专题11 基因工程（北京专用）-【好题汇编】2025年高考生物二模试题分类汇编

专题11基因工程 考点概览 考点01基因工程的基本工具和操作程序 考点02基因工程综合 基因工程的基本工具和操作程序考点01 1、（2025北京东城二模）T1是小鼠胚胎存活的关键基因，T1基因被切割后会导致功能丧失。研究者构建如表中的3种转基因小鼠。下列相关叙述不合理的是（    ） 雌鼠甲（转基因纯合子） 雄鼠乙 雄鼠丙 转入基因的位置 常染色体 X染色体 Y染色体 转入的基因及功能 基因A：转录出的RNA特异性结合T1基因，引导C蛋白切割T1基因 基因C：表达C蛋白，在A基因RNA的引导下，切割T1基因 A．可利用显微注射将目的基因导入受精卵，获得转基因小鼠 B．将甲与乙杂交，子代雌鼠胚胎因T1功能缺失而未能存活 C．将甲与丙杂交，获得F1与野生型交配，F2只有雌鼠存活 D．该技术可实现精准控制性别，节省养殖资源和人力成本 2、（2025北京东城二模）天然β-淀粉酶耐热性较差，难以满足工业化生产需求。通过PCR对天然β-淀粉酶基因进行改造，将其导入大肠杆菌表达后，获得了一种耐高温的β-淀粉酶。与天然酶相比，改造后的酶在第476位发生了氨基酸替换，由天冬氨酸改变为天冬酰胺。下列叙述错误的是（    ） A．天冬酰胺与天冬氨酸的R基不同，该替换导致酶的空间结构改变 B．根据新的氨基酸序列可逆推出唯一对应的基因编码序列 C．PCR技术在此过程中实现了对β-淀粉酶基因的定点突变 D．这种通过设计并合成新蛋白质的技术属于蛋白质工程 3、（2025北京西城二模）根的向地性与生长素（IAA）分布不均有关。对IAA敏感的启动子与绿色荧光蛋白基因形成的融合基因在根中表达情况如图，下列叙述错误的是（　　）    A．根的向地性利于植物吸收水分和无机盐 B．横放的根近地侧细胞生长速度大于远地侧细胞 C．可用农杆菌转化法将融合基因导入植物细胞中 D．绿色荧光的位置和强度代表IAA的分布和浓度 4、（2025北京西城二模）下列高中生物学实验过程中不需要加热的是（　　） A．用斐林试剂检测白梨汁中的还原性糖 B．观察黑藻叶片细胞的质壁分离及复原 C．用二苯胺试剂鉴定粗提取的DNA D．DNA片段的扩增（PCR）及电泳鉴定 5、（2025北京海淀二模）高温导致番茄叶片运输到果实的蔗糖难以转化为单糖，果实糖度降低。为解决该问题，研究者将一个热响应元件序列插入蔗糖转化酶基因（CN）的启动子中，培育环境智能型作物。下列关于热响应元件的叙述，错误的是（　　） A．导致番茄CN发生基因突变 B．抑制RNA聚合酶与CN的启动子结合 C．促进高温条件下CN的转录 D．提高高温环境下番茄果实的糖度 6、（2025北京海淀二模）高中生物实验中，下列利用酒精进行的实验操作与目的不符的是（　　） A．观察花生子叶脂肪颗粒——洗去多余的苏丹Ⅲ染液 B．观察洋葱根尖有丝分裂——用于配制解离液使组织细胞分离开来 C．DNA的粗提取与鉴定——用于溶解DNA以除去杂质 D．培养菊花茎段愈伤组织——避免愈伤组织受到杂菌污染 7、（2025北京海淀二模）为合成出局部为双链的RNA用于沉默特定基因，先将目的基因X从重组质粒pHIBS切割出来，再巧妙地连接到质粒载体pUAST中，如下图，其中质粒只展示了局部。 下列叙述正确的是（　　） A．该操作过程中还需要DNA连接酶和耐高温的DNA聚合酶 B．利用B和Bg、S和Xh黏性末端相同，实现基因X与pUAST连接 C．基因X的DNA片段需要完整保留启动子和终止子区域 D．可以用E和Bg，或者Xh和K双酶切重组pUAST 8、（2025北京顺义二模）转基因抗虫棉的Bt蛋白在细胞质积累，可能与内源蛋白相互作用，产生非期望效应。C蛋白能结合纤维素，科研人员将C基因与Bt基因连接构建融合基因（如图）导入棉花细胞。相关叙述正确的是（    ） A．使用DNA聚合酶催化C基因和Bt基因连接 B．选择引物2和4进行PCR以确定基因正确连接 C．可通过花粉管通道法将融合基因导入棉花细胞 D．融合基因表达可促进Bt蛋白在细胞膜定向积累 9、（2025北京朝阳二模）下列高中生物学实验中，无法使用光学显微镜观察到实验现象的是（　　） A．观察洋葱鳞片叶外表皮细胞的质壁分离与复原 B．观察花生子叶中被染成橘黄色的脂肪颗粒 C．观察经粗提取后的DNA的双螺旋结构 D．观察蝗虫精母细胞减数分裂中染色体形态 10、（2025北京昌平二模）H18杂交瘤细胞能够产生抗人肝癌单克隆抗体，但该细胞在培养过程中的凋亡现象制约着其生产能力的提高。Bcl-XL是一种抗凋亡蛋白，利用Bcl-XL基因改造杂交瘤细胞，获得了稳定表达Bcl-XL的杂交瘤细胞。下列说法错误的是（　　） A．制备H18杂交瘤细胞利用了动物细胞融合技术 B．利用产生特定抗体的B细胞与瘤细胞制备H18杂交瘤细胞 C．将Bcl-XL基因直接注射至H18杂交瘤细胞可实现稳定表达 D．经筛选可获得既抗凋亡又能分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞 11、（2025北京昌平二模）下图为利用定点突变技术改造基因的过程示意图，相关叙述错误的是（　　） A．需要设计并合成一段含有突变碱基的DNA引物 B．该技术能够实现特异性地替换任何一个特定碱基 C．通过电泳检测产物大小，即可确认基因突变是否成功 D．利用上述技术能够改造蛋白质的结构和功能 12、（2025北京东城二模）我国科研人员培育出复粒水稻（CL），与普通单粒水稻（NCL）相比，具有多粒簇生的特点。 (1)油菜素内酯（BR）是一种植物激素，是参与调节水稻籽粒生长发育的有机物，作用具有 的特点。 (2)如图1所示，幼穗中分生组织将发育形成不同部位。研究人员检测了CL和NCL幼穗不同部位中BRD3（BR降解酶）的表达量。结果显示：与NCL相比，CL中 。    (3)研究人员利用图2质粒转录得到两种RNA探针，通过RNA杂交技术检测幼穗组织相关基因转录情况，具体步骤如下表，请将实验材料补充完整（填选项）。    步骤 实验组（探针序列与BRD3的mRNA互补） 对照组（探针序列与BRD3的mRNA相同） 使用限制酶将图2质粒切成线形 ① ② 使用RNA聚合酶转录得到RNA，制备带标记的探针 ③ ④ 取NCL和CL幼穗的组织，制作成临时装片 将探针加入处理好的装片中，结合探针的部位会产生显色反应 a.Nco I    b.Sal I    c.T7RNA聚合酶    d.SP6RNA聚合酶 2种水稻幼穗组织显色情况为 。 (4)蛋白GSK和MADS均为BR信号通路中的调控因子，在体外进行实验的处理和结果如图3，结果说明 。经过一系列的研究，科研人员阐明了水稻通过BR-GSK-MADS通路调控复粒性状。    (5)已有研究表明，BR缺陷水稻的籽粒通常会变小。请从基因选择性表达的角度解释“CL同时具有多粒簇生和籽粒不变小特点”的原因。 。 基因工程综合考点02 13、（2025北京东城二模）CRISPR-Cas9基因编辑技术与AAV病毒结合使用是目的基因靶向敲入的有效途径。 (1)gRNA和Cas9蛋白是CRISPR-Cas9系统的关键组成，如图1，gRNA根据 原则与靶序列特异性结合后，实现Cas9的定点切割。AAV是DNA病毒，在基因工程中作为 将目的基因导入受体细胞，其两端的ITR序列相同，是病毒复制和包装必需的。Cas9切割靶序列后，AAV基因组提供DNA修复的模板，从而实现目的基因的敲入。    (2)将图1中的CRISPR-Cas9相关DNA片段和AAV基因组导入人多能干细胞，一段时间后，分别提取DNA，同时加入图1所示的引物1、2、3进行扩增，结果如图2。 引物1和2扩增后检测到条带说明 。根据图2结果推测，同源染色体中只有一条染色体敲入了目的基因的组别是 。 (3)用图1中引物1和4对（2）提取的DNA进行扩增，结果如图3。为解释图3结果，研究人员检测了细胞中敲入目的基因的拷贝数，结果如图4。 ①图4中的B组结果对应图3中的 组。 ②在图4中找到S4组的对应结果，并据此解释图3中S4组无条带的原因。 。 (4)进一步研究发现，在某些组别中出现多个AAV基因组DNA通过ITR序列连续串联插入，这类细胞的比例高达39%。请对CRISPR-Cas9相关DNA片段进行改进，以降低AAV基因组DNA串联插入细胞的比例，方案是 。 14、（2025北京东城二模）癌症是人类健康的重大威胁之一，传统治疗手段难以实现精准治疗。超声波具有非侵入、组织穿透性强、时空特异性等特点，科研人员拟开发“响应超声波的药物递送系统”细菌以实现癌症的精准治疗。 (1)用于培养药物递送细菌的液体培养基中包含水、酵母提取物、蛋白胨等成分，其中蛋白胨主要为细菌提供 和维生素。可利用 的方法快速直观地测定细菌数量，以便即时使用适量的细菌进行治疗。 (2)C蛋白有抗肿瘤作用，超声波可导致局部温度升高到42℃。科研人员制备了工程菌1，其中含有图1所示的基因表达载体。37℃培养的工程菌1接受超声波刺激后，可升温至42℃， 从而发挥抗肿瘤作用。 (3)T蛋白有T1、T2和T3三种亚型，具有相似的功能，制备分别含有这三种基因的工程菌1，并检测C蛋白表达量，结果如图2所示。科研人员最终选择T3基因进行后续研究，判断的依据是 。 (4)工程菌1只能在超声波刺激期间发挥作用，科研人员设计了含图3所示的基因表达载体的工程菌2，可以实现在短时间的超声波刺激后维持长时间的治疗。已知B基因编码的B酶可以作用于识别位点a和b，使a、b处的DNA发生断裂，最终导致a、b之间的DNA片段发生倒转。请根据以上信息，使用下列选项将表达载体补充完整。 ； ； ； ； 。 ①P1启动子    ②P3启动子（持续表达型启动子） ③T3基因    ④C基因    ⑤B基因 15、（2025北京海淀二模）为监测、调控和利用细菌的葡萄糖代谢途径，优化目标产物的生产过程，研究者尝试通过基因工程技术构建生物传感器。 (1)将GFP（绿色荧光蛋白）基因作为报告基因，构建出基因表达载体（R），将其导入大肠杆菌时，应先用 处理大肠杆菌。 (2)PE基因编码的PE酶催化E蛋白磷酸化，磷酸化的E蛋白可转运葡萄糖进入大肠杆菌细胞，转运葡萄糖后E蛋白去磷酸化。M蛋白是一种转录抑制因子。