3.2基因工程的基本操作程序课件-2024-2025学年高二下学期生物人教版选择性必修3

第2节 基因工程的基本操作程序 第3章 基因工程 1 从社会中来 1997年,我国政府首次批准商业化种植转基因抗虫棉。到2015年,我国已育成转基因抗虫棉新品种100多个,减少农药用量40万吨,增收节支社会经济效益450亿元。 普通棉花 转基因抗虫棉 2 培育转基因抗虫棉的简要过程 重组DNA分子 1.目的基因的筛选与获取 2.基因表达载体的构建 3.将目的基因导入受体细胞 4.目的基因的检测与鉴定 苏云金杆菌 Bt蛋白基因 棉花细胞 (核心) 抗虫棉 培育转基因抗虫棉一般需要哪些步骤呢? 载体载着什么呢?目的基因。 载着目的基因区干嘛?有了目的基因,我们才能赋予一种生物以另一种生物的遗传特性。使目的基因在受体细胞中稳定存在,并可进行遗传、表达和发挥作用。 载体进入受体细胞稳定表达,才能实现一种生物的基因在另一种生物中的转化。 才能确定目的基因是否真正在受体细胞中稳定遗传和正确表达。 3 第一步:目的基因的筛选与获取 1 目的基因 (1)概念: 在基因工程的设计和操作中,用于改变受体细胞性状或获得预期表达产物等的基因。 主要指的是编码蛋白质的基因,也可以是一些具有调控作用的因子。 (2)实例: 抗逆性基因 生产药物基因 毒物降解基因 工业用酶基因 抗虫棉 产生胰岛素的基因 编码蛋白质的基因 产生果胶酶的基因 4 一 注意: 所有的基因都编码蛋白质或肽链。 基因的种类一般分为结构基因、转录基因和调控基因。 结构基因的功能: 具有转录和翻译功能,能控制生物性状(编码蛋白质或肽链)。 转录基因的功能: 只有转录功能,没有翻译功能,能转录形成tRNA和rRNA。 调控基因的功能: 不能进行转录和翻译,只能调控其他基因的表达。 知识拓展:基因 不是 5 基因1 基因2 基因3 DNA片段 放大 基因通常是 。 非编码区 非编码区 编码区 能转录相应的mRNA,进一步编码(翻译)出蛋白质的DNA区段 不直接编码蛋白质,能调控基因表达 不直接编码蛋白质,能调控基因表达 知识拓展 :基因的结构 有遗传效应的DNA片段 ——通常能编码特定的蛋白质 在人类基因组中,非编码区占比超过98%,远超编码区(约2%) 6 1、原核细胞的基因结构 知识拓展 :基因的结构 编码区(基因) 非编码区 非编码区 启动子 RNA聚合酶识别并结合的位点,驱动基因转录出mRNA 启动子 终止子 本质: 位置: 作用: 是一段有特殊序列结构的DNA片段; 位于基因上游; 也是一段有特殊序列结构的DNA片段; 位于基因下游; 终止转录 本质: 位置: 作用: 终止子 编码区上游 编码区下游 7 2、真核细胞的基因结构 启动子 前体mRNA 转录 成熟mRNA 汉水丑生侯伟作品 终止子 编码区上游 编码区下游 剪切、拼接 外显子 内含子 外显子 内含子 能转录相应的mRNA,进一步能编码蛋白质的DNA序列。 能转录相应的mRNA,但却不能编码蛋白质的DNA序列。 编码区(基因) 非编码区 非编码区 知识拓展 :基因的结构 不编码氨基酸的序列在RNA自身的催化作用下被切除 8 原核细胞 真核细胞 不同点 编码区是 的 编码区是间隔的、 的 相同点 都由能够 的编码区和具有 作用的非编码区组成的 连续 不连续 3、原核细胞与真核细胞的基因结构比较 (2)编码相同数目氨基酸的蛋白质,原核细胞与真核细胞基因结构一样长吗? (1)非编码序列: 包括非编码区和内含子 【思考】 真核细胞基因结构更长,因为真核生物的基因还包括内含子(不编码蛋白质)。 编码蛋白质 调控 原核生物的基因:不能编码蛋白质的序列= 非编码区 真核生物的基因:不能编码蛋白质的序列= 非编码区+内含子 9 第一步:目的基因的筛选与获取 2 目的基因的筛选 (1)较为有效的方法:从相关的已知结构和功能清晰的基因中筛选。 苏云金杆菌 制成 杀虫剂 掌握目的基因的功能 掌握目的基因的结构 防治棉花害虫 发现杀虫作用与Bt基因有关 掌握Bt基因的序列 深入了解Bt基因的表达产物(Bt抗虫蛋白) Bt基因是培育转基因抗虫棉较为合适的目的基因。 10 第一步:目的基因的筛选与获取 【资料1】苏云金杆菌通过产生苏云金杆菌伴胞晶体蛋白(Bt抗虫蛋白),破坏鳞翅目昆虫的消化系统来杀死棉铃虫。 当Bt抗虫蛋白被分解为多肽后,多肽与害虫肠上皮细胞的特异性受体结合,导致细胞膜穿孔,最后造成害虫死亡。 1.Bt抗虫蛋白的抗虫原理? 2.抗虫棉中的Bt抗虫蛋白会不会对人畜产生危害? Bt抗虫蛋白只有在某类昆虫肠道的碱性环境中才能表现出毒性,而人和牲畜的胃液呈酸性,肠道细胞也没有特异性受体,因此,Bt抗虫蛋白不会对人畜产生上述影响。 11 序列比对工具 利用测序技术、序列数据库(如GenBank)、序列对比工具(如BLAST)等,找到合适的目的基因 测序技术 DNA测序仪 核苷酸序列比对 氨基酸序列比对 序列数据库 美国国家生物信息中心 测定核酸和蛋白质序列 以碱基顺序或氨基酸残基顺序为基本内容的分子生物信息数据库 把感兴趣的序列跟已经存在的序列数据库进行比较的工具。通过比对识别相关的序列,从而能获得目的基因和蛋白质的功能。 2 目的基因的筛选 (2)认识基因结构和功能的技术方法: 基因的结构指什么? 基因在DNA分子上的具体组成和排列方式(碱基排列顺序) 基因的结构指什么?如何检测DNA中碱基排列顺序?随着测序技术的发展,以及序列数据库(GenBank)、序列比对工具(如BLAST)等的应用,越来越多的基因的结构和功能为人们所知,为找到合适的目的基因提供了更多的机会和可能。 12 第一步:目的基因的筛选与获取 2 获取目的基因常用的方法 明确了目的基因后,该怎么获得它? 前提: 方法: 基因比较小、核苷酸序列已知 通过DNA合成仪用化学方法直接合成 DNA合成仪 蛋白质的 氨基酸序列 mRNA的 核苷酸序列 基因的 核苷酸序列 目的基因 推测 推测 化学合成 (1)人工合成目的基因 (2)通过构建基因文库来获取目的基因 (在遗传学中叫作扩增)(外源 DNA )这种方法犹如用猎枪发射的散弹打鸟,无论哪一颗弹粒击中目标,都能把鸟打下来。 