1.2.2微生物的选择培养和计数课件-2024-2025学年高二下学期生物人教版选择性必修3

课题背景 自然界中微生物数量繁多，种类庞杂，要想从中分离出需要的特定微生物并不容易，尤其当要分离的微生物在混合菌群中不是 优势种群时，更难实现。 稀释涂布平板法呈现的杂菌群 那么我们又如何达成这一目标呢？ 科学家们应用选择培养基解决了这一难题。 1 第一章 发酵工程 第二节 微生物的培养技术及应用 1.2.2微生物的选择培养和计数 1. 科学实例：寻找耐高温的DNA聚合酶 启示：寻找目的菌种时要根据它对生存环境的要求，到相应的环境中去寻找。 筛选原因：因为水生栖热菌能在70~80℃的高温条件生存，而绝大多数微生物在此条件下不能生存。 PCR是一种在体外DNA复制的技术，此项技术要求使用耐高温（930C）的DNA聚合酶。 1966年，布鲁克在美国黄石国家公园的一个热泉中发现了耐热的水生栖热菌，并分离到耐高温的DNA聚合酶。 耐高温的酶 耐高温生物体 高温环境（热泉、火山口） 寻找 寻找 一、选择培养基 2.实验室中微生物筛选的原理: 人为提供____________________的条件（包括_____、_____和_____等）， 同时___________________________。 有利于目的菌生长 抑制或阻止其他微生物的生长 营养 温度 pH 3.选择培养基的概念： 允许 生长，同时 或 其他种类微生物生长的培养基。 特定种类的微生物 抑制 阻止 4.举例： 类型 条件 分离得到的菌种 改变培养条件 70～80℃的高温 添加某种化学物质 加入青霉素 高浓度食盐 特殊碳、氮源 石油是唯一碳源 营养缺陷 不加碳源 不加氮源 水生栖热菌 酵母菌、霉菌等真菌 金黄色葡萄球菌 自养型微生物 固氮菌 能消除石油污染的微生物 一、选择培养基 思考：那么如果让你分离土壤中分解尿素的细菌，你应该怎么设计呢？ 思考讨论： 选择培养基配方的设计 尿素含氮量高，化学性质稳定，是一种重要的农业氮肥，尿素施入土壤后，被某些细菌分解成NH3，NH3再转化成NO3-、NH4+等才能被植物吸收。 尿素的立体结构 土壤中尿素分解菌之所以能将尿素分解，是因为它们能合成脲酶： CO(NH2)2+H2O 脲酶 CO2+2NH3 1、你如何设计培养基配方，将土壤稀释液中能分解尿素的细菌分离出来？ 培养基添加尿素作唯一氮源，只有能合成脲酶的微生物才能分解尿素。缺乏脲酶的微生物由于不能分解尿素、缺乏氮源而不能生长发育繁殖，所以用此培养基就能够选择出分解尿素的微生物。 思考讨论： 选择培养基配方的设计 尿素含氮量高，化学性质稳定，是一种重要的农业氮肥，尿素施入土壤后，被某些细菌分解成NH3，NH3再转化成NO3-、NH4+等才能被植物吸收。 尿素的立体结构 土壤中尿素分解菌之所以能将尿素分解，是因为它们能合成脲酶： CO(NH2)2+H2O 脲酶 CO2+2NH3 2、该培养基与普通培养基有哪些共同点和不同点？ 除了用尿素作为唯一氮源， 培养基的其他营养成分与普通培养基基本相同。 方法：对土样充分稀释后，将菌液涂布到制备好的选择培养基上。 1g土壤中有多少能分解尿素的细菌？ 计数：测定分解尿素的细菌的数量 筛选、分离：获得分解尿素的细菌的纯培养物 注意：稀释度足够高时，能在培养基表面形成单个菌落。 二、微生物的选择培养 稀释涂布平板法： 是将菌液进行一系列梯度稀释，然后将不同稀释度的菌液分别涂布到琼脂固体培养基的表面，进行培养。 7 探究实践：土壤中分解尿素的细菌的分离与计数 1.提出问题（实验目的） （1）从土壤中分离出能够分解尿素的细菌。 （2）统计每克土壤样品中究竟含有多少这样的细菌。 2.