R作为生物传感器，包括启动子（P）、GFP基因和PE基因等元件，工作过程如图1、图2。    ①据图1、图2可知，存在葡萄糖时，葡萄糖通过E蛋白转运进入细胞中后被磷酸化，推测M蛋白 ，PE表达产物可使E蛋白重新磷酸化。 ②在周围环境中葡萄糖存在状态不同时，R均可监测大肠杆菌的葡萄糖摄取状态，请阐释其工作原理 。 ③在含有葡萄糖的培养基中培养转入R的大肠杆菌，分别在不同培养时间检测 和荧光强度。若结果显示二者呈正相关，则可确定该生物传感器具有检测可靠性。 (3)在工业发酵生产色氨酸过程中，研究者利用R监测大肠杆菌对葡萄糖的摄取，发现菌体摄入的葡萄糖偏多，因为代谢过程中形成了一些副产品，导致生产成本偏高。已知大肠杆菌C基因编码的蛋白C可结合启动子Pc，促进RNA聚合酶也结合Pc；当胞内葡萄糖含量较高时，C蛋白无法结合Pec，Pc无法启动下游基因转录。研究者将R的启动子Р更换为启动子Pc，解决葡萄糖摄取偏多导致浪费的问题。请在表格中补充不同条件下，2个调控元件对R的精准调控过程。“+”表示相应蛋白结合、“-”表示相应蛋白脱离。 条件 Pc中c蛋白的结合序列 M蛋白的结合序列 无葡萄糖 + + 低浓度葡萄糖 ⅰ． ⅱ． 高浓度葡萄糖 ⅲ． ⅳ． 16、（2025北京海淀二模）大肠杆菌是基因工程中应用最广泛的受体细胞。研究者利用大肠杆菌开展转录起始和调控机制的研究。 (1)作为基因工程载体的质粒上一般含有启动子、 （至少填2个）等序列，其中启动子是RNA聚合酶识别和结合的部位。 (2)研究者利用大肠杆菌质粒进行体外单轮转录实验：用限制酶切割质粒，获得包含启动子序列的DNA模板，与足量RNA聚合酶混合并保温，使RNA聚合酶充分结合至启动子；依次加入足量的肝素（能与游离的RNA聚合酶结合，使其不能再结合启动子）和放射性标记的4种核糖核苷酸，一段时间后电泳检测转录产物，结果如图1。 ①电泳结果显示，除了正常长度的RNA外，转录还会产生 ，研究者称其为“无效转录物”。 ②对“无效转录物”的产生机制有两种假说： a．一个RNA聚合酶与启动子结合后，先反复转录出多个无效转录物，然后该聚合酶在DNA上延伸并只转录出一个正常长度的RNA，最后从DNA上脱离。 b．一个RNA聚合酶与启动子结合后，仅转录出一个RNA，该聚合酶就从DNA上脱离；转录出的RNA多数为无效转录物，少数为正常长度的RNA。 单轮转录实验中，若DNA模板的数目（m）、无效转录物的数目（p）、正常长度RNA的数目（q）之间存在数量关系 （用m、p、q表示），则支持假说a。 (3)阻遏蛋白R能与启动子附近下游序列结合，抑制转录。设计实验探究R的作用是抑制RNA聚合酶与启动子的结合，还是抑制RNA聚合酶在DNA上的延伸。 ①其中实验组的步骤如下。请将正确的试剂对应的字母填入横线上。 DNA模板与足量 混合并保温，再加入足量 混合并保温；依次加入足量的 和 反应一段时间，然后加入 再反应一段时间，电泳检测转录产物。 a．IPTG（使R脱离且不再与DNA结合） b．肝素 c．RNA聚合酶 d．放射性标记的4种核糖核苷酸 e．阻遏蛋白R ②电泳结果如图2，表明R 。 17、（2025北京顺义二模）学习以下材料，回答（1）～（4）题。 基因编辑技术的变革 CRISPR/Cas9系统是基因编辑技术的常用工具.由Cas9蛋白和人工设计的gRNA构成。gRNA嵌入Cas9的RNA结合区，形成稳定的RNA-蛋白复合体。gRNA可识别目标序列，引导Cas9切断DNA双链。这种情况下，细胞内原有的负责修复DNA切口的酶将“行动”起来，修复断裂的DNA（如图示）。 肝脏合成的蛋白T若发生错误折叠后，会聚集在心脏、神经等组织引发疾病。科学家研发了基于CRISPR/Cas9技术的基因治疗产品，命名为N-2001。该产品包含靶向T基因的gRNA和编码Cas9的mRNA，并由亲肝性脂质体包裹，注射到患者体内，取得一定治疗效果。但gRNA识别的序列短小，可能结合基因组中与目标序列相似的非目标序列，造成脱靶。 Cas9的两个结构域分别负责切割DNA双链中的一条，其中一个结构域失活得到nCas9，只能切割DNA中与gRNA结合的那条链。利用nCas9在目标序列的两条链上产生邻近切口，造成双链断裂，能有效减少脱靶效应。但Cas9和nCas9均是对DNA序列的直接改变，一旦发生错误难以纠正。 若使Cas9的两个结构域同时失活，则获得dCas9，dCas9虽然失去了切割DNA的能力，但仍可在gRNA的引导下定位到特定DNA序列上。以此为基础，我国科研人员通过改造获得“dCas9-Tet1”融合蛋白，将Tet1（去甲基化因子）精确地定位到抑癌基因的启动子区域，激活抑癌基因表达。研究表明，该疗法治疗的肺癌模型小鼠，抑癌基因的表达量显著升高，癌细胞增殖迁移能力均明显降低。dCas9基因编辑技术通过改变特定位点的DNA甲基化修饰，调控基因表达，为相关疾病的治疗提供了新思路。 (1)以含Cas9基因的重组质粒为模板，通过 技术扩增得到含Cas9基因的线性DNA片段，在体外转录出Cas9mRNA。 (2)由文中信息可知，N-2001输入到患者体内后，在无外源模板的情况下，其发挥作用的过程是:脂质体进入肝细胞后降解并释放Cas9mRNA→ → →T基因被Cas9剪切发生 →T蛋白含量降低。 (3)切割DNA双链时，nCas9比Cas9脱靶概率低的原因是 。 (4)DNMT是一种作用于基因启动子区域的DNA甲基化酶，通过研究确定了编码DNMT催化结构域的基因序列。请在N-2001基础上，设计一种基因编辑疗法的产品，实现对肝细胞内T基因表达的抑制 。    18、（2025北京朝阳二模）学习以下材料，回答（1）～（5）题。 小环大威力：ecDNA在癌症发生和进展中的作用 细胞中可能由于染色体断裂和重新连接，形成游离于染色体外的环状DNA分子，称为ecDNA。细胞周期中，ecDNA复制后随机分配给两个子细胞。 含原癌基因的ecDNA的产生概率极低，但临床调查发现约17.1%的癌症患者癌细胞中存在携带原癌基因的ecDNA。为构建与癌细胞中类似的ecDNA，研究者将两段含loxP位点和标记基因的外源DNA插入12号染色体，再用Cre酶处理．使染色体中的一个片段脱落并环化，形成含原癌基因MDM2的ecDNA（图1）。 处理后同时发出绿色和红色荧光的细胞即为含有/ecDNA的细胞，称为ec细胞。研究者对ec细胞进行传代培养，发现其后代中丢失绿色荧光的细胞比例逐渐增加。推测由于细胞分裂中ecDNA随机分配，产生不含ecDNA的子细胞，且这些子细胞在适宜环境中继续增殖；如果培养环境改变为ecDNA能为细胞带来更强适应能力的环境，则子代中ec细胞比例会增加，ec细胞中ecDNA的拷贝数也会增加。为检验假设，研究者将上述ec细胞分别放在含不同浓度潮霉素的培养基中培养，结果表明，潮霉素处理能够增加子代中ec细胞占比和ec细胞中ecDNA拷贝数。 为进一步研究ecDNA在体内的作用，研究者在小鼠肝细胞中诱导生成含有MDM2基因的ecDNA。小鼠肝脏中迅速出现癌细胞，形成肿瘤。 ecDNA的工程化构建为研究其致癌机制提供了新工具，未来有可能成为癌症精准治疗的靶点。 (1)eeDNA缺少着丝粒，因此复制后的ecDNA不能在 的作用下均分给两个子细胞。 (2)ecDNA的染色质状态更开放，其上的MDM2基因表达量 ，能促进细胞癌变和已癌变细胞的增殖。 (3)研究者进行外源DNA插入操作后，用含 的培养液筛选出成功插入的细胞。 (4)Cre酶可以将DNA上两个相同loxP位点之间的片段切割后环化（图2）。用Cre酶处理已插入片段1和片段2的12号染色体（图3），产生图1所示ecDNA。请写出片段2上各字母代表的表达元件。 (5)请根据潮霉素培养实验和小鼠肝细胞诱导实验推测携带原癌基因的ecDNA在癌细胞中广泛存在的原因 。 19、（2025北京朝阳二模）斑翅果蝇是农业害虫。我国研究者利用基因编辑技术培育带有雌性不育基因的斑翅果蝇，若将其释放到野外可降低野生斑翅果蝇种群数量。 (1)CRISPR/Cas9基因编辑系统中的gRNA与靶基因特异性结合，引导Cas9酶切断靶基因。断裂的DNA可能发生非同源末端连接修复，导致靶基因中发生碱基的 ，引起基因突变；也可能发生同源重组修复，导致靶基因被供体DNA中的片段替换（图1）。 (2)果蝇2号染色体上T基因控制合成一种信号物质，该物质由神经细胞分泌，是雌蝇产卵的必需信号，对雄蝇育性无影响。研究者制备图2所示供体DNA，将其与靶向T基因的gRNA和Cas9酶共同注入果蝇受精卵。继续培养后在低倍镜下挑选出 的成蝇，即为成功实现驱动片段替换的个体——G0。 (3)理论上，当细胞中1个T基因被驱动片段替换后，会表达靶向T基因的gRNA和Cas9酶，同时作为同源重组修复的模板，导致 ，使雌蝇不育。用G0雄蝇与野生型雌蝇杂交，F1雌蝇育性情况为 。 (4)有的G0果蝇受精卵中T基因发生末端连接修复，突变为t基因。t基因既不能正常表达，也不能被gRNA识别。用携带t基因的G0雄蝇与野生型雌蝇杂交，F1自由交配，若整个过程中没有t基因的新发产生，F2雌蝇中可育个体占比为 ，可见t基因对驱动片段在种群中的传播有抵抗作用。 (5)研究者对驱动片段进行改造，将其中编码gRNA的基因增加为3个，分别靶向T基因中不同的位点。请评价改造后的驱动片段的优点 。 20、（2025北京丰台二模）学习以下材料，回答（1）～（4）题。 利用基因工程酵母菌发酵获得高产柚皮素 柚皮素是一种脂溶性物质，广泛存在于柑橘类水果中，具有抗炎、抗氧化和抗肿瘤等药理作用，传统方法主要是从橙皮中提取，效率低、成本高。某科研团队将柚皮素合成关键基因导入酿酒酵母中，获得了能利用葡萄糖生产柚皮素的酵母菌株E32，但产量较低。 ARO8基因和ARO9基因与柚皮素合成代谢过程相关。科研团队分别构建了酵母菌株H4（ARO8过表达）和H5（ARO9敲除），经扩大培养后，测得二者柚皮素浓度分别为160.4mg/L和196.3mg/L，均显著高于E32。团队不断探索，最终获得了将多个基因过表达并敲除ARO9的菌株H36，产生的柚皮素浓度为452．8mg/L。 后续该团队对另一种工程菌解脂耶氏酵母的柚皮素合成关键酶CHS进行改造，将其132位苏氨酸变为半胱氨酸，196位缬氨酸变为丙氨酸，发现改造后的菌株产柚皮素的量显著提高。