1.2微生物的培养技术及应用课件-2024-2025学年高二下学期生物人教版（2019）选择性必修3

第1章 第2节 人教版 选择性必修3 1 目录 CONTENTS 无菌技术 2/ 培养基的配制 1/ 微生物的纯培养 3/ 01 培养基的配制 我们养一只小猫或者小狗，不仅要给它喂食、喂水，也要考虑它的大小便等问题 培养微生物也一样，需要给它们提供生长所需的各种物质以及满足它们生长繁殖所需的各种条件。 一 培养基的配制 培养基: 人们按照微生物对营养物质的不同需求，配制出供其生长繁殖的营养基质。 什么是微生物？ 对营养物质有什么不同需求？ 营养基质的具体成分有哪些？ ……. 视频：微生物 一 培养基的配制 1.微生物： 难以用肉眼观察的微小生物的统称。 概念： 类型： 无细胞结构 原核细胞 真核细胞 病毒： SARS病毒、新冠病毒等RNA病毒； 噬菌体等DNA病毒 原生生物： 草履虫、变形虫等 真菌： 酵母菌、毛霉等； 放线菌： 链霉菌等 细菌： 蓝细菌、大肠杆菌、乳酸菌等； 一 培养基的配制 人们按照微生物对营养物质的不同需求，配制出供其生长繁殖的营养基质。 2.培养基概念： 3.培养基营养成分： ①碳源 主要来源 作用 无机碳源： 有机碳源： CO2、NaHCO3等 牛肉膏、蛋白胨、糖类、脂肪酸和石油等 异养型微生物不能自身合成有机物，只能利用现成的有机碳 自养型微生物能通过自身光合作用或化能合成作用合成有机物，能利用无机碳源 微生物 碳源 蓝细菌 CO2 硝化细菌 CO2 根瘤菌 糖类等有机物 大肠杆菌 糖类、蛋白质等有机物 碳源物质在细胞内经过一系列复杂的化学变化后，成为微生物自身的结构物质和代谢产物。 一 培养基的配制 ②氮源 主要来源 作用 无机氮源： 有机氮源： N2、NH3、铵盐、硝酸盐等 牛肉膏、蛋白胨、尿素CO(NH2)2等 微生物 碳源 蓝细菌 CO2 硝化细菌 CO2 根瘤菌 糖类等有机物 大肠杆菌 糖类、蛋白质等有机物 氮源物质主要用于合成细胞中的蛋白质、核酸等 ③水 水是微生物生长和代谢必不可少的营养物质。 ④无机盐 主要来源 作用 无机盐一般有磷酸盐、硫酸盐、氯化物以及含钠、钾、钙、镁等元素的化合物。此外，还需要锌、锰、钼、铁、铜等微量元素。 是细胞的组成分，生理调节物质，某些化能自养菌的能源，酶的激活剂等 ①碳源 一 培养基的配制 ①碳源 ②氮源 ③水 ④无机盐 ⑤生长因子 生长因子通常是指微生物自身不能合成或合成量不足，但又是微生物生长和代谢所必需的小分子。 如某些维生素、氨基酸、嘌呤、嘧啶等。酵母浸粉、牛肉浸膏或植物组织提取液等天然物质中含有不同的生长因子。 一 培养基的配制 4.培养基分类： ①物理状态 液体培养基 半固体培养基 固体培养基 实验室常用的培养基凝固剂为琼脂，这是一种从海藻中提取的多糖类物质，一般不能被微生物所利用。 没有添加凝固剂的培养基 常用于大规模快速繁殖某种微生物。 半固体培养基加入琼脂量量为0.3%～0.7% 固体培养基加入琼脂量量为1.5%～2.0% 半固体培养基可用于观察微生物的运动和分类鉴定等 固体培养基常用于微生物分离、鉴定、计数和菌种保存等。 一 培养基的配制 4.培养基分类： ②成分来源 天然培养基 合成体培养基 天然培养基含有蛋白胨、牛肉膏和酵母浸粉等化学组成不确定的成分，如培养常见细菌的牛肉膏蛋白胨培养基。 合成培养基是由化学成分完全确定的物质配制而成的培养基。 一 培养基的配制 4.培养基分类： ③基本用途 选择培养基 鉴别培养基 选择培养基有利于目的微生物生长，使其成为优势菌，从而抑制杂菌生长，如仅以纤维素为碳源的培养基可用来筛选土壤中产纤维素分解酶的微生物。 鉴别培养基用于区分和鉴定不同微生物，如大肠杆菌在伊红美蓝培养基上的菌落呈现金属光泽的紫黑色。 通用培养基 通用培养基营养物质齐全，可以满足多种微生物的营养需求。 禽大肠杆菌病是由禽致病性大肠杆菌（avian pathogenic E. coli，APEC） 13 一 培养基的配制 5.培养基的作用： 培养、分离、鉴定、保存微生物或积累其代谢物。 6.培养基的配制： 某种常见的细菌培养基的营养构成 一 培养基的配制 5.培养基的作用： 培养、分离、鉴定、保存微生物或积累其代谢物。 6.培养基的配制： 某种常见的细菌培养基的营养构成 固体培养基 你能对该培养基进行分类吗？ 天然培养基 通用培养基 除了这些营养成分外，还需要满足其他需求吗？ 一 培养基的配制 6.培养基的配制： 某种常见的细菌培养基的营养构成 固体培养基 你能对该培养基进行分类吗？ 天然培养基 通用培养基 除了这些营养成分外，还需要满足其他需求吗？ 在提供上述几种主要营养物质的基础上，培养基还需要满足微生物生长对pH、特殊营养物质以及O2的需求。 一 培养基的配制 6.培养基的配制： 某种常见的细菌培养基的营养构成 固体培养基 你能对该培养基进行分类吗？ 天然培养基 通用培养基 除了这些营养成分外，还需要满足其他需求吗？ 