2026届高三生物一轮复习课件 基因工程

第三章 基因工程 总复习 本章重难点汇总 1.分析作为基因工程中三种基本工具各自的作用。 2.分析基因工程载体需要具备的条件。 3.运用DNA的理化性质，分析DNA的粗提取与鉴定的原理。 1.简述PCR的原理、条件及过程。 2.简述基因表达载体的组成及构建过程。 1.实例分析将目的基因导入受体细胞的方法及目的基因的检测与鉴定。 2.构建基因工程的基本操作流程。 3.基于DNA片段的扩增及电泳鉴定，尝试进行PCR的基本操作并用电泳鉴定PCR的产物。 1.基于基因工程在农牧、医药和食品等行业应用的实例，说明基因工程给社会带来的巨大进步。 2.基于基因工程在各方面发展的前景，理性看待基因工程的安全性。 1.举例说出蛋白质工程崛起的缘由。 2.简述蛋白质工程的基本原理。 3.基因工程的基本操作程序 目录 2.DNA的粗提取与鉴定 1.重组DNA技术的工具 5.基因工程的应用 6.蛋白质工程的原理和应用 4.DNA片段的扩增及电泳鉴定 任务一 重组DNA技术的工具 一、基因工程的理论基础 ①不同生物的DNA能够进行拼接吗？ 能。 ①因为几乎所有生物的DNA分子都是由4种脱氧核苷酸组成的双螺旋结构 ②DNA分子都遵循碱基互补配对原则 这为不同生物的DNA拼接提供物质基础。 ②Bt基因在棉花细胞中表达的产物是否还和原来相同也具有抗虫性呢？ 同样具有抗虫性。 ①基因是控制生物性状的遗传物质是结构和功能的基本单位 ②几乎所有生物共用一套遗传密码，都遵循中心法则 这为一种生物的基因在其他生物体内正常表达提供可能性。 1.概念：基因工程是指按照人们的愿望，通过转基因等技术，赋予生物新的遗传特性，创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。由于基因工程是在DNA分子水平上进行设计和施工的，因此又叫作重组DNA技术。 二、基因工程 2.归纳深化概念 别名 重组DNA技术 或 基因拼接技术 或 转基因技术 操作对象 基因 操作环境 生物体外 原理 基因重组 操作水平 DNA分子水平 基本过程 剪切→拼接→导入→表达 结果 符合人们需要的新的生物类型和生物产品 优点 克服远缘杂交不亲和障碍、定向改造生物性状 基因工程操作导致的基因重组与有性生殖中的基因重组的主要区别是什么？ 有性生殖中的基因重组是随机的，并且只能在同一物种间进行重组；基因工程可以实现遗传物质在不同物种间进行重组，并且方向性强，可以定向地改变生物的性状。 准确切割DNA分子的“分子手术刀” 将DNA片段再连接起来的“分子缝合针” 将体外重组好的DNA分子导入受体细胞的“分子运输车” 三、重组DNA技术的基本操作工具 "分子手术刀"—限制性内切核酸酶（简称：限制酶） 切割DNA分子的工具是限制性内切核酸酶，简称限制酶。 ①来源： 主要是从原核生物中分离纯化出来的。 ②种类： 迄今分离的限制酶有数千种 ③作用： 能够识别双链DNA分子的特定核苷酸 序列，并使每一条链中特定部位的磷 酸二酯键断开。 "分子手术刀"—限制性内切核酸酶（简称：限制酶） ④识别序列：大多数限制酶的识别序列由6个核苷酸组成，也有少数限制酶的识别序列由4个、8个或其他数量的核苷酸组成。 ⑤识别序列特点： 回文序列 中轴线两侧的碱基反向对称重复排列 切割的是什么？ 两个脱氧核苷酸之间的磷酸二酯键，氢键自动断开 "分子手术刀"—限制性内切核酸酶（简称：限制酶） 限制酶 EcoRⅠ的酶切过程 5' 3' 3' 5' 5' 3' 3' 5' 5' 3' 3' 5' 黏性末端 黏性末端 当限制酶在它识别序列的中心轴线两侧将DNA分子的两条链分别切开时，产生的是粘性末端 5' 3' 3' 5' "分子手术刀"—限制性内切核酸酶（简称：限制酶） 限制酶 SmaⅠ的酶切过程 当限制酶在它识别序列的中心轴线处切开时，产生的是平末端 5' 3' 3' 5' 5' 3' 3' 5' 平末端 平末端 1.作用：将双链 DNA片段“缝合”起来，恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的磷酸二酯键 。 "分子缝合针"—DNA连接酶 2.种类： 一类是从大肠杆菌中分离得到的，称为E.coli DNA连接酶 一类是从T4噬菌体中分离得到的，称为T4 DNA连接酶 E.coli DNA连接酶链接具有平末端的DNA片段的效率要远远低于T4 DNA连接酶。 * DNA（水解）酶：断开磷酸二酯键，将DNA水解成四种脱氧核 苷酸，彻底水解成磷酸、脱氧核糖和含氮碱基。 *限制酶：断开磷酸二酯键，形成DNA片段 *解旋酶：断开氢键，解开DNA双链，形成两条脱氧核苷酸链。 * DNA连接酶：通过磷酸二酯键连接DNA片段。 * DNA聚合酶：以DNA两条链为模板，能将单个核苷酸通过磷酸二 酯键连接成DNA子链。 DNA相关酶的比较 1.作用：将外源基因送入受体细胞, 在受体细胞内对目的基因进 行大量复制. 2.种类：质粒；噬菌体；动植物病毒等 “分子运输车”—基因进入细胞的载体 常用载体——质粒 质粒是一种裸露的、结构简单、独立于真核细胞细胞核或原核细胞拟核DNA之外，并具有自我复制能力的环状双链DNA分子。 ✭真正被用作载体的质粒，都是在天然质粒的基础上进行过人工改造的。 ★思考：质粒为什么适合作为载体？作为载体需要具备那些条件？ 条件1：有一个至多个限制酶切割位点　⁠ 供外源DNA片段（基因）插入其中 条件2：能在细胞中进行自我复制或整合到受体DNA上，随受体DNA同步复制　⁠ 能使目的基因在受体细胞中稳定存在且数量可扩增 条件3：常有特殊的标记基因　⁠⁠ 便于重组DNA分子的筛选　⁠ 条件4：对受体细胞无毒害作用　⁠ 避免受体细胞受到损伤 DNA的粗提取与鉴定 任务二 1．实验原理 (1)提取原理 ①DNA不溶于酒精，但某些蛋白质溶于酒精，利用这一原理，可以初步分离DNA与蛋白质。 ②DNA在不同浓度的NaCl溶液中溶解度不同，它能溶于2mol/L的NaCl溶液。 (3)鉴定原理 在一定温度下，DNA遇二苯胺试剂会呈现蓝色。 DNA的粗提取与鉴定 2.方法步骤 取材、研磨 称取30g洋葱,切碎,然后放入研钵中,倒入10mL 研磨液,充分研磨 2.方法步骤 DNA的粗提取与鉴定 过滤 分离 在漏斗中垫上纱布,将洋葱研磨液过滤到烧杯 中,在4℃冰箱中放置几分钟后,取上清液(或 离心后,取上清液) 在上清液中加入体积相等的、预冷的酒精溶液静置2-3min,用玻璃棒沿一个方向搅拌，卷起丝状物(粗提取的DNA),并用滤纸吸去水分(或用离心法取沉淀物) 鉴定 加入5mL 2mol/LNaCl溶液溶解DNA.再加入4mL二苯胺试剂,混合均匀后沸水中加热5 min。观察溶液颜色变化 DNA的粗提取与鉴定 3.实验结果: 溶有丝状物或沉淀物的试管变蓝,作空白对照的试管不变蓝。 【注意事项】 1．以血液为实验材料时，每100 mL血液中需要加入3 g柠檬酸钠，防止血液凝固。 2．