3.1重组DNA技术的基本工具课件-2024-2025学年高二下学期生物人教版（2019）选择性必修3

第3章 基因工程 第1节 重组DNA技术的基本工具 对生活中的生物学现象进行分析并提出问题，体现了科学探究的核心素养。 番木瓜容易受番木瓜环班病毒的侵袭，当番木瓜被这种病毒感染后,产量会大大下降。科学家通过精心设计,用“分子工具”培育出了转基因番木瓜,它可以抵御番木瓜环斑病毒。 DNA双螺旋的直径只有2nm,对如此微小的分子进行操作,是一项非常精细的工作,更需要专门的“分子工具”。那么,科学家究竟用到了哪些“分子工具”?这些“分子工具”各具有什么特征呢? 1.概述基因工程是如何在遗传学、微生物学、生物化学和分子生物学等学科基础上发展而来的。 2.阐明DNA重组技术的实现需要利用限制性内切核酸酶、DNA连接酶和载体三种基本工具。 1.简述重组DNA技术所需的三种基本工具及其作用。（生命观念） 2.说出基因工程中作为载体需要具备的条件。（科学思维） 3.认同基因工程的诞生和发展离不开理论研究和技术创新。 （社会责任） 一、基因工程的概念及其诞生和发展 1．基因工程的概念 别名 技术 操作环境 生物体外 操作对象 操作水平 水平 结果 创造出更符合人们需要的新的 和生物产品 重组DNA 基因 DNA分子 生物类型 2．基因工程的诞生和发展 (1)1944年，艾弗里等人通过肺炎链球菌的转化实验，不仅证明了遗传物质是 ，还证明了DNA可以在 。 (2)1953年，沃森和克里克建立了_____ 模型并提出了遗传物质自我复制的假说。 (3)1970年，科学家在细菌中发现了第一个 (简称限制酶)。 (4)20世纪70年代初，多种限制酶、 和逆转录酶被相继发现。这些发现为DNA的切割、连接以及功能基因的获得创造了条件。 DNA 同种生物的不同个体之间转移 DNA双螺旋结构 限制性内切核酸酶 DNA连接酶 (5)1972年，伯格首先在体外进行了DNA改造的研究，成功地构建了第 一个体外 分子。 (6)1973年，科学家证明 可以作为基因工程的载体，构建重组DNA，导入受体细胞，使外源基因在 细胞中成功表达，并实现物种间的基因交流。至此，基因工程正式问世。 (7)1983年，科学家采用农杆菌转化法培育出世界上第一例转基因 。此后，基因工程进入了迅速发展的阶段。 重组DNA 质粒 原核 烟草 1．为什么几乎所有生物的DNA分子都可以进行拼接？ 几乎所有生物的DNA分子都具有相似的成分和结构，都是由4种脱氧核苷酸形成规则的双螺旋结构。 2．为什么一种生物的基因在其他生物体内也能正常表达？ (1)所有生物共用一套遗传密码，这为一种生物的基因在其他生物体内正常表达提供了可能。 (2)基因是控制生物体性状的结构和功能单位，具有相对独立性，这为目的基因在受体细胞中的独立表达提供了可能。 ？ 对结合基因工程的基本原理提出问题，体现了科学探究的核心素养。 【例1】以下说法叙述符合基因工程概念的是 (　　) A．在细胞内将DNA进行重组，赋予生物新的遗传特性 B．将人的干扰素基因重组到质粒上后导入大肠杆菌，获得能产生人干扰素的菌株 C．用紫外线照射青霉菌，使其DNA发生改变，通过筛选获得青霉素高产菌株 D．自然界中天然存在的噬菌体自行感染细菌后将其DNA整合到细菌DNA上 B 基因工程是在生物体外将DNA进行重组，赋予生物新的遗传特性，A项错误；B项符合基因工程的概念；C项属于诱变育种；D项外源基因导入细菌不是人为操作的，不属于基因工程的范畴。 二、重组DNA技术的工具酶 1．限制性内切核酸酶(又称限制酶) (1)来源：主要来自 。 (2)功能：能够识别双链DNA分子的特定 ，并使每一条链中特定部位的 断开。 (3)识别序列：一般为 个或其他数量的核苷酸，最常见的为6个核苷酸。 (4)结果：产生 或 。 