在提供上述几种主要营养物质的基础上，培养基还需要满足微生物生长对pH、特殊营养物质以及O2的需求。 在培养乳酸杆菌时，需要在培养基中添加维生素； 在培养霉菌时，一般需要将培养基调至酸性； 在培养细菌时，一般需要将培养基调至中性或弱碱性； 在培养厌氧微生物时，需要提供无氧的条件。 微生物接种操作时为什么要“全副武装”和在专门的设备内进行？ 确保无杂菌污染 02 无菌技术 二 无菌技术 1.消毒： 获得纯净的微生物培养物的关键是防止杂菌污染。 无菌技术应围绕着如何避免杂菌的污染展开，主要包括 消毒和灭菌。 是指使用较为温和的物理、化学或生物等方法杀死物体表面或内部一部分微生物。 2.灭菌： 是指使用强烈的理化方法杀死物体内外所有的微生物，包括芽孢和孢子。 二 无菌技术 1.消毒： 是指使用较为温和的物理、化学或生物等方法杀死物体表面或内部一部分微生物。 2.灭菌： 是指使用强烈的理化方法杀死物体内外所有的微生物，包括芽孢和孢子。 对操作的空间、操作者的衣着和手进行清洁和消毒 将用于微生物培养的器皿、接种用具和培养基等进行灭菌。 二 无菌技术 1.消毒： 是指使用较为温和的物理、化学或生物等方法杀死物体表面或内部一部分微生物。 ①物理方法： 煮沸消毒： 在100 ℃煮沸5〜6 min，可以杀死微生物的营养细胞和一部分芽孢。 巴氏消毒： 对于一些不耐高温的液体，如牛奶，则可使用巴氏消毒法，即在62 〜65 ℃消毒30 min或80〜90 ℃处理30 s 〜1 min，可以杀死牛奶中的绝大多数微生物，并且基本不会破坏牛奶的营养成分。（啤酒啤酒、人乳及婴儿合成食物等） 紫外线消毒： 接种室、接种箱或超净工作台在使用前，可以用紫外线照射30 min，以杀死物体表面或空气中的微生物。 二 无菌技术 1.消毒： ①物理方法： ②化学方法： 如采用碘酒、体积分数为70%的酒精、双氧水等化学药剂，对实验室的空间、操作台表面、实验人员的工作服与手等进行消毒。 ③生物方法： 生物消毒法是指利用生物或其代谢物除去环境中的部分微生物的方法。例如，有的微生物能够寄生于多种细菌体内，使细菌裂解，因此可以用它们来净化污水、污泥。 二 无菌技术 2.灭菌： 是指使用强烈的理化方法杀死物体内外所有的微生物，包括芽孢和孢子。 ①湿热灭菌： 利用沸水、流通蒸汽或高压蒸汽进行灭菌的方法。 高压蒸汽灭菌： （效果最好） 实验室常用高压蒸汽灭菌锅，在压力100kPa、温度121 ℃条件下，维持15-30min 原理： 对象： 优点： 高温蒸汽破坏蛋白质、核酸等结构使其变性 操作简便，效果可靠，可以杀灭所有的生物，包括最耐热的某些微生物的休眠体。基本保持培养基的营养成分不被破坏。 培养基等 二 无菌技术 2.灭菌： ①湿热灭菌： ②干热灭菌： 干热灭菌箱内，在160-170 ℃的热空气中维持下2-3h达到灭菌目的 原理： 使微生物细胞膜破坏、蛋白质变性和原生质干燥等 对象： 耐高温，需保持干燥的物品 玻璃器皿 （如试管、培养皿、吸管、注射器） 金属器具 （如针头、 镊子、剪刀等） 二 无菌技术 2.灭菌： ①湿热灭菌： ②干热灭菌： ③灼烧灭菌： 将微生物的接种工具，如涂布器、接种环、接种针或其他金属用具，直接在酒精灯火焰的充分燃烧层灼烧，可以迅速彻底地灭菌（见下图）。 二 无菌技术 2.灭菌： ①湿热灭菌： ②干热灭菌： ③灼烧灭菌： 将微生物的接种工具，如涂布器、接种环、接种针或其他金属用具，直接在酒精灯火焰的充分燃烧层灼烧，可以迅速彻底地灭菌（见下图）。 此外，在接种过程中，试管口、瓶口等容易被污染的部位，也可以通过火焰灼烧来灭菌。 二 无菌技术 做好消毒和灭菌工作后，要注意避免已经灭菌处理的材料用具与周围的物品接触。为了避免周围环境中微生物的污染，接下来的许多操作都应在超净工作台上并在酒精灯火焰附近进行。 03 微生物的纯培养 三 微生物的纯培养 1.培养物： 在微生物学中，将接种于培养基内，在合适条件下形成的含特定种类微生物的群体。 分散的微生物在适宜的固体培养基表面或内部可以繁殖形成肉眼可见的、有一定形态结构的子细胞群体，这就是菌落。 菌落： 三 微生物的纯培养 1.培养物： 在微生物学中，将接种于培养基内，在合适条件下形成的含特定种类微生物的群体。 分散的微生物在适宜的固体培养基表面或内部可以繁殖形成肉眼可见的、有一定形态结构的子细胞群体，这就是菌落。 菌落： 如细菌菌落光滑，易与基质脱离； 放线菌菌落质地致密，菌落较小而不致广泛延伸； 酵母菌菌落较细菌菌落大而厚； 霉菌形成的菌落较疏松，多呈绒毛状、絮状。 三 微生物的纯培养 1.培养物： 在微生物学中，将接种于培养基内，在合适条件下形成的含特定种类微生物的群体。 2.纯培养物： 由单一个体繁殖所获得的微生物群体称为纯培养物。 三 微生物的纯培养 1.培养物： 在微生物学中，将接种于培养基内，在合适条件下形成的含特定种类微生物的群体。 2.纯培养物： 由单一个体繁殖所获得的微生物群体称为纯培养物。 3.纯培养： 获得纯培养物的过程就是纯培养。 过程 三 微生物的纯培养 4.