加入酒精后用玻璃棒搅拌时，动作要轻缓，以免加剧DNA分子的断裂，导致DNA分子不能形成丝状物。 3．析出DNA时必须用“冷酒精”。预冷的酒精具有以下优点：①可抑制核酸水解酶的活性，进而抑制DNA降解；②抑制分子运动，使DNA易形成沉淀析出；③低温有利于增加DNA分子的柔韧性，减少其断裂。 4．实验中出现的丝状物的主要成分是DNA，实际上每一根“丝”都是由许多DNA分子聚集在一起形成的，应用玻璃棒沿一个方向缓慢搅拌，避免破坏DNA。 5．粗提取的DNA中可能含有少量的蛋白质等。 6．为减少DNA的损失，过滤过程一般使用纱布过滤。 7．二苯胺试剂要现用现配，否则会影响鉴定的效果。 基因工程的基本操作程序 任务三 培育转基因抗虫棉的简要过程 苏云金杆菌 提取 Bt基因 （目的基因） 与载体拼接 重组DNA分子 导入 棉花细胞 （受体细胞） 表达Bt基因 抗虫棉 普通棉花 （无抗虫特性） 1.目的基因的筛选与获取 2.基因表达载体的构建 3.将目的基因导入受体细胞 4.目的基因的检测与鉴定 第一步：目的基因的筛选与获取 1.目的基因：用于改变受体细胞性状或获得预期表达产物等的基因就是 目的基因。它主要是指编码蛋白质的基因。如与生物抗逆 性、生产药物、毒物降解、工业用酶等相关的基因 2.目的基因的筛选：从相关的已知结构和功能清晰的基因中进行筛选 是较为有效的方法之一 3.筛选目的基因的技术：随着测序技术的发展，以及序列数据库（如GenBank）、序列比对工具（如BLAST）等的应用，越来越多的基因的结构和功能为人们所知，这也为科学家找到合适的目的基因提供了更多的机会和可能 第一步：目的基因的筛选与获取 4.目的基因的获取 1.从基因文库中获取目的基因 （目的基因序列未知） 将含有某种生物不同基因的许多DNA片段，导入受体菌的群体中储存，各个受体菌分别含有这种生物的不同的基因，称为基因文库。（类比图书馆） 如果这个文库包含了某种生物的所有基因，那么，这种基因文库叫做基因组文库。如果这个文库只包含了某种生物的一部分基因，这种基因文库叫做部分基因文库。 2.人工合成：基因序列已知且程度不是很大的DNA片段可以通过反转录法或采用DNA合成仪人工合成。 反转录法 化学合成法 第一步：目的基因的筛选与获取 4.目的基因的获取 1.从基因文库中获取目的基因 （目的基因序列未知） 将含有某种生物不同基因的许多DNA片段，导入受体菌的群体中储存，各个受体菌分别含有这种生物的不同的基因，称为基因文库。（类比图书馆） 如果这个文库包含了某种生物的所有基因，那么，这种基因文库叫做基因组文库。如果这个文库只包含了某种生物的一部分基因，这种基因文库叫做部分基因文库。 2.人工合成：基因序列已知且程度不是很大的DNA片段可以通过反转录法或采用DNA合成仪人工合成。 3.常用PCR特异性地快速扩增目的基因 （基因序列部分或全部已知） 第一步：目的基因的筛选与获取 5.PCR技术： 在体外(PCR扩增仪)提供参与DNA复制的各种组分与反应条件，对目的基因的核苷酸序列进行大量复制的技术。 ①全称：聚合酶链式反应 ②原理：DNA半保留复制的原理 ③前提：一段已知目的基因的核苷酸序列。 ④条件：模板DNA 一对引物（两种） 热稳定DNA聚合酶（Taq酶) 4 种脱氧核苷酸dNTP(包括：dATP、dTTP、dCTP、 dGTP；作用：提供原料和能量) PCR扩增仪 第一步：目的基因的筛选与获取 5.PCR技术： 体外模拟DNA复制所需的基本条件 参与组分 在DNA复制中的作用 DNA母链 提供DNA复制的模板 4种脱氧核苷酸 合成DNA子链的原料 解旋酶(体外用高温代替) 打开DNA双链(破坏氢键) DNA聚合酶 催化合成DNA子链(形成磷酸二酯键) 引物 使DNA聚合酶能够从引物的3'端开始连接脱氧核苷酸 DNA聚合酶特性：不能从头合成DNA，只能从DNA的3′端开始延伸DNA链，因此，需要引物。 引物：是指能与DNA母链一段碱基序列互补配对的一小段DNA或RNA。使DNA聚合酶能够从引物的3’端开始连接脱氧核苷酸。 第一步：目的基因的筛选与获取 PCR的过程 当温度超过90℃时，双链DNA解聚为单链。 变 性 复 性 延 伸 变 性 90℃ 第一步：目的基因的筛选与获取 PCR的过程 当温度下降到 50 ℃左右时，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA 结合。 变 性 复 性 延 伸 50℃ 第一步：目的基因的筛选与获取 PCR的过程 变 性 复 性 延 伸 当温度上升到 72 ℃左右时，溶液中的 4 种脱氧核苷酸在耐高温的 DNA 聚合酶的作用下，根据碱基互补配对原则合成新的DNA 链。 第一轮循环的产物作为第二轮反应的模板，经过变性、复性和延伸三步产生第二轮循环的产物。第二轮循环的产物作为第三轮反应的模板，经过变性、复性和延伸三步产生第三轮循环的产物。 72℃ 第一步：目的基因的筛选与获取 归纳 PCR技术 VS DNA复制 PCR DNA复制 相同点 原理 原料 条件 不同点 解旋方式 场所 酶 结果 半保留复制；碱基互补配对 四种脱氧核苷酸 模板、能量、酶 DNA在高温下变性解旋 解旋酶催化 体外复制 细胞核内 热稳定的DNA聚合酶 细胞内的DNA聚合酶 大量的DNA片段 形成2个完整的DNA分子 目的基因以指数形式在短时间内大量扩增。 PCR的结果分析 1.PCR技术的示意图 (1)第二次循环结束后,体系中有3种长度不等的DNA单链(a、b、c)。 ①a表示原DNA的单链,共2条。 ②b是以a为模板合成的子链。 ③c表示以b为模板合成的子链。 (2)第三次循环后,体系中(a+b)DNA有2个,(b+c)DNA有4个,(c+c)DNA(两条链等长的DNA)有2个。 PCR的结果分析 2.PCR中的数量关系汇总 复制次数 1 2 3 n DNA分子数 2 4 8 2n 含引物的DNA分子数 2 4 8 2n 共消耗引物的对数 1=21-1 3=22-1 7=23-1 2n-1 含某种特定引物的DNA分子数 1=21-1 3=22-1 7=23-1 2n-1 同时含两种引物的DNA分子数 0=21-2 2=22-2 6=23-2 2n-2 脱氧核苷酸链等长的DNA分子数 0=21-2 0=22-4 2=23-6 2n-2n 第二步：基因表达载体的构建 1.基因表达载体构建的目的： 核心 ①使目的基因在受体细胞中稳定存在并遗传给子代； ②使目的基因能表达和发挥作用。 2.基因表达载体的构成： 基因操作中使用的外源基因即人们所需要的基因 便于重组DNA分子的筛选和鉴定 1.位置：基因的上游(一段有特殊结构的DNA片段) 2.功能：RNA聚合酶识别和结合的部位，驱动基因转录(定方向) 1.位置：基因的下游(一段特殊的DNA片断) 2.功能：终止转录 回顾对比 启动子&终止子 VS 起始密码子&终止密码子 项目 启动子&终止子 起始密码子&终止密码子 本质 位置 作用 DNA片段 RNA片段 基因上下游 mRNA 启动和终止转录过程 翻译的起点和终点 第二步：基因表达载体的构建 3.