实验原理 绝大多数微生物都能利用葡萄糖，但是只有能合成_____的微生物才能分解尿素，利用___________________的_____培养基，可以从土壤中分离出_________的细菌。 组分 含量 KH2PO4 1.4g Na2HPO4 2.1g MgSO4·7H2O 0.2g 葡萄糖 10.0g 尿素 1.0g 琼脂 15.0g H2O 定容至1000mL 脲酶 以尿素作为唯一氮源 选择 分解尿素 CO(NH2)2+H2O 脲酶 2NH3+CO2 3.实验步骤 （1）土壤取样 ①取样地点要求： 酸碱度接近中性的潮湿土壤。细菌适宜在该环境中生长。 ②取样过程： 铲去表层土（一般3cm左右）。细菌绝大部分分布在距地表3～8cm的土壤层。 ③注意事项： 取土样时用的铁铲和取样袋在使用前都需要灭菌。操作完成后，一定要洗手。 铲取土样，将样品装入纸袋中 （2）制备培养基 ①选择培养基： 以尿素为唯一氮源。 ②牛肉膏蛋白胨培养基： 作为对照组， 来判断选择培养基是否具有选择作用。 牛肉膏 5.0g 蛋白胨 10.0g NaCl 5.0g 琼脂 20.0g 蒸馏水 定容到1000ml KH2PO4 1.4g Na2HPO4 2.1g MgSO4·7H2O 0.2g 葡萄糖 10.0g 尿素CO(NH2)2 1.0g 琼脂 15.0g 蒸馏水 定容到1000ml （3）样品的稀释与涂布平板 ②将10g土样加入盛有90mL无菌水的锥形瓶中，充分摇匀。 取1mL上清液加入盛有9mL无菌水的试管中，依次等比稀释。 1×10 1 mL 1 mL 1 mL 1 mL 1 mL 1 mL 1×102 1×103 1×104 1×105 1×106 1×107 9 mL 无菌水 ①铲取图样，将样品装入纸袋中 90 mL 无菌水 注：测细菌时，一般选用104、105、106倍稀释的稀释液进行平板培养 在初次实验中，对于稀释的范围没有把握,应选择一个比较宽的范围，将1×103～1×107倍稀释的稀释液分别涂布到平板上培养，以保证能从中选择出菌落数在30～300的平板进行计数。 在火焰旁进行 小于30说明稀释度太大，各平板之间菌落数差异会很大（多一个菌落，乘以稀释倍数误差就很大了），造成误差 11 ③取0.1mL 菌液滴加到培养基表面 1×107 ④将涂布器浸在盛有酒精的烧杯中 ⑤将涂布器放在火焰上灼烧，待酒精燃尽、涂布器冷却。 ⑥用涂布器将菌液均匀地涂布在培养基表面。涂布时可转动培养皿，使涂布均匀 注：多余的酒精在烧杯中滴尽，然后再放在火焰上灼烧。不要将过热的涂布器放在盛有酒精的烧杯中，以免引燃酒精。 （3）样品的稀释与涂布平板 1.每个浓度至少设置4个平板，1、2、3平板是选择培养基（实验组，三个重复）， 4为牛肉膏蛋白胨培养基 2.如何验证培养基中是否含有杂菌？ 设置2个平板作为对照： 不涂布稀释液的选择培养基和牛肉膏蛋白胨培养基 （用以判断选择培养基是否具有选择作用） 在火焰旁进行 其中一个平板计数结果与其他两个相差太大，操作过程可能出现了错误。微生物计数时，如果实验中出现重复实验的结果差别很大的情况，应分析实验过程中可能的影响因素，找出差异的原因，而不能简单地将结果舍弃后进行计数。 12 （3）样品的稀释与涂布平板 （3个重复） 选择培养基 注：本实验使用的平板和试管较多，为了避免混淆，最好在使用前做好标记。例如，在标记培养皿时应该注明组别、培养日期和平板上培养样品的稀释度等。 牛肉膏蛋白胨培养基 在火焰旁进行 （3）样品的稀释与涂布平板 在火焰旁进行 （4）微生物的培养与观察 ①培养条件： 不同种类的微生物，往往需要不同的培养温度和培养时间。 （细菌一般在30-37℃的温度下培养1-2d） ②观察： 每隔24h统计一次菌落数目，选取菌落数目稳定时的记录作为结果。