鸟枪法的具体做法: 用限制酶将供体细胞中的 DNA 切成许多片段 将这些片段分别构建表达载体, 然后通过载体分别转入不同的受体细胞,让供体细胞所提供的 DNA 的所有片段分别在各个受体细胞中大量复制,从中找出含有目的基因的细胞, 再用一定的方法把带有目的基因的细胞分离出来,如许多抗虫、抗病毒的基因都可以用该方法获得。 13 苏云金杆菌 Bt基因 ? 大量Bt基因 提取 2 获取目的基因常用的方法 全称: 原理: 操作环境: 目的: 优点: 聚合酶链式反应 DNA半保留复制 体外(PCR扩增仪/PCR仪) 对目的基因的核苷酸序列进行大量复制 可以在短时间内大量扩增目的基因 PCR由穆里斯等人于1985年发明,1993年获得诺贝尔化学奖 PCR扩增仪 ①PCR的概念: 模拟细胞内DNA的复制过程,在体外快速扩增特定的DNA片段。 (3)常用PCR特异性地快速扩增目的基因 获取到一个Bt基因之后,是否就该立即开始准备转基因操作? 14 模板: 原料: 能量: 酶: DNA的两条母链 4种游离的脱氧核苷酸 ③复制特点: ①边解旋边复制 碱基互补配对原则 (保证复制的准确进行) ①条件 ②复制原则: 要点回顾 :体内DNA复制 ATP ②半保留复制 DNA聚合酶(形成磷酸二酯键) 解旋酶(解螺旋,打开氢键) ④子链的延伸方向: 5'端 3'端 DNA聚合酶的特点1:只能从5'端向3'端延伸子链。 15 是一小段能与DNA母链的一段碱基序列 的短单链核酸。 DNA聚合酶的特点2:无法从头合成DNA链 拓展 :引物 3’ 5’ DNA母链1 3’ 5’ DNA母链2 3’ 5’ 引物1 3’ 5’ 引物2 3’ 5’ DNA母链1 3’ 5’ DNA母链2 解旋酶 引物结合在模板链的_端。 3’ 引物的概念: 细胞外(PCR)一般以DNA单链为引物(不切除) 细胞内的DNA复制通常以RNA单链为引物(后续被酶切除) 引物的本质: 互补配对 DNA聚合酶不能直接从模板链的一端直接开始合成子链 用于PCR的引物长度通常为20~30个核苷酸。结合体内DNA复制过程,思考PCR的进行需要哪些条件? 氢键的形成是自发的,不需要能量和酶 DNA聚合酶无法与单链DNA结合,需使DNA聚合酶能够从引物的3’端开始连接脱氧核苷酸 RNA引物:在细胞内DNA复制时,RNA引物由引发酶(primase)以DNA模板链为模板合成。引发酶是一种特殊的RNA聚合酶,能够识别DNA复制起始位点并合成短链RNA引物。 16 体内DNA复制参与的组分 在DNA复制中的作用 PCR中参与的组分 反应还需要其它条件: 解旋酶 DNA母链 4种脱氧核苷酸 DNA聚合酶 引物 (通常为小的单链RNA) 无需解旋酶,用高温代替 DNA(目的基因)模板 4种脱氧核苷酸(dNTP) 耐高温的DNA聚合酶(Taq酶) 引物(通常与两条模板链结合的2种短的单链DNA) 如缓冲液(一般添加Mg2+)、和控温设备 ②PCR的进行需要的条件: dNTP(即dATP、dGTP、dTTP、dCTP) 打开DNA双链,破坏氢键 提供DNA复制的模板 合成子链的原料 催化合成DNA子链 使DNA聚合酶能够从引物的3′端开始连接脱氧核苷酸 功能:①提供原料;②提供能量 17 ③PCR的过程: 18 当温度超过_以上时, 断裂,双链DNA解聚为两条 。 (1)变性: 氢键 单链DNA 变性 90 待扩增的DNA片段 3’ 3’ 5’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 不需要解旋酶 思考:变性的温度为何是90 以上的一个温度范围,而不是95 ? 因为变性的温度与氢键的数量有关。当氢键数量越多时,所需温度就越高;反之,当氢键数量越少时,所需温度也就越低。 ③PCR的过程: (4)利用PCR(Polymerase Chain Reaction)获取和扩增目的基因 变性 复性 延伸 19 ③PCR的过程: 3’ 5’ 3’ 5’ 引物1 5’ 3’ 引物2 5’ 3’ 思考:为什么需要引物? 引物结合在模板链的什么位置? ①因为Taq酶不能从头开始添加核苷酸。 ②引物结合在DNA模板链 3'端位置,引导子链从 5'端 3'端方向复制。 变性 复性 延伸 当温度下降 到左右时, 种引物通过 与两条单链DNA结合。 (2)复性: 碱基互补配对 50 两 便于引物与互补DNA链结合 20 当温度上升到_左右时,溶液中的4种_在耐高温的_ _的作用下,根据_原则合成新的DNA链。 脱氧核苷酸 DNA聚合酶 72 (3)延伸: (Taq酶) 3’ 5’ 3’ 5’ 引物1 5’ 3’ 引物2 5’ 3’ Taq酶 3’ Taq酶 3’ 思考1:为什么温度要上升至72 ? 72 是Taq酶的最适温度 ③PCR的过程: 变性 复性 延伸 碱基互补配对 思考1:Taq酶结合在引物的3’还是5’端? Taq酶结合在引物的3’端 21 耐高温的DNA聚合酶(Taq酶) 4种脱氧核苷酸(dNTP) 引物 待扩增的DNA片段(模板) 5’ 5’ 变性 复性 延伸 温度上升到90 以上,双链DNA解聚为单链 当温度下降到50 左右时,两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合。 温度上升到72 左右时,溶液中的4种脱氧核苷酸在耐高温的DNA聚合酶的作用下合成新的DNA链。 ③PCR的过程: 22 DNA解链为单链 高温(95 )变性 低温(50 )复性 中温(72 )延伸 引物结合到互补DNA链 Taq酶从引物起始进行子链的合成 PCR过程可以在PCR扩增(PCR仪)中自动完成。 ③PCR的过程: 23 2、PCR扩增过程中 需要源源不断的加入。 1、一个循环得到的产物又可以作为下一个循环的 。 