基因表达载体的构建过程： 首先会用一定的限制酶切割载体，使它出现一个切口 然后用同种限制酶或能产生相同末端的限制酶切割含有目的基因的DNA片段 再利用DNA连接酶将目的基因片段拼接到载体的切口处，这样就形成了一个重组DNA分子 第三步：将目的基因导入受体细胞 根据受体细胞的不同，导入的方法也不尽相同。 (1)花粉管通道法——我国独创的方法 ①用微量注射器将含目的基因的DNA溶液直接注入子房中。 ②在植物受粉后的一定时间内,剪去柱头,将DNA溶液滴加在花柱切面上,使目的基因借助花粉管通道进入胚囊。 1.导入植物细胞常用的方法 第三步：将目的基因导入受体细胞 (2)农杆菌转化法 ①转化:目的基因进入受体细胞内,并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程。 ②农杆菌的特点 a.自然条件下侵染双子叶植物和裸子植物,而对大多数单子叶植物没有侵染能力。 b.农杆菌细胞内含有Ti质粒,当它侵染植物细胞后,能将Ti质粒上的 T-DNA(可转移的DNA)转移到被侵染的细胞,并将其整合到该细胞的染色体DNA上。 1.导入植物细胞常用的方法 第三步：将目的基因导入受体细胞 ③农杆菌转化的过程 第三步：将目的基因导入受体细胞 第一次拼接： 将目的基因拼接到Ti质粒的T-DNA上 第一次导入： 将含目的基因的重组Ti质粒导入农杆菌 第二次导入： 将农杆菌导入植物细胞(含目的基因的T-DNA整合到受体细胞) 第二次拼接： 被插入目的基因的T-DNA拼接到受体细胞染色体的DNA上 第三步：将目的基因导入受体细胞 显微注射法 2.导入动物细胞常用的方法： 显微注射技术 目的基因表达载体 显微注射到受精卵中 受精卵发育 具有新性状的动物 ①体积大，易操作 ②全能性高 第三步：将目的基因导入受体细胞 原核生物的特点： 3.导入原核生物常用的方法： 繁殖快，多为单细胞，遗传物质相对较少。 一般先用Ca2+处理大肠杆菌细胞，使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA 分子的生理状态，然后再将重组的基因表达载体导入其中。 感受态 实质是：增加了细胞膜的通透性 大肠杆菌 第三步：将目的基因导入受体细胞 讨论： 1. 为什么培育转基因植物时，受体细胞可以是体细胞，也可以是受精卵？ 因为植物的体细胞具有全能性。 2. 为什么培育转基因动物时，受体细胞选用受精卵，而不能用体细胞？ 受精卵是全能性最高的，而高度分化的动物体细胞的全能性受到限制。 3. 当真核生物的基因(如胰岛素基因)导入原核生物为受体细胞时： ①若可以获得该蛋白，但是蛋白质无活性，原因可能是？ 原核生物缺少内质网和高尔基体等细胞器，无法对真核生物的蛋白质进行正确的加工 ②以上情况如何解决？ 人工体外再加工 或使用酵母菌等真核生物作为受体细胞 第四步：目的基因的检测与鉴定 目的基因进入受体细胞后，是否稳定维持和表达其遗传特性，只有通过检测与鉴定才能知道，这也是检查转基因技术是否培育成功的一步。 基因表达的过程 分子水平上的检测： ①检测目的基因是否插入 ②检测目的基因是否转录 ③检测目的基因是否翻译 DNA mRNA 蛋白质 PCR等技术 抗原—抗体杂交 个体生物学水平上的检测： 例如，通过采摘抗虫棉的叶片饲喂棉铃虫来确定Bt基因是否赋予了棉花抗虫特性以及抗性的程度。 DNA片段的扩增及电泳鉴定 任务四 DNA片段的扩增及电泳鉴定 1.实验原理 (1)DNA片段的扩增:PCR利用了DNA的热变性原理,通过调节温度来控制DNA双链的解聚与结合。 (2)DNA片段的电泳鉴定 ①DNA分子具有可解离的基团,在一定的pH下,这些基团可以带上正电荷或负电荷。 ②在电场的作用下,带电分子会向着与它所带电荷相反的电极移动,这个过程就是电泳。 ③在凝胶中DNA分子的迁移速率与凝胶的浓度、DNA分子的大小和构象等有关。 ④凝胶中的DNA分子通过染色,可以在波长为300 nm的紫外灯下被检测出来。 DNA片段的扩增及电泳鉴定 （2）操作步骤 PCR片段扩增 加液 离心 反应 用 按照一定的配方，在 中依次加入各组分 盖严离心管的盖子，放入 ，离心约10s 设置好PCR仪的循环程序，将装有 的微量离心管放入PCR仪中进行反应 微量移液器 微量离心管 离心机　 反应液 DNA片段的扩增及电泳鉴定 （2）操作步骤 制备凝胶 融化 倒模 凝固 用电泳缓冲液配制一定浓度的 溶液→在沸水浴或微波炉内加热至琼脂糖融化→稍冷却后加入适量的 混匀 将温热的琼脂糖溶液迅速倒入模具→插入合适大小的梳子以形成 。 待凝胶溶液完全凝固后,小心拔出梳子→取出凝胶放入电泳槽内 琼脂糖 核酸染料　 加样孔 DNA片段的扩增及电泳鉴定 （2）操作步骤 进行电泳 加液 加样 电泳 将 加入电泳槽中,没过凝胶1mm 将扩增得到的PCR产物与凝胶载样缓冲液(内含指示剂)混合→用微量移液器将混合液缓慢注入凝胶的 内;留一个加样孔加入 。 接通电源,设定电压;待 前沿迁移接近凝胶边缘时,停止电泳 电泳缓冲液　 加样孔 指示分子大小的标准参照物 指示剂 紫外灯 DNA片段的扩增及电泳鉴定 DNA片段的扩增及电泳鉴定 3.结果分析 (1)未出现扩增条带的主要原因 ①Taq DNA聚合酶失活。 ②引物出现质量问题。 ③Mg2+浓度过低。 ④变性时的温度低，变性时间短。 (2)出现非特异性扩增条带的主要原因 ①模板DNA出现污染。 ②引物特异性不强或形成引物二聚体。 ③Mg2+浓度过高。 ④复性时的温度过低等。 基因工程的应用 任务五 基因工程在农牧业方面的应用 基因工程在农牧业的应用现状概述 1996-2017年，全世界转基因作物种植面积增加了100多倍。 转基因作物的种植使化学农药的施用量减少了8.2%，作物产量增加了6.6×108t,增加经济效益1.3万亿。 美国是世界上转基因作物种植面积最大的国家，转基因棉花、大豆、玉米的种植面积占相关作物种植面积的比例都超过了90%。 2017年，我国转基因作物的种植面积位居世界第八位，商业化种植的转基因作物有棉花和番木瓜。 一、基因工程在农牧业方面的应用 基因工程的应用现状概述 几乎每年都有令人瞩目的研究成果报道，有些成果正在进入实用化和商业化开发的阶段； 2015年11月，第一种用于食用的转基因动物——转基因大西洋鲑（俗称“三文鱼”）在美国获得批准上市。 转基因鲑鱼（后排）和正常鲑鱼（前排） 转基因鲑鱼缩短了其成长周期，因此它受到的污染和体内聚集的有毒物质残留比普通鲑鱼少得多 一、基因工程在农牧业方面的应用 基因工程在农牧业中的应用发展迅速。已被广泛用于改良动植物品种、提高作物和畜产品产量等方面。 YUANHUAN 转基因抗虫植物 在农牧业方面的应用 转基因抗病植物 转基因抗除草剂植物 改良植物的品质 提高动物的生长速率 改良畜产品的品质 一、基因工程在农牧业方面的应用 转基因抗虫植物 从某些生物中分离出具有抗虫功能的基因，导入作物，使其具有抗虫性 1.培育方法： 转基因抗虫棉花、玉米、大豆、水稻、马铃薯等 2.