分子模拟实验显示，改造后的酶CHS-2与底物结合更紧密，催化效率显著增加。随后团队利用相关技术，将CHS-2基因拷贝数增加至4个，采用补料分批发酵方式，最终柚皮素产量高达8.65g/L，刷新了在酵母菌中合成柚皮素的最高记录。 (1)基因工程酵母菌发酵过程中，扩大培养的目的是 。 (2)科研团队尝试使用新型基因编辑工具TIGR优化菌株E32的柚皮素合成代谢途径。TIGR是酶与向导RNA结合形成的复合体，能识别并切割目标DNA。与CRISPR-Cas9系统相比，TIGR的识别序列更长。以下叙述合理的有_______。 A．向导RNA通过碱基互补配对原则准确定位目标序列 B．TIGR的较长靶序列有利于降低脱靶风险 C．利用TIGR将ARO8基因插入E32基因组后即可表达 D．TIGR可精准敲除ARO9基因以提高柚皮素产量 E．TIGR编辑后的酵母菌株，新性状能稳定遗传给子代 (3)该团队改造柚皮素合成关键酶CHS为CHS-2的具体操作包括：获取CHS酶的基因→ →构建基因表达载体→ →CHS-2酶的检测与鉴定。 (4)利用人工合成的脂质体包裹柚皮素治疗肝肿瘤靶向性低。在此基础上，通过制备单克隆抗体来提高柚皮素的靶向性，技术路线如下图。 实验前给小鼠注射 ，从脾脏分离B淋巴细胞。图中筛选2含多次筛选，筛选依据的基本原理是 。制备的单克隆抗体需 ，制成抗体—药物偶联物，以提高治疗肝肿瘤的靶向性。 21（2025北京昌平二模）基因工程菌在癌症的免疫治疗领域应用前景广阔。本研究探讨了基因工程菌对肿瘤生长的作用及机制。 (1)肿瘤细胞主要由 细胞识别并裂解，色氨酸是该免疫细胞的重要营养物质。 (2)用 处理色氨酸合成酶基因（Trp）和质粒，构建重组质粒，并导入酪酸梭菌（CB）中，获得基因工程菌（L-TrpCB）。从L-TrpCB中获取质粒酶切后电泳。图1结果表明，L-TrpCB构建 （成功/失败）。 (3)CFSE是一种细胞膜渗透性荧光染料，CFSE荧光信号在细胞分裂时均分至子代细胞。依据表1的实验方案，处理48h后利用流式细胞仪测定每个细胞的荧光强度。图2结果说明，L-TrpCB代谢物显著促进了细胞毒性T细胞的增殖，请说明理由 。 表1 处理 组别 初始细胞毒性T细胞 细胞代谢物 CFSE标记 预激活 CB代谢物 L-TrpCB代谢物 1 + + + 2 + + + － 3 + + － 4 + + 注：“+”“-”分别表示处理和不处理或添加和不添加 (4)研究者推测L-TrpCB代谢物通过激活mTOR信号通路促进细胞毒性T细胞的增殖。请基于上述研究，完善表2的实验设计，以验证推测的正确性，并预期实验结果 。 表2 组别 预处理 处理方式 检测指标 甲 初始细胞毒性T细胞，用CFSE标记，并做预激活 培养基+DMSO ③ 乙 ① 丙 ② 丁 雷帕霉素溶液 a.含CB代谢物的培养基        b.含L-TrpCB代谢物的培养基 c.雷帕霉素溶液（溶于DMSO）    d.DMSO（溶剂） e.单个细胞荧光强度        f.总荧光强度 注：雷帕霉素溶液是mTOR信号通路抑制剂 试卷第1页，共3页 1 / 2 学科网（北京）股份有限公司 学科网（北京）股份有限公司 学科网（北京）股份有限公司 $$ 专题11基因工程 考点概览 考点01基因工程的基本工具和操作程序 考点02基因工程综合 基因工程的基本工具和操作程序考点01 1、（2025北京东城二模）T1是小鼠胚胎存活的关键基因，T1基因被切割后会导致功能丧失。研究者构建如表中的3种转基因小鼠。下列相关叙述不合理的是（    ） 雌鼠甲（转基因纯合子） 雄鼠乙 雄鼠丙 转入基因的位置 常染色体 X染色体 Y染色体 转入的基因及功能 基因A：转录出的RNA特异性结合T1基因，引导C蛋白切割T1基因 基因C：表达C蛋白，在A基因RNA的引导下，切割T1基因 A．可利用显微注射将目的基因导入受精卵，获得转基因小鼠 B．将甲与乙杂交，子代雌鼠胚胎因T1功能缺失而未能存活 C．将甲与丙杂交，获得F1与野生型交配，F2只有雌鼠存活 D．该技术可实现精准控制性别，节省养殖资源和人力成本 【答案】C 【知识点】基因自由组合定律的实质和应用、染色体结构的变异、将目的基因导入受体细胞 【分析】T1是小鼠胚胎存活的关键基因，T1基因被切割后会导致功能丧失。基因A：转录出的RNA特异性结合T1基因，引导C蛋白切割T1基因。基因C：表达C蛋白，在A基因RNA的引导下，切割T1基因。则当基因A与基因C同时存在于转基因小鼠中时，小鼠会在胚胎时期死亡。 【详解】A、可利用显微注射将目的基因导入受精卵，获得转基因小鼠，A正确； B、设插入基因A的雌鼠甲（转基因纯合子）基因型是AAXOXO（O代表无相应基因），雄鼠乙的基因型为OOXCYO，雄鼠丙的基因型为OOXOYC， 将甲与乙杂交，子代为AOXCXO，AOXOYO。AOXCXO因为基因A与基因C同时存在，基因A转录出的RNA特异性结合T1基因，引导C蛋白切割T1基因，导致AOXCXO（子代雌鼠）胚胎因T1功能缺失而未能存活，B正确； C、将甲（AAXOXO）与丙（OOXOYC）杂交，获得F1为AOXOXO，AOXOYC，AOXOYC胚胎时期死亡，剩下AOXOXO，其与野生型（OOXOYO）交配后代雌鼠（AOXOXO）和雄鼠（AOXOYO）都能存活，C错误； D、甲与乙杂交，子代雌鼠胚胎因T1功能缺失而未能存活，甲与丙杂交，子代雄鼠胚胎因T1功能缺失而未能存活，所以该技术可实现精准控制性别，节省养殖资源和人力成本，D正确。 故选C。 2、（2025北京东城二模）天然β-淀粉酶耐热性较差，难以满足工业化生产需求。通过PCR对天然β-淀粉酶基因进行改造，将其导入大肠杆菌表达后，获得了一种耐高温的β-淀粉酶。与天然酶相比，改造后的酶在第476位发生了氨基酸替换，由天冬氨酸改变为天冬酰胺。下列叙述错误的是（    ） A．天冬酰胺与天冬氨酸的R基不同，该替换导致酶的空间结构改变 B．根据新的氨基酸序列可逆推出唯一对应的基因编码序列 C．PCR技术在此过程中实现了对β-淀粉酶基因的定点突变 D．这种通过设计并合成新蛋白质的技术属于蛋白质工程 【答案】B 【知识点】蛋白质的基本组成单位--氨基酸、遗传信息的翻译、基因突变、蛋白质工程的应用及实例分析 【分析】蛋白质工程：指以蛋白质分子的结构规律及其生物功能的关系作为基础，通过基因修饰或基因合成，对现有蛋白质进行改造，或制造一种新的蛋白质，以满足人类的生产和生活的需求。 【详解】A、不同氨基酸的差异在于R基不同，氨基酸的改变会影响蛋白质的空间结构，天冬酰胺与天冬氨酸的R基不同，该替换会导致酶的空间结构改变，A正确； B、由于密码子的简并性，根据新的氨基酸序列推导出的基因编码序列不是唯一的，B错误； C、通过PCR技术可以对基因进行定点突变，从而实现对天然β - 淀粉酶基因的改造，C正确； D、蛋白质工程是通过设计并合成新蛋白质或对现有蛋白质进行改造的技术，题中通过对天然β - 淀粉酶基因改造获得耐高温的β - 淀粉酶属于蛋白质工程，D正确。 故选B。 3、（2025北京西城二模）根的向地性与生长素（IAA）分布不均有关。对IAA敏感的启动子与绿色荧光蛋白基因形成的融合基因在根中表达情况如图，下列叙述错误的是（　　）    A．根的向地性利于植物吸收水分和无机盐 B．横放的根近地侧细胞生长速度大于远地侧细胞 C．可用农杆菌转化法将融合基因导入植物细胞中 D．绿色荧光的位置和强度代表IAA的分布和浓度 【答案】B 【知识点】生长素的生理作用以及实例分析、将目的基因导入受体细胞 【分析】根的向地性生长：根尖受到重力的影响，导致近地侧生长素浓度高于远地侧，抑制了近地侧细胞的生长，所以近地侧细胞生长速度慢。 【详解】A、根的向地性利于植物从土壤中吸收水分和无机盐，A正确； B、横放的根近地侧细胞生长素浓度高，生长受到抑制，所以生长速度小于远地侧细胞，B错误； C、可用农杆菌转化法将融合基因导入植物细胞中，因为农杆菌Ti质粒上的T-DNA可以将目的基因转入植物染色体DNA，C正确； D、题干中将对IAA敏感的启动子与绿色荧光蛋白基因形成融合基因，所以绿色荧光的位置和强度代表IAA的分布和浓度，D正确。 故选B。 4、（2025北京西城二模）下列高中生物学实验过程中不需要加热的是（　　） A．用斐林试剂检测白梨汁中的还原性糖 B．观察黑藻叶片细胞的质壁分离及复原 C．用二苯胺试剂鉴定粗提取的DNA D．DNA片段的扩增（PCR）及电泳鉴定 【答案】B 【知识点】检测生物组织中的糖类、脂肪和蛋白质、质壁分离及其复原实验、PCR扩增的原理与过程、DNA的粗提取及鉴定的方法 【分析】脂肪可用苏丹Ⅲ染液（或苏丹Ⅳ染液）鉴定，呈橘黄色（或红色）。 在沸水浴条件下，DNA遇二苯胺会被染成蓝色。 【详解】A、用斐林试剂检测白梨汁中的还原性糖，需水浴加热，A不符合题意； B、观察黑藻叶片细胞的质壁分离及复原，细胞需保持活性，不需要加热，B符合题意； C、用二苯胺试剂鉴定粗提取的DNA，需沸水浴，C不符合题意； D、DNA片段的扩增（PCR）的过程DNA需在高温条件下变性解旋，D不符合题意。 故选B。 5、（2025北京海淀二模）高温导致番茄叶片运输到果实的蔗糖难以转化为单糖，果实糖度降低。为解决该问题，研究者将一个热响应元件序列插入蔗糖转化酶基因（CN）的启动子中，培育环境智能型作物。下列关于热响应元件的叙述，错误的是（　　） A．导致番茄CN发生基因突变 B．抑制RNA聚合酶与CN的启动子结合 C．促进高温条件下CN的转录 D．提高高温环境下番茄果实的糖度 【答案】B 【知识点】遗传信息的转录、基因突变、基因表达载体的构建 【分析】基因突变是指DNA分子中发生碱基的替换、增添或缺失，从而引起的基因碱基序列的改变。 【详解】A、将热响应元件序列插入蔗糖转化酶基因（CN）的启动子中，改变了基因的结构，属于基因突变，A正确； B、若抑制RNA聚合酶与CN的启动子结合，就无法启动转录过程，而培育环境智能型作物是为了在高温下使蔗糖转化酶基因更好地表达，所以热响应元件不是抑制RNA聚合酶与启动子结合，B错误； C、因为要解决高温下果实糖度降低的问题，将热响应元件插入启动子中，应该是促进高温条件下CN的转录，从而使蔗糖转化酶能正常合成，将蔗糖转化为单糖，C正确； D、促进高温条件下CN的转录，蔗糖转化酶合成增加，能将运输到果实的蔗糖转化为单糖，进而提高高温环境下番茄果实的糖度，D正确。 