小且核苷酸序列已知时，可通过 （填仪器）用化学方法直接人工合成。 DNA合成仪 鱼票月半出品，必是精品 ②化学合成法： 化学合成法 （能/不能）合成自然界不存在的新基因，使生物产生新的性状以满足人类的要求。 【易错积累】 从基因组文库中获得的胰岛素基因（含内含子），若以大肠杆菌作为受体细胞却未得到对应的胰岛素，其原因可能是:____________________________。 能 该胰岛素基因含内含子，在大肠杆菌中缺乏真核生物的RNA剪切机制，内含子转录出的RNA序列不能被切除，故无法表达出胰岛素 鱼票月半出品，必是精品 PCR技术：PCR是聚合酶链式反应的缩写. 是一项根据DNA半保留复制 的原理，在体外提供参与DNA复制的各种组分与反应条件，对目的基因的核苷酸序列进行大量复制的技术. 全称 原理 操作环境 目的 优点 聚合酶链式反应 DNA半保留复制 体外（PCR扩增仪/PCR仪）（缓冲液） 对目的基因的核苷酸序列进行大量复制 可以在短时间内大量扩增目的基因 （3）利用PCR技术扩增目的基因 1.目的基因的获取 思考：结合体内DNA复制过程，思考PCR反应需要哪些条件？ 体内DNA复制 参与的组分 在DNA复制中的作用 PCR中参与的组分或反应条件 打开DNA双链 提供DNA复制的模板 合成子链的原料 催化合成DNA子链 使DNA聚合酶能够从引物的3′端开始连接脱氧核苷酸 能量 4种脱氧核苷酸 引物 （通常为一小段单链RNA） 用高温代替 目的基因 4种脱氧核苷酸 耐高温的DNA聚合酶 【需Mg2+激活】 引物（2种，通常为一小段单链DNA） DNA聚合酶 DNA母链 解旋酶 ATP 每一个dNTP的β 和 γ 磷酸键断裂所产生的能量 57 拓展：PCR中合成子链的原料（填空时写4种脱氧核苷酸） dNTP既可作为合成DNA子链的原料，又可为DNA的合成提供能量，因此体系中不需要添加ATP。 PCR中合成子链的原料实为dNTP, 也称 脱氧核苷三磷酸，N是指A、T、G、C四种含氮碱基，包括dATP、dGTP、dTTP、dCTP。它们是由两个磷酸分子和一个脱氧核苷酸组成的，其结构简式如下： A T C G P ~ P ~ P 脱氧核糖 含氮碱基 特殊的化学键 脱氧核苷酸 鱼票月半出品，必是精品 58 58 引物是一小段能与DNA母链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸。 3’ 5’ DNA母链1 3’ 5’ DNA母链2 3’ 5’ 引物1 3’ 5’ 引物2 什么是引物？ 引物可以是DNA单链， 也可以为RNA单链， 细胞内的DNA复制通常以RNA单链为引物 细胞外（PCR）一般以DNA单链为引物 用于PCR的引物长度通常为20~30个核苷酸。 引物结合在模板链的3’端 01 设计引物的依据： 目的基因两端（3’端）的核苷酸序列 若引物长度过短，则 引物与模板链结合的特异性较差 ①长度适当（20-30bp）； ②引物内部不发生局部碱基互补配对； ③引物之间不发生局部碱基互补配对； ④GC含量适宜 2.PCR过程中需要加入两种引物，原因是？ 两条模板链3′端序列不相同，用两种引物才能确保DNA两条链同时被扩增 。 因为DNA聚合酶不具有从头合成子链的功能，只能将单个脱氧核苷酸加到已有链的3′端。 1.为什么子链合成需要引物？ 3.引物要符合哪些要求？ 只能在引物的5’端加上限制酶识别序列！ 防止引物自身折叠 防止引物之间配对导致不能和模板链结合 【典例1】设计引物是PCR技术关键步骤之一。某同学设计的两组引物(只标注了部分碱基序列)都不合理(如下图)，请分别说明理由。 (1）第1组：_________________ ； 第2组：________________ 。 引物Ⅰ和引物Ⅱ会因局部发生碱基互补配对而不能与模板链结合 引物Ⅰ′内部会因局部碱基互补配对而自身折叠后失效 (2)两种引物与模板链如何配对？_____ 。 引物的5′端与模板链3′端互补配对 耐高温的DNA聚合酶 （Taq酶） 目的基因 引物（2种） 缓冲溶液 （一般添加Mg2+） ②PCR条件: 四种脱氧核苷酸 Mg2+能激活真核细胞和细菌的DNA聚合酶 （1）利用PCR获取和扩增目的基因 缓冲液作用：调节反应液至合适的pH 一、目的基因的筛选与获取——利用PCR获取和扩增目的基因 变性:当温度超过90℃时，双链DNA解聚为单链。 延伸:当温度上升到72℃左右时，溶液中的4种脱氧核苷酸在耐高温的DNA聚合酶的作用下，根据碱基互补配对原则合成新的DNA链。 