纯培养过程： 配制培养基 灭菌 培养 接种 分离 酵母菌的纯培养 三 微生物的纯培养 5.酵母菌的纯培养 (1)实验原理： ①分散的微生物在适宜的固体培养基表面或内部可以繁殖形成肉眼可见的、有一定形态结构的子细胞群体，这就是菌落。 ②采用平板划线法和稀释涂布平板法能将单个微生物分散在固体培养基上，之后经培养得到的单菌落一般是由单个微生物繁殖形成的纯培养物。 (2)目的要求： ①学会配制培养酵母菌的培养基并倒平板。 ②学会进行无菌操作。 ③尝试通过平板划线操作来获得纯化的酵母菌菌落。 三 微生物的纯培养 (3)材料用具： 酵母菌培养液、马铃薯、葡萄糖（或蔗糖）、琼脂、蒸馏水、天平、小刀、纱布、烧杯、锥形瓶、棉塞、牛皮纸（或报纸）、皮筋、培养皿、接种环、酒精灯、超净工作台、高压蒸汽灭菌锅、干热灭菌箱和恒温培养箱等。 三 微生物的纯培养 (4)方法步骤： ①制备培养基 ②接种和分离酵母菌 ③培养酵母菌 三 微生物的纯培养 (4)方法步骤： ①制备培养基 配制培养基 称取去皮的马铃薯200 g，切成小块，加水1 000 mL，加热煮沸至马铃薯软烂，用纱布过滤。向滤液中加入20 g葡萄糖（也可用蔗糖代替）、15〜20 g琼脂，用蒸馏水定容至1 000 mL。 ②接种和分离酵母菌 ③培养酵母菌 三 微生物的纯培养 (4)方法步骤： ②制备培养基 灭菌 将配制好的培养基转移到锥形瓶中，加棉塞，包上牛皮纸，并用皮筋勒紧，再放入高压蒸汽灭菌锅中，在压力为100 kPa、温度为121 ℃的条件下，灭菌15〜30 min。将5〜8套培养皿包成一包，用几层牛皮纸包紧，放入干热灭菌箱内，在160〜170 ℃灭菌2 h。 三 微生物的纯培养 (4)方法步骤： ②制备培养基 倒平板 待培养基冷却至50 ℃左右时，在酒精灯火焰附近倒平板。具体操作步骤如下。 1.拔出锥形瓶的棉塞。 2.将瓶口迅速通过火焰。 3.用拇指和食指将培养皿打开一条稍大于瓶口的缝隙，将培养基（10 〜 20 mL）倒入培养皿，立即盖上皿盖。 4.等待培养基冷却凝固后，将培养皿倒过来放置。 可以用手触摸盛有培养基的锥形瓶，感觉温度下降到刚刚不烫手即可。 平板冷凝后，皿盖上会凝结水珠，凝固后的培养基表面的湿度也比较高；将平板倒置，既可以使培养基表面的水分更好地挥发，又可以防止皿盖上的水珠落入培养基，造成污染。 不要完全打开，以免杂菌污染培养基 三 微生物的纯培养 三 微生物的纯培养 1.在倒平板的过程中，如果不小心将培养基溅在皿盖与皿底之间的部位，这个平板还能用来培养微生物吗？为什么？ 最好不要用这个平板培养微生物。 防止空气中的微生物可能在皿盖与皿底之间的培养基上滋生。 将所倒平板放入37℃的恒温箱中培养12h～24h，观察是否有菌落存在以确定是否被污染或灭菌是否彻底。 2.怎么确定所倒平板未被杂菌污染或灭菌彻底？ 思考： 三 微生物的纯培养 (4)方法步骤： ③接种和分离酵母菌 通过接种环在固体培养基表面连续划线的操作，将聚集的菌种逐步稀释分散到培养基的表面。经数次划线后培养，可以分离得到单菌落。平板划线的具体操作如图的流程图。 玻璃涂布器 （ 涂布平板用） 接种针 （ 穿刺接种用 ） 接种环 （ 划线接种用 ） 三 微生物的纯培养 ③接种和分离酵母菌 玻璃涂布器 （ 涂布平板用） 接种针 （ 穿刺接种用 ） 接种环 （ 划线接种用 ） ①灼烧接种环，直至接种环金属丝烧红 ②在火焰旁冷却接种环，拔出酵母菌培养液试管的棉塞 ③试管口通过火焰 ④在火焰附近用接种环蘸取一环菌液 ⑤试管口通过火焰，并塞上棉塞 ⑥将皿盖打开一条缝隙，用接种环在培养基表面迅速划三至五条平行线，盖上皿盖 ⑦灼烧接种环，待其冷却后，从第一次划线的末端开始作第二次划线。重复以上操作，作第三、四、五次划线 三 微生物的纯培养 补充： 平板划线法： 通过接种环在固体培养基表面连续划线的操作，将聚集的菌种逐步稀释分散到培养基表面。经过数次划线后培养，可以分离得到单菌落。 连续划线法 分区划线法 三 微生物的纯培养 补充： 平板划线法： 通过接种环在固体培养基表面连续划线的操作，将聚集的菌种逐步稀释分散到培养基表面。经过数次划线后培养，可以分离得到单菌落。 连续划线法 分区划线法 1 2 3 4 5 三 微生物的纯培养 分区划线法 1 2 3 4 5 第1次划线 灼烧接种环灭菌 第2次划线 灼烧接种环灭菌 第3次划线 灼烧接种环灭菌 灼烧接种环灭菌 ①接种环只蘸一次菌液，但要在培养基不同位置连续划线多次； ②划线首尾不能相接； ③每次划线前灼烧接种环进行灭菌； ④划线操作结束后，仍需灼烧接种环，培养皿倒置培养。 【平板划线法注意事项】 三 微生物的纯培养 1.为什么在操作的第一步以及每次划线之前都要灼烧接种环？在划线操作结束时， 仍然需要灼烧接种环吗？为什么？ 灼烧时期 目的 取菌种前 每次划线前 接种结束后 杀死接种环上原有微生物。 杀死上次划线时残留菌种，使下一次划线的菌种直接来源上次划线的末端 杀死接种环上残留的菌种，避免细菌污染环境和感染操作者。 