实例： 减少因化学农药的使用而造成的环境污染和对人类健康的损害、降低生产成本、提高产量 3.优点： 转基因抗病植物 将来源于某些病毒、真菌等的抗病基因导入植物中，培 育出转基因抗病植物。 1.培育方法： 抗病毒转基因甜椒、番木瓜和烟草等 2.实例： 一、基因工程在农牧业方面的应用 转基因抗除草剂植物 将降解或抵抗某种除草剂的基因导入作物，可培育出 抗除草剂的作物品种。 1.培育方法： 转基因抗除草剂玉米、油菜和甜菜等。 2.实例： 改良植物的品质 提高植物的营养价值、观赏价值等。 1.目的： 2.实例： 将必需氨基酸含量多的蛋白质编码基因导入植物中，提高氨基酸的含量，科学家培育的某种转基因玉米中赖氨酸的含量比对照高30%。 将与植物花青素代谢相关的基因导入矮牵牛中，使它呈现出自然界没有的颜色变异，大大提高观赏价值。 一、基因工程在农牧业方面的应用 提高动物的生长速率 将外源生长激素基因导入动物体内，以提高动物的生长速率。 1.培育方法： 转基因鲤鱼、转基因小鼠。 2.实例： 在同等养殖条件下，转基因鲤鱼的生长速率比非转基因鲤鱼提高了42%〜115% 一、基因工程在农牧业方面的应用 改良畜产品的品质 有些人由于乳糖酶分泌少，不能完全消化牛奶中的乳糖，食用牛奶后会出现腹泻等不适症状，这称为乳糖不耐受。我国约有1/3的成年人乳糖不耐受。 一、基因工程在农牧业方面的应用 改良畜产品的品质 将肠乳糖酶基因导入奶牛的基因组，转基因牛分泌的乳汁中，乳糖的含量大大降低，而其他营养成分不受影响。 1.措施： 2.优点：避免食物过敏、腹泻、 恶心等不适。 有些人由于乳糖酶分泌少，不能完全消化牛奶中的乳糖，食用牛奶后会出现腹泻等不适症状，这称为乳糖不耐受。我国约有1/3的成年人乳糖不耐受。 二、基因工程在医药卫生领域方面的应用 对微生物或动植物的细胞进行基因改造，使它们能够生产药物，是目前基因工程取得实际应用成果非常多的领域。这些药物包括细胞因子、抗体、疫苗和激素等，它们可以用来预防和治疗人类肿瘤、心血管疾病、传染病、糖尿病和类风湿关节炎等。我国生产的重组人干扰素、血小板生成素、促红细胞生成素和粒细胞集落刺激因子等基因工程药物均已投放市场 01 02 03 在医药卫生领域方面的应用 用转基因动物作为器官移植的供体 让转基因哺乳动物批量生产药物 对微生物或动植物的细胞进行基因改造生产药物 二、基因工程在医药卫生领域方面的应用 1.药物类型：细胞因子、抗体、疫苗和激素等。 对微生物或动植物的细胞进行基因改造生产药物 2.应用：可以用来预防和治疗人类肿瘤、心血管疾病、传染病、糖尿病和类风湿关节炎等； 3.实例：我国生产的重组人干扰素、血小板生成素、促红细胞生成素和粒细胞集落刺激因子等 二、基因工程在医药卫生领域方面的应用 干扰素 干扰素是一种具有干扰病毒复制作用的糖蛋白，在临床上被广泛用于治疗病毒感染性疾病。此外，干扰素对治疗乳腺癌、淋巴瘤、多发性骨髓瘤和某些白血病等也有一定的疗效。传统生产干扰素的方法是从人血液中的白细胞内提取，每300 L血液只能提取出1 mg干 扰素。1980—1982年，科学家用基因工程方法 从大肠杆菌及酵母菌细胞内获得了干扰素，从 1 kg培养物中可以得到20〜40 mg干扰素。1993 年，我国批准生产重组人干扰素α-1b，它是我 国批准生产的第一个基因工程药物，目前主要 用于治疗慢性乙型肝炎、丙型肝炎等。 以侯云德院士（右）为首的研究人员，成功研制出我国第一个基因工程药物—重组人干扰素α-1b 二、基因工程在医药卫生领域方面的应用 1.实例：乳腺生物反应器或乳房生物反应器 让转基因哺乳动物批量生产药物 2.过程： 启动子具有物种和组织特异性 3.实例：目前已经在牛、山羊等动物的乳腺生物反应器中，获得了抗凝血酶、血清白蛋白、生长激素和α-抗胰蛋白酶等重要医药产品。 乳腺生物反应器与基因工程菌生产人的药用蛋白 乳腺生物反应器 基因工程菌 基因结构 动物基因结构与人类的基因结构基本相同 细菌的基因结构与酵母菌、人类的基因结构有较大差异 基因表达 合成的药用蛋白与天然蛋白质相同 细菌细胞内缺少内质网、高尔基体等细胞器,合成的蛋白质可能不具有生物活性 受体细胞 动物受精卵 微生物细胞 目的基因导入方式 显微注射法 感受态细胞法（Ca2+处理法） 生产条件 不需严格灭菌;温度等外界条件对其影响不大 需严格灭菌;严格控制基因工程菌所需的温度、pH、营养物质浓度等 外界条件 药物提取 从动物乳汁中提取 从微生物细胞或其培养液中 提取 二、基因工程在医药卫生领域方面的应用 乳汁中含有人生长激素的转基因牛 人治疗性抗体转基因奶牛 含有人凝血因子Ⅸ的转基因羊 注意：乳腺生物反应器实质是在动物的乳汁中生产一些具有重要价值产品的转基因动物的总称 二、基因工程在医药卫生领域方面的应用 拓展：膀胱生物反应器 继哺乳动物乳腺生物反应器研发成功后，膀胱生物反应器的研究也取得了成功。科学家培育出一种转基因小鼠，其膀胱上皮细胞可以合成人的生长激素并分泌到尿液中。 在研制膀胱生物反应器时，应使药用蛋白基因在什么细胞中特异性表达？它与乳腺生物反应器相比，有什么优点？ 膀胱上皮细胞 不受性别和生理期限制，且尿液蛋白质少，更容易分离药用蛋白 二、基因工程在医药卫生领域方面的应用 ①人体器官移植的难题： 用转基因动物作为器官移植的供体 人体移植器官短缺是世界性难题；免疫排斥 ②解决途径： 寻求可替代的移植器官，如用猪的器官来解决人类器官移植的来源问题 ③猪的优点： a.猪的内脏构造、大小、血管分布与人极为相似 b.猪体内隐藏的、可导致人类疾病的病毒远远少于灵长类动物 二、基因工程在医药卫生领域方面的应用 ③对猪的器官进行改造的方法： a.在器官供体的基因组中导入某种调节因子，以抑制抗原决定基因的表达； b.设法除去抗原决定基因，然后再结合克隆技术，培育出不会引起免疫排斥反应的转基因克隆猪器官。 用转基因动物作为器官移植的供体 导入人基因具特殊用途的猪和小鼠 三、基因工程在食品工业方面的应用 1.基因工程菌： 用基因工程的方法，使外源基因得到高效表达的菌类。 2.基因工程菌的应用： 利用基因工程菌，除了可以生产药物，还能生产食品工业用酶、氨基酸和维生素等 3.步骤： 基因工程构建基因工程菌 工业发酵批量生产 三、基因工程在食品工业方面的应用 4.实例： ①阿斯巴甜 一种普遍使用的甜味剂，主要由天冬氨酸和苯丙氨酸形成，这两种氨基酸可通过基因工程实现大规模生产。 ②凝乳酶 奶酪生产中用来凝聚固化奶中的蛋白质 制备方法：将编码牛凝乳酶的基因导入大肠杆菌、黑曲霉或酵母菌的基因组中，再通过工业发酵批量生产凝乳酶 ③淀粉酶、脂肪酶 加工转化糖浆需要淀粉酶，加工烘烤食物要用到脂酶 优点：基因工程获得的工业用酶的纯度更高，生产成本显著降低，生产效率较高。 ④其他 培育可以降解多种污染物的“超级细菌”来处理环境污染； 利用经过基因改造的微生物来生产能源。 ······ 蛋白质工程的原理和应用 任务六 一、蛋白质工程概述 1.