PCR过程： 延伸阶段选用72℃而非90℃原因： ①防止DNA变性；②保持耐高温的DNA聚合酶的活性 复性温度与什么有关： ①引物长度（引物越长，复性温度高） ②引物中GC含量（GC含量越高，复性温度越高） 复性:当温度下降到50℃左右时，两种引物通过碱基互补配对与两条单链结合。 上一次循环的产物为下一次循环的模板，完成扩增后，常采用琼脂糖凝胶电泳来鉴定PCR的产物。 关键点拨 PCR扩增目的基因时，复性温度的设定是成败的关键。 复性温度过高会破坏引物与模板的碱基配对，复性温度过低又会造成引物不能与DNA模板链的特定部位结合。 复性温度的设定与___________、__________有关，假设引物的长度相同，在G、C含量高时，设定的复性温度要____一些。因为DNA分子中G—C之间有____个氢键，A—T之间有____个氢键。 引物长度 G、C含量 两 三 高 若引物长度过短，则 引物与模板链结合的特异性较差 (1)在PCR技术扩增目的基因时 （需要/不需要）解旋酶，原因是 。 (2)利用PCR技术扩增目的基因前，需根据目的基因的核苷酸序列设计 种引物，进行PCR时需加热至90∽95度然后冷却至50度左右，此操作的目的是_____________________________________________。 【典例2】如图为PCR技术扩增图解，请回答下列问题 不需要 PCR过程中是通过高温使DNA双链解聚为单链的，而不是用解旋酶 两 ①90∽95度高温使DNA解聚为单链； ②冷却至50度左右使两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合 鱼票月半出品，必是精品 1.DNA片段扩增原理: 5’- -3’ 3’- -5’ 3’- -5’ 5’- -3’ 5’- -3’ -5’ 5’- 3’- -5’ 5’- -3’ -5’ 5’- 3’- -5’ 3’- -3’ 高温 变性 延伸 复性 低温 中温 1次循环 ①PCR利用了DNA的_______原理，通过_________来控制DNA双链的解聚与结合，PCR仪实质上就是一台能够_____________的仪器，一次PCR一般要经历___次循环； 热变性 调节温度 自动调控温度 30 ②PCR扩增DNA片段还利用了______________的原理； DNA半保留复制 探究实践 DNA片段的扩增及电泳鉴定P84 PCR→PCR产物→电泳 2.DNA片段电泳鉴定的原理 ①DNA分子具有_____________，在一定的___下，这些基团可以带上正电荷或负电荷，在_____的作用下，这些________会向着________________的电极移动，这个过程就是_____； 可解离的基团 pH 电场 带电分子 电泳 与它所带电荷相反 ②PCR的产物一般通过_______________来鉴定； ③在凝胶中DNA分子的迁移速率与___________、______________和_____等有关 ④凝胶中的DNA分子通过_____，可以在波长为______的______下被检测出来。 琼脂糖凝胶电泳 凝胶的浓度 染色 300nm 紫外灯 DNA分子的大小 构象 1）DNA分子中的磷酸基团能解离出氢离子，剩下的部分（DNA的磷酸残基）带负电荷，因此电泳时DNA分子可从负极向正极迁移 2）在同一浓度的凝胶中，DNA分子量越大，迁移速率越慢。 加样孔 大DNA片段 小DNA片段 可以在紫外灯下直接观察到DNA条带的分布及粗细程度来评价扩增的结果。进行电泳鉴定的结果应该是一条条带，该片段大小约为750bp。 结果分析 电泳条带的宽度、亮度与DNA含量呈正相关 如果电泳鉴定的结果不止一条条带，请分析产生这个结果的可能原因。 ①引物特异性不强或形成引物二聚体; ②复性时退火温度过低;③DNA聚合酶的质量不好 结果分析 出现非特异性扩增带的原因： ①模板DNA出现_____。 ②引物特异性不强或形成引物二聚体。 ③Mg2＋浓度_____。 ④复性时的温度_____。 污染 过高 过低 （引物和模板不完全配对） 未出现扩增条带的原因： ①TaqDNA聚合酶失活。 ②引物出现质量问题。 ③Mg2＋浓度过低。 ④变性时的温度低，变性时间短。 第一次扩增 注意： 1.引物结合在目的基因的3’端 2.子链的延伸方向是5 ′→3 ′ 第二次扩增 第三次扩增 1.在第几轮循环产物中开始出现两条脱氧核苷酸链等长的DNA片段？比例是多少？ 