2.在灼烧接种环之后，要等其冷却后再进行划线的原因？ 以免接种环温度太高，杀死菌种。 3.在作第二次以及其后的划线操作时，总是从上一次划线的末端开始划线的原因？ 使细菌的数目随着划线次数的增加而逐步减少，以便获得单个菌落。 视频 演示 三 微生物的纯培养 稀释涂布平板法 分离和纯化微生物方法二： （仅做视频了解） 三 微生物的纯培养 (4)方法步骤： ③培养酵母菌 完成平板划线后，待菌液被培养基吸收，将接种后的平板和一个未接种的平板倒置，放入28 ℃左右（培养温度因酵母菌种类的不同而稍有差异）的恒温培养箱中培养24〜48 h。 三 微生物的纯培养 在未接种的培养基表面应该没有菌落生长，如果有，说明培养基被杂菌污染。 提示： 如果观察到了不同形态的菌落，可能是接种的菌种不纯或者无菌操作不规范等原因引起的。 1.在未接种的培养基表面是否有菌落生长？如果有，说明了什么？ 2.在接种酵母菌的培养基上，你是否观察到了单菌落？这些菌落的颜色、大小是否一致？如果你观察到了不同形态的菌落，你能分析出可能是由哪些原因引起的吗？ 3.是否进行了及时细致的观察与记录？ 培养12 h与24 h后的酵母菌菌落的大小会有明显不同。 （培养时间越长，菌落越大、颜色越深） 结果分析与评价 55 酵母菌的纯培养 2.接种和分离酵母菌 1.制备培养基 3.培养酵母菌 ①配制培养基（马铃薯、葡萄糖、琼脂、水） ②灭菌 ③倒平板（在酒精灯火焰附近操作） 培养基：湿热灭菌（高压蒸汽灭菌锅） 培养皿：干热灭菌（干热灭菌锅） 用接种环在固体培养基上用平板划线法接种 平板倒置，放入28℃左右的恒温培养箱培养 酵母菌纯培养小结 本节小结 练习与应用 一、概念检测 1.微生物的纯培养既需要适宜的培养基，又要防止杂菌污染。判断下列相关表述是否正确。 (1) 培养基中的营养物质浓度越高，对微生物的生长越有利。( ) (2) 消毒和灭菌的杀菌程度存在差异。( ) (3) 微生物的纯培养物就是不含有代谢废物的微生物培养物。 ( ) × × √ 练习与应用 2. 日常生活中保存食品的方法有哪些？这些方法是如何阻止或抑制微生物生长的？ 日常生活中保存食品的方法有干制、腌制、低温储存等。干制可以降低食品的水分含量；腌制可以通过食盐、糖等制造高渗环境，从而抑制微生物的生长和繁殖；低温则是通过降低微生物的代谢速率来抑制微生物的生长和繁殖。 自然界中微生物数量繁多，种类庞杂，要想从中分离出需要的特定微生物并不容易，尤其当要分离的微生物在混合的菌群中不是优势种群时，仅通过一般的平板划线法或稀释涂布平板法很难实现。该怎么办呢？ 第1章 第2节 人教版 选择性必修3 61 目录 CONTENTS 微生物的选择培养和计数 2/ 选择培养基 1/ 1973年，科学家从美国黄石国家公园的热泉中筛选出水生栖热菌 水生栖热菌 耐高温的DNA聚合酶 耐高温的DNA聚合酶 耐高温的DNA聚合酶 水生栖热菌 为什么水生栖热菌能从热泉中被筛选出来呢？ 这是因为水生栖热菌能在 70~80 ℃的高温条件下生存，而绝大多数微生物在此条件下不能生存。 水生栖热菌 根据这个原理，我们能不能从许多微生物中筛选出我们需要的一种呢？ 实验室中微生物的筛选，也可以应用同样的原理，即人为提供有利于目的菌生长的条件（包括营养、温度和pH等），同时抑制或阻止其他微生物的生长。 01 选择培养基 一 选择培养基 1.概念： 选择培养基：在微生物学中，将允许特定种类的微生物生长，同时抑制或阻止其他种类微生物生长的培养基，称为选择培养基。 2.方法： 方法：人为提供有利于目的菌生长的条件（包括营养、温度和PH等），同时抑制或阻止其他微生物的生长。 一 选择培养基 3.选择培养基三种常见制备方法或实例 利用营养缺陷进行选择培养 特点 通过控制培养基的营养成分，使营养缺陷的微生物不能正常生长。 举例 缺乏氮源时可以分离固氮微生物; 缺乏碳源时可以分离固碳微生物。 一 选择培养基 3.选择培养基三种常见制备方法或实例 利用某种化学物质进行的选择培养 特点 在完全培养基中加入某种化学物质，利用加入的化学物质对微生物产生的影响抑制某些微生物，同时选择所需微生物。 举例 加入青霉素可以分离出酵母菌和霉菌。 一 选择培养基 3.选择培养基三种常见制备方法或实例 利用培养条件进行的选择培养 特点 改变微生物的培养条件（温度、PH等） 举例 将培养基放到高温环境中培养可以得到耐高温的微生物；将培养基放到高盐环境可分离耐盐微生物，其他微生物在盐浓度高时易失水而不能生存。 一 选择培养基 CO(NH2)2+H2O CO2+2NH3 脲酶 NO3-、NH4＋ 被植物吸收 一 选择培养基 设计一种选择培养基，用尿素作为唯一氮源,可以将分解尿素的细菌分离出来。 这种培养基与普通培养基相比，只是用尿素作为唯一氮源，培养基的其他营养成分基本相同。 1. 如果让你配制一种培养基，将土壤稀释液中能分解尿素的细菌分离出来，培养基的配方该如何设计？ 2. 该培养基与普通培养基有哪些共同点和不同点？ 