蛋白质工程的概念： 蛋白质工程是指以蛋白质分子的结构规律及其与生物功能的关系作为基础，通过改造或合成基因，来改造现有蛋白质，或制造一种新的蛋白质，以满足人类生产和生活的需求。 2.基础： 蛋白质分子的结构规律及其与生物功能的关系作为基础 3.操作方法及对象: 改造或合成基因 4.结果： 改造现有蛋白质，或制造一种新的蛋白质 5.目的： 满足人类生产和生活的需求 6.与基因工程的关系： 它是在基因工程的基础上，延伸出来的第二代基因工程，是涉及多学科的综合科技工程。 一、蛋白质工程概述 7.相关学科及技术： 分子生物学、晶体学以及计算机技术 8.前景：目前，它已成为研究蛋白质结构和功能的重要手段，并将广泛应用于农业、医药工业和其他工业生产中。 9.困难：蛋白质发挥功能必须依赖正确的高级结构，而蛋白质的高级结构十分复杂。 二、蛋白质工程崛起缘由 1.基因工程的实质及不足 ①实质：基因工程是将一种生物的基因转移到另一种生物体内，使后者可以产生它原本不能产生的蛋白质，进而表现出新性状。 ②不足：基因工程原则上只能生产自然界中已经存在的蛋白质。 苏云金芽孢杆菌 产生 Bt基因 表达 伴胞晶体蛋白 (Bt抗虫蛋白) 破坏鳞翅目昆虫的消化系统 杀死棉铃虫 导入 目的基因 核DNA 培育 抗虫棉 天然蛋白质是生物长期进化过程中形成的，它们的结构和功能符合特定物种生存的需要，却不一定完全符合人类生产和生活的需要。 二、蛋白质工程崛起缘由 调控 赖氨酸 天冬氨酸激酶+二氢吡啶二羧酸合成酶 实例：提高玉米赖氨酸含量 （含量低） 含量升高 达到一定浓度 抑制 苏氨酸(352位） 异亮氨酸 天冬酰胺(104位) 赖氨酸产量提高（叶片提高5倍，种子2倍） 三、蛋白质工程的基本原理 蛋白质工程的概念： 蛋白质工程是指以蛋白质分子的结构规律及其与生物功能的关系作为基础，通过改造或合成基因，来改造现有蛋白质，或制造一种新的蛋白质，以满足人类生产和生活的需求。 1.蛋白质工程的目标： 根据人们对蛋白质功能的特定需求，对蛋白质的结构进行设计改造。 思考：为什么蛋白质工程需改造基因而不是直接改造蛋白质？ (1)任何一种天然蛋白质都是由基因编码的，改造了基因即对蛋白质进行了改造，而且可以遗传下去。如果对蛋白质直接改造，即使改造成功，被改造的蛋白质也是无法遗传的。 (2)对基因进行改造比对蛋白质直接改造更容易操作，难度要小得多。 三、蛋白质工程的基本原理 2.天然蛋白质合成过程： 按照中心法则进行 基因 转录 mRNA 翻译 形成具有特定氨基酸序列的多肽链 形成具有高级结构的蛋白质 行使生物功能 三、蛋白质工程的基本原理 3.蛋白质工程的基本思路： 逆中心法则，与天然蛋白质合成的过程相反 从预期的蛋白质功能出发→设计预期的蛋白质结构→推测应有的氨基酸序列→找到并改变相对应的脱氧核苷酸序列（基因）或合成新的基因→获得所需要的蛋白质。 思考·讨论 蛋白质工程基本思路的应用 某多肽链的一段氨基酸序列是： 讨论1．怎样得出决定这一段肽链的脱氧核苷酸序列？请把相应的碱基序列写出来。 查密码子表得知：丙氨酸（GCU、GCC、GCA、GCG)、色氨酸(UGG)、赖氨酸(AAA、AAG）、谷氨酸（GAA、GAG）、苯丙氨酸（UUU、UUC） mRNA序列为： GCU（或C或A或G）UGG AAA（或G）GAA（或G）UUU（或C） DNA序列为： CGA（或G或T或C）ACC TTT（或C）CTT（或C）AAA（或G） GCT（或C或A或G）TGG AAA（或G）GAA（或G）TTT（或C） 思考·讨论 蛋白质工程基本思路的应用 某多肽链的一段氨基酸序列是： 讨论2．确定目的基因的碱基序列后，怎样才能合成或改造目的基因？ 确定目的基因的碱基序列后，可以人工合成目的基因或从基因文库中获取目的基因。对基因的改造经常会用到基因定点突变技术来进行碱基的替换、增添等。 据氨基酸的性质和特点，设计并制造出自然界中不存在的全新蛋白质。 大改： 在蛋白质分子中替换某一个肽段或某一个特定的结构域。 中改： 利用基因工程中的定点诱变技术，改造蛋白质分子某活性部位的一个或几个氨基酸残基 小改： 延伸：蛋白质工程和基因工程的比较 项目 蛋白质工程 基因工程 操作对象 操作起点 操作水平 操作流程 结果 实质 基因 基因 预期的蛋白质功能 目的基因 DNA分子水平 DNA分子水平 预期蛋白质功能→设计蛋白质结构→推测氨基酸序列→找到并改变对应的脱氧核苷酸序列（基因）或合成新基因→获得所需要的蛋白质 目的基因的筛选与获取→构建基因表达载体→将目的基因导入受体细胞→目的基因的检测与鉴定 可生产自然界没有的蛋白质 生产自然界已有的蛋白质 通过改造或合成基因来定向改造现有蛋白质或制造新的蛋白质 将一种生物的基因转移到另一种生物体内，后者可以产生它本不能产生的蛋白质，进而表现出新的性状 四、蛋白质工程的应用 1.医药工业方面 （1）研发速效胰岛素类似物 天然胰岛素易形成二聚体或六聚体 预期功能 降低胰岛素的聚合作用 设计结构 改变B链第20～29位氨基酸组成 推测序列 B28位脯氨酸替换为天冬氨酸或将它与B29位的赖氨酸交换位置 改造 新胰岛素基因 转录 mRNA 翻译 多肽链 折叠 预期结构 行使功能 有效抑制胰岛素的聚合 速效胰岛素 四、蛋白质工程的应用 1.医药工业方面 干扰素在体外保存相当困难 将干扰素分子上的一个半胱氨酸变成丝氨酸 在-70℃下干扰素可保存半年 天然干扰素 （体外保存困难） 半胱氨酸 丝氨酸 改造后的干扰素 （-70℃可保存半年） (2)延长干扰素体外保存时间 四、蛋白质工程的应用 1.医药工业方面 医学问题：小鼠单克隆抗体会使人体产生免疫 反应，从而导致治疗效果大大降低。 解决办法： 通过改造基因，将小鼠抗体上结合抗 原的区域（即可变区）“嫁接”到人的 抗体（即恒定区）上，经过这样改造 的抗体诱发免疫反应的强度就会减低 很多。 (3).改造抗体 四、蛋白质工程的应用 2. 在其他工业方面 如利用蛋白质工程获得枯草杆菌蛋白酶的突变体，筛选出符合工业化生产需求的突变体，提高该酶的使用价值。 (1)改进酶的性能或开发新的工业用酶 枯草杆菌 枯草杆菌蛋白酶 四、蛋白质工程的应用 3、农业方面 科学家正在尝试改造某些参与调控光合作用的酶，以提高植物光合 作用的效率，增加粮食的产量。 ①改造某些参与调控光合作用的酶 伊维菌素是新型的广谱、高效、低毒抗生素类抗寄生虫药 (2)设计优良微生物农药，通过改造微生物蛋白质的结构，使它防治病虫害的效果增强。 五、蛋白质工程面临的困难： 蛋白质工程是一项难度很大的工程，主要是因为蛋白质发挥功能必须依赖于正确的高级结构，而这种高级结构往往十分复杂。要设计出更加符合人类需要的蛋白质，还需要不断地攻坚克难。随着科技的深入发展，蛋白质工程将会给人类带来更多的福祉。 由计算机建立的血红蛋白三维结构模型 四 级 结 构 二 级 结 构 一级结构 二级结构 三级结构 四级结构 拓展：人类蛋白质组计划 人类蛋白质组计划是继人类基因组计划之后，生命科学乃至自然科学领域重大的国际合作科研项目。2001年，国际人类蛋白质组组织宣布成立。