模板 引物、原料 第二轮循环的产物 第三轮的产物 第一轮循环的产物 复制次数 1 2 3 n DNA分子数 含引物的DNA分子数 含引物1的DNA分子数 同时含引物1和2的DNA分子数 消耗引物数量 2n 2n 2n-1 2n-2 2n+1-2 2 4 8 2 4 8 1 3 7 0 2 6 2 6 14 第一轮循环的产物作为第二轮反应的模板,经过变性、复性和延伸三步产生第二轮循环的产物;第二轮循环的产物作为第三轮反应的模板,经过变性、复性和延伸三步产生第三轮的产物; 24 问题1:复性的过程一定是引物与DNA模板链结合吗? ①引物与DNA模板结合 ②解开的两条模板链重新结合 ③引物与引物结合 思考 讨论 加入过量的引物,引物与模板之间的碰撞结合机会,远远高于模板互补链之间的碰撞机会。 在设计引物时,避免引物之间的碱基序列互补 问题2:怎样提高复性时引物与模板配对结合率, 而不是模板链之间配对结合呢? 问题3:如何避免引物与引物结合? 引物之间可能结合形成二聚体,避免互补序列:④引物可能与非目标序列结合a. 模板链一般比较长,比引物复杂得多,重新结合的概率较低。只要引物是过量的,模板与引物配对结合的概率就特别高,就能保证复性时是引物和模板链配对结合。 25 ①DNA聚合酶无法识别RNA; ②高温变性步骤会破坏RNA的结构,导致其降解。 问题4:用PCR可以扩增mRNA吗?(p79) 不能! 单链RNA 逆转录酶 杂交双链 核酸酶H 单链DNA 引物、DNA聚合酶 双链DNA PCR扩增 需要将RNA反转录为cDNA,然后再进行扩增。 问题5:如果需要扩增mRNA上的遗传信息,该如何操作? 思考 讨论 mRNA是单链RNA分子,无法直接作为PCR的模板。 1.逆转录酶以RNA为模板合成一条与RNA互补的DNA链,形成RNA-DNA杂交分子;核酸酶H(RNase H)是一类能够特异性识别并切割RNA-DNA杂交体中RNA链的核酸内切酶。 2.核酸酶H降解RNA-DNA杂交分子中的RNA链,使之变成单链DNA; 3.以单链DNA为模板,在DNA聚合酶的作用下合成另一条互补的DNA链,形成双链DNA分子,即cDNA 26 要求:1.写出互补链的碱基序列,并注明方向。 2.从①-④中选择2个合适的位置设计引物,写出引物的部分序列,并注明方向。 5’-ATG …… ATC GAG ACC GGT …… TAA-3’ 3’-TAC …… TAG CTC TGG CCA …… ATT-5’ ① ② ③ ④ 3’… ATT-5’ 5’-ATG… 3’ 问题6:根据查询的Bt基因编码链序列,尝试设计引物。 1、PCR扩增时至少需要_种引物,原因是_ 2 2、设计引物的要求: ①2种引物之间不能发生碱基互补配对,原因是:_。 ②同种引物之间不能发生碱基互补配对,原因是:_ 防止引物自身配对折叠 防止引物之间配对, 导致引物不能与模板链结合 DNA的两条链是反向平行的(序列不同) 同种引物之间不能发生碱基互补配对,原因是:防止引物自身折叠 2种引物之间不能发生碱基互补配对,原因是防止引物之间配对,导致引物不能与模板链结合 27 练习:若用PCR技术扩增图示目的基因,应选用的引物是 。 引物甲、引物丙 用2种引物才能保证DNA的两条链同时被扩增 28 一般不是; 扩增的是两种引物之间所对应的特定DNA片段; 问题7:PCR 扩增的是完整的模板 DNA 分子吗? 设计引物时必须依据: 目的基因的核苷酸序列 问题8:由此可知在扩增目的基因时,引物是根据什么来设计的? PCR进行的前提条件是: 已知目的基因的DNA序列 思考 讨论 PCR进行的前提条件是已知目的基因的DNA序列。两端(3’端)的部分核苷酸序列,以便根据该序列合成引物。 29 问题9:利用PCR技术扩增目的基因,在第几轮循环产物中开始出现两条脱氧核苷酸链等长的DNA片段(即出现完整的目的基因)? 5’ 3’ 5’ 5’ 第一次循环 第二次循环 3’ 5’ 第三次循环 3’ 3’ 思考 讨论 30 讨论: 1. 下图是某同学设计的两组引物(只标注了部分碱基序列),请据图分析两组引物是否合理并分别说明理由。 C A G G C T A T C C G A 引物 引物 第 1 组 A A C T G C A G T T 引物A 都不合理; 第1组引物 和引物 之间会因局部发生碱基互补配对而失效; 第2组引物 A自身折叠后会因出现局部碱基互补配对而失效。 引物设计时还要注意:引物过短特异性差;引物过长可能出现引物内部碱基互补配对及引物与非目的基因序列模糊配对。 5' 3' 3' 5' “模糊配对” 31 ①DNA分子有_个 ②总链数_条 ③不含引物的链数:_ ④含引物的链数_ ⑤含引物1或2的链数:_ ⑥仅含引物1的DNA数:_ ⑦仅含引物2的DNA数:_ ⑧引物1、2均含有的DNA数:_ ⑨不含引物的DNA数:_ ⑩需要引物的总数:_ 2n 2n+1 2 2n+1-2 循环n次: 2n-1 1 1 2n-2 0 2n+1-2 (4)PCR反应的过程 32 【拓展】DNA的复制的原料-dNTP dNTP 是脱氧核苷三磷酸的缩写,N 是指 A、T、G、C 四种含氮碱基,包括dATP、dGTP、dTTP、dCTP。它们是由两个磷酸分子和一个脱氧核苷酸组成的,其结构简图如下: P P P ~ ~ N 脱氧核糖 A T G C 脱氧核苷酸 dNTP 为子链合成供能 dATP dGTP dCTP dTTP 在PCR过程中实际加入的为dNTP(即dATP、dGTP、dTTP、dCTP),既可作为合成DNA子链的原料,又可为DNA的合成提供能量。 33 第2节 基因工程的基本操作程序 第二步 基因表达载体的构建 第3章 基因工程 34 1、目的基因的筛选: 从相关的已知结构和功能清晰的基因中进行筛选 2、目的基因的获取: 人工合成、基因文库、利用PCR获取和扩增目的基因等 DNA半保留复制 原理: PCR反应体系(条件) 过程: 3、利用PCR获取和扩增目的基因 DNA模板(目的基因) 4种脱氧核苷酸(dNTP) 引物:一小段DNA单链,与DNA母链的一段碱基序列互补配对 酶:耐高温的DNA聚合酶(Taq酶) 缓冲液、温控条件等 变性( 90 以上,双链DNA解聚为单链) 复性( 50 左右,引物与两条单链DNA结合) 延伸( 72 左右,Taq酶合成新的DNA链) 温故知新 35 获得了足量的Bt基因后,能否直接将游离的Bt蛋白基因送入棉花细胞? (1)游离的DNA片段进入受体细胞,一般会直接被分解; (2)就算可以进行转录并翻译成蛋白质,游离的DNA片段也无法随着细胞分裂而进行复制,导致子代细胞中不再含有目的基因。 