一 选择培养基 选择培养基与鉴别培养基的比较 项目 选择培养基 鉴别培养基 原理 用途 举例 根据不同微生物的特殊营养要求或对某些化学、物理因素的抗性不同 加入某种指示剂或化学药品(不影响微生物正常生长)，使微生物的某种代谢产物与培养基中的特定指示剂或化学药品发生反应 培养、分离出目标微生物 鉴别目标微生物 培养酵母菌和霉菌时，可在培养基中加入青霉素，抑制细菌的生长；利用以尿素为唯一氮源的培养基来培养可分解尿素的细菌 可用伊红美蓝培养基鉴定饮用水或乳制品中是否含有大肠杆菌(若有，则菌落呈黑色) 土壤中含有能分解尿素的细菌,还记得它们如何分解的吗？ CO(NH2)2+H2O CO2+2NH3 脲酶 我们如何分离它们？ 每克土壤样品究竟含有多少这样的细菌？ NO3-、NH4＋ 被植物吸收 02 微生物的选择培养和计数 二 微生物的选择培养和计数 怎么分离？ 如何计数？ 二 微生物的选择培养和计数 分离的原理： （一）实验原理 绝大多数微生物都能利用葡萄糖，但是只有能合成脲酶的微生物才能分解尿素。利用以尿素作为唯一氮源的选择培养基，可以从土壤中分离出分解尿素的细菌。 计数的原理： 当样品的稀释度足够高时，通过统计平板上的菌落数，能推测出样品中的活菌数目。 选择培养基配方 二 微生物的选择培养和计数 分离的原理： （一）实验原理 绝大多数微生物都能利用葡萄糖，但是只有能合成脲酶的微生物才能分解尿素。利用以尿素作为唯一氮源的选择培养基，可以从土壤中分离出分解尿素的细菌。 计数的原理： 当样品的稀释度足够高时，通过统计平板上的菌落数，能推测出样品中的活菌数目。 组分 含量 KH2PO4 1.4g NaH2PO4 2.1g MgSO4·7H2O 0.2g 葡萄糖 10.0g 尿素CO(NH2)2 1.0g 琼脂 15.0g 蒸馏水 定容到1000ml 筛选 能分解尿素的细菌 选择培养基配方 二 微生物的选择培养和计数 分离的原理： （一）实验原理 绝大多数微生物都能利用葡萄糖，但是只有能合成脲酶的微生物才能分解尿素。利用以尿素作为唯一氮源的选择培养基，可以从土壤中分离出分解尿素的细菌。 组分 含量 KH2PO4 1.4g NaH2PO4 2.1g MgSO4·7H2O 0.2g 葡萄糖 10.0g 尿素CO(NH2)2 1.0g 琼脂 15.0g 蒸馏水 定容到1000ml 筛选 能分解尿素的细菌 问：如何确定该选择培养基具有选择作用呢？ 配一种起对照作用的培养基 （牛肉膏蛋白胨培养基） 土壤微生物都能生存 问：还记得牛肉膏蛋白胨培养基怎么培养吗？ 选择培养基配方 二 微生物的选择培养和计数 （一）实验原理 组分 含量 KH2PO4 1.4g NaH2PO4 2.1g MgSO4·7H2O 0.2g 葡萄糖 10.0g 尿素CO(NH2)2 1.0g 琼脂 15.0g 蒸馏水 定容到1000ml 牛肉膏 5.0g 蛋白胨 10.0g NaCl 5.0g 琼脂 20.0g 蒸馏水 定容到1000ml 牛肉膏蛋白胨培养基 通用培养基 （能分解尿素的细菌可存活） （能分解尿素的细菌+不能分解尿素的细菌都能存活） 问：培养基配制好后要进行什么操作？ 选择培养基 固体、合成培养基 固体、天然培养基 二 微生物的选择培养和计数 通用培养基 选择培养基 灭菌 （高压蒸汽灭菌） 倒平板 （备用） 二 微生物的选择培养和计数 通用培养基 选择培养基 灭菌 （高压蒸汽灭菌） 倒平板 选择培养基配方 二 微生物的选择培养和计数 组分 含量 KH2PO4 1.4g NaH2PO4 2.1g MgSO4·7H2O 0.2g 葡萄糖 10.0g 尿素CO(NH2)2 1.0g 琼脂 15.0g 蒸馏水 定容到1000ml 牛肉膏 5.0g 蛋白胨 10.0g NaCl 5.0g 琼脂 20.0g 蒸馏水 定容到1000ml 牛肉膏蛋白胨培养基 通用培养基 （能分解尿素的细菌可存活） （能分解尿素的细菌+不能分解尿素的细菌都能存活） 不能高温灭菌 二 微生物的选择培养和计数 平板准备好的同时，还需要准备什么？ 土壤微生物 问：土壤微生物存在土壤中，怎么选择合适的土壤？ 细菌适宜在酸碱度接近中性的潮湿土 壤中生长，绝大多数分布在距地表3〜8 cm的土壤层。 因此，取样时一般要铲去表层土。 在城市，常见的是公园里、街道旁、花盆中的土壤； 在农村，则容易收集到农田或菜园里的土壤。 二 微生物的选择培养和计数 平板准备好的同时，还需要准备什么？ 土壤微生物 问：土壤微生物存在土壤中，怎么选择合适的土壤？ 细菌适宜在酸碱度接近中性的潮湿土 壤中生长，绝大多数分布在距地表3〜8 cm的土壤层。 因此，取样时一般要铲去表层土。 在城市，常见的是公园里、街道旁、花盆中的土壤； 在农村，则容易收集到农田或菜园里的土壤。 问：土壤收集后能不能直接倒入平板内培养？应该怎么操作？ 将土样加入盛有无菌水的锥形瓶中，充分摇匀,取液体加入平板内培养 二 微生物的选择培养和计数 问：土壤微生物存在土壤中，怎么选择合适的土壤？ 