2003年，该组织正式提出启动两项重大国际合作项目：一项是由中国科学家牵头执行的“人类肝脏蛋白质组计划”；另一项是由美国科学家牵头执行的“人类血浆蛋白质组计划”，由此拉开了人类蛋白质组计划的帷幕。 “人类肝脏蛋白质组计划”是国际上第一个人类组织器官的蛋白质组计划，由我国贺福初院士牵头，这是中国科学家第一次领衔重大国际科研协作计划。它的目标是通过对肝脏蛋白质高通量、规模化的研究，解析肝脏蛋白质在生理、病理过程中的功能意义，为重大肝病的预防、诊断、治疗和新药的研发提供重要的科学依据。人类蛋白质组计划取得的成果有力推动了蛋白质工程的发展，为它提供了重要的理论支持。2014年6月，中国人类蛋白质组计划启动。 3.基因结构 拓展 2.PCR引物的设计 1.限制酶的选择原则 4.反转录 拓展一 限制酶的选择原则 限制酶的选择原则 思考：应选择哪种限制酶切割获取目的基因(图甲)和载体(图乙)，并将二者组装起来？ (1)应选择切点位于目的基因两端的限制，如图甲可选择Pst Ⅰ。 不能选择切点位于目的基因内部的限制酶，如图甲不能选择SmaⅠ。 限制酶的选择原则 思考：应选择哪种限制酶切割获取目的基因(图甲)和载体(图乙)，并将二者组装起来？ (2)切割质粒时,一般所选限制酶要与切割目的基因的限制酶一致,以确保具 有相同的黏性末端。 【注意】 ① 质粒作为载体必须具备标记基因、启动子和终止子等，所以所选择的限制酶尽量不要破坏这些结构；② 切割位点应位于启动子和终止子之间以利于目的基因的插入和表达； ③ 若所选限制酶的切点不是一个，则切割重组后可能丢失某些片段（如丢失复制原点区）,则重组DNA进入受体细胞后不能自主复制。 限制酶的选择原则 思考：应选择哪种限制酶切割获取目的基因(图甲)和载体(图乙)，并将二者组装起来？ (3)为避免目的基因和质粒的自身环化和随意连接，可使用两种不同的限制 酶切割目的基因和质粒， 如图甲可选择用PstⅠ和EcoRⅠ两种限制酶(但要确保质粒上也有这两种限制酶的切点，且位置合适)。 目的基因和质粒的自身环化和随意连接 【例题1】 若要利用某目的基因(图甲)和P1噬菌体载体(图乙)构建重组DNA(图丙),限制性内切核酸酶的识别序列和酶切位点分别是BglⅡ(AG↓ATCT)、EcoRⅠ(GA↓ATTC)和Sau3AⅠ(↓GATC)。下列分析最合理的是（ ） A.用EcoRⅠ切割目的基因和P1噬菌体载体 B.用BglⅡ和EcoRⅠ切割目的基因和P1噬菌体载体 C.用BglⅡ和Sau3AⅠ切割目的基因和P1噬菌体载体 D.用EcoRⅠ和Sau3AⅠ切割目的基因和P1噬菌体载体 D 【例题2】 图1是通过基因工程制备乙肝表面抗原(HbsAg)从而获得乙肝疫苗的过程。步骤①和③需要用合适的限制酶切割含有乙肝表面抗原基因的DNA片段和质粒,部分限制酶的识别序列及位置如图2。质粒中的启动子是质粒中基因得以正常表达所必需的部分。LacZ基因控制合成某种酶,该酶能分解X-gal产生蓝色物质,使菌落呈现蓝色,否则菌落为白色。 (1)在图1步骤④中,使用的基因工程工具酶是　　　　　    ,将一个乙肝表面抗原基因与一个质粒重组的过程中,游离的磷酸基团数目减少　　    个。 (2)根据图2,为了避免自身环化及便于筛选,切割质粒选用的限制酶是　　　　　　　    　　 　　　　,获得乙肝表面抗原基因选用的限制酶是　　　　　　　                         。 DNA连接酶 4 BamHⅠ和HindⅢ BclⅠ和HindⅢ (3)为筛选能表达乙肝表面抗原的大肠杆菌细胞,需要将大肠杆菌接种到含　　　　　　    　　　　　　 　　   的固体培养基上,挑选　　　    的菌落纯化培养。 (4)通过基因工程生产的疫苗与灭活或减毒的病原微生物的疫苗,在安全性方面的比较结果及理由是　　 　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　    。 氨苄青霉素和X-gal 白色 利用基因工程生产的疫苗更安全,因为该疫苗只含病毒蛋白,不含病毒核酸,不会出现病毒侵染的情况 拓展二 PCR引物的设计 PCR技术中引物的选择 思考并回答下列有关引物的问题。 (1)引物的本质是什么？ 引物是一小段能与DNA母链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸，既可以是DNA单链，也可以是RNA单链。细胞内的DNA进行复制时，也需要引物，一般是RNA片段。 (2)用于PCR的引物的长度通常为多少个核苷酸？ 用于PCR的引物长度通常为20～30个核苷酸。 PCR技术中引物的选择 思考并回答下列有关引物的问题。 (3)细胞内DNA复制时是否需要引物？为什么？ 需要。因为DNA聚合酶不能从头开始合成DNA单链，只能将游离的脱氧核苷酸连接在一条DNA单链的3′端，所以在延伸子链前，需要提前合成一小段RNA或DNA作为引物。 (4)利用PCR扩增目的基因时，为什么要用2种不同的引物？ DNA是两条反向平行的双链结构，而复制时只能从固定的方向(模板链的3′端)开始，所以引物的碱基序列是不同的。 思考并回答下列有关引物的问题。 (5)如果已知某目的基因的序列和结构，利用PCR筛选和扩增出该目的基因的关键是什么？ 根据目的基因两端的核苷酸序列设计引物。 (6)设计引物需要注意的问题是什么？ PCR技术中引物的选择 引物自身不能有互补的序列 两种引物之间不能有互补的序列 引物不能太短，避免特异性不强。引物短可与模板链多处进行碱基互补配对 5’-ACGATTAC······TCCGGATAA-3’（α链） 3’-TGCTAATG······AGGCCTATT-5’（β链） PCR技术中引物的选择 ←引物扩增的方向 引物扩增的方向→ 3’-ATT-5’（引物2） （引物1）5’-ACG-3’ 引物与待扩增序列（目的基因）的对应关系如下： 引物1与待扩增基因中部分序列(α链)相同。在此情况下，引物1结合 的是β链，向着和α链相同的方向扩增，即“同向相同，同向扩增”。 引物2与待扩增基因中部分序列(α 链)反向互补。这种情况下，引物2 与α链结合，并向着和α链相反的方 向扩增，即“反向互补，反向扩增” PCR技术中引物的选择 解题突破点 1 引物应位于目的基因两侧，且能顺利扩增出目的基因 2 引物只能与母链的3'端结合。引物只能引导子链从5'端向3'端延伸   3 为了便于扩增的DNA片段与表达载体连接，可在引物的5'端加上限制酶的识别序列， 且常在两种引物上设计不同的酶切位点，保证目的基因与载体的正向连接 PCR技术中引物的选择 试一试： 反向PCR技术扩增 1. [2025江西宜春模拟](多选)常规PCR只能扩增两引物间的DNA区段，要扩增已知DNA 序列两侧的未知DNA序列，可用反向PCR技术。反向PCR技术扩增的原理如图所示。下列叙述正确的是（ ） PCR技术中引物的选择 A.切割M和N时选用的限制酶可以相同，也可以不同 B.