第二步:构建基因表达载体 (1)使目的基因在受体细胞中稳定存在,且可以遗传给下一代; (2)使目的基因能够在受体细胞中表达和发挥作用。 1 构建基因表达载体的目的 思考:要想目的基因实现以上功能,载体需要哪些结构? 基因表达载体 抗虫基因 与载体拼接 ——基因工程的核心 P80 36 2 基因表达载体的组成 标记基因 复制原点 终止子 启动子 插入目的基因 复制原点: DNA复制的起始位点 标记基因:作用为鉴别受体细胞中是否含有目的基因,从而将含有目的基因的细胞筛选出来。 启动子: 本质:有特殊序列结构的 片段 位置:基因的 。 功能: 识别和结合的部位,驱动基因转录出 。 DNA 上游 RNA聚合酶 mRNA 终止子: 本质:有特殊序列结构的 片段 位置:基因的 。 功能:终止 。 DNA 下游 转录 目的基因:能控制表达所需要的特殊性状 位置:必须插到 和 之间 启动子 终止子 抗生素抗性基因、荧光蛋白基因等。 限制酶切位点 目的基因插入位点不是随意的:基因表达载体需要启动子与终止子的调控,所以目的基因应插入启动子和终止子之间的部位,若目的基因插入启动子部位,启动子将失去原功能。 37 1、基因表达载体中启动子、终止子的来源: ①如果目的基因是从自然界中已有的物种中分离出来的。 诱导型启动子: 有时为了满足需要,在载体中人工构建诱导型启动子,当 存在时,可以 或 目的基因的表达。 在构建基因表达载体时,不需要在质粒上接上特定的启动子、终止子。 ——已含有启动子、终止子 ②如果目的基因是通过人工方法合成的,或是cDNA。 ——目的基因不含启动子和终止子 在构建基因表达载体时,需要在目的基因的前后端接上特定的启动子、终止子。 诱导物 激活 抑制 38 启动子 终止子 起始密码子 终止密码子 本质 位置 功能 DNA片段 DNA片段 mRNA上 三个相邻的碱基 mRNA上 三个相邻的碱基 目的基因上游 目的基因下游 mRNA首端 mRNA尾端 RNA聚合酶识别和结合的部位,驱动基因转录出mRNA 终止转录 翻译的起始信号(编码氨基酸) 翻译的结束信号(不编码氨基酸) 启动子、终止子、起始密码子、终止密码子的比较 39 辨析概念: 克隆载体 vs 表达载体 基因克隆载体必须具备的组分 标记基因 复制原点 启动子 终止子 限制酶切位点 基因表达载体必须具备的组分 考虑到翻译,基因表达载体插入的目的基因中必须含有能转录出完整 、 和 的序列。 mRNA的结构: 核糖体结合位点 起始密码子 终止密码子 二者在组成上有什么区别?表达载体:在克隆载体基础上增加表达元件,使外源基因在宿主细胞中转录和翻译。克隆载体:专注于DNA复制和保存,不包含表达元件(如启动子、终止子)。。 二者都有标记基因和复制原点两部分DNA片段。 表达载体在载体基础上增加了目的基因、启动子、终止子三部分结构。 40 DNA分子 (含目的基因) 限制酶处理 带有黏性末端或平末端的切口 带有相同黏性末端或平末端的目的基因片段 DNA连接酶 重组DNA分子 (重组质粒) 同种 载体 (质粒) 2 基因表达载体的构建过程 目的基因 限制酶 切割位点 标记基因 启动子 限制酶切割位点 终止子 复制原点 限制酶 限制酶 DNA连接酶 重组 DNA分子 41 活动1. 模拟基因表达载体的构建: (1)用图中的质粒和DNA构建基因表达载体时,不能使用Sma 切割,原因是 。 Sma 会①破坏质粒的抗生素抗性基因 ②破坏外源DNA中的目的基因 Hind BamH EcoR EcoR sma Bt基因 方案一: 只用EcoR 切割目的基因和质粒 方案二: 同时用BamH 和Hind (或EcoR 和Hind )切割目的基因和质粒 图甲、乙表示质粒及目的基因所在DNA片段,图中箭头表示相关限制酶的酶切位点。 42 使用一种限制酶(EcoR )进行切割Bt基因和pBI121质粒,共有几种连接情况?请大家尝试剪切、拼接操作。 载体与目的基因反向连接 载体与目的基 因正向连接 目的基因与目的基因之间的连接 目的基因自身环化 载体 自身环化 载体与载体之间的连接 方案一:单酶切法 转录方向错误影响:若目的基因包含启动子或依赖载体上的启动子,反向插入会导致转录方向与预期相反,无法生成功能性mRNA。 案例:假设目的基因编码绿色荧光蛋白(GFP),反向插入后,即使转录生成mRNA,其序列也会与正向插入的mRNA互补,无法翻译为GFP蛋白。若载体上的启动子为RNA聚合酶II依赖型,反向插入可能导致转录提前终止或生成无意义的转录本。 43 载体 自身环化 片段间 的连接 目的基因自身环化 质粒自身环化 目的基因与质粒连接 目的基因与目的基因连接 质粒与质粒连接 正向连接 反向连接 目的基因 1 1’ 2 2’ 1 2 2’ 1’ 2 2’ 1’ 1 ①质粒、目的基因自身环化; ②质粒与目的基因随意连接。 单酶切法缺点: 总结:如果用同一种限制酶分别切割目的基因和质粒,再用DNA连接酶处理后会出现几种产物?(只考虑两两结合) 44 如何防止目的基因和质粒自身环化以及目的基因反向连接? a b a b 双酶切的优点: 防止质粒、目的基因自身环化 防止质粒与目的基因随意连接 选择两种不同的限制酶同时对目的基因和质粒切割,使基因两端产生两个不同的粘性末端 方案二:双酶切法 a酶: b酶: 45 46 思考:若目的基因两端无合适的限制酶切割位点怎么办? 5' 3' 3' 5' 5' 3' 3' 5' 5' 3' 5' 3' 5' 5' 3' 3' 3' 3' 引物1 引物2 引入限制酶识别序列 引入限制酶识别序列 5' 3' 3' 5' 3' 3' 5' 3' 3' 3' 5' 3' 3' 5' 3' 5' 3' 5' 3' 3' 5' 3' 5' 3' 3' 5' 3' 3' 使用引物设计引入酶切位点,通过PCR扩增实现突变。 