（一般来说，在相同的培养条件下，同种微生物表现出稳定的菌落特征，如形状、大小和颜色等） （5）结果分析 现象 分析 未涂布培养基上无菌落生长 未涂布培养基上有菌落生长 牛肉膏蛋白胨培养基上的菌落数目明显多于选择培养基上的菌落数目 培养基未被杂菌污染 培养基被杂菌污染 选择培养基具有选择作用 如果得到了两个或多个菌落数为30～300的平板，说明稀释度合适，操作比较成功，能够进行菌落的计数。 稀释103倍 稀释104倍 稀释105倍 空白对照 ——间接计数法 1.稀释涂布平板法 （1）原理： 当样品的稀释度足够___时，培养基表面生长的一个____，来源于__________中的一个____；通过计数平板上的____数，就能推测出样品中大约含有多少_____。 高 菌落 样品稀释液 活菌 菌落 活菌 （2）计数原则 ①选择菌落数为_______的平板计数 30-300 ②同一稀释度下，应至少对___个平板进行重复计数，然后求出______； 3 平均值 样品的______将直接影响平板上的菌落数目； 稀释度 三、微生物的数量测定 （3）结果分析： ①统计的菌落数往往比活菌的实际数目____； 原因：__________________________________________ ______________ ②统计结果一般用_______而不是用活菌数来表示； 少 当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落 菌落数 （4）计算公式： 每g样品中的菌落数＝(C÷V)×M C代表某一稀释度下平板上生长的平均菌落数 V代表涂布平板时所用的稀释液的体积(mL) M代表稀释倍数 例：某同学在稀释倍数为106 的培养基中测得平板上菌落数的平均数为234，那么每g样品中的菌落数是（涂布平板时所用稀释液的体积为0.1mL) ( ) A. 2.34×108 B. 2.34×109 C. 234 D. 23.4 B 2.显微镜直接计数 ——直接计数法 （1）方法： 利用特定的___________或_____________在______下观察、计数，然后再计算_________的样品中微生物的数量； 细菌计数板 血细胞计数板 显微镜 一定体积 血细胞计数板常用于_______________________________等的计数 相对较大的酵母菌细胞、霉菌孢子 细菌计数板可对_________________进行观察和计数； 细菌等较小的细胞 （2）优点： 快速直观 （3）缺点： ①统计的结果一般是活菌数和死菌数的总和，不能区分死菌与活菌。 ②个体小的细菌在显微镜下难以观察。 项目 直接计数法 间接计数法 原理 主要用具 计数数据 优点 缺点 计算公式 3.计数方法的比较 三、微生物的数量测定 利用特定细菌计数板或血细胞计数板，在显微镜下计算一定容积的样品中微生物的数量 显微镜、细菌计数板 菌体本身 计数方便、操作简单 死菌、活菌都计算在内 每毫升原液含菌数= 每小格平均菌体数×400×10000×稀释倍数 当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌。通过统计平板上的菌落数，就能推测出样品中大约含有多少活菌 培养基 培养基上的菌落数 计数的是活菌 操作较复杂，有一定的误差性 每毫升原液含菌数=培养基上平均菌落数 ÷涂布液体积×稀释倍数 20 小结：两种接种方法的比较 平板划线法 稀释涂布平板法 纯化原理 接种工具 单菌落的获得 用途 接种效果图 相同点 通过连续划线的操作，将聚集的菌种逐步稀释分散 将菌液进行一系列的梯度稀释，然后将不同稀释程度的菌液分别涂布到固体培养基的表面，进行培养，以得到单菌落 接种环 涂布器 从最后划线的区域挑取 稀释度合适，整个平板上都可找到单菌落 分离纯化菌种，获得单菌落 ①分离纯化菌种，获得单菌落②用于计数 ①都能分离纯化菌种；②都是在固体培养基上进行的。 