3.4 蛋白质工程的原理和应用-【省心备课】2024-2025学年高二生物同步教学精优课件（人教版2019选择性必修3）

第4节 蛋白质工程的原理和应用 贺老师 第3章 基因工程 1 对胰岛素的改造 从动物体内提取胰岛素的量十分有限，每100kg猪或牛的胰腺只能提取4～5g胰岛素，提取效率低且成本高昂。 科学家如何解决这个问题？ 2 问题1：结合必修2所学中心法则的有关知识，写出胰岛素的合成过程。 【资料1】1978年，科学家们利用基因工程技术，生产出首个与人胰岛素序列完全相同的胰岛素产品。1982年，第1种重组人胰岛素产品获得批准。人胰岛素逐渐取代动物胰岛素被应用于临床。 胰岛素的三维结构 胰岛素只有形成特定的空间结构，才能具有降血糖的功能。 结构与功能相适应 翻译 行使 生物功能 特定氨基酸序列的多肽链 折叠 具有高级结构的蛋白质 胰岛素基因 转录 mRNA 对胰岛素的改造 动物胰岛素 人胰岛素（基因工程） 3 将一种生物的基因转移到另一种生物体内，后者可以产生它本不能产生的 ，进而表现出新性状。 2、基因工程的不足： 在原则上只能生产自然界 。 已存在的蛋白质 1、基因工程的实质：（教材P93） 对胰岛素的改造 动物胰岛素 人胰岛素（基因工程） 蛋白质 4 【资料2】天然胰岛素见效慢，是因为天然胰岛素制剂往往以二聚体或六聚体的形式存在，需要经历长时间才能解离为单体，发挥作用。 3、天然蛋白质的不足： 天然蛋白质的 符合 生存的需要，却不一定完全符合 的需要。 结构和功能 对胰岛素的改造 特定物种 人类生产和生活 六聚体 二聚体 单体 这则资料体现了什么 5 【资料3】科学家通过研究胰岛素的三维结构发现，胰岛素B链第20~29位的氨基酸是胰岛素分子形成多聚体的关键区域，若将第28位的脯氨酸替换为天冬氨酸，或者将它与第29位的赖氨酸交换位置，可以有效抑制胰岛素的聚合，从而获得胰岛素单体。 胰岛素的分子结构示意图 脯氨酸 天冬氨酸 问题2：胰岛素为什么会发生聚合？ 如何有效抑制胰岛素的聚合，使胰岛素以单体的形式存在? 对胰岛素的改造 六聚体 单体 6 方案1：直接改造胰岛素上的氨基酸 脯氨酸 天冬氨酸 ①蛋白质的空间结构十分复杂，直接改造难度大，DNA为双螺旋结构； ②蛋白质是由基因编码的，改造了基因可以间接改造蛋白质； ③基因可以遗传，蛋白质无法遗传； 问题3： 如何将第28位的脯氨酸替换为天冬氨酸? 你能想到几种方案？ 对胰岛素的改造 选方案2 方案2：改造胰岛素基因 如果你是科学家，这两种方案你会选择哪种？为什么？ 方案2，工艺简单，产量高 最简单的思路是？不选方案一的原因是？选方案二的原因是？ 7 对胰岛素的改造 问题4：如何改造胰岛素基因，使其编码蛋白的第28位氨基酸由脯氨酸变为天冬氨酸？ 六聚体 单体 脯氨酸 天冬氨酸 GGG CCC CCC CTG GAC GAC 基因 mRNA 氨基酸 速效胰岛素 胰岛素 脯氨酸 天冬氨酸 改造蛋白质的思路： 逆中心法则，与天然蛋白质合成的过程相反 人工合成目的基因 确定目的基因的碱基序列后，怎样才能合成或改造目的基因？ 蛋白质工程是中心法则的逆推 8 ①预期蛋白质的功能 ②设计预期的蛋白质结构 ③推测应有的氨基酸序列 ④找到并改变相对应的脱氧核苷酸序列(基因)或合成新的基因 ⑤获得所需蛋白质 天然胰岛素B链部分氨基酸序列： 酪氨酸 苏氨酸 脯氨酸 赖氨酸 苏氨酸 设计后胰岛素B链部分氨基酸序列： B28 B29 酪氨酸 苏氨酸 赖氨酸 脯氨酸 苏氨酸 B28 B29 mRNA mRNA 由于人胰岛素 B 链基因较短，按照设计好的编码序列进行化学合成，是获取这种突变型目的基因的首选方法。 