47 第三步:将目的基因导入受体细胞 受体细胞 基因表达载体 导入 动物 植物 微生物 将目的基因与载体结合,构建好基因表达载体后,下面该进行什么操作? 农杆菌转化法 花粉管通道法 ——显微注射法 ——Ca2+处理法 将目的基因导入受体细胞的方法有哪些,各个方法的原理是什么?各自适用于什么生物? 48 植物细胞 1、花粉管通道法 方法一:子房注射法 用微量注射器将含目的基因的DNA 溶液直接注入子房中 含目的基因的DNA 溶液 (我国科学家独创) 1 将目的基因导入植物细胞 49 2.适用生物: 1.受体细胞: 受精卵 1、花粉管通道法 方法二: 柱头处理法 在植物受粉后的一定时间内,剪去柱头,将DNA溶液滴加在花柱切面上,使目的基因借助花粉管通道进入胚囊。 3.特点: 简便经济,但要求花朵较大 开花植物 1 将目的基因导入植物细胞 50 2、农杆菌转化法 农杆菌细胞内含有Ti质粒,当它侵染植物细胞后,能将Ti质粒上的T-DNA(可转移的DNA)转移到被侵染的细胞、并且将其整合到该细胞的染色体DNA上。 问题1:农杆菌具有怎样的结构基础,利于目的基因进入植物细胞?(p81) 农杆菌是生活在土壤中的微生物,自然条件下可侵染双子叶植物和裸子植物,而对大多数单子叶植物没有侵染能力。当双子叶植物体受到损伤时,伤口处的细胞会分泌大量的酚类化合物,吸引农杆菌移向这些细胞。 冠瘿瘤 (1) 农杆菌: 1 将目的基因导入植物细胞 当双子叶植物体受到损伤时,伤口处的细胞会分泌大量的酚类化合物,吸引农杆菌移向这些细胞,这时农杆菌中的Ti质粒上的T-DNA(可转移的DNA)转移至受体细胞染色体的DNA上。这种酚类化合物主要在双子叶植物细胞壁中合成。 51 2、农杆菌转化法 1 将目的基因导入植物细胞 问题2:为使目的基因在受体细胞中稳定存在,在构建基因表达载体时,应将目的基因插入哪里? 将目的基因插入Ti质粒的T-DNA中,通过农杆菌的转化作用,就可以使目的基因进入植物细胞 (2) 转化: 目的基因进入受体细胞内,并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程。 实质: 基因重组(控制不同性状的基因的重新组合) 转化的实质属于哪一种变异类型? 52 2、农杆菌转化法 (3) 过程: 目的基因 Ti质粒 表 达 载 体 农杆菌 植物细胞 植物细胞 染色体DNA 新性状植株 构建 转入 导入 插入 表达 思考:农杆菌转化法中,目的基因只能进入植物的一个体细胞中,但基因工程最终要的是一个转基因植株,如何实现这一目标? 得到含有目的基因的植物细胞后进行植物组织培养 需要农杆菌产生的vir蛋白切割T-DNA 能否直接将重组质粒导入植物细胞?1.农杆菌转化法中,目的基因是否就是T-DNA,如果不是,T-DNA与目的基因是什么关系? T-DNA不是目的基因,但它将来会被整合到宿主细胞染色体的DNA上,只要将目的基因插入T-DNA中,目的基因就可以随T-DNA进入宿主细胞并整合到宿主细胞的染色体上。 53 两次拼接 第一次拼接: 目的基因拼接到Ti质粒的T-DNA上。 第二次拼接: 被插入目的基因的T-DNA拼接到受体细胞染色体的DNA上。 2、农杆菌转化法 (3) 过程: 两次导入 第一次导入: 将含目的基因的重组Ti质粒导入农杆菌。 第二次导入: 含含目的基因的T-DNA导入受体细胞。 农杆菌转化法共有几次DNA分子的拼接,几次导入细胞? 54 2、农杆菌转化法 (4) 具体转化方法: 随着转化方法的突破,用农杆菌侵染水稻、玉米等多种单子叶植物也取得了成功。 方法一:可将新鲜的从叶片上取下的圆形小片与农杆菌共培养,然后筛选转化细胞,并再生成植株。 方法二:可以将花序直接浸没在含有农杆菌的溶液中一段时间,然后培养植株并获得种子,再进行筛选、鉴定等。 思考:1、方法1筛选出的转化细胞怎样再生成植株? 2、以上两种方法的受体细胞有何不同? 受体细胞为体细胞 植物组织培养:利用植物细胞的全能性 受体细胞为受精卵 55 2 将目的基因导入动物细胞 1、导入方法: 2、受体细胞: 显微注射法 受精卵 为什么常选用受精卵作为受体细胞呢? ①体积大,易操作。 3、过程: 构建基因表达载体并提纯 利用显微注射将基因表达载体注入动物的受精卵中 早期胚胎培养 胚胎移植 获得具有新性状的动物 ②易表现出全能性。 56 【拓展】 病毒侵染法 也可以用病毒DNA与目的基因一起构建的载体,用病毒去感染受体细胞,使目的基因导入受体细胞内。这种方法比较常见于将目的基因导入动物细胞。 如疫情期间我国陈薇院士团队研发的重组新型冠状病毒疫苗是用腺病毒载体,搭载新冠病毒S基因,进入人体内,使人体产生对S蛋白引发相应的免疫反应。 57 (1)常用方法: Ca2+处理 常用原核细胞(大肠杆菌应用最广泛) 目的:增加细胞壁的通透性,可使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态(感受态细胞) (2)受体细胞: Ca2+ 感受态细胞 吸收 大肠 杆菌 Ca2+ 表达 载体 Ca2+ 处理法示意图 2 将目的基因导入微生物细胞 繁殖快 单细胞 遗传物质少 易培养 58 实例:利用转基因大肠杆菌生产药物 转录 翻译 如果把一个真核生物的基因导入原核细胞中表达,一定会产生原来的蛋白质吗? 剪切、连接 加工 真核基因:编码区(外显子+内含子) 前体mRNA 成熟mRNA 多肽链 蛋白质(四级结构) 原因: ①真核生物的基因有内含子,原核生物细胞里没有相应的机制来剪切、拼接前体RNA; ②原核生物没有真核生物的蛋白质加工系统(如内质网、高尔基体等) 一般不能产生原来的蛋白质 59 胰腺 提取筛选 胰岛素mRNA 胰岛素 cDNA 逆转录 重组 质粒 质粒 导入 大肠杆菌 mRNA 胰岛素原 胰岛素 加工 原核生物作为受体细胞产生的真核生物的蛋白质通常没有生物活性,需要在体外进行再加工。 没有内质网、高尔基体对蛋白质进一步加工。 