2025/5/16 进一步探究： CO(NH2)2+H2O 脲酶 CO2+2NH3 脲酶阴性 脲酶阳性 土壤中分解尿素的细菌的鉴定 在以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂。 培养某种细菌后，如果pH升高，指示剂将变红，说明该细菌能够分解尿素。 可以观察菌落周围是否出现红色环带，红色环带直径与菌落直径比值越大，说明分解能力越强。 液体培养基： 可以直接看液体的变色情况； 固体培养基： 选择培养基 鉴别培养基 ：允许特定种类的微生物生长，同时抑制或阻止其他种类微生物生长。 ：加入某种试剂或化学药品，使目的菌培养后发生 特征性变化。 培养基的分类:按照功能分类 例1，加入青霉素的培养基：分离酵母菌、霉菌等真菌； 例2，不加氮源的无氮培养基：分离固氮菌； 例3，不加含碳有机物的无碳培养基：分离自养型微生物 例1，加入伊红美蓝的培养基：鉴别大肠杆菌（形成紫黑色菌落） 例2，加入刚果红的培养基：鉴别纤维素分解菌（出现透明光圈） A.选择培养基：将某种类微生物从混杂的微生物群体中分离出来。 B.鉴别培养基：用于鉴别不同类型的微生物 选择培养基 鉴别培养基 ：允许特定种类的微生物生长，同时抑制或阻止其他种类微生物生长。 ：加入某种试剂或化学药品，使目的菌培养后发生 特征性变化。 培养基的分类:按照功能分类 【课堂小结】 微生物的选择培养和计数 选择培养基 原理 概念 微生物的选择培养 稀释涂布 平板法 微生物的数量测定 间接计数 直接计数 一、概念检测 1.研究人员用无机盐、琼脂和石油配制的培养基从被石油污染的土壤中筛选出了一种石油降解菌。判断下列相关表述是否正确。 （1）这种培养基是一种选择培养基。（ ） （2）利用这种石油降解菌可以降解石油。修复土壤。（ ） （3）相对于未被污染的土壤,从被石油污染的土壤中更容易分离到石油降解菌。（ ） √ √ √ 练习与应用（P20） 一、概念检测 2.用稀释涂布平板法来统计样品中的活菌数时，通过统计平板上的菌落数就能推测出样品中的活菌数,原因是( ) A. 菌落中的细菌数目是固定的 B. 平板上的一个菌落就是一个细菌 C. 通过此方法统计的菌落数与活菌的实际数目相同 D. 平板上的一个菌落一般来源于样品稀释液中的一个活菌 D 练习与应用（P20） 二、拓展应用 1.反刍动物，如牛和羊具有特殊的器官一瘤胃。在瘤胃中生活着多种微生物，其中许多微生物能分解尿素。请你设计一个实验从瘤胃中分离出能够分解尿素的微生物。 提示：反刍动物的瘤胃中有大量的微生物，其中就有分解尿素的微生物。由于瘤胃中的微生物多为厌氧菌，接触空气后会死亡，因此分离其中能分解尿素的微生物除了需要准备选择培养基，还应该参照厌氧菌的培养方法进行实验设计。 练习与应用（P20） 二、拓展应用 2.地球上的植物每年产生的纤维素超过70亿吨，其中 40% ~ 60% 能被土壤中某些微生物分解利用，这是因为它们能够产生纤维素酶。对这些微生物的研究与应用，使人们能够利用精杆等生产酒精，用纤维索酶处理服装面料等。已知刚果红是一种染料，它可以与像纤维素这样的多糖物质形成红色复合物，但并不与水解后的纤维二糖、葡萄糖等发生这种反应。当我们在含有纤维素的培养基中加 入刚果红时，刚果红与纤维素形成红色复合 物；而当纤维素被纤维素分解菌分解后，复 合物就无法形成，培养基中会出现以这些菌 为中心的透明圈(如下图所示)。请回答下列 问题。 