翻译 翻译 转录 天然胰岛素对应的部分基因： 改造后应得到的基因序列： 转录 9 对胰岛素的改造 问题5：确定目的基因的碱基序列后，怎样才能合成或改造目的基因？ GGG CCC CTG GAC 基因 ①定点突变技术 利用重叠延伸PCR技术进行定点突变： ②人工合成 确定目的基因的碱基序列后，怎样才能合成或改造目的基因？可以人工合成目的基因，或应用基因定点突变技术来进行碱基的替换、增添等进而改造基因。 10 定点突变——环状质粒定点突变技术 引物 突变 DNA聚合酶 DNA连接酶 受体细胞 转录 突变 项目 内容 条件 原料 酶 引物 操作方法 先通过 扩增已获得定点突变的基因，再通过基因工程将突变基因导入受体细胞，经过 和 合成所需的蛋白质。 结果 后代中 为诱变的DNA分子 适用范围 空间结构完全清楚的蛋白质， 对其基因进行碱基的 等 特点 4种脱氧核苷酸 DNA聚合酶和DNA连接酶 含突变位点的DNA分子片段 有目的性和针对性 PCR 转录 翻译 一半 替换 11 对胰岛素的改造的基本思路 氨基酸序列 新胰岛素基因 改造 降低胰岛素的聚合作用 预期功能 三维结构 推测 B28位脯氨酸替换为天冬氨酸 预期结构 转录 mRNA 折叠 行使 翻译 多肽链 有效抑制胰岛素的聚合 设计 功能 ①定点突变技术 ②人工合成 六聚体 单体 12 3.水蛭素是一种蛋白质，可用于预防和治疗血栓，但在治疗过程中发现其抗凝血活性低。研究人员欲提高水蛭素抗凝血活性，正确的操作步骤是(　　) ①确定影响活性的氨基酸序列　②分析水蛭素的空间结构，找到影响其活性的结构域　③推测需要替换的氨基酸序列　④构建表达载体，使其在受体细胞中表达　 ⑤PCR技术获得改造后的水蛭素基因　⑥确定基因中的碱基序列 A.②①③⑤⑥④  B.②③⑥①⑤④ C.②①③⑥⑤④  D.①②③④⑤⑥ 大本p76 ①预期蛋白质的功能 ②设计预期的蛋白质结构 ③推测应有的氨基酸序列 ④找到并改造相对应的脱氧核苷酸序列(基因)或合成新的基因 ⑤获得所需蛋白质 C 13 蛋白质工程 蛋白质工程是指以蛋白质分子的结构规律及其与生物功能的关系作为基础，通过改造或合成基因，来改造现有蛋白质，或制造一种新的蛋白质，以满足人类生产和生活的需求。（p93） ①基础：_______________________________________________ ②途经：___________________ ③操作对象：______ ④目的：_______________________________________________________________ ⑤理论和技术： 蛋白质分子的结构规律及其与生物功能的关系 改造或合成基因 改造现有蛋白质或制造一种新的蛋白质，以满足人类生产和生活的需求 基因(易错点) 借助计算机 通过X射线衍射技术 基因的定点突变技术 晶体学技术 又称第二代基因工程 获得蛋白质晶体： 分析晶体的结构： 构建蛋白质三维结构图: 碱基的替换： 由计算机建立的血红蛋白三维结构模型 利用X射线晶体衍射等，充分了解胰岛素的空间结构。 14 讨论 1.