第3轮；1/4 2.PCR扩增的是完整的模板DNA分子吗？ 不是，PCR扩增的仅仅是两种引物之间所对应的特定DNA片段。 第三次循环后 目的基因 1、复制三次后，含引物的DNA分子数是 。 2、复制三次后，含其中一种引物的DNA分子数是 。 3、复制三次后同时含两种引物的DNA分子数是 。 4、复制三次后，共消耗引物的对数是 。 5、只有目的基因（2条等长脱氧核苷酸链）的DNA分子数是 。 8 7 6 2 7 含母链的两个DNA分子只含一个引物，其它子代DNA分子都含两个引物 每个DNA都含引物 2n 2n－1 2n－2 即新增DNA数：2n－1 2n－2n 75 PCR中的数量关系 复制次数 1 2 3 n DNA分子数 含引物的DNA分子数 含其中一种引物的DNA分子数 同时含两种引物的DNA分子数 共消耗引物的对数 含等长脱氧核苷酸链的DNA分子数 2 4 8 2n 2 4 8 2n 1＝21－1 3＝22－1 7＝23－1 2n－1 0＝21－2 2＝22－2 6＝23－2 2n－2 1＝21－1 3＝22－1 7＝23－1 2n－1 0＝21－2 0＝22－4 2＝23－6 2n－2n 76 Q1:1个模板DNA分子经过n轮PCR，以_____方式扩增，可以扩增出__个DNA片段，共需要引物数量为 个。　　　　 指数 2n 2n＋1－2 Q2：用PCR可以扩增mRNA吗？ 不可以直接扩增mRNA，需要将它逆转录成DNA再进行扩增。 【归纳总结】 Q3：若一个DNA分子利用PCR扩增n次后，产生的2n个DNA分子，其中有 个DNA分子只含有一个引物， 个DNA分子中每个DNA分子都含有两种引物。 2 2n-2 Q4：第 轮循环产物中开始出现两条脱氧核苷酸链等长的DNA片段，占所得DNA分子的比例为 。 3 1/4 两条链等长的DNA分子数：2n－2n 两条链等长的DNA分子所占比例：1-（n/2n-1） 2n－1 对 鱼票月半出品，必是精品 5.在DNA聚合酶的作用下，两条子链的延伸方向都是 。DNA聚合酶只能特异地复制处于　　 之间的DNA序列，若这个过程中消耗了引物62个,则进行了 轮的DNA复制。 6.目的基因能被准确扩增的原因是 。 两个引物 从子链的5′端向3′端延伸 5 目的基因独特的双螺旋结构提供了精确的复制模板；碱基互补配对原则保证复制准确的进行  2n＋1－2=62 7.PCR技术的必需条件，除了模板、原料、酶之外，至少还有三个条件，即液体环境、适宜的__________和_________，前者由________ 自动调控，后者则靠___________来维持。 温度 PH值 PCR扩增仪 缓冲液 鱼票月半出品，必是精品 8.从理论上讲，在PCR技术中，循环4次产生的DNA分子中，第四次循环产物中含有引物A的DNA片段所占的比例为 。 9.假设DNA片段有150个脱氧核苷酸对，若DNA分子中胞嘧啶脱氧核苷酸有70个，则5次循环，需要胸腺嘧啶脱氧核苷酸 个（不考虑引物所对应的片段） 10.假设DNA片段有200个脱氧核苷酸对，经3次扩增后，从理论上计算，除需要引物14个外（注：每个引物中含有20个脱氧核苷酸），还需要游离的脱氧核苷酸 个。 15/16 2480 2520 新增加的DNA分子数：2n-1 (2n-1)400 - 20×14 只有1个含母链的DNA分子不含引物A 1个DNA分子中有80个T (2n-1)T 游离脱氧核苷酸数=新增DNA中脱氧核苷酸数-引物中已有的脱氧核苷酸数 鱼票月半出品，必是精品 现学现用： 若想获得以下已知序列的DNA片段，设计了一些PCR引物，应选用的PCR引物是______(从引物①②③④中选) DNA序列(虚线处省略了部分核苷酸序列) 已知序列 PCR引物 ①5′AACTATGCGCTCATGA3′ ②5′GCAATGCGTAGCCTCT3′ ③5′AGAGGCTACGCATTGC3′ ④5′TCATGAGCGCATAGTT3′ ①③ 鱼票月半出品，必是精品 大本P341 若如表所列为已知的DNA序列和设计的一些PCR引物，步骤Ⅲ选用的PCR引物必须是________(从引物①②③④中选择，填编号)。   DNA序列(虚线处省略了部分核苷酸序列) 已知序列   PCR引物 ①5′－AACTATGCGCTCATGA－3′ ②5′－GCAATGCGTAGCCTCT－3′ ③5′－AGAGGCTACGCATTGC－3′ ④5′－TCATGAGCGCATAGTT－3′ ②④ 3’ 5’ 3’ 5’ ④ ② 采用PCR技术获取和扩增EPSPS基因时，所需要的两种引物序列分别为：(注意标明5'和3'端） 1. EPSPS基因某条链的末端序列如下图： 5'-CTTGGATGAT-3' 5'-TCTGTTGAAT-3' 3’ 5’ 5’ 3’ 与已知序列互补 与已知序列相同 3’ 5’ 3’ 5’ 2. 