3.1重组DNA技术的基本工具课件-2024-2025学年高二下学期生物人教版选择性必修3

第1节 重组DNA技术的基本工具 第3章 基因工程 1 普通棉花 转基因抗虫棉 Bt抗虫蛋白基因 (简称Bt基因) 问题探讨 资料1：棉铃虫是棉花种植区最主要的害虫，主要危害棉株嫩顶和幼蕾，棉蕾受危害后，蛀孔处易受病菌感染，导致腐烂、脱落。1992年，我国南北两大主要产棉区出现了棉铃虫的空前大暴发，北方棉区尤为严重，约30%的棉花种植面积减产，直接经济损失100亿元以上。 让作物自带杀虫剂？ 资料2：科学家发现苏云金芽孢杆菌能通过分泌多种晶体蛋白(简称Bt抗虫蛋白)，破坏鳞翅目昆虫的消化系统进而杀死棉铃虫。 思考：假如你是一名科学家，为了挽救棉铃虫导致的棉花减产问题，你接下来会怎么做？ 2 重组DNA技术所需的三种基本工具： 这些“分子工具”各具有什么特征？ “分子手术刀” “分子缝合针” “分子运输车” 准确切割DNA分子 将DNA片段连接起来 将体外重组好的DNA分子导入受体细胞 3 问题探讨 限制酶 如何获取Bt抗虫蛋白基因？需要什么工具？ 将Bt基因的序列复制粘贴到NEB网页框中，点击提交（Submit） 4 问题探讨 限制酶 100 1100 5 问题探讨 100 1100 限制酶切割的作用特点和切割结果是什么？ BamHI NotI XhoI 如何获取Bt抗虫蛋白基因？ 6 一、限制性内切核酸酶——“分子手术刀” 1. 请同学们阅读资料3~资料5，回答以下问题： 任务一： 分析限制性内切核酸酶的作用 资料3：1970年代，科学家分离出Ⅱ类限制性内切酶（如EcoRI），并证实其仅作用于双链DNA的特定核苷酸序列（如回文序列），切割后产生黏性末端或平末端。通过对比实验发现，这些酶对单链DNA和RNA均无活性。 资料4：科学家通过晶体学研究表明，限制酶通过结合双链DNA的磷酸骨架和碱基配对区实现特异性识别，其活性中心无法结合RNA的单链结构或核糖-磷酸骨架。 资料5：已知EcoRI只能识别GAATTC序列，并在G与A之间切割磷酸二酯键。 （1）根据以上资料分析，限制酶的切割对象是 ；切割部位是 。 （2）根据以上资料分析，限制酶切割结果是？ 小结：限制酶的切割特点是特异性识别双链DNA分子并切割特定部位的磷酸二酯键。 形成黏性末端或平末端 双链DNA分子 磷酸二酯键 7 一、限制性内切核酸酶——“分子手术刀” 任务一： 分析限制性内切核酸酶的作用 2. 【探究活动1】动手模拟限制酶的切割过程： EcoR I (只能识别GAATTC序列， 并在G与A之间切割 磷酸二酯键) 黏性末端 平末端 Sma I (只能识别CCCGGG序列， 并在C与G之间切割 磷酸二酯键) 8 一、限制性内切核酸酶——“分子手术刀” 任务一： 分析限制性内切核酸酶的作用 2. 【探究活动1】动手模拟限制酶的切割过程： EcoR I (只能识别GAATTC序列， 并在G与A之间切割 磷酸二酯键) Sma I (只能识别CCCGGG序列， 并在C与G之间切割 磷酸二酯键) 黏性末端 平末端 9 一、限制性内切核酸酶——“分子手术刀” 3. 已知各限制酶的识别序列和切割位点(箭头所示)如下，请你根据图示写出相应限制酶切割形成的黏性末端，并思考同种限制酶切割产生的黏性末端是否相同？不同限制酶切割产生的黏性末端是否一定不同？ Spe I Xba I BamH I 10 一、限制性内切核酸酶——“分子手术刀” Spe I Xba I 同尾酶： 即切割形成相同的黏性末端的限制酶。 