怎样得出决定这一段肽链的脱氧核苷酸序列？请把相应的碱基序列写出来。 某多肽链的一段氨基酸序列是： 思考·讨论p94 GCU GCC GCA GCG UGG AAA AAG 丙氨酸 … 色氨酸 赖氨酸 谷氨酸 苯丙 氨酸 … UUU UUC GAA GAG 查密码子表 mRNA序列 脱氧核苷酸序列 密码子的简并：一个氨基酸由一个或多个密码子决定 15 ---蛋白质工程基本思路的应用 某多肽链的一段氨基酸序列是： 思考·讨论 讨论： 1.怎样得出决定这一段肽链的脱氧核苷酸序列？请把相应的碱基序列写出来。 2. 确定目的基因的碱基序列后，怎样才能合成或改造目的基因？ GCU GCC GCA GCG UGG AAA AAG 丙氨酸 … 色氨酸 赖氨酸 谷氨酸 苯丙 氨酸 … UUU UUC GAA GAG 由于密码子具有简并性，一个氨基酸由一个或多个密码子决定。 ①人工合成目的基因。 ②从基因文库中获取目的基因后利用定点突变技术对基因进行改造。 4×1×2×2×2 = 32种 mRNA的序列： 脱氧核苷酸（基因）的序列： 有32种 16 思考：基因工程和蛋白质工程的操作对象都是基因，如何辨别一个操作是基因工程还是蛋白质工程？ 是否形成新的基因 蛋白质工程 是否对原有基因进行改造 是 否 是 否 蛋白质工程 基因工程 看蛋白质 看基因 是否为天然蛋白质 是 否 蛋白质工程 基因工程 蛋白质工程是在基因工程基础上延伸出来的第二代基因工程。 17 天然干扰素不易保存 预期结构 一个半胱氨酸变成丝氨酸 新干扰素基因 mRNA 延长保存时间 氨基酸替换 改造 转录 折叠 预期功能 行使功能 设计结构 推测序列 翻译 多肽链 在-70℃下可以保存半年 蛋白质工程的应用 1 医药工业方面 自然蛋白质的不足：干扰素是一种具有干扰病毒复制作用的糖蛋白，在临床上被广泛用于治疗病毒感染性疾病，但在体外保存却相当困难。 实例1：通过改造 ，延长干扰素体外保存时间 干扰素基因 18 蛋白质工程的应用 自然蛋白质的不足：小鼠单克隆抗体会使人体产生免疫反应，从而导致治疗效果大大降低。 1 医药工业方面 实例2：制备人鼠嵌合抗体 【蛋白质工程】通过改造_____，将小鼠抗体上结合抗原的区域（即可变区）“嫁接”到人的抗体（即恒定区）上，经过这样改造的抗体诱发 的强度就会降低很多。 思考：该过程能通过基因定点突变技术改造基因实现吗？ 不能；需要通过基因拼接完成。 负责识别和结合抗原 在同一种动物中，恒定区较为相似。 免疫反应 基因 抗体的特异识别功能没有丧失 19 蛋白质工程被广泛用于 或 。 蛋白质工程的应用 【资料】枯草杆菌蛋白酶具有水解蛋白质的作用，因此常被用于洗涤剂工业、丝绸工业等。利用蛋白质工程获得的该酶的突变体已有上百种，从中可能筛选出一些符合工业化生产需求的突变体，从而提高这种酶的使用价值。 改进酶的性能 开发新的工业用酶 2 在其他工业方面 水解蛋白质，常被用于洗涤剂工业、丝绸工业等。 20 赖氨酸合成 调控 达到一定浓度 两种酶的活性 352位的苏氨酸变成异亮氨酸 二氢吡啶二羧酸合成酶 天冬氨酸激酶 + 104位的天冬酰胺变成异亮氨酸 赖氨酸含量 抑制 提高 提高 限制 提高 提高5倍 提高2倍 蛋白质工程的应用 3 在农业方面 基因工程：将赖氨酸含量多的蛋白质编码基因导入植物中， 蛋白质工程：通过改造基因，进而改造现有蛋白质 21 ②改造微生物 ； 【资料】科学家利用蛋白质工程的思路来设计优良微生物农药,通过改造微生物蛋白质的结构，增强微生物防治病虫害的效果。 ①改造某些 ； 【资料】科学家正在尝试改造某些参与调控光合作用的酶， 以提高植物光合作用的效率，增加粮食的产量。 参与调控光合作用的酶 蛋白质结构 蛋白质工程的应用 3 在农业方面 伊维菌素 伊维菌素是新型的广谱、高效、低毒抗生素类抗寄生虫药 22 蛋白质工程是一项难度很大的工程。 由计算机建立的血红蛋白三维结构模型 科学家要设计出更加符合人类需要的蛋白质，还需要不断地攻坚克难。随着科技的深入发展，蛋白质工程将会给人类带来更多的福祉。 1.主要原因 蛋白质发挥功能必须依赖正确的高级结构， 而蛋白质的高级结构是十分复杂、难度很大的工程。 2.前景展望 蛋白质工程的应用 4 蛋白质工程的难点 23 利用重叠延伸PCR技术进行定点突变： 利用大引物PCR技术进行定点突变： 24 异想天开 p95 能不能根据人类需要的蛋白质的结构，设计相应的基因，导入合适的宿主细胞中，让宿主细胞生产人类所需要的蛋白质食品呢？ 理论上讲可以，但目前还没有真正成功的例子。 主要原因是蛋白质的高级结构非常复杂，人类对大多数蛋白质的高级结构和蛋白质在生物体内如何行使功能了解得还不够，很难设计出一个全新的而又具有功能的蛋白质。即使设计并获得了一个全新的蛋白质，它的生理生化特性、用它生产的蛋白质食品的安全性等都需要长期深入的研究。 蛋白质食品的工厂化生产想象图 25 1. 蛋白质工程可以说是基因工程的延伸，判断： (1)基因工程需要在分子水平对基因进行操作，蛋白质工程不需要对基因进行操作。（ ） (2)蛋白质工程需要改变蛋白质分子的所有氨基酸序列。（ ） (3)蛋白质工程可以改造酶，提高酶的热稳定性。（  ） √ × × 一、概念检测 26 2. 蛋白质工程是在深入了解蛋白质分子的结构与功能关系的基础上进行的，它最终要达到 的目的是 （ ） A. 分析蛋白质的三维结构 B. 研究蛋白质的氨基酸组成 C. 获取编码蛋白质的基因序列信息 D. 改造现有蛋白质或制造新的蛋白质，满足人类的需求 3. 水蛭素是一种蛋白质，可用于预防和治疗血栓。研究人员发现，用赖氨酸替换水蛭素第 47位的天冬酰胺可以提高它的抗凝血活性。在这 项替换研究中，目前可行的直接操作对象是（ ） A.基因           B.氨基酸　　C.多肽链         D.蛋白质 D A 一、概念检测 27 T4溶菌酶是一种重要的工业用酶，但是它在温度较高时容易失去活性。为了提高T4溶菌酶的耐热性，科学家首先对影响T4溶菌酶耐热性的一些重要结构进行了研究。然后以此为依据对相关基因进行改造，使T4溶菌酶的第3位异亮氨酸变为半胱氨酸。于是，在该半胱氨酸与第97位的半胱氨酸之间形成了一个二硫键，T4溶菌酶的耐热性得到了提高。 1.这项工作属于什么工程的范畴？ 2.在该实例中引起T4溶菌酶空间结构发生改变的根本原因是什么？ 3.如果要将该研究成果应用到生产实践，还需要做哪些方面的工作？ 蛋白质工程 二、拓展应用 p96 还需重新明确： 该酶的耐受温度范围、催化反应的最适温度、酶活力的大小等; 需要建立规模化生产该酶的技术体系,评估生产成本等。 根本原因：基因的碱基序列发生了变化。 第3位上的 异亮氨酸 半胱氨酸 与第97位的半胱氨酸形成-s-s- 定点突变 二、拓展应用 ④将连接产物导入大肠杆菌 重组质粒 空质粒 导入空质粒 导入了质粒的大肠杆菌才能存活 也有其他连接产物 导入重组质粒 1.