练习与应用（P20） 二、拓展应用 （1）现在要从土壤中分离纤维素分解菌,请你给出详细的实验方案。 （2）你打算到什么环境中去寻找纤维素分解菌？为什么？ （3）有同学说,可以把滤纸埋在土壤中,经过一段时间后,再从已腐烂的滤纸上筛选纤维素分解菌。请你评价这一做法。 （1）可以参考本节“探究·实践”中的设计思路进行设计。 练习与应用（P20） （2）纤维素分解菌大多分布在富含纤维素的环境中，采集土样时，可以选择纤维素丰富的环境，如树林中多年落叶形成的腐殖土等。 （3）这是人工设置适合纤维素分解菌生存的环境,腐烂的滤纸上很可能有纤维素分解菌。 30 (1)筛选分解尿素的细菌的培养基以尿素为唯一氮源，且为液体培养基。( ) 解析：选择培养基一般为固体培养基。 (2)能分解尿素的细菌之所以能分解尿素，是因为其能产生脲酶。( ) (3)稀释涂布平板法能分离细菌，也能计数( ) (4)平板划线法不仅能纯化细菌，也能计数( ) （5）可利用以石油为唯一碳源的培养基筛选能分解石油的细菌（ ）（6）取土壤和稀释土壤溶液时应在酒精灯火焰旁操作（ ） × √ √ × √ √ 【基础过关】 平板划线法能对细菌分离纯化但不能计数，通常将被石油污染过的土壤浸出液稀释后，采用稀释涂布平板法分离分解石油的细菌菌种，并对菌种进行计数，A错误，C正确；筛选能分解石油的细菌只能利用以石油为唯一碳源的选择培养基，B正确；称取土壤和稀释土壤溶液过程中的每一步都要在酒精灯火焰旁操作，D正确。 31 (7)从土壤中取样时，土层越浅越好( ) (8)来自土壤的微生物稀释倍数越大越好( ) (9)测定不同微生物数量时，接种的土壤悬浮液的稀释度相同( ) (10)菌落特征是鉴别菌种的重要依据( ) (11)利用显微镜直接计数法统计的细菌数量就是活菌的数量( ) × × × √ × 【基础过关】 【典例】利用稀释涂布平板法纯化的大肠杆菌，经培养后发现培养基上出现了多种菌落，不可能的原因是(　　) A.培养基制备过程中被杂菌污染 B.接种过程中，无菌操作不符合要求 C.系列稀释时，无菌操作不符合要求 D.使用涂布器时涂布不均匀 D 解析　出现杂菌污染的原因可能有培养基制备过程中被杂菌污染；接种过程中，无菌操作不符合要求；系列稀释时，无菌操作不符合要求等，A、B、C不符合题意；使用涂布器时涂布不均匀会导致菌落分布比较集中，不会导致杂菌污染，D符合题意。 33 【典例】某同学将1 mL土壤样液稀释100倍，在3个平板上用稀释涂布平板法分别接入0.1 mL稀释液，经适当培养后，3个平板上的菌落数分别为56、57和58。下列叙述错误的是(　　) A.可得出土壤样液中活菌大约为5.7×107个/L B.此方法统计的菌落数往往比实际的活菌数目低 C.一般选择菌落数为30～300的平板进行计数 D.显微镜直接计数法统计的是稀释液中的活菌数 D 解析　将1 mL样品稀释100倍，在3个平板上分别接入0.1 mL稀释液；经适当培养后，3个平板上的菌落数分别为56、57和58，据此可得出每升样品中的活菌数为(56＋57＋58)÷3÷0.1×1 000×100＝5.7×107，A正确；由于两个或多个细胞连在一起时，在平板上观察到的只是一个菌落，所以统计的菌落数往往比实际的活菌数目低，B正确；为保证结果准确，一般选择菌落数为30～300的平板进行计数，C正确；显微镜直接计数法统计的是稀释液中所有菌体的数目，包括活菌和死菌，D错误。 34 【典例】下列关于土壤中分解尿素的细菌的分离与计数的叙述正确的是 (　　) A.只有能合成脲酶的微生物才能分解尿素 B.统计样品中的活菌数目一般用平板划线法 C.筛选分解尿素的细菌时，应以尿素作为培养基中唯一的营养物质 D.