思考：你从中发现什么规律？ 同种限制酶产生的黏性末端相同， 3. 已知各限制酶的识别序列和切割位点(箭头所示)如下，请你根据图示写出相应限制酶切割形成的黏性末端，并思考同种限制酶切割产生的黏性末端是否相同？不同限制酶切割产生的黏性末端是否一定不同？ 不同的限制酶可能会形成相同的黏性末端 BamH I 11 二、DNA连接酶——“分子缝合针” 【探究活动2】以下是不同限制酶切割后形成的DNA片段末端，请你试着把它们缝合起来？此处要用到的分子工具是？这个工具的作用是？ 任务二： 分析DNA连接酶的作用 — — — — — — 磷酸二酯键 小结：DNA连接酶可以”缝合”具有相同黏性末端的DNA片段，恢复被切开的磷酸二酯键。 12 二、DNA连接酶——“分子缝合针” 种类 种类 来源 特点 DNA连接酶 _________ E.coli DNA连接酶连接具有平末端的DNA片段的效率要远远低于T4 DNA连接酶 T4 DNA连接酶 T4噬菌体 E.coli 大肠杆菌 13 二、DNA连接酶——“分子缝合针” 与DNA相关的几种酶的比较 项目 DNA连接酶 DNA聚合酶 限制酶 解旋酶 作用部位 磷酸二酯键 磷酸二酯键 磷酸二酯键 氢键 作用对象 DNA片段 单个的脱氧核苷酸 DNA DNA 作用结果 将两个DNA片段连接成重组DNA分子 将单个的脱氧核苷酸连接到DNA单链末端 切割DNA分子形成黏性末端或平末端 将双链DNA分子局部解旋为单链 14 任务三： 分析载体需具备的条件、载体的选择及重组DNA分子构建 三、基因进入受体细胞的载体——“分子运输车” 资料6：1973年，Stanley Cohen团队首次将细菌质粒（如CoE质粒）作为基因工程载体，解决了DNA片段无法自主复制的难题，标志着基因工程载体的正式诞生。质粒是具有自我复制能力的环状双链DNA分子。 资料7：1995年，腺病毒载体首次用于人类囊性纤维化治疗试验，开启了病毒载体在基因治疗中的新时代。利用经过改造的无害腺病毒作为载体可将外源基因导入目标细胞，并成功整合到宿主染色体中，从而实现稳定表达特定蛋白或纠正缺陷基因的目的。腺病毒不会引起人类疾病，安全性非常高。 （1）要使携带的外源DNA片段在受体细胞中稳定存在，载体需要具备什么条件？ （2）我们用肉眼看不到载体是否进入受体细胞，为了便于筛选重组DNA分子，载体需要具备什么条件？ 1. 请同学们阅读下列资料，回答相关问题： 能在受体细胞中进行自我复制，或整合到受体DNA上，随受体DNA同步复制 载体需要具有特殊的标记基因，便于重组DNA分子的筛选。 15 任务三： 分析载体需具备的条件、载体的选择及重组DNA分子构建 三、基因进入受体细胞的载体——“分子运输车” 【探究活动3】请你利用已有的Bt抗虫蛋白基因序列和下面提供的质粒载体谱图，设计将Bt基因连接到载体的具体方案，并概括载体要与外源DNA片段连接，载体又需要具备什么条件？ 载体需要具有一个至多个限制酶切割位点，供外源DNA片段插入其中。 16 回顾抗虫棉的培育过程：（三种分子工具的作用） 模拟科学家培育抗虫棉： 限制酶切割获取目的基因 DNA连接酶把目的基因与载体相连 DNA连接酶 重组DNA分子 载体 导入 限制酶 17 思考： 思考如何利用本节所学的三种“分子工具”培育转基因番木瓜？请设计几种不同的获得转基因番木瓜的方法，可课后通过DeepSeek等人工智能工具对其原理和可行性进行分析。 