环化之后产生的DNA分子没有游离的磷酸基团 C扩增时，应选择图中引物1和引物4，且二者间不能互补配对 D.PCR仪设置温度时，一个循环一次是高温变性、中温复性、低温延伸 答案：ABC 解析： 由酶切片段推出环状DNA的5’端和引物的5’端与3’端 5’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 5’ 3’ 5’ 3’ 突破点1、2： PCR过程中需要两种引物，引物引导子链从5’端向3’端延伸，为保证扩增的是已知序列两侧的未知序列，故应该选择引物1与引物4，且二者间不能互补配对。 C正确。 切割M和N时选用的限制酶要保证产生相同的黏性末端，可以选相同的限制酶，也可以选不同的限制酶，A正确。 环状DNA分子没有游离的磷酸基团， B正确。 PCR技术的操作步骤依次是高温使DNA变性、低温复性(使DNA单链与引物结合)、中温延伸，D错误。 PCR技术中引物的选择 新角度：设计引物时应满足什么条件 科研人员将高产基因和抗除草剂草甘膦基因作为目的基因，利用重叠延 伸PCR技术构建融合基因，从而培育出既高产又抗草甘膦的转基因大豆。融合基因构建 过程如图1所示，所用Ti质粒及限制酶切割位点如图2所示。回答下列问题： PCR技术中引物的选择 (1)图1中，两条杂交链的获得都至少需要经过 次扩增循环。 PCR1与PCR2的产 物能够形成杂交链的条件是 。PCR3过程不需要引物，其原因是 PCR技术中引物的选择 (2)若要将获得的融合基因用于构建基因表达载体，应选用引物 对融合基因进行 PCR扩增，为了保证扩增后的融合基因能正向插人Ti质粒中，在设计这两种引物时应满足的条件是 . PCR技术中引物的选择 (3)将融合基因导入农杆菌需用Ca2+先处理农杆菌，目的是 . 利用农杆菌转化法将融合基因导入农杆菌、大豆细胞的过程中，需要筛选两次，这两次 筛选分别是 . 2. (1)突破点2： 图1中，目的基因经过一次循环可得到含有引物P2或引物P3的单链，但引物P2端和引物P3端都为相应链的5'端，不可直接延伸子链。为了使杂交链顺利延伸子链，至少需要经过2次循环才能得到如图1所示的引物P2端和引物P3端都为相 应链的3'端的杂交链。为实现PCR1的产物能与PCR2的产物融合，设计引物时应该考虑引物 P2的5'端与引物P3的5'端的一小段DNA序列互补配对。据图1可知，两条杂交链3'端的碱基序列可以作为子链合成的引物，因此PCR3过程中不需要引物。 (2)据图1分析，扩增获得的融合基因，需要引物P1和P4。 突破点3： 构建基因表达载体时，融合基因应插入Ti质粒的启动子和终止子之间，因此需用限制酶NheI、XmaI切割质粒。要保证融合基因能够正向插入Ti质粒中，融合基因在扩增后能够被限制酶NheI、XmaI切割，且插入的融合基因的转录方向应与质粒上启动子的方向一致，因此需在引物P1的5'端加上限制酶Nhe I的识别序列，在引物P4的5'端加上限制酶XmaI的识别序列。   (3)用Ca2+先处理农杆菌，其目的是使农杆菌能够吸收周围环境中的DNA分子。两次筛选情况分析如表：   第一次是筛选出含重 组质粒的农杆菌 构建基因表达载体时，重组质粒中卡那霉素抗性基因被破坏，潮霉素 抗性基因完整，因此需筛选出能在含潮霉素培养基上生长而不能在 含卡那霉素培养基上生长的农杆菌   第二次是筛选出导入 目的基因的大豆细胞 用该农杆菌去感染大豆细胞，由于融合基因中含有草甘膦抗性基因， 因此在添加草甘膦的培养基中能够生长的大豆细胞为导入融合基因 的细胞 参考答案： (1)2 引物P2和引物P3的5'端存在部分碱基互补配对的序列  两条杂交链3'端 的碱基序列可以作为子链合成的引物 (2)P1和P4 在引物P1的5'端加上限制酶Nhe I的识别序列，在引物P4的5'端加上限制酶XmaI的识别序列 (3)使其能够吸收周围环境中的 DNA 先筛选出能在含潮霉素培养基上生长而不能在含卡那霉素培养基上生长的农杆菌，再 用含草甘膦的培养基筛选出导入融合基因的大豆细胞(合理即可) 拓展三 原核生物与真核生物的基因结构 原核生物与真核生物的基因结构 一、原核生物的基因结构 与RNA聚合酶的结合位点 编码区 非编码区 非编码区 编码区上游 启动子 编码区下游 终止子 原核生物的基因结构 编码区： 非编码区： 编码蛋白质，连续不间断 不编码蛋白质，调控遗传信息表达 上游有启动子， 下游有终止子 原核生物与真核生物的基因结构 二、真核生物的基因结构 与RNA聚合酶的结合位点 编码区 非编码区 非编码区 编码区上游 启动子 编码区下游 终止子 真核生物的基因结构 编码区： 非编码区： 外显子：能编码蛋白质的序列 不编码蛋白质，调控遗传信息表达 上游有启动子， 下游有终止子 外显子 内含子 内含子：不能编码蛋白质的序列 非编码序列：包括非编码 区和内含子 原核生物 真核生物 示意图 不同点 编码区是连续的 编码区是间隔的、不连续的 相同点 都由能够编码蛋白质的编码区和具有调控作用的非编码区区组成的 真核细胞VS原核细胞的基因结构 真核细胞与原核细胞转录的不同 拓展四 反转录 反转录 反转录是以RNA为模板，通过反转录酶，合成DNA的过程。是DNA生物合成的一种特殊方式。 反转录是进行基因工程过程中，以RNA为模板提取出DNA遗传信息的过程。 RNA RNA-DNA复合物 单链DNA cDNA分子 反转录酶（逆转录酶） 水解RNA链 DNA聚合酶 人为地提取出所需要的目的基因的信使RNA，并以之为模板人工合成DNA。 反转录酶的作用是以dNTP为底物，以RNA为模板，按5′→3′方向，合成一条与RNA模板互补的DNA单链，这条DNA单链叫做互DNA(complementary DNA, cDNA)，它与RNA模板形成RNA-DNA杂交体。随后又在反转录酶的作用下，水解掉RNA链，再以cDNA为模板合成第二条DNA链。至此，完成由RNA指导的DNA合成过程。 1．(2024·安徽卷)下列关于“DNA 粗提取与鉴定”实验的叙述，错误的是(　　) A．实验中如果将研磨液更换为蒸馏水，DNA提取的效率会降低 B．利用DNA和蛋白质在酒精中的溶解度差异，可初步分离DNA C．DNA在不同浓度NaCl溶液中溶解度不同，该原理可用于纯化DNA粗提物 D.将溶解的DNA粗提物与二苯胺试剂反应，可检测溶液中是否含有蛋白质杂质 D 解析：研磨液有利于DNA的溶解，换为蒸馏水，DNA提取的效率会降低，A正确；DNA不溶于酒精溶液，但细胞中的某些蛋白质溶于酒精，可分离DNA，B正确；DNA在NaCl溶液中的溶解度随着NaCl浓度的变化而改变，因此可用不同浓度的NaCl溶液对DNA进行粗提取，C正确；在沸水浴的条件下，DNA遇二苯胺会被染成蓝色，二苯胺试剂用于鉴定DNA，D错误。 高 考 真 题 2．(2024·湖南卷)某同学将质粒DNA进行限制酶酶切时，发现DNA完全没有被酶切，分析可能的原因并提出解决方法。下列叙述错误的是(　　) A．限制酶失活，更换新的限制酶 B．酶切条件不合适，调整反应条件如温度和酶的用量等 C．