原核生物 核苷酸序列 磷酸二酯键 黏性末端 平末端 4～8 (5)应用：已知限制酶EcoR Ⅰ和Sma Ⅰ识别的碱基序列和酶切位点分别为G↓AATTC和CCC↓GGG，在图中写出两种限制酶切割DNA后产生的末端并写出末端的种类。 黏性末端 平末端 要切两个切口，产生四个黏性末端，产生四个游离的磷酸基团。 会产生相同的黏性末端。 不能。限制酶只能识别并切开双链DNA分子。 ？ 对结合限制酶的作用与特点提出问题，体现了科学探究的核心素养。 1.要想获得某个特定性状的基因必须要用限制酶切几个切口？可产生几个黏性末端？产生几个游离的磷酸基团？ 2.如果把两种来源不同的DNA用同一种限制酶来切割，会怎样呢？ 3.限制酶能切开RNA分子的磷酸二酯键吗？为什么？ 11 4.推测限制酶存在于原核生物中的主要作用是什么？ 限制酶在原核生物中主要作用是切割外源DNA、使之失效，从而达到保护自身的目的。 5.为什么限制酶不切割细菌本身的DNA分子？ 通过长期的进化，细菌中含有某种限制酶的细胞，其DNA分子中不具备这种限制酶的识别切割序列，或者通过甲基化酶将甲基转移到所识别序列的碱基上，使限制酶不能将其切开。 2．DNA连接酶 (1)作用：将双链DNA片段“缝合”起来，恢复被限制酶切开的 。 (2)种类： 种类比较　　 E·coli DNA连接酶 T4 DNA连接酶 来源 特点 E·coli DNA连接酶连接具有平末端的DNA片段的效率要远远 T4 DNA连接酶 大肠杆菌 T4噬菌体 磷酸二酯键 低于 DNA连接酶和DNA聚合酶均能形成磷酸二酯键，二者的作用对象相同吗？为什么？ 不相同。DNA连接酶是将两个DNA片段连接起来，而DNA聚合酶是将单个的脱氧核苷酸加到已有的DNA片段上。 比较DNA连接酶和DNA聚合酶并提出问题，体现了科学探究的核心素养。 ？ 【归纳提升】 1．限制酶的识别序列和切割末端的判断 (1)限制酶识别序列的特点：呈现碱基互补对称，无论是奇数个碱基还是偶数个碱基，都可以找到一条中轴线，中轴线两侧的双链DNA上的碱基是反向对称重复排列的。以中心线为轴，两侧碱基互补对称。 (2)黏性末端或平末端是否由同一种限制酶切割形成的判断方法：将黏性末端或平末端之一旋转180°后，看它们是否是完全相同的结构。 若是完全相同的结构，则为相同限制酶切割形成的； 若不是完全相同的结构，则为不同限制酶切割形成的。 对基因工程涉及到的酶进行归纳概括，体现了科学思维的核心素养。 2．五种酶的比较 　 作用底物 作用部位 产物 限制酶 DNA分子 黏性末端或平末端 DNA连接酶 DNA片段 重组DNA分子 DNA聚合酶 脱氧核苷酸和DNA片段 子代DNA 解旋酶 DNA分子 脱氧核苷酸单链 DNA (水解)酶 DNA分子 游离的脱氧核苷酸 磷酸二酯键 磷酸二酯键 磷酸二酯键 碱基对中的氢键 磷酸二酯键 【例2】（2024·齐齐哈尔高二检测）下列对DNA连接酶的功能描述正确的是（　　） A.将碱基、脱氧核糖、磷酸连接起来 B.在基因工程中只作用于两个黏性末端 C.与DNA聚合酶作用的部位相同，作用对象不同 D.用于DNA复制时母链与子链间形成氢键 DNA连接酶形成磷酸二酯键，将磷酸和脱氧核糖之间的化学键连接起来，A错误；DNA连接酶在基因工程中可作用于黏性末端或平末端，B错误；DNA连接酶与DNA聚合酶作用的部位相同，都是磷酸二酯键，作用对象不同，DNA连接酶作用于DNA片段，DNA聚合酶作用于单个游离的脱氧核苷酸，C正确；DNA连接酶用于DNA复制时形成磷酸二酯键，D错误。 C 三、基因进入受体细胞的载体 1．种类 (1)常用载体——质粒 ①化学本质：一种裸露的、结构简单的 分子。 ②分布：独立于真核细胞细胞核或原核细胞拟核DNA之外。 环状双链DNA 注：真正被用作载体的质粒，都是在天然质粒的基础上进行过人工改造的 (2)其他载体： 、 等。 