某动物体内含有研究者感兴趣的目的基因，研究者欲将该基因导入大肠杆菌的质粒中保存。该质粒含有氨苄青霉素抗性基因(AmpR)、LacZ基因及一些酶切位点，其结构和简单的操作步骤如下图所示。  挑选 白色菌落 复习与提高 p98 30 请根据以上信息回答下列问题。 （1）在第②步中,应怎样选择限制酶？ （2）在第③步中，为了使质粒DNA与目的基因能连接，还需要在混合物中加入哪种物质？ （3）选用含有 AmpR 和 LacZ 基因的质粒进行实验有哪些优势？ （4）含有重组质粒的大肠杆菌菌落将呈现什么颜色？ 为什么？ 相同的限制酶或切割能产生相同末端的限制酶 DNA连接酶 便于进行双重筛选。AmpR 基因可用于检测质粒是否导入了大肠杆菌，LacZ 基因可以检测导入的是否为空质粒。 目的基因的插入破坏了LacZ基因，使其不能表达出 B-半乳糖苷酶，底物 X-gal不能被分解，因此菌落为白色。 白色 31 2.科学家将 Oct3/4、Sox2、c-Myc 和Klf4基因通过逆转录病毒转入小鼠成纤维细胞中，然后在培养ES细胞的培养基上培养这些细胞。2〜3周后，这些细胞显示出ES细胞的形态、具有活跃的分裂能力，它们就是iPS细胞。请回答下列问题。 ⑴在这个实验过程中，逆转录病毒的作用是什么？ 载体，将外源基因（Oct3/4、Sox2、c-Myc和KIf4）送入小鼠成纤维细胞。 ①将转入外源基因和没有转入外源基因的成纤维细胞分别培养在相同的培养基中，并确保其他培养条件相同。 ②如果只有转入外源基因的细胞转化成了iPS细胞，就可以证明iPS细胞的产生不是由于培养基的作用。 ⑵如何证明iPS细胞的产生不是由于培养基的作用？ 设置对照组。 ES细胞：胚胎干细胞 p46 32 ⑶如果要了解 Oct3/4、Sox2、c-Myc 和Klf4基因在诱导iPS细胞时，每个基因作用的相对大小，该如何进行实验？请你给出实验设计的思路。 依次只去掉1个基因，与转入4个基因的小鼠成纤维细胞的诱导情况进行比较。来推测缺失的那个基因对诱导iPS细胞的影响，进而判断每个基因作用的相对大小。（其他合理答案均可） 不会。因为在诱导转化的过程中细胞的遗传物质没有发生变化，理论上产生的还是“自体”细胞。 iPS细胞拥有分化为各种细胞的潜能，存在分化成肿瘤细胞的风险。 ⑷若将病人的皮肤成纤维细胞诱导成iPS 细胞，再使它转化为需要的细胞，用这些细胞给该病人治病，这是否会引起免疫排斥反应？为什么？iPS细胞具有分裂活性，用它进行治疗时可能存在什么风险？ 33 3.水稻根部一般没有根瘤菌，在种植时常需要施加氮肥。科学家想利用基因工程技术来减少施用氮肥的生产成本及可能造成的环境污染，他们提出了以下两种方案。 方案一 把根瘤菌的固氮相关基因导入水稻根系微生物中，使微生物能在根系处固氮，从而减少氮肥的施用量。 方案二 直接将固氮相关基因导入水稻细胞中，建立水稻的“小型化肥厂”，让水稻直接固氮，这样就可以免施氮肥了。 请评估这两种方案哪种更容易实现。 从便捷性角度认为能固氮的水稻新品种更值得推广； 从转基因安全性角度认为能固氮的水稻根系微生物更值得推广等。 34 EVCapture4.2.3软件录制 Lavf57.25.100 本视频由湖南一唯信息科技开发的EV录屏软件录制，www.ieway.cn $$