故选B。 6、（2025北京海淀二模）高中生物实验中，下列利用酒精进行的实验操作与目的不符的是（　　） A．观察花生子叶脂肪颗粒——洗去多余的苏丹Ⅲ染液 B．观察洋葱根尖有丝分裂——用于配制解离液使组织细胞分离开来 C．DNA的粗提取与鉴定——用于溶解DNA以除去杂质 D．培养菊花茎段愈伤组织——避免愈伤组织受到杂菌污染 【答案】C 【知识点】检测生物组织中的糖类、脂肪和蛋白质、有丝分裂实验、影响植物组织培养的因素、DNA的粗提取与鉴定的实验设计 【分析】酒精是生物实验常用试剂之一，如检测脂肪实验中需用体积分数为50%的酒精溶液洗去浮色；观察植物细胞有丝分裂实验和低温诱导染色体数目加倍实验中都需用体积分数为95%的酒精对材料进行解离；绿叶中色素的提取和分离实验中需用无水酒精来提取色素；由于酒精可将收集的土壤小动物及时固定，防止腐烂，进行土壤小动物类群丰富度的调查时，可用体积分数70%的酒精溶液对小动物进行固定和防腐；DNA的粗提取与鉴定实验中，酒精可使DNA沉淀析出，因此在冷却的95%的酒精溶液中DNA析出。 【详解】A、观察花生子叶脂肪颗粒，用50%的酒精洗去浮色，即洗去多余的苏丹Ⅲ染液，A正确； B、观察洋葱根尖有丝分裂，用95%的酒精和15%的盐酸制成解离液，使组织细胞分离开来，B正确； C、DNA的粗提取与鉴定，由于蛋白质溶于酒精而DNA不溶于酒精，所以酒精的作用是溶解蛋白质除去杂质，C错误； D、培养菊花茎段愈伤组织，用70%的酒精消毒，避免愈伤组织受到杂菌污染，D正确。 故选C。 7、（2025北京海淀二模）为合成出局部为双链的RNA用于沉默特定基因，先将目的基因X从重组质粒pHIBS切割出来，再巧妙地连接到质粒载体pUAST中，如下图，其中质粒只展示了局部。 下列叙述正确的是（　　） A．该操作过程中还需要DNA连接酶和耐高温的DNA聚合酶 B．利用B和Bg、S和Xh黏性末端相同，实现基因X与pUAST连接 C．基因X的DNA片段需要完整保留启动子和终止子区域 D．可以用E和Bg，或者Xh和K双酶切重组pUAST 【答案】B 【知识点】基因表达载体的构建 【分析】基因工程的基本操作步骤 1、目的基因的获取：从基因组文库或 cDNA 文库筛选、PCR 扩增：设计引物扩增特定基因片段、人工合成：已知序列的短基因（如胰岛素基因）。 2、基因表达载体的构建：将目的基因与载体用限制酶切割后，通过DNA连接酶连接。 3、将重组DNA导入受体细胞 原核细胞（如大肠杆菌）：用Ca²⁺处理使其成为感受态细胞，吸收重组质粒。 真核细胞：显微注射法、农杆菌转化法、基因枪法。 4、筛选与鉴定：抗性筛选、PCR鉴定、核酸杂交、表达产物检测。 【详解】A、基因工程中，切割目的基因和载体需限制酶，连接二者需DNA连接酶；耐高温的DNA聚合酶用于PCR技术，而本题操作是切割和连接，无需PCR，A错误； B、B和Bg均产生-GATC-黏性末端（同尾酶），可互补连接。S 和Xh为另一对同尾酶，均产生-TCGA-黏性末端，切割后也能连接，利用B和Bg、S和Xh黏性末端相同，实现基因X与pUAST反向连接，B正确； C、启动子和终止子是驱动基因表达的调控序列，应存在于载体（pUAST）中，而非目的基因片段中，C错误； D、重组质粒（pUAST-基因 X）中，已不存在Bg和S酶切位点，D错误。 故选B。 8、（2025北京顺义二模）转基因抗虫棉的Bt蛋白在细胞质积累，可能与内源蛋白相互作用，产生非期望效应。C蛋白能结合纤维素，科研人员将C基因与Bt基因连接构建融合基因（如图）导入棉花细胞。相关叙述正确的是（    ） A．使用DNA聚合酶催化C基因和Bt基因连接 B．选择引物2和4进行PCR以确定基因正确连接 C．可通过花粉管通道法将融合基因导入棉花细胞 D．融合基因表达可促进Bt蛋白在细胞膜定向积累 【答案】C 【知识点】PCR扩增的原理与过程、基因表达载体的构建、将目的基因导入受体细胞 【分析】基因工程需要四个步骤：目的基因的筛选与获取、基因表达载体的构建、将目的基因导入受体细胞、目的基因的检测与鉴定；构建基因表达载体就是要让基因在受体细胞中稳定存在，并且遗传给下一代；同时，使目的基因能够表达和发挥作用，这一步是基因工程的核心工作。 【详解】A、DNA聚合酶的功能是催化DNA链的延伸（如PCR中），而连接两个基因需要的是DNA连接酶（如T4 DNA连接酶），因此使用DNA连接酶催化C基因和Bt基因连接，A错误； B、PCR检测融合基因时，需选择位于两个基因外侧的引物（如C基因上游和Bt基因下游），确保仅当基因正确连接时才能扩增出目标片段，因此选择引物1和4进行PCR才可以确定基因正确连接，B错误； C、花粉管通道法通过将外源DNA直接导入花粉管，利用受精过程将基因整合到胚胎细胞中，因此可通过花粉管通道法将融合基因导入棉花细胞，C正确； D、C蛋白能结合纤维素（主要存在于细胞壁），融合基因表达后，Bt蛋白通过与C蛋白的结合被定向至细胞壁附近，减少细胞质中的积累，从而避免非期望效应，D错误。 故选C。 9、（2025北京朝阳二模）下列高中生物学实验中，无法使用光学显微镜观察到实验现象的是（　　） A．观察洋葱鳞片叶外表皮细胞的质壁分离与复原 B．观察花生子叶中被染成橘黄色的脂肪颗粒 C．观察经粗提取后的DNA的双螺旋结构 D．观察蝗虫精母细胞减数分裂中染色体形态 【答案】C 【知识点】检测生物组织中的糖类、脂肪和蛋白质、质壁分离及其复原实验、观察细胞的减数分裂实验、DNA的粗提取与鉴定的实验设计 【分析】高倍显微镜的使用要点：（1）找：在低倍镜下找到观察目标并调节至清晰。（注：必须先观察目标至清晰）（2）移：在低倍镜下将观察目标移到视野中央。（3）转：转动转换器，换为高倍镜。（4）调：调节光圈或反光镜及细准焦螺旋至物像清晰。 【详解】A、观察洋葱鳞片叶外表皮细胞质壁分离的实验需要在光学显微镜的低倍镜下观察到，A不符合题意； B、观察花生子叶脂肪颗粒被苏丹Ⅲ染色，可在光学显微镜下观察到橘黄色颗粒，B不符合题意； C、DNA的双螺旋结构无法使用光学显微镜观察到，C符合题意； D、观察蝗虫精母细胞减数分裂中染色体形态，将染色体染色后可在光学显微镜下观察到，D不符合题意。 故选C。 10、（2025北京昌平二模）H18杂交瘤细胞能够产生抗人肝癌单克隆抗体，但该细胞在培养过程中的凋亡现象制约着其生产能力的提高。Bcl-XL是一种抗凋亡蛋白，利用Bcl-XL基因改造杂交瘤细胞，获得了稳定表达Bcl-XL的杂交瘤细胞。下列说法错误的是（　　） A．制备H18杂交瘤细胞利用了动物细胞融合技术 B．利用产生特定抗体的B细胞与瘤细胞制备H18杂交瘤细胞 C．将Bcl-XL基因直接注射至H18杂交瘤细胞可实现稳定表达 D．经筛选可获得既抗凋亡又能分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞 【答案】C 【知识点】基因表达载体的构建、动物细胞融合与单克隆抗体的制备 【分析】动物细胞融合技术就是使两个或多个动物细胞结合形成一个细胞的技术。融合后形成的杂交细胞具有原来两个或多个细胞的遗传信息。 【详解】AB、动物细胞融合技术可使两个或多个动物细胞结合形成一个细胞，融合后形成的杂交细胞具有原来两个或多个细胞的遗传信息。利用产生抗人肝癌抗体的B细胞与瘤细胞融合，可制备H18杂交瘤细胞，A正确，B正确； C、将Bcl-XL基因直接注射至H18杂交瘤细胞可能出现Bcl-XL基因被降解、Bcl-XL基因无法正确并稳定表达等问题，故要将Bcl-XL基因与载体构成基因表达载体，再导入H18杂交瘤细胞进行稳定表达，C错误； D、通过基因改造后，如果H18杂交瘤细胞成功整合了Bcl-XL基因，则H18杂交瘤细胞能同时具备既抗凋亡又能分泌单克隆抗体两种特性，可筛选出这样的细胞，D正确。 故选C。 11、（2025北京昌平二模）下图为利用定点突变技术改造基因的过程示意图，相关叙述错误的是（　　） A．需要设计并合成一段含有突变碱基的DNA引物 B．该技术能够实现特异性地替换任何一个特定碱基 C．通过电泳检测产物大小，即可确认基因突变是否成功 D．利用上述技术能够改造蛋白质的结构和功能 【答案】C 【知识点】基因突变、PCR扩增的原理与过程 【分析】PCR原理：在高温作用下，打开DNA双链，每条DNA单链作为母链，以4种游离脱氧核苷酸为原料，合成子链，在引物作用下，DNA聚合酶从引物3'端开始延伸DNA链，即DNA的合成方向是从子链的5'端自3'端延伸的。 【详解】A、定点突变技术通常需要设计并合成一段含有突变碱基的DNA引物，用于引导DNA合成过程中的特定碱基替换，A正确； B、定点突变技术能够实现特异性地替换任何一个特定碱基，这是该技术的主要优势之一，B正确； C、通过电泳检测产物大小不能直接确认基因突变是否成功。电泳主要用于检测DNA片段的大小，而确认突变是否成功通常需要进一步的测序分析，C错误； D、定点突变技术可以通过改变基因的碱基序列来改变蛋白质的结构和功能，这是该技术的重要应用之一，D正确。 故选C。 12、（2025北京东城二模）我国科研人员培育出复粒水稻（CL），与普通单粒水稻（NCL）相比，具有多粒簇生的特点。 (1)油菜素内酯（BR）是一种植物激素，是参与调节水稻籽粒生长发育的有机物，作用具有 的特点。 (2)如图1所示，幼穗中分生组织将发育形成不同部位。研究人员检测了CL和NCL幼穗不同部位中BRD3（BR降解酶）的表达量。结果显示：与NCL相比，CL中 。    (3)研究人员利用图2质粒转录得到两种RNA探针，通过RNA杂交技术检测幼穗组织相关基因转录情况，具体步骤如下表，请将实验材料补充完整（填选项）。    步骤 实验组（探针序列与BRD3的mRNA互补） 对照组（探针序列与BRD3的mRNA相同） 使用限制酶将图2质粒切成线形 ① ② 使用RNA聚合酶转录得到RNA，制备带标记的探针 ③ ④ 取NCL和CL幼穗的组织，制作成临时装片 将探针加入处理好的装片中，结合探针的部位会产生显色反应 a.Nco I    b.Sal I    c.T7RNA聚合酶    d.SP6RNA聚合酶 2种水稻幼穗组织显色情况为 。 (4)蛋白GSK和MADS均为BR信号通路中的调控因子，在体外进行实验的处理和结果如图3，结果说明 。经过一系列的研究，科研人员阐明了水稻通过BR-GSK-MADS通路调控复粒性状。    (5)已有研究表明，BR缺陷水稻的籽粒通常会变小。请从基因选择性表达的角度解释“CL同时具有多粒簇生和籽粒不变小特点”的原因。 。 【答案】(1)微量、高效 (2)P的BRD3的表达量明显较高，S中差别不大。 (3) a b d c 实验组有显色反应，对照组无显色反应 (4)GSK可以维持MADS的磷酸化，但去磷酸化酶会引起MADS的去磷酸化 (5)在CL中，与多粒簇生相关的基因在特定细胞中选择性表达，使CL表现多粒簇生；同时，与籽粒大小相关的细胞中BR - GSK - MADS通路相关基因正常表达，维持籽粒正常大小 【知识点】其他植物激素的产生、分布和功能、目的基因的检测与鉴定 【分析】植物激素是由植物体产生的，能从产生部位运输到作用部位、对植物生命活动起到调节作用的微量有机物；启动子是RNA聚合酶识别并结合的位点，起到驱动转录的作用。 【详解】（1）油菜素内酯（BR）作为一种植物激素，具有微量、高效的特点。 （2）由图可知，花梗分生组织中，CL中BRD3的表达量高于NCL，小穗分生组织中二者差别不大，即与NCL相比，CL中P的BRD3的表达量明显较高，S中差别不大。 （3）①要得到与BRD3的mRNA互补的探针，根据图中基因转录方向以及启动子位置，需要用a限制酶NcoⅠ切割质粒，使得转录能从与BRD3基因的cDNA转录方向相反的方向进行。②要得到与BRD3的mRNA相同的探针，需要用b限制酶SalⅠ切割质粒，使得转录能从与BRD3基因的cDNA转录方向相同的方向进行。③当用NcoⅠ切割质粒后，启动转录需要d：SP6RNA聚合酶，因为此时是SP6启动子起作用。④当用SalⅠ切割质粒后，启动转录需要c：T7RNA聚合酶，因为此时是T7启动子起作用。由于实验组探针与BRD3的mRNA互补，对照组探针与BRD3的mRNA相同，预期结果应该是在NCL和CL幼穗组织中，实验组有显色反应（因为能与BRD3的mRNA杂交），对照组无显色反应（不能与BRD3的mRNA杂交 ，因为是相同序列，不会互补配对结合）。 （4）观察实验设置，有加入MADS、GSK、去磷酸化酶不同组合的情况，检测指标是磷酸化的MADS。当加入MADS时，均会出现磷酸化的MADS；而同时加入MADS和GSK组，磷酸化的MADS基本不变，说明GSK基本可以维持MADS的磷酸化；而加入MADS、GSK和去磷酸化酶时，磷酸化的MADS大量减少。这表明去磷酸化酶能使MADS去磷酸化。 （5）在CL中，与多粒簇生相关的基因在特定细胞中选择性表达，使CL表现多粒簇生；同时，与籽粒大小相关的细胞中BR - GSK - MADS通路相关基因正常表达，维持籽粒正常大小，所以CL同时具有多粒簇生和籽粒不变小特点。 基因工程综合考点02 13、（2025北京东城二模）CRISPR-Cas9基因编辑技术与AAV病毒结合使用是目的基因靶向敲入的有效途径。 (1)gRNA和Cas9蛋白是CRISPR-Cas9系统的关键组成，如图1，gRNA根据 原则与靶序列特异性结合后，实现Cas9的定点切割。AAV是DNA病毒，在基因工程中作为 将目的基因导入受体细胞，其两端的ITR序列相同，是病毒复制和包装必需的。Cas9切割靶序列后，AAV基因组提供DNA修复的模板，从而实现目的基因的敲入。    (2)将图1中的CRISPR-Cas9相关DNA片段和AAV基因组导入人多能干细胞，一段时间后，分别提取DNA，同时加入图1所示的引物1、2、3进行扩增，结果如图2。 引物1和2扩增后检测到条带说明 。根据图2结果推测，同源染色体中只有一条染色体敲入了目的基因的组别是 。 (3)用图1中引物1和4对（2）提取的DNA进行扩增，结果如图3。为解释图3结果，研究人员检测了细胞中敲入目的基因的拷贝数，结果如图4。 ①图4中的B组结果对应图3中的 组。 ②在图4中找到S4组的对应结果，并据此解释图3中S4组无条带的原因。 。 (4)进一步研究发现，在某些组别中出现多个AAV基因组DNA通过ITR序列连续串联插入，这类细胞的比例高达39%。请对CRISPR-Cas9相关DNA片段进行改进，以降低AAV基因组DNA串联插入细胞的比例，方案是 。 【答案】(1) 碱基互补配对 载体 (2) 目的基因成功敲入 S2、S3、S4、S5 (3) S1 S4组对应图4中的E组，细胞中一对同源染色体的两条染色体均敲入了不止1个目的基因，导致引物之间距离过大而无法完成PCR (4)增加一个靶向ITR的 gRNA 基因 【知识点】PCR扩增的原理与过程、基因表达载体的构建、目的基因的检测与鉴定 【分析】基因工程的基本操作步骤：目的基因的筛选与获取、基因表达载体的构建、将目的基因导入受体细胞、目的基因的检测与鉴定，基因工程的核心是基因表达载体的构建，即构建含gRNA基因和Cas9基因的基因表达载体（或重组DNA分子、重组质粒），导入受体细胞，形成gRNA−Cas9蛋白复合物并发挥功能； 【详解】（1）据图可知gRNA是一段RNA序列，和DNA序列的结合是依据碱基互补配对原则进行的，引导Cas9蛋白对目的基因进行定点切割。以病毒作为基因工程的载体，其优点之一是可以利用病毒侵染宿主细胞，将目的基因导入细胞 （2）据图1可知引物1和引物2是分别根据载体与目的基因的序列设计的，在PCR体系中加入图1中的引物1和引物2后能检测到条带说明目的基因成功插入。根据图2结果推测，同源染色体中只有一条染色体敲入了目的基因的组别是S1和S3 （3）图4中的B组未检测到野生型靶序列，含目的基因的靶序列总拷贝数为2，对应对应图3中的S1组。S4组对应图4中的E组，细胞中一对同源染色体的两条染色体均敲入了不止1个目的基因，导致引物之间距离过大而无法完成PCR，所以在图3中的S4组无条带。 （4）由于在某些组别中出现多个AAV基因组DNA通过ITR序列连续串联插入，且这类细胞的比例高达39%，为降低AAV基因组DNA串联插入细胞的比例，可以增加一个靶向ITR的 gRNA 基因，打破这种串联插入。 14、（2025北京东城二模）癌症是人类健康的重大威胁之一，传统治疗手段难以实现精准治疗。超声波具有非侵入、组织穿透性强、时空特异性等特点，科研人员拟开发“响应超声波的药物递送系统”细菌以实现癌症的精准治疗。 (1)用于培养药物递送细菌的液体培养基中包含水、酵母提取物、蛋白胨等成分，其中蛋白胨主要为细菌提供 和维生素。可利用 的方法快速直观地测定细菌数量，以便即时使用适量的细菌进行治疗。 (2)C蛋白有抗肿瘤作用，超声波可导致局部温度升高到42℃。科研人员制备了工程菌1，其中含有图1所示的基因表达载体。37℃培养的工程菌1接受超声波刺激后，可升温至42℃， 从而发挥抗肿瘤作用。 (3)T蛋白有T1、T2和T3三种亚型，具有相似的功能，制备分别含有这三种基因的工程菌1，并检测C蛋白表达量，结果如图2所示。科研人员最终选择T3基因进行后续研究，判断的依据是 。 (4)工程菌1只能在超声波刺激期间发挥作用，科研人员设计了含图3所示的基因表达载体的工程菌2，可以实现在短时间的超声波刺激后维持长时间的治疗。已知B基因编码的B酶可以作用于识别位点a和b，使a、b处的DNA发生断裂，最终导致a、b之间的DNA片段发生倒转。请根据以上信息，使用下列选项将表达载体补充完整。 ； ； ； ； 。 ①P1启动子    ②P3启动子（持续表达型启动子） ③T3基因    ④C基因    ⑤B基因 【答案】(1) 碳源、氮源 显微镜直接计数 (2)启动C基因的表达 (3)温度由37℃到42℃时，含有T3亚型的C蛋白表达量变化最大 (4) ①P1 启动子 ④C 基因 ②P3 启动子 ③T3 基因 ⑤B 基因 【知识点】微生物的培养与应用综合、基因工程的操作程序综合 【分析】基因工程技术的基本步骤：（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成；（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等，标记基因可便于目的基因的鉴定和筛选。（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是钙离子处理法；（4）目的基因的检测与鉴定。 【详解】（1）蛋白胨的作用：蛋白胨是由蛋白质水解得到的产物，含有多种氨基酸、多肽等，可为细菌生长提供碳源、氮源（合成蛋白质、核酸等的原料），同时也可提供部分碳源和维生素。 细菌计数方法：题目要求 “快速直观” 测定细菌数量，常用方法为显微镜直接计数法（如血球计数板法），通过显微镜直接观察并计数菌体，无需培养，适合即时检测。 （2）根据图 1，工程菌 1 的基因表达载体中，C 基因由 P1 启动子驱动，且 T 基因（编码 T 蛋白）由持续表达型启动子 P2 驱动。 37℃时，T 蛋白可能抑制 P1 启动子活性，导致 C 基因不表达；当超声波刺激升温至 42℃，温度变化可能使 T 蛋白的抑制作用解除（或 P1 启动子在高温下激活），从而启动 C 基因转录，产生具有抗肿瘤作用的 C 蛋白。 （3）图 2 纵坐标为 C 蛋白表达量，横坐标为温度。观察不同 T 蛋白亚型（T1、T2、T3）对应的曲线，T3 亚型在 37℃时表达量最低，42℃时表达量最高，即温度响应最显著（表达量变化幅度最大）。 选择 T3 基因的原因是：在超声波升温（37℃→42℃）后，其驱动的 C 基因表达量激增最明显，能更高效地发挥抗肿瘤作用。 （4）目标：工程菌 2 需在短时间超声波刺激后维持长时间治疗，即通过一次刺激启动持续表达。 B 酶的作用：B 酶可识别位点 a 和 b，使中间 DNA 片段倒转。倒转后，启动子方向需与转录方向一致。 载体设计逻辑： P1 启动子（受温度诱导）：需位于 a 和 b 之间，倒转前可能因方向错误无法启动转录，升温后 B 酶作用使片段倒转，P1 启动子方向正确，启动下游基因。 C 基因：需在 P1 启动子正确驱动下表达，P1倒转后被激活。 