细菌适宜在酸碱度接近中性的潮湿土 壤中生长，绝大多数分布在距地表3〜8 cm的土壤层。 因此，取样时一般要铲去表层土。 在城市，常见的是公园里、街道旁、花盆中的土壤； 在农村，则容易收集到农田或菜园里的土壤。 问：土壤收集后能不能直接倒入平板内培养？应该怎么操作？ 将土样加入盛有无菌水的锥形瓶中，充分摇匀,取液体加入平板内培养 问：取土样时取多少？无菌水加多少？取溶有微生物的液体多少？这些操作能随意加吗？ ？ ？ 不可以，因为后期要进行计数，统计微生物数量 问：微生物数量太多不好统计怎么办？具体怎么操作？ 稀释涂布平板法 二 微生物的选择培养和计数 稀释涂布平板法是将菌液进行一系列的梯度稀释，然后将不同稀释度的菌液分别涂布到固体培养基表面的方法。在稀释度足够高的菌液里，聚集在一起的微生物将被分散成单个细胞，从而能在培养基表面形成单个菌落。 平板划线法是通过接种环在固体培养基表面连续划线的操作，将聚集的微生物细胞逐步稀释分散到培养基的表面的方法。在数次划线后培养，可以分离到由一个细胞繁殖而来的肉眼可见的子细胞群体，即菌落。 二 微生物的选择培养和计数 稀释涂布平板法是将菌液进行一系列的梯度稀释，然后将不同稀释度的菌液分别涂布到固体培养基表面的方法。在稀释度足够高的菌液里，聚集在一起的微生物将被分散成单个细胞，从而能在培养基表面形成单个菌落。 平板划线法是通过接种环在固体培养基表面连续划线的操作，将聚集的微生物细胞逐步稀释分散到培养基的表面的方法。在数次划线后培养，可以分离到由一个细胞繁殖而来的肉眼可见的子细胞群体，即菌落。 学习：稀释涂布平板法 二 微生物的选择培养和计数 稀释涂布平板法操作过程 将10g土样加入盛有90mL无菌水的锥形瓶中，充分摇匀。取1mL上清液加入盛有9mL无菌水的试管中，依次等比稀释。 1×10 1 mL 1 mL 1 mL 1 mL 1 mL 1 mL 1×102 1×103 1×104 1×105 1×106 1×107 9 mL 无菌水 90mL无菌水 10g ②在火焰旁将10g土样加入盛有90mL无菌水的锥形瓶中，充分摇匀，制成菌液。 ①铲取土样，将样品装入纸袋中。 取 1 mL 上清液加入盛有 9 mL 无菌水的试管中，依次等比稀释。 1×10 1 mL 1 mL 1 mL 1 mL 1 mL 1 mL 1×102 1×103 1×104 1×105 1×106 1×107 10g ③取0.1mL菌液，滴加到培养基表面。 微量移液枪 1×10 1 mL 1 mL 1 mL 1 mL 1 mL 1 mL 1×102 1×103 1×104 1×105 1×106 1×107 10g ③取0.1mL菌液，滴加到培养基表面。 微量移液枪 ④将涂布器浸在盛有酒精的烧杯中。 ⑤将涂布器放在火焰上灼烧，待酒精燃尽、涂布器冷却后，再进行涂布。 1×10 1 mL 1 mL 1 mL 1 mL 1 mL 1 mL 1×102 1×103 1×104 1×105 1×106 1×107 10g ③取0.1mL菌液，滴加到培养基表面。 微量移液枪 ④将涂布器浸在盛有酒精的烧杯中。 ⑤将涂布器放在火焰上灼烧，待酒精燃尽、涂布器冷却后，再进行涂布。 ⑥用涂布器将菌液均匀地涂布在培养基表面。涂布时可转动培养皿，使涂布均匀。 恒温培养箱 1×10 1 mL 1 mL 1 mL 1 mL 1 mL 1 mL 1×102 1×103 1×104 1×105 1×106 1×107 10g ③取0.1mL菌液，滴加到培养基表面。 微量移液枪 ④将涂布器浸在盛有酒精的烧杯中。 ⑤将涂布器放在火焰上灼烧，待酒精燃尽、涂布器冷却后，再进行涂布。 ⑥用涂布器将菌液均匀地涂布在培养基表面。涂布时可转动培养皿，使涂布均匀。 待涂布的菌液被培养基吸收后，将平板倒置，放入30〜37 ℃的恒温培养箱中培养1〜2 d。 稀释涂布平板法操作过程 恒温培养箱 1×10 1 mL 1 mL 1 mL 1 mL 1 mL 1 mL 1×102 1×103 1×104 1×105 1×106 1×107 10g ③取0.1mL菌液，滴加到培养基表面。 微量移液枪 ④将涂布器浸在盛有酒精的烧杯中。 ⑤将涂布器放在火焰上灼烧，待酒精燃尽、涂布器冷却后，再进行涂布。 ⑥用涂布器将菌液均匀地涂布在培养基表面。涂布时可转动培养皿，使涂布均匀。 待涂布的菌液被培养基吸收后，将平板倒置，放入30〜37 ℃的恒温培养箱中培养1〜2 d。 稀释涂布平板法操作过程 二 微生物的选择培养和计数——分离培养 ①各操作细节要保证“无菌”。如移液管要经过灭菌，梯度稀释时，试管口和移液管在离火焰1~2cm处，涂布器要经过灼烧灭菌等。 几点注意事项 ②将涂布器浸在盛有质量分数为70%的酒精的烧杯中。取出时，要让多余的酒精在烧杯中滴尽，然后将沾有少量酒精的涂布器在火焰上灼烧。 ③操作中要注意防火。不要将过热的涂布器放在盛有酒精的烧杯中，以免引燃其中的酒精。 ④涂布结束后，应将一个未接种的培养基和已接种的培养基放在一起培养，以检测培养基是否灭菌彻底。 