实践应用 18 根据已学知识，推测限制酶存在于原核生物中的主要作用是什么？为什么限制酶不切割细菌本身的DNA分子？ 发散思维： 根据任务一的第3问思考，在BamHI和XbaI中，哪种限制酶切割产生的DNA片段能与限制酶SpeⅠ切割产生的DNA片段相连接？连接完成后，该重组DNA分子的新连接处能否再被所用的限制酶识别？为什么？ 5'—ACTAGT—3' 3'—TGATCA—5' Spe I 5'—GGATCC—3' 3'—CCTAGG—5' BamH I 5'—TCTAGA—3' 3'—AGATCT—5' Xba I 19 四、探究•实践——DNA的粗提取与鉴定 DNA提取的应用 刑侦破案 基因组测序 插入人胰岛素基因的大肠杆菌 基因工程 亲子鉴定 20 四、探究•实践——DNA的粗提取与鉴定 实验设计思路： DNA、RNA、蛋白质和脂质等在物理和化学性质方面存在差异，可以利用这些差异，选用适当的物理或化学方法去除其他成分，对DNA进行提取。 思考： 1、从哪里提取DNA？ 2、如何从细胞中提取DNA，有哪些困难？ 细胞 细胞内成分复杂，且真核生物的DNA和蛋白质结合形成染色体，难以分离提纯。 21 四、探究•实践——DNA的粗提取与鉴定 1. 实验原理 (1)．提取DNA的原理 (2)．鉴定DNA的原理 （1）DNA不溶于酒精，但某些蛋白质溶于酒精。 （2）DNA在不同浓度的NaCl溶液中溶解度不同， 能溶于2mol/L NaCl溶液。 某种蛋白质的溶解度 在一定温度下（沸水浴），DNA遇二苯胺试剂会呈现蓝色，因此二苯胺试剂可以作为鉴定DNA的试剂。 0 0.14 NaCI浓度（mol/L） DNA溶解度 22 四、探究•实践——DNA的粗提取与鉴定 （1）选材 猪血（哺乳动物的成熟红细胞）无细胞核和线粒体，几乎不含DNA，不适合； 鸡血中红细胞有核DNA，且核DNA的量较多，适合。 含DNA的生物材料都可以，选取DNA含量相对较高的生物组织，成功率更大。 鸡血中加入柠檬酸钠，可防止血液凝固。 1）选什么样的材料实验更易成功？ 2）猪血和鸡血，哪个适合用作提取DNA的材料？操作时如何防止血液凝固？ 新鲜洋葱、香蕉、菠菜、菜花和猪肝等 2. 材料用具 23 四、探究•实践——DNA的粗提取与鉴定 （2）试剂 研磨液 体积分数为95%的酒精 2mol/L 的NaCl溶液 二苯胺 试剂 蒸馏水 溶解并提取DNA 析出DNA 溶解DNA 鉴定DNA，要现配现用 2. 材料用具 24 四、探究•实践——DNA的粗提取与鉴定 取材研磨 过 滤 DNA析出 DNA鉴定 问题：如果研磨不充分会对实验结果产生怎样的影响？ 研磨不充分，会使DNA分子不能从细胞核中释放出来，从而使研磨液中的DNA含量较低，影响最终提取的DNA量。 研磨液成分 作用 SDS EDTA Tris-HCl缓冲液 称取30g洋葱，切碎，放入研钵中，倒入10mL研磨液，充分研磨。 使蛋白质变性 抑制DNA酶 稳定DNA 3. 方法步骤 25 四、探究•实践——DNA的粗提取与鉴定 3. 方法步骤 取材研磨 DNA析出 DNA鉴定 破碎细胞，使核物质容易溶解在研磨液中 防止研磨时产生的热量影响DNA的提取量 研磨效果好（有利于充分研磨） (4)研磨不宜太用力 (1)研磨的目的： (2)研磨时间不宜太长： (3)有条件的可以在材料处理的过程中加入纤维素酶、果胶酶 过 滤 称取30g洋葱，切碎，放入研钵中，倒入10mL研磨液，充分研磨。 26 四、探究•实践——DNA的粗提取与鉴定 3. 