如图，为保证双功能醇醛脱氢酶基因(Adh)能通过双酶切以正确方向插入质粒，需设计引物1和引物2，其中引物1的序列为 5'-　　　　　 　　　　　　-3' GGTACCGTACCTTTGT EcoRⅠ会破坏标记基因（红霉素抗性基因），应该选用XbaⅠ、KpnⅠ对目的基因和质粒进行切割（双酶切）。 引物1的5‘端应携带KpnⅠ的识别序列GGTACC，故引物1的碱基序列为5’GGTACCGTACCTTTGT3’。 目的基因的转录方向要与基因表达载体的转录方向相同 3.荧光定量PCR是一种在PCR反应体系中加入荧光标记的探针，利用荧光信号的积累，对整个PCR进程进行检测，最后对PCR产物扩增量进行定量分析技术。作用原理如图所示： 1）据图分析，TaqDNA聚合酶的 作用有：_ __（答两点） 2）带荧光标记的探针，其_______端带有荧光物质，在延伸阶段，通过检测反应体系中的____________，可以达到检测PCR产物扩增量的目的。 催化DNA的合成（子链延伸） 分解与模板杂交的荧光探针 5' 荧光强度 3）若运用该技术检测COVID-19（新冠病毒）的核酸，图中所示模板DNA来源于__________________________________________________。 以COVID-19的RNA为模板逆转录合成DNA 鱼票月半出品，必是精品 思考：如果直接将目的基因导入受体细胞，目的基因能稳定存在吗？如果不能，如何避免该结果的发生呢？ 游离的DNA片段在受体细胞中不能稳定存在 构建基因表达载体（核心工作） 构建基因表达载体的目的： （1）使目的基因在受体细胞中稳定存在，且可以遗传给下一代； （2）使目的基因能够在受体细胞中表达和发挥作用。 目的基因 启动子 终止子 标记基因 复制原点 基因表达载体的组成： 相同点： 不同点： 二者都有标记基因和复制原点两部分DNA片段。 表达载体在载体基础上增加了目的基因、启动子、终止子三部分结构。 辨析：载体≠表达载体 鱼票月半出品，必是精品 二、基因表达载体的构建 2 组成 作用： 便于重组DNA分子的筛选 本质： 位置： 功能： 基因的下游 终止转录 本质： 位置： 功能： RNA聚合酶识别和结合的部位，驱动基因转录出mRNA。 基因的上游 注意：目的基因必须插入到 与 之间。 启动子 终止子 （DNA复制的起始位点） 一段有特殊结构的DNA片段 一段有特殊结构的DNA片段 启动子和终止子能协助目的基因的表达 抗生素抗性基因或荧光蛋白基因等 二、基因表达载体的构建 ②通过cDNA文库获得的目的基因没有启动子，因此只将编码序列导入受体生物中无法转录。 ③为了满足应用需要，会在载体中构建诱导型启动子，当诱导物存在时，可以激活或抑制目的基因的表达。 ④为了增强目的基因的表达水平，还可以增加一些其他调控元件，如增强子等。 ①启动子具有物种和组织特异性，即只有使用受体自身基因的启动子才能比较有利于基因的表达。如：构建在水稻胚乳细胞内表达的基因表达载体需要选择的启动子是 。 水稻胚乳细胞启动子 辨析：“启动子与终止子”和“起始密码子与终止密码子” 启动子与终止子 起始密码子与终止密码子 起始密码子 终止密码子 本质：DNA片段（位于DNA分子中） 作用：起始和终止转录过程。 启动子是RNA聚合酶结合部位 本质：mRNA分子中的3个相邻碱基 作用：起始和终止翻译过程。 起始密码子是核糖体结合部位 同种限制酶或同尾酶 使用两种限制酶同时切割目的基因/质粒，有何优点? 。 可防止目的基因和质粒自身环化以及目的基因与运载体的反向连接 二.基因表达载体的构建 3.过程 鱼票月半出品，必是精品 【变式训练1】以下关于基因表达载体的构建的说法正确的是(　　) A.基因表达载体的构建是在生物体的细胞内完成的 B.基因表达载体中只有启动子才能驱动目的基因转录出mRNA C.基因表达载体的组成应包括启动子、终止密码子、目的基因、标记基因等 D.基因表达载体通常采用抗生素合成基因作为标记基因 B 体外 终止子 抗生素抗性基因 解析　基因表达载体的构建是在生物体外完成的，A错误；基因表达载体的组成应包括启动子、终止子、目的基因、标记基因等，终止密码子位于mRNA上，C错误；基因表达载体通常采用抗生素抗性基因作为标记基因，D错误。 