2．功能 (1)相当于运输工具，将外源基因送入 。 (2)携带 在受体细胞内大量复制。 噬菌体 动植物病毒 受体细胞 外源基因 ③质粒作为载体所具备的条件及原因 条件 原因 能在细胞中进行 到受体DNA上 能使目的基因 且数量可扩增 有一个至多个 位点 供外源DNA片段(基因)插入其中 常有特殊的__________ 便于重组DNA分子的_____ 对受体细胞 作用 避免受体细胞受到损伤 自我复制或整合 稳定存在 限制酶切割 标记基因 筛选 无毒害 1．质粒可以作为目的基因的载体，所有质粒都是载体吗？为什么？ 不是。作为载体必须具备一定的条件，条件不具备，则不能作为载体。 2．载体在基因工程中的作用是什么？ 作为运输工具，将外源(目的)基因导入受体细胞；携带外源(目的)基因在受体细胞内大量复制。 ？ 分析载体并提出问题，体现了科学探究的核心素养。 3.质粒上氨苄青霉素抗性基因的作用是什么？ 作为标记基因，便于重组DNA分子的筛选。 4.为使外源基因插入质粒中，质粒需具备的条件是什么？ 有一个至多个限制性内切核酸酶的切割位点。 1．载体上标记基因的标记原理 载体上的标记基因一般是一些抗生素的抗性基因。目的基因要转入的受体细胞没有抵抗相关抗生素的能力。当含有抗生素抗性基因的载体进入受体细胞后，抗性基因在受体细胞内表达，使受体细胞能够抵抗相应的抗生素，所以在受体细胞的培养体系中加入该种抗生素就可以只保留转入载体的受体细胞。 2．细胞膜上的载体与基因工程中的载体不同 (1)化学本质不同：细胞膜上的载体化学成分是蛋白质；基因工程中的载体可能是物质，如质粒(DNA)，也可能是生物，如动植物病毒等。 (2)功能不同：细胞膜上的载体功能是协助细胞膜控制物质进出细胞；基因工程中的载体是一种“分子运输车”，把目的基因送入受体细胞。 【归纳提升】 【例3】质粒是基因工程中最常用的目的基因运载工具。下列有关叙述错误 的是 (　　) A．质粒是不只存在于细菌细胞质中能自主复制的小型环状双链DNA分子 B．在所有的质粒上都能找到一个或多个限制酶切割位点 C．携带目的基因的重组质粒整合到宿主细胞的染色体DNA上会随后者的复制而复制 D．质粒上的抗性基因常作为标记基因供重组DNA的鉴定和选择 质粒不只分布于原核生物中，在真核生物——酵母菌细胞内也有分布，A正确；并不是所有的质粒都能找到限制酶的切割位点，从而成为合适的运载目的基因的工具，B错误；重组质粒进入受体细胞后，可以在细胞内自我复制，也可以整合后复制，C正确；质粒上的抗性基因常作为标记基因，D正确。 B DNA、RNA、蛋白质和脂质等在物理和化学性质方面存在差异，可以利用这些差异，选用适当的物理或化学方法对它们进行提取。 DNA不溶于酒精，但某些蛋白质溶于酒精 DNA能溶于物质的量浓度为2mol/L的NaCl溶液 在一定温度下（沸水浴），DNA被二苯胺试剂染成蓝色 初步分离DNA 和蛋白质 溶解DNA 鉴定DNA 0 0.14 NaCI浓度（mol/L） DNA溶解度 四、DNA的粗提取与鉴定 1.实验原理 2．方法步骤 (1)称取约30 g洋葱，切碎，然后放入研钵中，倒入10 mL ，充分研磨。 (2)在漏斗中垫上纱布，将洋葱研磨液过滤到烧杯中，在4 ℃冰箱中放置几分 钟后，再取 。也可以直接将研磨液倒入塑料离心管中，在1 500 r/min 的转速下离心5 min，再取 放入烧杯中。 (3)在上清液中加入 的酒精溶液(体积分数为95%)，静置 2～3 min，溶液中出现的白色丝状物就是粗提取的DNA。用玻璃棒沿 方 向搅拌，卷起丝状物，并用滤纸吸去上面的水分；或者将溶液倒入塑料离心 管中，在10 000 r/min的转速下离心 ，弃上清液，将管底的 (粗 提取的DNA)晾干。 研磨液 上清液 上清液 体积相等的、预冷 5 min 沉淀物 一个 (4)取两支20 mL的试管，各加入 的NaCl溶液5 mL。