实例:利用转基因大肠杆菌生产药物 如何让人的胰岛素基因在原核细胞中表达? 通常没有生物活性,需要在体外进行再加工。因为原核生物没有内质网和高尔基体,无法对蛋白质进行进一步的加工。 60 1.研究人员将两个抗虫基因(T)导入棉花细胞内培育转基因抗虫棉。那么两个抗虫基因在染色体上随机整合有几种情况? 转两个T基因 普通棉花细胞 有三种情况,如下图所示。 2.若甲、乙、丙三种植株自交, 其后代抗虫与不抗虫的比例为多少? 甲自交 全为抗虫 乙自交 抗虫:不抗虫=3:1 丙自交 抗虫:不抗虫=15:1 甲 乙 丙 思考 讨论 61 目的基因导入受体细胞方法比较 细胞种类 植物细胞 动物细胞 微生物细胞 常用方法 受体细胞 转化过程 花粉管通道法 农杆菌转化法 显微注射法 Ca2+处理法 体细胞或受精卵 受精卵 通常选原核细胞 将目的基因插入Ti质粒的T DNA上 转入农杆菌中 导入植物细胞 整合到受体细胞DNA上 提纯含目的基因 的表达载体 显微注射 早期胚胎培养、胚胎移植 获得具有新性状的个体 Ca2+处理细胞 感受态细胞 基因表达载体与 感受态细胞混合 感受态细胞吸收DNA分子 62 2. 导入植物细胞 —— 农杆菌转化法 (3)过程: 目的基因 Ti质粒 表 达 载 体 农杆菌 植物细胞 植物细胞 染色体DNA 新性状植株 构建 转入 导入 插入 表达 ①切下植物叶片与农杆菌共培养,然后筛选转化细胞(受体细胞-体细胞); ②将花序培养在农杆菌溶液中,获得种子后筛选、鉴定 (受体细胞-受精卵)。 63 问题1:将基因表达载体导入受体细胞后,如何判断是否导入成功? 若导入的是空载体、载体-载体连接物,标记基因筛选也是呈阳性,因此仅凭标记基因筛选呈阳性无法完全确定目的基因是否导入。 此外,即便导入了基因表达载体(目的基因成功导入),但是仍然不知道目的基因插入的位置、方向等是否正确,能否正确表达。 问题2:标记基因筛选呈阳性一定能确定转基因生物培育成功了吗? 可以利用标记基因(如抗生素抗性基因)筛选成功导入基因表达载体的受体细胞,如可用含青霉素的选择培养基鉴别。 思考 讨论 第四步:目的基因的检测与鉴定 因此也需要在转录和翻译以及个体水平上进行检测和鉴定 64 mRNA Bt抗虫蛋白 抗虫棉 ①检测转基因生物染色体DNA上是否插入了目的基因 ②检测目的基因是否转录出了mRNA ③检测目的基因是否翻译成蛋白质 ④检测是否具有抗性以及抗性程度等 检测水平: 分子水平 个体水平 Bt基因 结合Bt基因表达的过程,推测可以从哪些方面(或水平)进行检测与鉴定? 检测内容: 分子水平 分子水平 将目的基因导入受体细胞的方法有哪些,各个方法的原理是什么?各自适用于什么生物? 已知目的基因的序列 65 分子水平检测 方法一:DNA分子杂交技术 1 检测目的基因是否插入受体细胞染色体DNA上 问题1:DNA分子十分微小,我们该如何观察受体细胞是否含目的基因呢? 问题2:放射性同位素或荧光蛋白应该标记哪种物质? 如何让目的基因也带有放射性同位素或荧光蛋白标记?(已知目的基因序列) 利用放射性同位素或荧光蛋白。 利用碱基互补配对原则使被标记的DNA片段与目的基因结合。 标记DNA分子 探针的长度可以包括整个基因,或基因的一部分。 66 探针 目的基因 带标记的基因探针,与目的基因DNA单链在一定条件下互补配对,结合成双链,从而出现杂交带,说明 了。 方法一:DNA分子杂交技术 问题1 :探针的本质是什么?与目的基因的关系是什么? 探针是一段DNA片段(通常结合放射性同位素或荧光蛋白等), 探针的序列应与目的基因高度互补,避免与其他基因发生非特异性结合 变性 碱基互补配对原则 1 检测目的基因是否插入受体细胞染色体DNA上 目的基因整合到受体生物染色体DNA上 若探针与PCR扩增后的基因杂交,出现杂交带,说明目的基因整合到受体生物染色体DNA上了。基本原理: 具有一定同源性的两条DNA单链,热处理后变为单链。在一定条件下(适宜的温度等)可以按照碱基互补配对原则形成双链。杂交过程中,杂交的双方是待测的DNA和用放射性同位素标记的已知DNA片段(又称为基因探针)。 67 1 检测目的基因是否插入受体细胞染色体DNA上 方法二:PCR扩增 转基因生物 提取DNA 根据目的基因的序列设计PCR引物 PCR操作 是否扩增出目的基因 电泳(常用) DNA测序技术;DNA分子杂交技术等 M:marker; 1:阳性质粒 2:原始品系 3-9:转Bt品系 转Bt基因品系PCR琼脂糖凝胶电泳检测结果 问题1 :对受体细胞的DNA进行PCR操作,引物该如何设计?结果如何检测? 判断标准: 68 2 检测目的基因是否转录(mRNA) 转基因生物 PCR操作 电泳检测是否 扩增出目的基因 逆转录 cDNA 提取RNA mRNA作为模板 方法二:分子杂交技术 方法一:PCR扩增 基因探针 转基因生物的mRNA 杂交分子 (可检测) 变性 碱基互补配对原则 基本思路: 1.制作基因探针,并用PCR扩增 2.提取受体细胞全部mRNA,使基因探针和转基因生 物的mRNA杂交,若出现 杂交带,表明转录出了mRNA。 69 注射小鼠体内 苏云金芽孢杆菌 提取 Bt抗虫蛋白 抗体 标记抗体 提取蛋白 电泳分离 抗原 抗体 杂交 转基因生物 放射性检测 (杂交带) 2 检测目的基因是否翻译(蛋白质) 方法: 抗原—抗体杂交 抗原与抗体的特异性结合 原理: 思考:如何检测目的基因是否翻译产生了Bt抗虫蛋白?(提示:免疫学方法) 70 个体水平的检测 (1)通过抗虫、抗病的接种实验鉴定生物 以及 等 例:通过采摘抗虫棉的叶片饲喂棉铃虫来确定Bt基因是否赋予了棉花抗虫特性以及抗性的程度。 是否具有抗性 抗性的程度 如何检测导入的Bt基因是否具有抗虫特性? 71 转基因生物 鉴定方法 成功标志 抗虫植物 抗病毒(菌)植物 抗盐植物 抗除草剂植物 获取目的基因产物的转基因生物(如胰岛素) 饲喂害虫(抗虫接种实验) 害虫死亡 病毒(菌)接种实验 未染病 盐水浇灌 正常生长 喷洒除草剂 正常生长 提取细胞产物与天然产品进行功能、活性比较 功能、活性正常 个体水平的检测 72 ①检测转基因生物染色体DNA上是否插入了目的基因 ②检测目的基因是否转录出了mRNA ③检测目的基因是否翻译成蛋白质 ——“抗原—抗体杂交技术” 2.