91 2.为制备目的基因Y（下图）与质粒X的重组DNA，将质粒X与含Y的DNA片段加入含有限制性核酸内切酶BgIⅡ与BamHⅠ的反应混合物中，酶切后的片段再加入含有DNA连接酶的反应体系中。其中，质粒X含有leu2基因，可用于合成亮氨酸，目的基因Y含有卡那霉素抗性基因KanR 要筛选含有重组质粒的细胞，应选择 的培养基。 含卡那霉素但不含亮氨酸的培养基 鱼票月半出品，必是精品 3.用限制酶HindⅢ，BamH I和二者的混合物分别降解一个4kb（1kb即1千个碱基对）大小的线性DNA分子，降解产物分别进行凝胶电泳，在电场的作用下，降解产物分开，如图所示. 据此分析，这两种限制酶在该DNA分子上的限制位点数目是以下哪一组？（　　） A. HindⅢ1个，BamHⅠ2个 B. HindⅢ2个，BamHⅠ3个 C. HindⅢ2个，BamHⅠ1个 D. HindⅢ和BamHⅠ各有2个 A  HindⅢ 将DNA切割为2段（2.8kb和1.2kb），故限制酶 HindⅢ有一个切点; BamHⅠ 将DNA切割为3段（1.8kb、1.3kb、0.9kb），表明BamHⅠ 有2个切点 4．图甲、乙中的箭头表示三种限制性内切核酸酶的酶切位点，Amp R表示氨苄青霉素抗性基因，neo表示新霉素抗性基因。下列叙述错误的是 (　 　) A．在构建重组质粒时，可用PstⅠ和HindⅢ切割质粒和外源DNA B．在酶切过程中，不能将质粒中的全部标记基因破坏 C．若只用PstⅠ处理质粒和外源DNA分子片段，无法避免自身环化和反向连接 D．导入重组质粒的大肠杆菌可以在含氨苄青霉素的培养基中生长 D 构建重组质粒时，需要选择相同的限制酶或同尾酶切割外源基因和质粒，图中质粒和外源基因中相同的限制酶是PstⅠ和HindⅢ，它们不会破坏目的基因，并且质粒上能够保留一个完整的标记基因 Amp R被破坏 步骤: 在植物受粉后，花粉形成的花粉管还未愈合前，剪去柱头，滴加DNA(含目的基因)，使目的基因借助 进入受体细胞。 花粉管通道 03 ② ①用微量注射器将________________________直接注入子房中。 含目的基因的DNA溶液 （1）将目的基因导入植物细胞--花粉管通道法 受体细胞： 受精卵 三.将目的基因导入受体细胞 农杆菌是一种在土壤中生活的微生物，它能在自然条件下侵染大多数双子叶植物和裸子植物的受伤部位，并诱导产生冠瘿瘤等。 （1）将目的基因导入植物细胞 ——农杆菌转化法 03 1.转化 此处“转化”与肺炎链球菌转化实验中的“转化”含义相同，实质都是基因重组。 指目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程。 ①农杆菌特点： a.能在自然条件下侵染_____________和___________，而对大多数____________没有侵染能力。 双子叶植物 裸子植物 单子叶植物 b.农杆菌细胞内含有______，当它侵染植物细胞后，能将______上的______（____________）转移到被侵染的细胞，并且将其________________________ Ti质粒 Ti质粒 T-DNA 可转移的DNA 整合到受体细胞的染色体DNA上 将目的基因插入__________________中，通过农杆菌的________作用，就可以使目的基因__________________并整合到受体细胞的染色体DNA上，使目的基因能够维持稳定和表达。 ②利用农杆菌进行转化的思路： Ti质粒的T-DNA 转化 进入植物细胞 （1）将目的基因导入植物细胞--农杆菌转化法 03 97 构建基因表 达载体 含目的基因的重组Ti质粒 表现出新性状的植株 导入植物 细胞 植物细胞 将目的基因插入染色体DNA中 目的基因 Ti质粒 T-DNA 含重组Ti质粒的农杆菌 转入农杆菌 ③转化过程 Ti质粒 目的基因 构建 基因表达载体 转入 农杆菌 导入 T-DNA携带目的基因插入植物细胞染色体DNA中 植物组织培养 转基因植株 植物组织培养 （1）将目的基因导入植物细胞--农杆菌转化法 03 将目的基因导入受体细胞 得到含有目的基因的植物细胞后进行植物组织培养 该过程经过____次拼接、____次导入？ (1)第一次拼接 ______________________________________________________________________ (2)第二次拼接 ______________________________________________________________________ (3)第一次导入 _____________________________________________________________________ (4)第二次导入 ____________________________________________________________________ 将目的基因拼接到Ti质粒的T-DNA上 被插入目的基因的T-DNA拼接到受体细胞染色体的DNA上（非人工操作） 两 两 将含目的基因的重组Ti质粒重新导入农杆菌 含目的基因的T-DNA导入受体细胞（非人工操作） 03 将目的基因导入受体细胞 据图回答问题： 03 将目的基因导入受体细胞 拼接：将2个DNA片段连接起来。 导入：将重组质粒或目的基因导入细胞。 (5)用农杆菌感染时，优先选择 （受伤的/完好的）叶片与重组质粒的农杆菌培养，选用该叶片的理由是 。 受伤的 叶片伤口处的细胞可释放大量的酚类物质，可吸引农杆菌 (6)若要利用农杆菌转化法转化单子叶植物细胞，可采取添加 ，其目的是 ______________________________ 。 (7)利用Ti质粒构建重组质粒的目的是： 。 酚类物质 吸引农杆菌移向受体细胞，有利于目的基因成功转化 将目的基因插入到Ti质粒上的T-DNA上，利用其将目的基因导入受体细胞并整合到受体细胞染色体DNA上，使目的基因能稳定存在并表达 03 将目的基因导入受体细胞 据图回答问题： 随着转化方法的突破，农杆菌侵染水稻、玉米等多种单子叶植物也取得了成功。 ④转化的具体方法： a.可以将新鲜的从叶片上取下的圆形小片__________________，然后________________，并_____________。 受体细胞为_______ 与农杆菌共培养 筛选转化细胞 再生成植株 体细胞 b.可以将_______直接浸没在___________________中一段时间，然后培养植株并获得_______，再进行________、_________等。 受体细胞为_______ 花序 含有农杆菌的溶液 种子 筛选 鉴定 受精卵 （1）将目的基因导入植物细胞--农杆菌转化法 03 将目的基因导入受体细胞 2.受体细胞的选择 (1)对于植物来说，受体细胞可以是受精卵或体细胞，因为植物细胞具有全能性。 (2)对于动物来说，受体细胞一般是受精卵，因为： (3)在生产需要加工和分泌的蛋白质时，受体细胞选大肠杆菌还是酵母菌更适宜？ 核心归纳 受精卵的全能性高，而高度分化的动物体细胞的全能性受到抑制。 选酵母菌。大肠杆菌为原核细胞无内质网和高尔基体，无法加工和运输蛋白质；而酵母菌作为真核细胞具有内质网、高尔基体，能对蛋白质进行加工和运输。 ①受体细胞： 原核细胞（常用大肠杆菌） 优点： 繁殖周期短 体积小易于培养操作 多为单细胞 遗传物质相对较少 （3）将目的基因导入微生物细胞——Ca2+处理法 使用Ca2+处理的目的： 增加细胞膜的通透性，使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态（感受态细胞）。 吸收 感受态细胞 03 （2）将目的基因导入动物细胞——显微注射法 将基因表达载体导入受体细胞后，如何判断导入是否成功？ 即使导入成功，如何判断目的基因是否可以正常表达？ 思考 （1）检测目的基因是否已经导入（检测DNA ） （2）检测目的基因是否已经转录（检测mRNA） （3）检测目的基因是否已经翻译（检测蛋白质） （4）检测目的基因是否已经发挥作用（检测个体是否获得某种特性） 04 目的基因的检测与鉴定 PCR技术 PCR技术 DNA-mRNA分子杂交 鱼票月半出品，必是精品 1.PCR在生物学实验中具有非常广泛的用途，下列不属于PCR的应用范畴的是(　　) A.扩增和筛选目的基因 B.检测目的基因是否导入受体细胞 C.检测目的基因是否转录出mRNA D.检测目的基因是否翻译出蛋白质 D ③检测目的基因是否翻译（表达出目的蛋白） 从转基因生物提取出蛋白质和相应的抗体进行杂交，如果出现抗原-抗体杂交带，说明目的基因已经翻译。 