将丝状物或沉淀物溶于其中一支试管的NaCl溶液中。然后，向两支试管中各加入4 mL的 试剂。混合均匀后，将试管置于 中加热5 min。待试管冷却后，比较两支试管中溶液颜色的变化。 2 mol/L 二苯胺 沸水 实验组 对照组 水浴加热 1．鸟类和哺乳动物的红细胞都适合用来提取DNA吗？ 哺乳动物的红细胞没有细胞核，不适合作材料提取DNA。 2．实验过程要充分地搅拌和研磨，如果研磨不充分，会对实验结果产生怎样的影响？ 研磨不充分会使细胞核内的DNA释放不完全，提取的DNA量变少，导致看不到丝状沉淀物，用二苯胺鉴定不显示蓝色。 3.实验过程中应如何使用玻璃棒搅拌？为什么？ 搅拌时玻璃棒不能直插烧杯底部，搅拌要轻缓，并向一个方向搅拌以便获得较完整的DNA分子。 ？ 分析实验过程并提出问题，体现了科学探究的核心素养。 观察提取的DNA的颜色，如果不是白色丝状物，说明DNA中的杂质较多。 二苯胺试剂鉴定呈现蓝色说明实验基本成功；如果不呈现蓝色，可能的原因有所提取的DNA含量低，或者在实验操作过程中出现了失误等。 4.你提取出白色丝状物或沉淀物了吗？用二苯胺试剂鉴定的结果如何？ ★材料中的核物质没有充分释放出来，如研磨不充分或蒸馏水的量不够。 ★加入酒精后摇动或搅拌时过猛，DNA被破坏。 ★苯胺最好现用现配，否则二苯胺变成浅蓝色，影响鉴定效果。 5.与其他同学提取的DNA进行比较，看看实验结果有何不同， 分析产生差异的原因。 【归纳提升】 DNA粗提取与鉴定实验成功的关键 1.破碎细胞应彻底充分。 2.对提取的含杂质较多的DNA进行提纯时，所用的酒精必须经过充分预冷后才能使用。 3.实验过程中，搅拌时玻璃棒不能直插烧杯底部，并且搅拌要轻缓，并向一个方向搅拌以便获得较完整的DNA分子。 4.由于玻璃表面带电荷，DNA易被吸附于玻璃表面，故实验中应尽量不使用或少使用玻璃器皿，这样可以提取到较多的DNA。 5.二苯胺试剂要现配现用，否则会影响鉴定的效果。 【例4】（2024·山东高考）关于“DNA的粗提取与鉴定”实验，下列说法正确的是 ( ) A.整个提取过程中可以不使用离心机 B.研磨液在4℃冰箱中放置几分钟后，应充分播匀再倒人烧杯中 C.鉴定过程中DNA双螺旋结构不发生改变 D.仅设置--个对照组不能排除二苯胺加热后可能变蓝的干扰 在DNA的粗提取与鉴定实验中，可将获得的研磨液用纱布过滤后，在4℃的冰箱中放置几分钟，再取上清液,也可以直接将研磨液用离心机进行离心后取上清液，A正确；研磨液在4℃冰箱中放置几分钟后, DNA在上清液中，应取上清液倒入烧杯中，B错误；鉴定过程中用沸水浴加热，DNA双螺旋结构会发生改变, C错误；加入二苯胺试剂后沸水浴处理的时间要在5分钟以上，且要等到冷却后再观察结果，这样才可以观察到较为明显的显色反应，仅设置-个对照组可以排除二苯胺加热后可能变蓝的干扰，D错误。 A 来源 重组DNA技术的基本工具 “分子手术刀”：限制酶 “分子缝合针”：DNA连接酶 作用部位 产生结果 种类 作用 种类 “分子运输车”：基因进入受体细胞的载体 条件 1．科研人员经过多年的努力，创立了一种新兴生物技术——基因工程。实施该工程的最终目的是(　　) A．定向提取生物体的DNA分子 B．定向地对DNA分子进行人工“剪切” C．在生物体外对DNA分子进行改造 D．定向地改造生物的遗传性状 D 基因工程的内容就是在生物体外，通过对DNA分子进行人工“剪切”和“拼接”，对生物的基因进行改造和重新组合，然后导入受体细胞内进行无性生殖，使重组基因在受体细胞内表达，产生出更符合人们需要的基因产物，也就是定向地改造生物的遗传性状，故D正确。 2．(2023·广东高考)“DNA粗提取与鉴定”实验的基本过程是裂解→分离→沉淀→鉴定。下列叙述错误的是 (　　) A.