个体生物学水平鉴定 1.分子水平检测 抗性检测: 功能活性比较: PCR技术或分 子杂交技术 抗虫、抗病接种实验; 基因工程产品与天然产品的功能活性比较 ——检测是否具有抗性以及抗性强度等 如:胰岛素注射到糖尿病模型小鼠 小结:目的基因的检测与鉴定 73 1.目的基因的筛选和获取-前提 利用PCR获取和扩增 人工合成 DNA文库 2.构建基因表达载体-核心 目的基因、启动子、终止子、标记基因等 3.将目的基因导入受体细胞-关键 农杆菌转化法(植物)、显微注射法(动物) 、 感受态细胞(如加Ca2+)转化法(微生物); 4.目的基因的检测与鉴定-保证 分子检测:是否插入、转录、翻译 个体水平:是否具有抗性以及抗性强度等。 总结 :基因工程的基本操作程序 74 1.研究人员将两个抗虫基因(T)导入棉花细胞内培育转基因抗虫棉。那么两个抗虫基因在染色体上随机整合有几种情况? 转两个T基因 普通棉花细胞 有三种情况,如下图所示。 2.若甲、乙、丙三种植株自交, 其后代抗虫与不抗虫的比例为多少? 甲自交 全为抗虫 乙自交 抗虫:不抗虫=3:1 丙自交 抗虫:不抗虫=15:1 甲 乙 丙 思考 讨论 75 问题1:为什么不直接在构建基因表达载体的时候给目的基因添加放射性同位素或荧光蛋白标记来检测目的基因是否导入受体细胞? 放射性同位素标记 安全风险:放射性同位素具有辐射危害,可能会影响转基因生物的正常生长。 标记稳定性:放射性同位素会随时间衰变,导致标记信号减弱或消失,无法长期追踪目的基因的表达情况。 荧光蛋白标记 荧光标记对目的基因功能的影响:若目的基因是编码某功能蛋白(如酶、激素),直接融合荧光蛋白可能导致其空间结构改变,从而丧失活性。 载体容量限制:常用质粒载体的插入片段通常≤5kb,若目的基因较大(如某些人类基因>2kb),再加入荧光蛋白基因可能导致载体不稳定或难以导入受体细胞。 76 问题2:基因工程中,检测是否翻译出相应的蛋白质的抗原—抗体杂交法中,为什么要使用二抗? ①信号放大 原理:一抗直接与目标蛋白结合,但一抗的分子量较小,携带的标记物(如荧光素、酶)有限。 二抗优势:二抗是针对一抗的抗体,可同时结合多个一抗分子,形成“抗体-一抗-目标蛋白”的复合物,显著增加标记物的数量,从而放大检测信号。 ②通用性与灵活性 一抗的特异性:一抗需针对目标蛋白的特定抗原表位设计,不同目标蛋白需不同的一抗。 二抗的通用性:二抗仅需识别一抗的物种来源(如鼠源、兔源),无需针对具体目标蛋白。 优势:同一批二抗可与多种一抗配合使用,简化实验设计,降低成本。 77 第2节 基因工程的基本操作程序 DNA片段的扩增及电泳鉴定 第3章 基因工程 78 (1)PCR利用了 原理,通过调节 来控制DNA双链的解聚与结合,PCR仪实质上就是一台能够自动调控温度的仪器。 (2)PCR扩增DNA片段还利用了 的原理。一次PCR一般要经历 次循环。 DNA的热变性 温度 DNA半保留复制 30 5’- -3’ 3’- -5’ 3’- -5’ 5’- -3’ 5’- -3’ -5’ 5’- 3’- -5’ 5’- -3’ -5’ 5’- 3’- -5’ 3’- -3’ 高温 变性 中温 低温 复性 延伸 1次循环 (一)利用PCR在体外进行DNA片段扩增 1 实验原理 79 (一)利用PCR在体外进行DNA片段扩增 80 ①PCR仪 ②微量离心管 ③微量移液器 ④一次性吸液枪头 2 材料用具 ——自动控温,实现DNA的扩增 ——实际上是进行PCR反应的场所 PCR仪 微量离心管 推动杆 调节旋钮 卸枪头按钮 体积刻度 吸液杆 枪头 (注意:加不同样品时,需要更换枪头) (一)利用PCR在体外进行DNA片段扩增 (用于向微量离心管转移PCR配方中的液体) 81 10倍浓缩的扩增缓冲液(含Mg2+) 5 L 20mmol/L的4种脱氧核苷酸的等量混合液(实为dNTP) 1 L 20 mol/L的引物 2.5 L 20 mol/L的引物 2.5 L H2O 28~33 L 1-5U/ L的Taq DNA聚合酶(即耐高温的DNA聚合酶) 1~2U 模板DNA (1pg~1 g) 5~10 L 总体积 50 L ⑤PCR反应体系的配方 2 材料用具 注意:酶和缓冲液要在冰块上缓慢融化,用后置于-20 冰箱中保存。酶和缓冲液一般分装成小份,避免反复融化导致 。 活性降低甚至失活 82 3 方法步骤 1.加样: 用微量移液器按照PCR反应体系配方,在微量离心管中依次加入各组分。 2.离心: 待所有组分都加入后,盖严离心管的盖子,将微量离心管放入离心机里,离心约10s,使反应液集中在离心管的底部。 ——提高反应速率 (一)利用PCR在体外进行DNA片段扩增 83 3.反应:参照下表的参数,设置好PCR仪的循环程序。将装有反应液的微量离心管放入PCR仪中进行反应。 循环程序 变性 复性 延伸 预变性 94 ,5min — — 30次 94 ,30s 55 ,30s 72 ,1min 最后1次 94 ,1min 55 ,30s 72 ,10min 使DNA充分变性,双链打开,以利于引物更好地和模板结合。 问题1:预变性的目的是什么? 问题2:为什么最后1次变性和延伸时间都延长了? Taq 酶活性会随着循环次数增加而下降。在每一轮循环中,部分片段可能没有完全延伸完,Taq 酶就脱落了。最后1次变性、延伸时间延长,让这些DNA打开,重新充分延伸。 3 方法步骤 (一)利用PCR在体外进行DNA片段扩增 84 问题1:PCR的产物是什么? 问题2:如何鉴定PCR的产物? DNA片段 琼脂糖凝胶电泳 (二)利用琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR产物 85 (1)电泳:DNA分子具有_,在一定的 _下,这些基团可以带上正电荷或负 电荷,在电场的作用下,这些带电分子会向着与它所带电荷_的电极移动,这个过程就是电泳。 