在以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂，若指示剂变蓝，则表明筛选到了分解尿素的细菌 A 解析　统计样品中的活菌数目时一般用稀释涂布平板法，B错误；筛选分解尿素的细菌时应以尿素作为培养基中的唯一氮源，培养基中还应含有水、无机盐、碳源等营养物质，C错误；在以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂，若指示剂变红，则表明筛选到了分解尿素的细菌，D错误。 35 检测1.下列关于“土壤中分解尿素的细菌的分离与计数”实验操作的叙述，错误的是(　　) A.利用稀释涂布平板法准确估计菌落数目的关键是有恰当的稀释度 B.若要判断选择培养基是否起到了选择作用需要设置未接种的牛肉膏蛋白胨培养基作为对照 C.该实验应采用稀释涂布平板法 D.用以尿素为唯一氮源且添加了酸碱缓冲剂的培养基来培养该细菌后不会使酚红指示剂变红 B 【当堂检测】 解析　利用稀释涂布平板法估算菌落数目的关键是有恰当的稀释度，若稀释倍数太低，菌落太多，会长在一起，稀释倍数太高，平板上菌落数目过少，都不宜进行计数，A正确；若要判断选择培养基是否起到了选择作用，需设置接种在没有选择作用的牛肉膏蛋白胨培养基上培养作为对照，B错误；因要对细菌进行计数，所以该实验应采用稀释涂布平板法，C正确；分解尿素的细菌能合成脲酶，将尿素分解产生氨，使培养基的碱性增强，用以尿素为唯一氮源且添加了酸碱缓冲剂的培养基来培养该细菌，则能维持pH稳定，不会使酚红指示剂变红，D正确。 36 检测2.下列是关于“检测土壤中细菌总数”实验操作的叙述，其中错误的是(　　) A.用蒸馏水配制牛肉膏蛋白胨培养基，经高温、高压灭菌后倒平板 B.取104、105、106倍的土壤稀释液和无菌水各0.1 mL，分别涂布于各组平板上 C.将实验组和对照组平板倒置，37 ℃恒温培养24～48 h D.确定对照组无菌后，选择菌落数在300以上的实验组平板进行计数 D 解析　检测细菌总数，用蒸馏水配制培养基，常用高压蒸汽灭菌法灭菌后，取104、105、106倍的土壤稀释液和无菌水各0.1 mL，分别涂布于各组平板上，将实验组和对照组放置在适宜条件下培养，在确定对照组无菌后，选择菌落在30～300的平板为代表进行计数，D错误。 37 检测3. 在涂布有大肠杆菌的培养基上进行抑菌实验，在a、b、c处分别贴浸有不同抗生素(浓度相同)的无菌滤纸片，d处滤纸片浸有无菌水。培养后的结果如图。以下判断错误的是(　　) A. a处抑菌效果小于b处 B. b处的滤纸片没有沥干 C. c处抗生素无效 D. d为对照 A 解析　a与b形成的透明圈大小相近，因此a、b处抑菌效果相似，A错误；b处透明圈不规则，可说明b处的滤纸片没有沥干，B正确；c处的与d处相同，说明c处抗生素无效，C正确；d处用浸有无菌水的滤纸片，作为对照组，D正确。 38 检测4. 如图为“土壤中分解尿素的细菌的分离和计数”实验中样品稀释示意图。请据图分析，下列说法错误的是(　　) A A.③号试管的稀释倍数为103 B.④号试管中稀释液进行平板培养得到的菌落平均数可能为⑤号试管的10倍 C.⑤号试管的结果表明每克土壤中的菌株数为1.7×109 D.将涂布器在酒精灯火焰上灼烧冷却后，再进行涂布 解析　③号试管的稀释倍数是104，A错误；④号试管中稀释液进行平板培养，稀释倍数是⑤号试管的1/10，如果稀释倍数适当，得到的菌落平均数可能是⑤号试管的10倍，B正确；⑤号试管利用稀释涂布平板法计数的结果表明每克土壤中的菌株数为(168＋175＋167)÷3÷0.1×106＝1.7×109，C正确；将涂布器在酒精灯火焰上灼烧冷却后再进行涂布，以免温度过高杀死细菌，D正确。 39 40 $$