裂解:使细胞破裂释放出DNA等物质 B.分离:可去除混合物中的多糖、蛋白质等 C.沉淀:可反复多次以提高DNA的纯度 D.鉴定:加入二苯胺试剂后即呈现蓝色 D 裂解是加蒸馏水让细胞吸水涨破,释放出DNA等物质,A正确;DNA在不同浓度的NaCl溶液中溶解度不同,能溶于2 mol/L的NaCl溶液,将溶液过滤,即可将混合物中的多糖、蛋白质等与DNA分离,B正确;DNA不溶于酒精,而某些蛋白质溶于酒精,可以反复多次用酒精沉淀出DNA,提高DNA纯度,C正确;将DNA溶解于NaCl溶液,加入二苯胺试剂,沸水浴5 min,待冷却后,能呈现蓝色,D错误。 3．（多选）（2024·齐齐哈尔高二检测）下列有关限制酶和DNA连接酶的叙述错误的是 (　　 ) A.用限制酶剪切获得一个目的基因时产生两个切口，有四个磷酸二酯键被断开 B.在使用限制酶的同时，必须用解旋酶解开DNA的双螺旋结构 C.DNA连接酶可以连接两个肽链片段 D.T4DNA连接酶和E．coliDNA连接酶都能催化平末端和黏性末端的连接 BC 用限制酶切割获得一个目的基因时得到两个切口，有4个磷酸二酯键被断开，A正确；在使用限制酶的同时，不需要用解旋酶解开DNA的双螺旋结构，B错误；DNA连接酶可以连接两个DNA片段，C错误；T4DNA连接酶和E．coliDNA连接酶都能催化平末端和黏性末端的连接，但E·coli DNA连接酶连接具有平末端的DNA片段的效率要远远低于T4 DNA连接酶，D正确。 4.下列关于载体的叙述中，错误的是(　　) A．载体与目的基因结合后形成一个重组的DNA分子 B．在基因工程操作中，真正被用作载体的质粒，都是在天 然质粒的基础上进行过人工改造的 C．目前常用的载体有质粒、噬菌体和动植物病毒等 D．载体具有某些标记基因，便于对其进行切割 D 用DNA连接酶将目的基因和载体DNA连接在一起，形成的DNA分子为一个重组DNA分子，A正确；常用的载体有质粒、噬菌体和动植物病毒等，其中在基因工程操作中，真正被用作载体的质粒，都是在天然质粒的基础上进行过人工改造的，B、C正确；标记基因的作用是鉴别受体细胞中是否含有目的基因，从而将含有目的基因的细胞筛选出来，D错误。 5.目前基因工程所用的质粒载体主要是以天然细菌质粒的各种元件为基础重新组建的人工质粒，pBR322质粒是较早构建的质粒载体，其主要结构如图一所示。 (1)构建人工质粒时要有抗性基因，以便于__________________________ _________________________。 (2)pBR322分子中有单个EcoRⅠ限制酶作用位点，EcoRⅠ只能识别序列—GAATTC—，并只能在G与A之间切割。若在某目的基因的两侧各有1个EcoR Ⅰ的切点，请画出目的基因两侧被限制酶EcoRⅠ切割后所形成的黏性末端_____________________。 重组DNA的鉴定和筛选(鉴别目 的基因是否导入受体细胞) (1)构建人工质粒时要有抗性基因作为标记基因，用于重组DNA的鉴定和筛选或便于鉴别目的基因是否导入受体细胞。(2)EcoRⅠ只能识别核酸序列—GAATTC—，并只能在G与A之间切割。根据限制酶的识别序列和切割位点进行解答。 (3)pBR322分子中另有单个的BamHⅠ限制酶作用位点，现将经BamH Ⅰ处理后的质粒与用另一种限制酶BglⅡ处理得到的目的基因，通过DNA连接酶的作用恢复________键，成功地获得了重组质粒，这说明________________ ________________________________。 （3）DNA连接酶的作用是恢复磷酸二酯键；由题干可知，两种限制酶(BamHⅠ和BglⅡ)切割得到的黏性末端相同，这样才能进行相应的碱基互补配对。 磷酸二酯　 和BglⅡ)切割得到的黏性末端相同 两种限制酶(BamHⅠ Lavf58.20.100 $$