质粒DNA突变导致酶识别位点缺失，需更换正常质粒DNA D．酶切位点被甲基化修饰，换用对DNA甲基化不敏感的限制酶 B 解析：限制酶失活会使DNA完全不被酶切，此时应更换新的限制酶，A正确；酶切条件不合适可能使酶失活，导致DNA完全没有被酶切，需调整反应条件如温度和pH等，但酶用量过多或过少都不会出现DNA完全没有被酶切的情况，B错误；质粒DNA突变可能导致限制酶识别位点缺失，进而造成限制酶无法进行切割，此时应更换为正常质粒，C正确；质粒DNA上酶切位点被甲基化修饰，会导致对DNA甲基化敏感的限制酶无法进行酶切，此时应换用对DNA甲基化不敏感的限制酶，D正确。 高 考 真 题 3．(2023·新课标卷)某同学拟用限制酶(酶1、酶2、酶3 和酶4)、DNA 连接酶为工具，将目的基因(两端含相应限制酶的识别序列和切割位点)和质粒进行切割、连接，以构建重组表达载体。限制酶的切割位点如图所示。 下列重组表达载体构建方案合理且效率最高的是(　　) A．质粒和目的基因都用酶3切割，用E.coli DNA连接酶连接 B．质粒用酶3切割，目的基因用酶1切割，用T4 DNA连接酶连接 C．质粒和目的基因都用酶1和酶2切割，用T4 DNA连接酶连接 D．质粒和目的基因都用酶2和酶4切割，用E.coli DNA连接酶连接 C 高 考 真 题 解析：酶3切割后产生平末端，E.coli DNA连接酶连接具有平末端的DNA片段的效率非常低，A不符合题意；若用酶3切割质粒，酶1切割目的基因，两者产生的末端无法连接在一起，B不符合题意；酶1和酶2切割后产生不同的黏性末端，T4 DNA连接酶既可连接黏性末端，也可连接平末端，若用酶1和酶2同时切割质粒和目的基因，并用T4 DNA连接酶连接，则既可避免质粒和目的基因的自身环化，又能保证目的基因依据正确方向插入质粒，C符合题意；酶4切割位点位于抗生素抗性基因(标记基因)内部，酶切后会破坏标记基因，D不符合题意。 高 考 真 题 4．(2024·江西卷)γ－氨基丁酸在医药等领域有重要的应用价值。利用L－谷氨酸脱羧酶(GadB)催化L－谷氨酸脱羧是高效生产γ－氨基丁酸的重要途径之一。研究人员采用如图方法将酿酒酵母S的L－谷氨酸脱羧酶基因(gadB)导入生产菌株E.coliA，构建了以L－谷氨酸钠为底物高效生产γ－氨基丁酸的菌株E.coliB。下列叙述正确的是 (　　) A．上图表明，可以从酿酒酵母S中分离得到 目的基因gadB B．E.coliB发酵生产γ－氨基丁酸时，L－谷氨 酸钠的作用是供能 C．E.coliA和E.coliB都能高效降解γ－氨基丁酸 D．可以用其他酶替代NcoⅠ和KpnⅠ构建重组质粒 A 高 考 真 题 解析：题意显示，研究人员采用题图方法将酿酒酵母S的L－谷氨酸脱羧酶基因(gadB)导入生产菌株E.coliA，说明可以从酿酒酵母S中分离得到目的基因gadB，A正确；题意显示，用L－谷氨酸脱羧酶(GadB)催化L－谷氨酸脱羧是高效生产γ－氨基丁酸的重要途径之一，E.coliB中能表达L－谷氨酸脱羧酶(GadB)，因此可用E.coliB发酵生产γ－氨基丁酸，该过程中L－谷氨酸钠的作用不是供能，B错误；E.coliA中没有L－谷氨酸脱羧酶(GadB)，因而不能降解L－谷氨酸，而E.coliB中含有该酶的基因，因而能高效降解γ－氨基丁酸，C错误；图中质粒上含有NcoⅠ 和KpnⅠ的酶切位点，因而不可以用其他酶替代NcoⅠ和KpnⅠ构建重组质粒，D错误。 高 考 真 题 5．(2024·辽宁卷)将天然Ti质粒改造成含有Vir基因的辅助质粒(辅助T－DNA转移)和不含有Vir基因、含有T－DNA的穿梭质粒，共同转入农杆菌，可提高转化效率。细菌和棉花对密码子偏好不同，为提高翻译效率，增强棉花抗病虫害能力，进行如下操作。回答下列问题。 注：F1－F3，R1－R3表示引物；T－DNA－LB表示左边界；T－DNA－RB 表示右边界；Ori表示复制原点；KanR表示卡那霉素抗性基因；HygBR表示潮霉素B抗性基因。 高 考 真 题 (1)从苏云金杆菌提取DNA时，需加入蛋白酶，其作用是_____________________________________。提取过程中加入体积分数为95%的预冷酒精，其目的是_________。 (2)本操作中获取目的基因的方法是________________和________________。 (3)穿梭质粒中p35s为启动子，其作用是___________________________，驱动目的基因转录；插入两个p35s启动子，其目的可能是________。 (4)根据图中穿梭质粒上的KanR和HygBR两个标记基因的位置，用________基因对应的抗生素初步筛选转化的棉花愈伤组织。 水解蛋白质，使得DNA与蛋白质分离 溶解蛋白质等物质，析出不溶于酒精的DNA PCR技术扩增 人工合成 RNA聚合酶识别并结合的部位 同时实现两个目的基因的共同表达及调控，从而降低基因工程的成本与复杂性 HygBR 高 考 真 题 (5)为检测棉花植株是否导入目的基因，提取棉花植株染色体DNA作模板，进行PCR，应选用的引物是________和________。 (6)本研究采用的部分生物技术属于蛋白质工程，理由是__________。 A．通过含有双质粒的农杆菌转化棉花细胞 B．将苏云金杆菌Bt基因导入棉花细胞中表达 C．将1－1362基因序列改变为棉花细胞偏好密码子的基因序列 D．用1－1362合成基因序列和1363－1848天然基因序列获得改造的抗虫蛋白 F3　 　R2 　CD 高 考 真 题 解析：(1)从苏云金杆菌提取DNA时，需加入蛋白酶，其作用是水解蛋白质，使得DNA与蛋白质分离。提取过程中加入体积分数为95%的预冷酒精，其目的是溶解蛋白质等物质，析出不溶于酒精的DNA。 (2)本操作中获取目的基因的方法是人工合成和PCR技术扩增。 (3)穿梭质粒中p35s为启动子，其作用是RNA聚合酶识别并结合的部位，驱动目的基因转录；插入两个p35s启动子，其目的可能是同时实现两个目的基因的共同表达及调控，从而降低基因工程的成本与复杂性。 高 考 真 题 (4)结合基因表达载体的示意图，根据图中穿梭质粒上的KanR和HygBR两个标记基因的位置，用HygBR基因对应的抗生素初步筛选转化的棉花愈伤组织。 (5)为检测棉花植株是否导入目的基因，提取棉花植株染色体DNA作模板，进行PCR，应选用的引物是F3和R2。 (6)蛋白质工程是指以蛋白质分子的结构规律及其与生物功能的关系作为基础，通过改造或合成基因，来改造现有蛋白质，或制造一种新的蛋白质，以满足人类生产和生活的需求。本研究采用的部分生物技术属于蛋白质工程，理由是将1－1362基因序列改变为棉花细胞偏好密码子的基因序列、用1－1362合成基因序列和1363－1848天然基因序列获得改造的抗虫蛋白，A、B不符合题意，C、D符合题意。 高 考 真 题 Lavf57.62.100 (4) —取出凝胶置于______下观察和照相 Lavf58.20.100 $$