方法步骤 取材研磨 过 滤 DNA析出 DNA鉴定 方法一：在漏斗中垫上 过滤研磨液，4℃冰箱中静置后取 ； 方法二：将研磨液倒入塑料离心管中离心，取 。 纱布 上清液 上清液 问题1：过滤的纱布能用滤纸代替吗？ 不可以，因为DNA会被吸附到滤纸上而大量损失。 问题2：上清液中除DNA之外，可能含有哪些杂质？ 可能含有核蛋白、多糖等杂质 27 四、探究•实践——DNA的粗提取与鉴定 3. 方法步骤 DNA析出 DNA鉴定 取材研磨 过 滤 问题1：此步骤的目的是？ 使蛋白质等溶解在酒精中，DNA不溶于酒精而析出。 问题2：酒精预冷的作用？ ①可抑制核酸水解酶的活性，进而抑制DNA降解； ②抑制分子运动，使DNA易形成沉淀析出； ③低温有利于增加DNA分子的柔韧性，减少其断裂。 问题3：为什么搅拌时应轻缓、并沿一个方向目的？ 减少DNA断裂，以便获得较完整的DNA分子 在上清液中加入体积相等的 溶液,静置2~3min，溶液中出现的 就是粗提取的DNA 。 预冷的酒精 白色丝状物 28 四、探究•实践——DNA的粗提取与鉴定 3. 方法步骤 实验组 对照组 沸水浴加热 DNA析出 DNA鉴定 取材研磨 过 滤 加入2mol/L氯化钠溶液 不加入丝状物 加入4ml二苯胺试剂 加入2mol/L氯化钠溶液 加入丝状物 加入4ml二苯胺试剂 将丝状物或沉淀物溶于 溶液中，加 入 试剂，混合均匀后，将试管置于沸水中加热5min。 二苯胺 2mol/L的NaCl 29 四、探究•实践——DNA的粗提取与鉴定 4. 结果分析与评价 二苯胺试剂鉴定呈现蓝色说明实验基本成功；如果不呈现蓝色，可能的原因有所提取的DNA含量低，或者在实验操作过程中出现了失误等。 （1）提取出丝状物或沉淀物一定是白色的吗？用二苯胺试剂鉴定的结果如何？ 观察提取的DNA的颜色，如果不是白色丝状物，说明DNA中的杂质较多。 本实验粗提取的DNA可能仍然含有核蛋白、多糖等杂质。 （2）你能分析出粗提取的DNA中可能含有哪些杂质吗？ （3）本实验的检测结果蓝色较浅的原因可能是什么？ ①材料中的核物质没有充分释放出来，如研磨不充分。 ②加入酒精后摇动或搅拌时过猛，DNA被破坏。 ③二苯胺最好现用现配，二苯胺易被空气氧化，影响鉴定效果。 30 四、探究•实践——DNA的粗提取与鉴定 5. 进一步研究 为了提纯DNA，某同学提出以下实验方案，请分析原因： 操作2:上述得到的DNA提取液，缓缓加入蒸馏水，调节NaCl溶液的浓度为0.14mol/L，玻璃棒搅拌，析出DNA。 操作1:得到的DNA粗提取物（丝状物或沉淀）加入2mol/L的NaCl溶液溶解，过滤，取滤液（DNA提取液）。 加2mol/L的NaCl溶液的目的： 加蒸馏水的目的： 溶解DNA，除掉高盐溶液中不能溶解的杂质，提纯DNA液。 降低NaCl溶液浓度，从而降低DNA分子在NaCl溶液中的溶解度，使DNA析出，除掉溶解在低盐溶液中的杂质。 通过反复溶解与析出DNA，就能够除去 的多种杂质。 与DNA溶解度不同 31 四、探究•实践——DNA的粗提取与鉴定 32 四、探究•实践——DNA的粗提取与鉴定 6. 拓展探究 （1）如果选用鸡血细胞进行实验，如何快速破碎细胞？ 将鸡血细胞置于蒸馏水中，待细胞涨破后，收集滤液。 利用蛋白酶分解杂质蛋白，不分解DNA，有利于DNA与蛋白质分开。 （2）有时会在DNA滤液中添加嫩肉粉（木瓜蛋白酶），这样有什么好处？ 33 Lavf56.40.101 Tencent APD MTS $$