可解离的基团 pH 相反 1 实验原理 一般使用的电泳缓冲液pH=8,DNA分子带 ,在电场中DNA便向 泳动。 负电荷 正极 磷酸电离形成的磷酸基团带负电 样品点样孔应靠近 极。 负 (二)利用琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR产物 86 (2)鉴定方法:PCR的产物一般通过 来鉴定。 琼脂糖来源于红藻的多糖,其主要成分为多聚半乳糖,琼脂糖在水中一般加热到90 以上溶解,温度下降到35-40 时形成良好的半固体状的凝胶。 琼脂糖凝胶具有网络结构(孔径),孔径大小与琼脂糖凝胶浓度有关,浓度越高,孔径越 ,能够通过的核酸分子越 。 1 实验原理 琼脂糖凝胶电泳 在凝胶中DNA分子的迁移速率与_、_和_等有关 凝胶的浓度 DNA分子的大小 构象 小 小 DNA的迁移速率与其构象密切相关,超螺旋结构迁移最快,开环结构最慢。在实验中,可通过优化凝胶条件(如浓度、电压)和DNA构象(如酶切处理)来提高分辨率和分离效果。DNA的构象:迁移速率:双螺旋环状DNA>双螺旋链状DNA>单链DNA。 87 迁移速率:在凝胶中DNA分子的迁移速率与凝胶的浓度、DNA分子的大小和构象等有关。 检测:凝胶中的DNA分子通过染色,可以在波长为300nm的紫外灯下被检测出来。 琼脂糖凝胶浓度(%) 分离DNA分子大小(Kb) 迁移速率 0.6 1~20 慢 快 0.7 0.8~10 0.9 0.5~7 1.2 0.4~6 1.5 0.2~4 2.0 0.1~3 琼脂糖凝胶浓度越大,分离的DNA分子越小,迁移速率越快 88 核酸染色剂 常用的核酸染色剂有EB(溴化乙锭)、GoldView等,EB能插入DNA分子中的碱基对之间,导致EB与DNA结合。嵌入核酸碱基间的EB能吸收300nm波长的紫外光,发出可见荧光。其荧光强度与DNA分子的含量成正比。 1 实验原理 89 标准参照物(Marker) DNA Marker是 的片段,在实验时和样本DNA同时进行凝胶电泳,通过对比两者的迁移速率,可以大致估计 。 样本DNA的大小 已知的DNA分子大小 1 实验原理 90 琼脂糖凝胶电泳装置 2 实验器材 (二)利用琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR产物 91 制备凝胶 观察鉴定 进行电泳 电泳缓冲液配制琼脂糖溶液,一般配制质量体积比0.8%~1.2%的琼脂糖溶液。在沸水浴或微波炉内加热至琼脂糖熔化。稍冷却后,加入适量的核酸染料混匀。 将温热的琼脂糖溶液迅速倒入模具,并插入合适大小的梳子,以形成加样孔。 待凝胶溶液完全凝固,小心拔出梳子,取出凝胶放入电泳槽内。 ①熔化: ②倒模: ③凝固: 3 方法步骤 (二)利用琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR产物 92 制备凝胶 观察鉴定 进行电泳 将电泳缓冲液加入电泳槽中,电泳缓冲液没过凝胶1mm为宜 扩增得到的PCR产物与凝胶载样缓冲液(内含指示剂)混合,再用微量移液器将混合液缓慢注入凝胶的加样孔内。留一个加样孔加入指示分子大小的标准参照物(marker)。 接通电源,根据电泳槽阳极至阴极之间的距离来设定电压,一般为1~5V/cm。待 前沿迁移接近凝胶边缘时,停止电泳 ①加液 ②加样 ③电泳 (二)利用琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR产物 指示剂 ①有颜色,使样品呈现颜色,便于加样。 ②分子量较小,指示样品迁移的速率及方向。 3 方法步骤 ①常使用一种有颜色的标记物指示样品迁移的速率及方向;通过观察指示剂位置变化判断电泳是否完成 ②使样品呈现颜色,便于加样。 93 制备凝胶 观察鉴定 进行电泳 取出凝胶置于 下观察和照相。 3 方法步骤 紫外灯 (二)利用琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR产物 94 一条条带(目的基因片段) 1.本实验进行电泳鉴定的结果应该是几条条带? 2.如图所示,该片段大小约为 。 750bp 思考 讨论 0次 12次 12次 30次 30次 Marker 根据条带的 及 来评价扩增的结果 3.判断成功扩增出DNA片段的依据是什么? 分布 粗细程度 估计DNA的大小 估计DNA的数量 95 4.你进行电泳鉴定的结果是几条条带?如果不止一条条带,请分析产生这个结果的可能原因? 未出现扩增条带可能的原因有: ①引物出现质量问题; ②变性时温度 ,变性时间 ,模板DNA链未打开。 ③Taq酶失活; ④Mg2+浓度过 。 出现非特异性扩增带可能的原因有: ①引物特异性不强或容易聚合成二聚体 ②复性时的温度过低,引物随机连接到非目的基因片段 ③DNA聚合酶的浓度过高,即使引物与模板的结合并不完全匹配,酶仍可能催化延伸反应,生成非特异性扩增产物。 ④Mg2+浓度过高 ⑤模板DNA出现污染 低 低 短 思考 讨论 96 Lavf58.45.100 Packed by Bilibili XCoder v2.0.2 Lavf58.29.100 Bilibili VXCode Swarm Transcoder v0.6.37 EVCapture4.1.9软件录制 Lavf57.25.100 本视频由湖南一唯信息科技开发的EV录屏软件录制,www.ieway.cn EVCapture4.1.9软件录制 Lavf57.25.100 本视频由湖南一唯信息科技开发的EV录屏软件录制,www.ieway.cn EVCapture4.1.9软件录制 Lavf57.25.100 本视频由湖南一唯信息科技开发的EV录屏软件录制,www.ieway.cn Multimedia Cloud Transcode (cloud.baidu.com) Lavf58.20.100 Packed by Bilibili XCoder v2.0.2 $$