抗体 标记抗体 提取蛋白质 抗原 抗体 杂交 04 目的基因的检测与鉴定 ——通过抗原-抗体杂交 转基因生物 鉴定方法 成功标志 抗虫植物 抗病毒（菌）植物 抗盐植物 抗除草剂植物 获取目的基因产物的转基因生物 饲喂害虫（害虫接种实验） 害虫死亡 病毒（菌）接种实验 未染病 盐水浇灌 正常生长 喷洒除草剂 正常生长 提取细胞产物与天然产品进行功能、活性比较 功能、活性正常 抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等----个体生物学水平的鉴定 04 目的基因的检测与鉴定 (1)花粉管通道法是我国科学家独创的一种方法，主要适用于双子叶植物和裸子植物。( ) (2)培育转基因动物时，常选择受精卵作为受体细胞，利用显微注射法将目的基因直接注入受精卵中。( ) (3)可以通过盐碱地栽培试验从细胞水平上检测转基因抗盐碱作物是否具有抗盐碱的特性以及抗盐碱的程度。( ) × × × 【基础过关】 （农杆菌转化法） 个体生物学水平 需构建基因表达载体 一、真核细胞的基因结构 编码区 非编码区 非编码区 内含子 外显子 启动子 终止子 编码区上游 编码区下游 编码区： 间隔的、不连续的 有外显子、内含子之分 间隔的、不连续的 外显子： 内含子： 能转录相应的mRNA，进一步能编码蛋白质的DNA序列 能转录相应的mRNA，但却不能编码蛋白质的DNA序列 【补充】基因的结构 真核细胞中：不能编码蛋白质的序列=内含子+非编码区序列 编码序列=外显子 转录 前体mRNA 成熟mRNA 非编码区 非编码区 编码区 与RNA聚合酶结合位点 外显子 内含子 1 2 3 4 5 启动子 终止子 剪切、拼接 不完全相同 原因：基因的选择性表达。 【思考】同一个体不同体细胞中DNA转录的起点是否相同 （选“相同/不相同/不完全相同”）？ 为什么？ 【补充】基因的结构 二、原核细胞的基因结构 非编码区 非编码区 编码区 编码区上游 编码区下游 启动子 终止子 连续的、不间隔的 非编码区： 含有能调控遗传信息表达的DNA序列，如启动子、终止子 获取目的基因一般获取哪一部分的DNA片段？ 基因编码区 成熟mRNA 相应酶去除内含子 转录 翻译 真核基因：编码区（外显子+内含子） 多肽链 前体mRNA 蛋白质 加工 如果把一个真核生物的基因导入原核细胞中表达，一定会产生原来的蛋白质吗？ 提示：一般不能产生原来的蛋白质 原因： ①原核生物细胞里没有相应的酶来去除内含子； ②原核生物没有蛋白质加工系统（如内质网、高尔基体等） 03 将目的基因导入受体细胞 DNA的粗提取与鉴定 一、实验原理： 1．提取DNA的原理 2．鉴定DNA的原理 利用DNA与RNA、蛋白质和脂质等在物理和化学性质方面的差异，提取DNA，去除其他成分。 如：(1)DNA不溶于酒精，但某些蛋白质溶于酒精。 (2)DNA在不同浓度的NaCl溶液中的溶解度不同，它能溶于2mol/L的NaCl溶液。 在一定温度下（沸水浴），DNA遇二苯胺试剂会呈现蓝色。 不是只能溶于2 mol/L的NaCl溶液中 DNA含量相对较高的生物组织，如新鲜洋葱、香蕉、菠菜、菜花和猪肝等 不能选择哺乳动物成熟的红细胞，因为哺乳动物成熟的红细胞中没有细胞核和线粒体，几乎不含DNA 二、材料用具 1.选材： 注意： 2.试剂： ①研磨液 ②体积分数为95%的酒精 ③2mol/L 的NaCl溶液 ④二苯胺试剂 ⑤蒸馏水 析出DNA，初步分离DNA与蛋白质 溶解DNA，过滤后，DNA在滤液中 鉴定DNA，要现配现用，否则二苯胺变成浅蓝色，影响鉴定效果 含有NaCl、洗涤剂 （猪肝与猪血不同） 1.取材、研磨： 称取30g洋葱，切碎，然后放入研钵中，倒入10mL 研磨液，充分研磨 研磨的目的： 破碎细胞，使细胞内的DNA释放出来，并溶解于研磨液中 三、方法步骤： 1.加入洗涤剂的目的是 溶解细胞膜、核膜，释放出DNA。 2.加入食盐的目的是 使 DNA 分子溶解于浓 NaCI 溶液中。 （了解即可）研磨液的成分：洗涤剂和食盐 利用动物细胞提取DNA破碎细胞的方法：动物细胞无细胞壁，可直接吸水涨破。 2.过滤或离心，取上清液： （方案一）在漏斗中垫上纱布，将洋葱研磨液过滤到烧杯中，在4℃冰箱中放置几分钟后，再取上清液。 （方案二）也可直接将研磨液倒入塑料离心管中，1500r/min的转速下离心5min，再取上清液放入烧杯中。 上清液中除DNA之外，可能含有哪些杂质？ 可能含有核蛋白、多糖等杂质 三、方法步骤： ①低温可抑制核酸水解酶的活性，进而抑制 DNA 降解； ②抑制DNA分子运动，使其易形成沉淀析出 ③低温有利于增加DNA的柔韧性，减少其断裂 在4℃冰箱中放置几分钟： 注意：过滤时不能用滤纸，因为DNA会被吸附在滤纸上 3.