二 你知道本实验用了多少培养基平板吗？都是什么类型的培养基平板？ 实验结果 未接种的牛肉膏蛋白胨培养基平板一个 未接种的选择培养基平板一个 102 103 104 105 106 不同稀释倍数的已接种的牛肉膏蛋白胨培养基各一个 102 103 104 105 106 不同稀释倍数的已接种的选择培养基每种稀释倍数至少3个 微生物的选择培养和计数——分离培养 减少实验误差,保证实验结果更准确 二 你知道本实验用了多少培养基平板吗？都是什么类型的培养基平板？ 实验结果 未接种的牛肉膏蛋白胨培养基平板一个 未接种的选择培养基平板一个 102 103 104 105 106 不同稀释倍数的已接种的牛肉膏蛋白胨培养基各一个 102 103 104 105 106 不同稀释倍数的已接种的选择培养基每种稀释倍数至少3个 一组对照 一组对照 微生物的选择培养和计数——分离培养 减少实验误差,保证实验结果更准确 未接种的 牛肉膏蛋白胨培养基 未接种的 选择培养基 二 实验结果 问：这组培养基没有菌落生成，说明什么？ 说明培养基没有被杂菌污染 问：若这组培养基有菌落生成，说明什么？ 说明培养基被杂菌污染了 微生物的选择培养和计数——分离培养 二 实验结果 已接种的不同稀释倍数 牛肉膏蛋白胨培养基 102 103 104 105 106 微生物的选择培养和计数——分离培养 二 实验结果 已接种的稀释102倍 的选择培养基 已接种的稀释102倍 的选择培养基 已接种的稀释102倍 的选择培养基 已接种的稀释102倍 的牛肉膏蛋白胨培养基 （对照） 微生物的选择培养和计数——分离培养 二 实验结果 已接种的稀释103倍 的选择培养基 已接种的稀释103倍 的选择培养基 已接种的稀释103倍 的选择培养基 已接种的稀释103倍 的牛肉膏蛋白胨培养基 （对照） 微生物的选择培养和计数——分离培养 二 实验结果 已接种的稀释104倍 的选择培养基 已接种的稀释104倍 的选择培养基 已接种的稀释104倍 的选择培养基 已接种的稀释104倍 的牛肉膏蛋白胨培养基 （对照） 微生物的选择培养和计数——分离培养 二 实验结果 已接种的稀释105倍 的选择培养基 已接种的稀释105倍 的选择培养基 已接种的稀释105倍 的选择培养基 已接种的稀释105倍 的牛肉膏蛋白胨培养基 （对照） 微生物的选择培养和计数——分离培养 二 实验结果 已接种的稀释106倍 的选择培养基 已接种的稀释106倍 的选择培养基 已接种的稀释106倍 的选择培养基 已接种的稀释106倍 的牛肉膏蛋白胨培养基 （对照） 微生物的选择培养和计数——分离培养 二 微生物的选择培养和计数——分离培养 102 103 104 105 106 已接种的稀释不同倍数的的选择培养基 问：你觉得测定土壤中细菌的数量，一般选用多少倍稀释的稀释液进行平板培养吗？ 测定土壤中细菌的数量，一般选用1×104 、1×105 和1×106 倍稀释的稀释液进行平板培养。 二 微生物的选择培养和计数——分离培养 102 103 104 105 106 已接种的稀释不同倍数的的选择培养基 在实际操作中，通常选用一定稀释范围的样品液进行培养，以保 证获得菌落数为30〜300、适于计数的平板。 如何计数？ 二 微生物的选择培养和计数——计数 计数的原理： 当样品的稀释度足够高时，通过统计平板上的菌落数，能推测出样品中的活菌数目。 104 105 106 当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个单菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌。通过统计平板上的菌落数，就能推测出样品中大约含有多少活菌。 问：你觉得这种方法计算结果比实际值偏大还是偏小？ 统计的菌落数往往比活菌的实际数目少，这是因为当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落。 因此，统计结果一般用菌落数而不是用活菌数来表示。 二 微生物的选择培养和计数——计数 菌落数 52 菌落数 63 菌落数 77 105 问：现在通过计数得到稀释105倍的选择培养的菌落数分别是52,63,77，你能计算出每克土样中分解尿素的细菌数吗？ 每g样品中的菌落数＝ (C÷V)×M M代表稀释倍数 C代表某一稀释度下平板上生长的平均菌落数 V代表涂布平板时所用的稀释液的体积(mL) =(64÷0.1)×105 =6.4×107个 二 微生物的选择培养和计数——计数 菌落数 52 菌落数 63 菌落数 77 105 问：除平板计数外，还可以用什么方法进行计数呢？ 除上述的活菌计数外，利用显微镜进行直接计数，也是一种常用的、快速直观的测定微生物数量的方法。 二 微生物的选择培养和计数——计数 问：除平板计数外，还可以用什么方法进行计数呢？ 