P2 启动子（持续表达型）：驱动 B 基因（编码 B 酶），需持续表达以确保倒转发生，故位于 a-b 区间外，由 P2启动子直接驱动。 T3 基因：结合（3）的结论，选择 T3 基因，需在倒转后被正确启动，可能与 P1 启动子方向一致。 B 基因：需持续表达，故由 P2启动子驱动，位于载体末端。 最终载体结构（按顺序）：P1 启动子（①）→ C 基因（④）（倒转前方向错误，刺激后倒转，启动子方向正确）。 a-b 区间外：P3 启动子（②）→ T3 基因（③）（持续表达相关调控蛋白）；P2 启动子→ B 基因（⑤）（持续表达 B 酶，介导倒转）。 15、（2025北京海淀二模）为监测、调控和利用细菌的葡萄糖代谢途径，优化目标产物的生产过程，研究者尝试通过基因工程技术构建生物传感器。 (1)将GFP（绿色荧光蛋白）基因作为报告基因，构建出基因表达载体（R），将其导入大肠杆菌时，应先用 处理大肠杆菌。 (2)PE基因编码的PE酶催化E蛋白磷酸化，磷酸化的E蛋白可转运葡萄糖进入大肠杆菌细胞，转运葡萄糖后E蛋白去磷酸化。M蛋白是一种转录抑制因子。R作为生物传感器，包括启动子（P）、GFP基因和PE基因等元件，工作过程如图1、图2。    ①据图1、图2可知，存在葡萄糖时，葡萄糖通过E蛋白转运进入细胞中后被磷酸化，推测M蛋白 ，PE表达产物可使E蛋白重新磷酸化。 ②在周围环境中葡萄糖存在状态不同时，R均可监测大肠杆菌的葡萄糖摄取状态，请阐释其工作原理 。 ③在含有葡萄糖的培养基中培养转入R的大肠杆菌，分别在不同培养时间检测 和荧光强度。若结果显示二者呈正相关，则可确定该生物传感器具有检测可靠性。 (3)在工业发酵生产色氨酸过程中，研究者利用R监测大肠杆菌对葡萄糖的摄取，发现菌体摄入的葡萄糖偏多，因为代谢过程中形成了一些副产品，导致生产成本偏高。已知大肠杆菌C基因编码的蛋白C可结合启动子Pc，促进RNA聚合酶也结合Pc；当胞内葡萄糖含量较高时，C蛋白无法结合Pec，Pc无法启动下游基因转录。研究者将R的启动子Р更换为启动子Pc，解决葡萄糖摄取偏多导致浪费的问题。请在表格中补充不同条件下，2个调控元件对R的精准调控过程。“+”表示相应蛋白结合、“-”表示相应蛋白脱离。 条件 Pc中c蛋白的结合序列 M蛋白的结合序列 无葡萄糖 + + 低浓度葡萄糖 ⅰ． ⅱ． 高浓度葡萄糖 ⅲ． ⅳ． 【答案】(1)Ca²⁺ (2) 脱离启动子P 存在葡萄糖时，葡萄糖进入细胞使M蛋白脱离启动子P，PE基因表达，产生荧光；无葡萄糖时，M蛋白结合启动子P，PE基因不表达，无荧光 葡萄糖摄取量 (3) + - - - 【知识点】基因工程的操作程序综合 【分析】基因工程的基本操作步骤 1、目的基因的获取：从基因组文库或 cDNA 文库筛选、PCR 扩增：设计引物扩增特定基因片段、人工合成：已知序列的短基因（如胰岛素基因）。 2、基因表达载体的构建：将目的基因与载体用限制酶切割后，通过DNA连接酶连接。 3、将重组DNA导入受体细胞 原核细胞（如大肠杆菌）：用Ca²⁺处理使其成为感受态细胞，吸收重组质粒。 真核细胞：显微注射法、农杆菌转化法、基因枪法。 4、筛选与鉴定：抗性筛选、PCR鉴定、核酸杂交、表达产物检测。 【详解】（1）将GFP（绿色荧光蛋白）基因作为报告基因，构建出基因表达载体（R），将其导入大肠杆菌时，应先用Ca²⁺处理大肠杆菌。 （2）①推测M蛋白的作用：当存在葡萄糖时，葡萄糖通过E蛋白转运进入细胞并被磷酸化，此时M蛋白与启动子P脱离。这是因为葡萄糖的代谢产物可能改变了M蛋白的构象或磷酸化状态，使其失去对启动子的亲和力，从而解除对PE基因和GFP基因的转录抑制。 ②生物传感器的工作原理：无葡萄糖时M蛋白结合在启动子P上，抑制PE基因和GFP基因的转录，因此细胞不产生GFP，无荧光信号。有葡萄糖时葡萄糖通过E蛋白转运进入细胞并被磷酸化，导致M蛋白脱离启动子P。此时，启动子P启动PE基因和GFP基因的转录，PE酶使E蛋白重新磷酸化以维持葡萄糖摄取，同时GFP表达产生荧光。荧光强度与葡萄糖摄取量正相关，从而实现对葡萄糖摄取状态的监测。 ③验证生物传感器可靠性的检测指标：在含有葡萄糖的培养基中培养转入R的大肠杆菌，分别在不同培养时间检测葡萄糖消耗量和荧光强度。若二者呈正相关，则证明荧光信号可可靠反映葡萄糖摄取量。 （3）调控机制解释：低浓度葡萄糖时C蛋白仍能结合Pc（+），启动子Pc被激活；同时，葡萄糖的存在使M蛋白脱离启动子（-），PE基因和GFP基因高效表达，促进葡萄糖摄取。高浓度葡萄糖抑制C蛋白与Pc的结合（-），启动子Pc活性降低；同时，M蛋白仍保持脱离状态（-），但由于Pc失活，PE基因和GFP基因表达量下降，从而减少葡萄糖摄取，避免浪费。这种双调控机制使生物传感器能根据葡萄糖浓度动态调整基因表达，优化目标产物的生产过程。 16、（2025北京海淀二模）大肠杆菌是基因工程中应用最广泛的受体细胞。研究者利用大肠杆菌开展转录起始和调控机制的研究。 (1)作为基因工程载体的质粒上一般含有启动子、 （至少填2个）等序列，其中启动子是RNA聚合酶识别和结合的部位。 (2)研究者利用大肠杆菌质粒进行体外单轮转录实验：用限制酶切割质粒，获得包含启动子序列的DNA模板，与足量RNA聚合酶混合并保温，使RNA聚合酶充分结合至启动子；依次加入足量的肝素（能与游离的RNA聚合酶结合，使其不能再结合启动子）和放射性标记的4种核糖核苷酸，一段时间后电泳检测转录产物，结果如图1。 ①电泳结果显示，除了正常长度的RNA外，转录还会产生 ，研究者称其为“无效转录物”。 ②对“无效转录物”的产生机制有两种假说： a．一个RNA聚合酶与启动子结合后，先反复转录出多个无效转录物，然后该聚合酶在DNA上延伸并只转录出一个正常长度的RNA，最后从DNA上脱离。 b．一个RNA聚合酶与启动子结合后，仅转录出一个RNA，该聚合酶就从DNA上脱离；转录出的RNA多数为无效转录物，少数为正常长度的RNA。 单轮转录实验中，若DNA模板的数目（m）、无效转录物的数目（p）、正常长度RNA的数目（q）之间存在数量关系 （用m、p、q表示），则支持假说a。 (3)阻遏蛋白R能与启动子附近下游序列结合，抑制转录。设计实验探究R的作用是抑制RNA聚合酶与启动子的结合，还是抑制RNA聚合酶在DNA上的延伸。 ①其中实验组的步骤如下。请将正确的试剂对应的字母填入横线上。 DNA模板与足量 混合并保温，再加入足量 混合并保温；依次加入足量的 和 反应一段时间，然后加入 再反应一段时间，电泳检测转录产物。 a．IPTG（使R脱离且不再与DNA结合） b．肝素 c．RNA聚合酶 d．放射性标记的4种核糖核苷酸 e．阻遏蛋白R ②电泳结果如图2，表明R 。 【答案】(1)终止子、标记基因、复制原点 (2) 长度较短的RNA p＞q=m (3) c e b d a 抑制RNA聚合酶在DNA上的延伸 【知识点】PCR扩增的原理与过程、基因表达载体的构建、目的基因的检测与鉴定 【分析】 基因工程技术的基本步骤： （1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成； （2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等； （3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样．将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法； （4）目的基因的检测与鉴定：分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA是否插入目的基因−−DNA分子杂交技术；②检测目的基因是否转录出了mRNA−−分子杂交技术；③检测目的基因是否翻译成蛋白质−−抗原−抗体杂交技术。个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。 【详解】（1）构建成功的基因表达载体应含有启动子，终止子、目的基因、标记基因（或复制原点）等结构，启动子是一段有特殊结构的DNA片段，位于基因的首端，它是RNA聚合酶识别和结合的部位，作用是驱动基因转录（出mRNA）。 （2）电泳结果显示，除了正常长度的RNA外，转录还会产生长度为2～6个核苷酸的多种RNA。假说a认为一个RNA聚合酶与启动子结合后，先反复转录出多个无效转录物，然后该聚合酶在DNA上延伸并只转录出一个正常长度的RNA，最后从DNA上脱离。所以若DNA模板的数目（m）＝正常长度RNA的数目（q）＜无效转录物的数目（p），则支持a观点。　　　　　　， （3）阻遏蛋白R能与启动子附近下游序列结合，抑制转录。若要设计实验探究R的作用是抑制RNA聚合酶与启动子的结合，还是抑制RNA聚合酶在DNA上的延伸，实验步骤如下:DNA模板与足量RNA聚合酶混合并保温，再加入足量阻遏蛋白R混合并保温；依次加入足量的肝素和放射性标记的4种核糖核苷酸反应一段时间，然后加入IPTG（使R脱离且不再与DNA结合)再反应一段时间，电泳检测转录产物。若R的作用是抑制RNA聚合酶与启动子的结合，则在只加入R的条件下转录产物中应该是同时存在无效转录产物和正常RNA片段，结果于电泳图结果不符；若R是抑制RNA聚合酶在DNA上的延伸，则在只加入R的条件下转录产物中应该是不存在无效转录产物和正常RNA片段，在加入IPTG后R的抑制作用消失，开始有无效转录产物和正常RNA片段，与电泳结果相符，故可推测R的作用是抑制RNA聚合酶在DNA上的延伸。 17、（2025北京顺义二模）学习以下材料，回答（1）～（4）题。 基因编辑技术的变革 CRISPR/Cas9系统是基因编辑技术的常用工具.由Cas9蛋白和人工设计的gRNA构成。gRNA嵌入Cas9的RNA结合区，形成稳定的RNA-蛋白复合体。gRNA可识别目标序列，引导Cas9切断DNA双链。这种情况下，细胞内原有的负责修复DNA切口的酶将“行动”起来，修复断裂的DNA（如图示）。 肝脏合成的蛋白T若发生错误折叠后，会聚集在心脏、神经等组织引发疾病。科学家研发了基于CRISPR/Cas9技术的基因治疗产品，命名为N-2001。