预冷酒精析出DNA或离心收集沉淀中的DNA （方案一）在上清液中加入体积相等的、预冷的酒精溶液(体积分数为95%)，静置2-3min，溶液中出现的白色丝状物就是粗提取的DNA。用玻璃棒沿一个方向搅拌，卷起丝状物，并用滤纸吸去上面的水分； （方案二）或将溶液倒入塑料离心管中，在10000r/min的转速下离心5min，弃上清液，将管底的沉淀物(粗提取的DNA)晾干。 搅拌时应轻缓、并沿一个方向： 减少DNA分子断裂，以便获得较完整的DNA分子 ①低温可抑制核酸水解酶的活性，进而抑制 DNA 降解； ②低温抑制分子运动，使 DNA 易形成沉淀析出； ③低温有利于增加 DNA 分子的柔韧性，减少其断裂。 为什么用预冷酒精： 试管编号 A（对照组） B（实验组） 步骤1 加入2 mol/L的NaCl溶液5mL 步骤2 不进行任何处理 步骤3 加入4mL二苯胺试剂，混匀 步骤4 沸水浴5 min 实验现象 溶液不变蓝色 实验结论 DNA的鉴定 DNA鉴定的结果 4.NaCl溶液溶解DNA并鉴定 加丝状物或沉淀物 溶液逐渐变为蓝色 DNA在沸水浴的情况下遇二苯胺会呈现蓝色 ——看提取物颜色 ——看与二苯胺反应颜色的深浅 DNA纯度 DNA的量 不是出现蓝色沉淀 结果分析与评价 观察提取的DNA的颜色，如果不是白色丝状物，说明DNA中的杂质较多。 二苯胺试剂鉴定呈现蓝色说明实验基本成功；如果不呈现蓝色，可能的原因： 研磨不充分，材料中的核物质没有充分释放出来，所提取的DNA含量低 (1)DNA不溶于酒精，但一些蛋白质溶于酒精，可利用这一原理初步分离DNA与蛋白质。( ) (2)研磨之后，通过过滤或离心，DNA会保留在沉淀物中。( ) 解析：研磨之后，通过过滤或离心，DNA会保留在上清液中。 (3)DNA能与二苯胺试剂在常温下反应生成蓝色沉淀。( ) 解析： DNA能与二苯胺试剂在沸水浴下反应，使溶液呈现蓝色，而非蓝色沉淀。 √ × × 【基础过关】 4.在“DNA的粗提取与鉴定”实验中，甲、乙、丙、丁四个小组除表中所列处理方法不同外，其他操作步骤均正确，但实验结果却不同。下列有关叙述不正确的是 组别 实验 材料 提取核物质时加入的溶液 去除杂质时加入的溶液 DNA鉴定时加入的试剂 甲 鸡血 蒸馏水 体积分数为95%的酒精(25 ℃) 二苯胺试剂 乙 菜花 蒸馏水 体积分数为95%的酒精(冷却) 双缩脲试剂 丙 猪血 蒸馏水 体积分数为95%的酒精(冷却) 二苯胺试剂 丁 鸡血 蒸馏水 体积分数为95%的酒精(冷却) 二苯胺试剂 A.实验材料选择错误的组别是丙 B.沸水浴后试管中溶液颜色变蓝的组别是甲、丁 C.甲组实验现象不明显的原因是25 ℃的酒精对DNA的凝集效果差 D.乙组实验不成功仅因为在鉴定时加入了双缩脲试剂 √ 不能选择哺乳动物成熟的红细胞，几乎不含DNA 植物细胞要研磨，动物细胞可直接吸水涨破 识别序列的特点 遵循碱基互补配对原则，无论是奇数个碱基还是偶数个碱基，都可以找到一条中心轴线，如图，中轴线两侧的双链DNA上的碱基反向对称重复排列，称为回文序列。如 以中心线为轴，两侧碱基互补对称； 以为轴，两侧碱基互补对称。 解析：一种限制酶能识别双链DNA分子中的特定核苷酸序列，并在特定位点上切割DNA分子，既可以切割目的基因又可以切割质粒，体现了酶的专一性，A错误；限制酶与DNA连接酶的作用部位相同，都是磷酸二酯键，C错误；限制酶主要从原核生物中提取，D错误。 3．下列有关基因工程中限制酶的描述，正确的是(　 　) A．同种限制酶既可以切割目的基因又可以切割质粒，因此不具备专一性 B．限制酶只能识别和切割DNA，不能识别RNA C．限制酶与DNA连接酶的作用部位不相同 D．限制酶只能从原核生物中提取 B 解析：细菌质粒是环状DNA分子，和真核细胞DNA的基本组成单位相同，都是脱氧核苷酸，A错误；细菌质粒的复制过程可在受体细胞内进行，B错误；细胞中蛋白质合成的场所是核糖体，C错误；质粒是一种裸露的、结构简单、独立于真核细胞细胞核或原核细胞拟核DNA之外，并具有自我复制能力的环状双链DNA分子，D正确。 5．下列关于质粒的叙述，正确的是(　 　) A．细菌质粒和真核细胞DNA的基本组成单位不同 B．细菌质粒的复制过程一定是在受体细胞外独立进行的 C．质粒是存在于所有细胞中的蛋白质合成的场所 D．质粒是细胞质中能够自我复制的环状双链DNA分子 D Lavf58.29.100 Bilibili VXCode Swarm Transcoder v0.3.75 $$