除上述的活菌计数外，利用显微镜进行直接计数，也是一种常用的、快速直观的测定微生物数量的方法。 该方法利用特定的细菌计数板或血细胞计数板，在显微镜下观察、计数，然后再计算一定体积的样品中微生物的数量，统计的结果一般是活菌数和死菌数的总和。 (计数的结果比实际值大) 较薄，对细菌等较小的细胞进行观察和计数。 较厚，用于相对较大的酵母菌细胞、霉菌孢子等的计数。 红框代表 一个大格 大格 一个大格（计数室）分为25个中格（双线边） 黄框代表 一个中格 一个中格分为16个小格 1mm 面积 1mm2 1/25mm2 1/400mm2 厚度（高度） 0.1mm 计数公式 ×稀释倍数 A ¯ (0.05mm)2×0.1mm×16 =25×104× A ¯ ×稀释倍数 个/ml 中方格中酵母菌数量的平均值 ＝每小格平均菌株数×400×104×稀释倍数 内容 直接计数法 间接计数法 主要用具 显微镜、细菌计数板或血细胞计数板 涂布器 计数依据 细菌个数 培养基上菌落数 优点 计数方便、操作简单 计数的是活菌 计算公式 每毫升原液含菌株数＝每小格平均菌株数×400×1 0000×稀释倍数 每克样品中的菌株数:(C÷V)×M 　C:某稀释度下平板上生长的平均菌落数;V:涂布平板时所用的稀释液的体积(mL);M:稀释倍数 缺点 不能区分死菌与活菌 当两个或多个菌体连在一起时,平板上观察到的只是一个菌落 结果 比实际值偏大 比实际值偏小 二 微生物的选择培养和计数 比较 平板划线法 稀释涂布平板法 工具 接种环 涂布器 原理 通过接种环在琼脂固体培养基的表面_________操作，将聚集的菌种逐步稀释分散到培养基表面。（不能计数） 将菌液进行一系列的_________，稀释度足够高时，聚集在一起的微生物将被分散成单个细胞。（可计数） 特点 方法简单，但不适宜计数 单菌落更易分开，可以计数，但操作复杂 平板 示图 共同点 使培养基上形成由单个细菌细胞繁殖而来的子细胞群体——菌落 连续划线 梯度稀释 二 微生物的选择培养和计数 微生物的数量测定 选择培养基的作用 微生物选择培养获取纯培养物的方法-稀释涂布平板法 微 生 物 的 选 择 培 养 和 计 数 选择培养基 微生物的选择培养 科学实例 筛选原则 选择培养基的概念及举例 稀释涂布平板法的操作过程 间接计数法 — 稀释涂布平板法 直接计数 —计数板计数法 土壤中分解尿素的细菌的分离与计数 培养基的制备 实验设计 （1）土壤取样 （2）样品的稀释 （3）稀释涂布平板法接种 （4）微生物的培养与观察 实验设计 小结 练习与应用 1. 研究人员用无机盐、琼脂和石油配制的培养基从被石油污染的土壤中筛选出了一种石油降解菌，判断下列相关表述是否正确。 （1）这种培养基是一种选择培养基。（ ） （2）利用这种石油降解菌可以降解石油，修复土壤。（ ） （3）相对于未被污染的土壤，从被石油污染的土壤中更容易分离到石油降解菌。（ ） 2. 用稀释涂布平板法来统计样品中的活菌数时，通过统计平板上的菌落数就能推测出样品中的活菌数，原因是（ ） A. 菌落中的细菌数目是固定的 B. 平板上的一个菌落就是一个细菌 C. 通过此方法统计的菌落数与活菌的实际数目相同 D. 平板上的一个菌落一般来源于样品稀释液中的一个活菌 √ √ √ D Lavf58.29.100 Bilibili VXCode Swarm Transcoder v0.6.8 Multimedia Cloud Transcode (cloud.baidu.com) Content Adaptive Encoding 3.0 Content Adaptive Encoding 3.0 Multimedia Cloud Transcode (cloud.baidu.com) Content Adaptive Encoding 3.0 Multimedia Cloud Transcode (cloud.baidu.com) Content Adaptive Encoding 3.0 Multimedia Cloud Transcode (cloud.baidu.com) Content Adaptive Encoding 3.0 Multimedia Cloud Transcode (cloud.baidu.com) Content Adaptive Encoding 3.0 Multimedia Cloud Transcode (cloud.baidu.com) Lavf58.29.100 Bilibili VXCode Swarm Transcoder v0.7.31 Lavf58.29.100 Bilibili VXCode Swarm Transcoder v0.7.46 Multimedia Cloud Transcode (cloud.baidu.com) Content Adaptive Encoding 3.0 Lavf58.29.100 Bilibili VXCode Swarm Transcoder v0.7.6 $$