该产品包含靶向T基因的gRNA和编码Cas9的mRNA，并由亲肝性脂质体包裹，注射到患者体内，取得一定治疗效果。但gRNA识别的序列短小，可能结合基因组中与目标序列相似的非目标序列，造成脱靶。 Cas9的两个结构域分别负责切割DNA双链中的一条，其中一个结构域失活得到nCas9，只能切割DNA中与gRNA结合的那条链。利用nCas9在目标序列的两条链上产生邻近切口，造成双链断裂，能有效减少脱靶效应。但Cas9和nCas9均是对DNA序列的直接改变，一旦发生错误难以纠正。 若使Cas9的两个结构域同时失活，则获得dCas9，dCas9虽然失去了切割DNA的能力，但仍可在gRNA的引导下定位到特定DNA序列上。以此为基础，我国科研人员通过改造获得“dCas9-Tet1”融合蛋白，将Tet1（去甲基化因子）精确地定位到抑癌基因的启动子区域，激活抑癌基因表达。研究表明，该疗法治疗的肺癌模型小鼠，抑癌基因的表达量显著升高，癌细胞增殖迁移能力均明显降低。dCas9基因编辑技术通过改变特定位点的DNA甲基化修饰，调控基因表达，为相关疾病的治疗提供了新思路。 (1)以含Cas9基因的重组质粒为模板，通过 技术扩增得到含Cas9基因的线性DNA片段，在体外转录出Cas9mRNA。 (2)由文中信息可知，N-2001输入到患者体内后，在无外源模板的情况下，其发挥作用的过程是:脂质体进入肝细胞后降解并释放Cas9mRNA→ → →T基因被Cas9剪切发生 →T蛋白含量降低。 (3)切割DNA双链时，nCas9比Cas9脱靶概率低的原因是 。 (4)DNMT是一种作用于基因启动子区域的DNA甲基化酶，通过研究确定了编码DNMT催化结构域的基因序列。请在N-2001基础上，设计一种基因编辑疗法的产品，实现对肝细胞内T基因表达的抑制 。    【答案】(1)PCR (2) 合成Cas9蛋白 gRNA引导Cas9定位到T基因 突变 (3)nCas9切割双链产生邻近切口，需两种gRNA分别识别目标基因两条链的两段序列 (4)靶向T基因启动子的gRNA+编码dCas9-DNMT融合蛋白的mRNA+亲肝性脂质体 【知识点】基因突变、PCR扩增的原理与过程、基因表达载体的构建、基因编辑技术 【分析】CRISPR/Cas9系统由Cas9蛋白和人工设计的gRNA构成。在gRNA引导下，gRNA通过碱基互补配对原则特异性结合目的基因序列，然后Cas9与靶序列结合并将DNA双链切断，对真核细胞的基因组进行特异编辑。 【详解】（1）以含Cas9基因的重组质粒为模板，通过PCR技术扩增得到含Cas9基因的线性DNA片段，而后在体外转录出Cas9mRNA，为定向切割DNA做准备。 （2）由文中信息可知，N-2001输入到患者体内后，在无外源模板的情况下，其发挥作用的过程是：脂质体进入肝细胞后降解并释放Cas9mRNA→合成Cas9蛋白→gRNA引导Cas9蛋白定位到T基因→T基因被Cas9剪切发生突变→T蛋白含量降低，进而发生性状改变。 （3）切割DNA双链时，nCas9切割双链产生邻近切口，需两种gRNA分别识别目标基因两条链的两段序列，因此nCas9特异性更强，因而比Cas9脱靶概率低。 （4）DNMT是一种作用于基因启动子区域的DNA甲基化酶，启动子的甲基化会导致基因表达受阻，进而引起T基因编码蛋白质减少，根据该思路设计使T基因的启动子发生甲基化，因此，通过研究确定了编码DNMT催化结构域的基因序列，在N-2001基础上，设计靶向T基因启动子的gRNA+编码dCas9-DNMT融合蛋白的mRNA+亲肝性脂质体，进而实现T基因启动子甲基化。 18、（2025北京朝阳二模）学习以下材料，回答（1）～（5）题。 小环大威力：ecDNA在癌症发生和进展中的作用 细胞中可能由于染色体断裂和重新连接，形成游离于染色体外的环状DNA分子，称为ecDNA。细胞周期中，ecDNA复制后随机分配给两个子细胞。 含原癌基因的ecDNA的产生概率极低，但临床调查发现约17.1%的癌症患者癌细胞中存在携带原癌基因的ecDNA。为构建与癌细胞中类似的ecDNA，研究者将两段含loxP位点和标记基因的外源DNA插入12号染色体，再用Cre酶处理．使染色体中的一个片段脱落并环化，形成含原癌基因MDM2的ecDNA（图1）。 处理后同时发出绿色和红色荧光的细胞即为含有/ecDNA的细胞，称为ec细胞。研究者对ec细胞进行传代培养，发现其后代中丢失绿色荧光的细胞比例逐渐增加。推测由于细胞分裂中ecDNA随机分配，产生不含ecDNA的子细胞，且这些子细胞在适宜环境中继续增殖；如果培养环境改变为ecDNA能为细胞带来更强适应能力的环境，则子代中ec细胞比例会增加，ec细胞中ecDNA的拷贝数也会增加。为检验假设，研究者将上述ec细胞分别放在含不同浓度潮霉素的培养基中培养，结果表明，潮霉素处理能够增加子代中ec细胞占比和ec细胞中ecDNA拷贝数。 为进一步研究ecDNA在体内的作用，研究者在小鼠肝细胞中诱导生成含有MDM2基因的ecDNA。小鼠肝脏中迅速出现癌细胞，形成肿瘤。 ecDNA的工程化构建为研究其致癌机制提供了新工具，未来有可能成为癌症精准治疗的靶点。 (1)eeDNA缺少着丝粒，因此复制后的ecDNA不能在 的作用下均分给两个子细胞。 (2)ecDNA的染色质状态更开放，其上的MDM2基因表达量 ，能促进细胞癌变和已癌变细胞的增殖。 (3)研究者进行外源DNA插入操作后，用含 的培养液筛选出成功插入的细胞。 (4)Cre酶可以将DNA上两个相同loxP位点之间的片段切割后环化（图2）。用Cre酶处理已插入片段1和片段2的12号染色体（图3），产生图1所示ecDNA。请写出片段2上各字母代表的表达元件。 (5)请根据潮霉素培养实验和小鼠肝细胞诱导实验推测携带原癌基因的ecDNA在癌细胞中广泛存在的原因 。 【答案】(1)纺锤体 (2)较高 (3)潮霉素和嘌呤霉素 (4)a．潮霉素抗性基因、b．GFP基因上游序列、c．红色荧光蛋白基因 (5)若含原癌基因的ecDNA产生于正常细胞中，会促进细胞癌变，是部分癌症的发生原因；若含原癌基因的ecDNA产生于已癌变细胞中，会促进细胞增殖，使这些细胞占据竞争优势。 【知识点】有丝分裂中染色体的形态结构、基因表达载体的构建、目的基因的检测与鉴定、基因的表达综合 【分析】1、基因工程至少需要三种工具：限制性核酸内切酶（限制酶）、DNA连接酶、运载体。 2、基因工程的基本操作步骤主要包括四步：①目的基因的获取；②基因表达载体的构建；③将目的基因导入受体细胞；④目的基因的检测与表达。 【详解】（1）染色体的着丝粒两侧都有纺锤丝附着在上面，纺锤丝牵引着染色体的运动，eeDNA缺少着丝粒，因此复制后的ecDNA不能在纺锤体的作用下均分给两个子细胞。 （2）ecDNA的染色质状态更开放，有利于基因的表达，其上的MDM2基因表达量较高，能促进细胞癌变和已癌变细胞的增殖。 （3）分析题图1可知，插入外源DNA片段后，12号染色体上含有嘌呤霉素抗性基因和潮霉素抗性基因，可以用含有嘌呤霉素和潮霉素的培养液筛选出成功插入的细胞。 （4）结合题图1、2、3可知，图3的位点1已含有嘌呤霉素抗性基因和GFP抗性基因，则位点2的a应为潮霉素抗性基因，b为GFP基因上游序列，c为红色荧光蛋白基因。 （5）结合题干信息可知：潮霉素处理能够增加子代中ec细胞占比和ec细胞中ecDNA拷贝数；研究者在小鼠肝细胞中诱导生成含有MDM2基因的ecDNA。小鼠肝脏中迅速出现癌细胞，形成肿瘤，由此推测：若含原癌基因的ecDNA产生于正常细胞中，会促进细胞癌变，是部分癌症的发生原因；若含原癌基因的ecDNA产生于已癌变细胞中，会促进细胞增殖，使这些细胞占据竞争优势。 19、（2025北京朝阳二模）斑翅果蝇是农业害虫。我国研究者利用基因编辑技术培育带有雌性不育基因的斑翅果蝇，若将其释放到野外可降低野生斑翅果蝇种群数量。 (1)CRISPR/Cas9基因编辑系统中的gRNA与靶基因特异性结合，引导Cas9酶切断靶基因。断裂的DNA可能发生非同源末端连接修复，导致靶基因中发生碱基的 ，引起基因突变；也可能发生同源重组修复，导致靶基因被供体DNA中的片段替换（图1）。 (2)果蝇2号染色体上T基因控制合成一种信号物质，该物质由神经细胞分泌，是雌蝇产卵的必需信号，对雄蝇育性无影响。研究者制备图2所示供体DNA，将其与靶向T基因的gRNA和Cas9酶共同注入果蝇受精卵。继续培养后在低倍镜下挑选出 的成蝇，即为成功实现驱动片段替换的个体——G0。 (3)理论上，当细胞中1个T基因被驱动片段替换后，会表达靶向T基因的gRNA和Cas9酶，同时作为同源重组修复的模板，导致 ，使雌蝇不育。用G0雄蝇与野生型雌蝇杂交，F1雌蝇育性情况为 。 (4)有的G0果蝇受精卵中T基因发生末端连接修复，突变为t基因。t基因既不能正常表达，也不能被gRNA识别。用携带t基因的G0雄蝇与野生型雌蝇杂交，F1自由交配，若整个过程中没有t基因的新发产生，F2雌蝇中可育个体占比为 ，可见t基因对驱动片段在种群中的传播有抵抗作用。 (5)研究者对驱动片段进行改造，将其中编码gRNA的基因增加为3个，分别靶向T基因中不同的位点。请评价改造后的驱动片段的优点 。 【答案】(1)增添、缺失或替换 (2)发出红色荧光 (3) 另1个T基因也被驱动片段替换 均不育 (4)3/8 (5)T基因中即使发生末端连接修复，也可以被其它gRNA识别，引发同源重组修复，降低t基因产生概率 【知识点】基因突变、基因分离定律的实质和应用 【分析】DNA分子中发生碱基对的替换、增添和缺失，而引起的基因结构改变，称为基因突变，基因突变若发生在配子中，将遵循遗传规律传递给后代；若发生在体细胞中则不能遗传 【详解】（1）基因突变是指碱基对的增添、缺失或替换。故断裂的DNA可能发生非同源末端连接修复，导致靶基因中发生碱基的增添、缺失或替换，引起基因突变。 （2）将供体DNA与靶向T基因的gRNA和Cas9酶共同注入果蝇受精卵，实质是基因工程中将基因表达载体注入受体细胞，需要根据标记基因挑选，图2中红色荧光蛋白基因是标记基因，所以在低倍镜下挑选出发出红色荧光的成蝇，即为成功实现驱动片段替换的个体——G0。 （3）当细胞中1个T基因被驱动片段替换后，会表达靶向T基因的gRNA和Cas9酶，而gRNA可以与T基因特异性结合，同时Cas9酶在特定位点将其切割，所以导致另1个T基因也被驱动片段替换，用G0雄蝇与野生型雌蝇杂交，杂交子代中一对同源染色体上T基因被替换，而另一条没有被替换，但根据前面分析，最终这对染色体上的T基因都会被替换，所以F1雌果蝇均不育。 （4）有的C0果蝇受精卵中T基因发生末端连接修复，突变为t基因。t基因既不能正常表达，也不能被gRNA识别，t基因本身也是发生了基因突变，所以tt是不育的，但不能将野生型染色体转变为T基因，因此如果果蝇同时含有t和野生型基因，是可育的。 用携带t基因的C0雄蝇（记为Tt）与野生型雌蝇（记为++）杂交，子代T+：t+=1:1，T+变为TT，在雌果蝇中表现不育，所以F1自由交配，雄果蝇产生的配子T：t：+=2:1:1，雌果蝇产生的配子t：+=1:1，随机结合F2中Tt：T+：tt：t+：++=2:2:1:2:1，所以雌果蝇中可育个体比例为3/8。 （5）对驱动片段进行改造，将其中编码gRNA的基因增加为3个，分别靶向T基因中不同的位点的好处是T基因中即使发生末端连接修复，也可以被其它gRNA识别，引发同源重组修复，降低t基因产生概率。 20、（2025北京丰台二模）学习以下材料，回答（1）～（4）题。 利用基因工程酵母菌发酵获得高产柚皮素 柚皮素是一种脂溶性物质，广泛存在于柑橘类水果中，具有抗炎、抗氧化和抗肿瘤等药理作用，传统方法主要是从橙皮中提取，效率低、成本高。某科研团队将柚皮素合成关键基因导入酿酒酵母中，获得了能利用葡萄糖生产柚皮素的酵母菌株E32，但产量较低。 ARO8基因和ARO9基因与柚皮素合成代谢过程相关。科研团队分别构建了酵母菌株H4（ARO8过表达）和H5（ARO9敲除），经扩大培养后，测得二者柚皮素浓度分别为160.4mg/L和196.3mg/L，均显著高于E32。团队不断探索，最终获得了将多个基因过表达并敲除ARO9的菌株H36，产生的柚皮素浓度为452．8mg/L。 后续该团队对另一种工程菌解脂耶氏酵母的柚皮素合成关键酶CHS进行改造，将其132位苏氨酸变为半胱氨酸，196位缬氨酸变为丙氨酸，发现改造后的菌株产柚皮素的量显著提高。分子模拟实验显示，改造后的酶CHS-2与底物结合更紧密，催化效率显著增加。随后团队利用相关技术，将CHS-2基因拷贝数增加至4个，采用补料分批发酵方式，最终柚皮素产量高达8.65g/L，刷新了在酵母菌中合成柚皮素的最高记录。 (1)基因工程酵母菌发酵过程中，扩大培养的目的是 。 (2)科研团队尝试使用新型基因编辑工具TIGR优化菌株E32的柚皮素合成代谢途径。TIGR是酶与向导RNA结合形成的复合体，能识别并切割目标DNA。与CRISPR-Cas9系统相比，TIGR的识别序列更长。以下叙述合理的有_______。 A．向导RNA通过碱基互补配对原则准确定位目标序列 B．TIGR的较长靶序列有利于降低脱靶风险 C．利用TIGR将ARO8基因插入E32基因组后即可表达 D．TIGR可精准敲除ARO9基因以提高柚皮素产量 E．TIGR编辑后的酵母菌株，新性状能稳定遗传给子代 (3)该团队改造柚皮素合成关键酶CHS为CHS-2的具体操作包括：获取CHS酶的基因→ →构建基因表达载体→ →CHS-2酶的检测与鉴定。 (4)利用人工合成的脂质体包裹柚皮素治疗肝肿瘤靶向性低。在此基础上，通过制备单克隆抗体来提高柚皮素的靶向性，技术路线如下图。 实验前给小鼠注射 ，从脾脏分离B淋巴细胞。图中筛选2含多次筛选，筛选依据的基本原理是 。制备的单克隆抗体需 ，制成抗体—药物偶联物，以提高治疗肝肿瘤的靶向性。 【答案】(1)获得大量菌种，以提取更多产物 (2)ABD (3) 将 132 位和 196 位氨基酸对应的碱基进行定点突变 导入解脂耶氏酵母细胞 (4) 肝肿瘤细胞 抗原与抗体的反应具有特异性 偶联在包裹着柚皮素的脂质体表面/连接柚皮素 【知识点】基因表达载体的构建、将目的基因导入受体细胞、动物细胞融合与单克隆抗体的制备、发酵工程的基本环节 【分析】基因工程：目的基因的筛选与获取、构建基因表达载体、将目的基因导入受体细胞、目的基因的检测与鉴定。 【详解】（1）在基因工程酵母菌发酵过程中，扩大培养的主要目的是获得大量菌种，以提取更多产物 。这是因为酵母菌是发酵过程中的关键微生物，其数量直接影响到发酵效率和产物的产量。通过扩大培养，可以获得足够数量的酵母菌，以满足后续发酵过程的需求。 （2）A、据题干信息分析可知，TIGR是酶与向导RNA结合形成的复合体，能识别并切割目标DNA，故TIGR相当于限制酶，其中向导RNA通过与目标DNA序列进行碱基互补配对，从而引导编辑工具准确找到并切割目标DNA，A正确； B、脱靶是指基因编辑工具错误地切割了非目标DNA序列。与CRISPR-Cas9系统相比，TIGR的识别序列更长，这意味着它与目标DNA的匹配度更高，从而降低了脱靶的风险，B正确； C、仅仅将基因插入基因组并不足以保证该基因能够表达。基因的表达还受到许多其他因素的影响，如启动子的存在、转录因子的调控等。因此，不能简单地认为利用TIGR将ARO8基因插入E32基因组后该基因就能表达，C错误； D、由于TIGR能够准确识别并切割目标DNA序列，因此它可以用来精准地敲除与柚皮素合成代谢途径相关的基因（如ARO9基因），从而优化该途径并提高柚皮素的产量，D正确； E、通过TIGR编辑后的酵母菌株只含有一个该基因，故其为杂合子，杂合子的子代会出现性状分离，故新性状不能稳定遗传给子代，E错误。 故选ABD。 （3）据题干信息分析可知，该团队改造柚皮素合成关键酶CHS为CHS−2的具体操作包括：首先获取CHS酶的基因，这是基因工程的基础步骤；然后对CHS基因进行定点突变，即将CHS酶的132位苏氨酸变为半胱氨酸，196位缬氨酸变为丙氨酸；接着构建基因表达载体，将突变后的CHS基因导入到解脂耶氏酵母细胞中；再进行CHS−2酶的检测与鉴定，以确保改造后的酶具有预期的催化效率和底物结合能力。 （4）在实验前，需要给小鼠注射特定的抗原（如肝肿瘤细胞或相关抗原），以刺激小鼠产生针对该抗原的特异性免疫反应，从而从脾脏中分离出能够识别并结合该抗原的B淋巴细胞。图中筛选2含多次筛选，筛选依据的基本原理是抗原-抗体杂交，即利用抗原与抗体之间的特异性结合来筛选出能够产生特异性抗体的B淋巴细胞克隆。制备的单克隆抗体需要与偶联在包裹着柚皮素的脂质体表面（连接柚皮素），制成抗体-药物偶联物，以提高治疗肝肿瘤的靶向性。这样，抗体能够特异性地识别并结合到肝肿瘤细胞上，而柚皮素则能够发挥其药理作用，从而实现对肝肿瘤的有效治疗。 21（2025北京昌平二模）基因工程菌在癌症的免疫治疗领域应用前景广阔。本研究探讨了基因工程菌对肿瘤生长的作用及机制。 (1)肿瘤细胞主要由 细胞识别并裂解，色氨酸是该免疫细胞的重要营养物质。 (2)用 处理色氨酸合成酶基因（Trp）和质粒，构建重组质粒，并导入酪酸梭菌（CB）中，获得基因工程菌（L-TrpCB）。从L-TrpCB中获取质粒酶切后电泳。图1结果表明，L-TrpCB构建 （成功/失败）。 (3)CFSE是一种细胞膜渗透性荧光染料，CFSE荧光信号在细胞分裂时均分至子代细胞。依据表1的实验方案，处理48h后利用流式细胞仪测定每个细胞的荧光强度。图2结果说明，L-TrpCB代谢物显著促进了细胞毒性T细胞的增殖，请说明理由 。 表1 处理 组别 初始细胞毒性T细胞 细胞代谢物 CFSE标记 预激活 CB代谢物 L-TrpCB代谢物 1 + + + 2 + + + － 3 + + － 4 + + 注：“+”“-”分别表示处理和不处理或添加和不添加 (4)研究者推测L-TrpCB代谢物通过激活mTOR信号通路促进细胞毒性T细胞的增殖。请基于上述研究，完善表2的实验设计，以验证推测的正确性，并预期实验结果 。 表2 组别 预处理 处理方式 检测指标 甲 初始细胞毒性T细胞，用CFSE标记，并做预激活 培养基+DMSO ③ 乙 ① 丙 ② 丁 雷帕霉素溶液 a.含CB代谢物的培养基        b.含L-TrpCB代谢物的培养基 c.雷帕霉素溶液（溶于DMSO）    d.DMSO（溶剂） e.单个细胞荧光强度        f.总荧光强度 注：雷帕霉素溶液是mTOR信号通路抑制剂 【答案】(1)细胞毒性T (2) 限制酶、DNA连接酶 成功 (3)由于CFSE荧光信号在细胞分裂时均分至子代细胞，第一组加L-TrpCB代谢物的荧光强度最低，说明分裂速度最快，L-TrpCB代谢物显著促进了细胞毒性T细胞的增殖 (4) （实验结果）甲组单个细胞荧光强度降低，乙组单个细胞荧光强度高于甲组 （检测指标）e （乙组）b （丙组）b+c 【知识点】实验与探究综合、细胞免疫、基因工程的操作程序综合 【分析】基因工程技术的基本步骤：（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。（4）目的基因的检测与鉴定。 【详解】（1）肿瘤细胞主要是细胞免疫，由细胞毒性T细胞识别并裂解。 （2）重组质粒的构建需要限制酶、DNA连接酶，故要用限制酶、DNA连接酶处理色氨酸合成酶基因（Trp）和质粒。构建后的重组质粒既包括Trp片段、又包括质粒片段，所以构建成功。 （3）与CB代谢物处理组相比，L-Trp CB代谢物处理组中细胞荧光强度降低更明显，说明细胞分裂次更多，即L-TrpCB代谢物显著促进了细胞毒性T细胞的增殖。 （4）本实验是验证性实验，结论是L-TrpCB代谢物通过激活mTOR信号通路促进细胞毒性T细胞的增殖，由于CFSE荧光信号在细胞分裂时均分至子代细胞，故实验结果应该测单个细胞荧光强度（e），根据实验的对照原则和单一变量原则，处理方式为：乙组为 b（含L-TrpCB代谢物的培养基），丙组为： b（含L-TrpCB代谢物的培养基）+c（雷帕霉素溶液（溶于DMSO））。由于L-Trp CB代谢物处理组中细胞荧光强度降低更明显，故结果是含L-TrpCB代谢物的培养基的组单个细胞荧光强度最低（即甲组单个细胞荧光强度降低），而含L-TrpCB代谢物的培养基加入雷帕霉素溶液后细胞荧光强度明显增高（即乙组单个细胞荧光强度高于甲组） 试卷第1页，共3页 1 / 2 学科网（北京）股份有限公司 学科网（北京）股份有限公司 学科网（北京）股份有限公司 $$