3.2基因工程的基本操作程序 导学案-2024-2025学年高二下学期生物人教版（2019）选择性必修3

第三章第2节　基因工程的基本操作程序 导学案 【学习目标】 1．阐明基因工程的原理和基本操作程序，某一转基因产品的方案。 2对人类生产或生活中的一需求，选取适当的基因工程的技术和方法，尝试设计获得 3．尝试进行 PCR 的基本操作并用电泳鉴定 PCR 的产物。 【重点难点】 重点： 1.基因工程基本操作程序的四个步骤 2.DNA 片段的扩增及电泳鉴定 难点： 1.利用 PCR 获取和扩增目的基因 2. DNA 片段的扩增及电泳鉴定 第1课时　目的基因的筛选与获取和基因表达载体的构建 --------〔感知教材〕-------- 一、目的基因的筛选与获取 1．筛选合适的目的基因 (1)目的基因 ①概念：在基因工程的设计和操作中，用于改变受体细胞性状或获得预期 等的基因就是目的基因。 ②作用：根据不同的需要，目的基因是不同的，它主要是指 的基因。 ③类型：与 、 、 和工业用酶等相关的基因，如培育转基因抗虫棉用到的 ，即Bt基因。 (2)筛选目的基因的方法：从 的基因中进行筛选是较为有效的方法之一。 2．获取目的基因的方法 (1) 目的基因。 (2)常用PCR特异性地快速扩增目的基因。 (3)通过构建基因文库来获取目的基因。 3．利用PCR获取和扩增目的基因 (1)含义：PCR是 的缩写。它是一项在体外提供参与DNA复制的 与 ，对目的基因的 进行大量复制的技术。 (2)原理： 。 (3)基本条件 ①场所：在一定的 中进行，其中一般要添加Mg2+。 ②模板：DNA母链。 ③原料：4种 。 ④酶： 。 ⑤引物：使DNA聚合酶能够从引物的 开始连接脱氧核苷酸。 (4) 过程 变性（温度超过90℃）：目的基因DNA 后解聚为单链重复循环 ↓ 复性（温度50℃左右）：两种 通过碱基互补配对与两条单链DNA结合 ↓ 延伸（温度72℃左右）：以单链DNA为模板，在 作用下进行延伸，即将4种脱氧核苷酸加到引物的3`端 (5)鉴定：常采用 来鉴定PCR的产物。 二、基因表达载体的构建 1．构建基因表达载体的目的 (1)让目的基因在受体细胞中 ，并且 给下一代。 (2)使目的基因能够 和发挥作用。 2．基因表达载体的组成 3．基因表达载体的构建过程 (1)首先用一定的 切割载体。 (2)然后用 限制酶或能产生相同末端的限制酶切割含有目的基因的DNA片段。 (3)再利用 将目的基因片段拼接到载体的切口处(如图所示)。 --------〔明辨是非〕-------- 1.利用PCR扩增目的基因所需的酶与体内DNA复制所需的酶是否相同? 2.利用PCR扩增胰岛素基因时,要建立在对扩增的胰岛素基因序列完全已知的基础上,是否正 确? 3.外源DNA必须位于重组质粒的启动子和终止子之间才能进行复制,是否正确? --------〔拓展深化〕-------- 1．思考并回答下列有关引物的问题。 (1)引物的本质是什么？ (2)用于PCR的引物的长度通常为多少个核苷酸？ (3)细胞内DNA复制时是否需要引物？为什么？ (4)利用PCR扩增目的基因时，为什么要用2种不同的引物？ (5)如果已知某目的基因的序列和结构，利用PCR筛选和扩增出该目的基因的关键是什么？ 2．如图为PCR扩增技术相关过程，请思考并回答下列问题。 (1)PCR扩增的是完整的模板DNA分子吗？说明理由。 (2)要保证目的基因能与载体相连接，还要对引物进行什么操作？ (3)利用PCR技术扩增目的基因，在第几轮循环产物中开始出现两条脱氧核苷酸链等长的DNA片段？比例是多少？ (4)如果循环n次，则共需消耗多少对引物？ 3．获取Bt基因后能直接将它导入受体细胞吗？为什么？ 4．请结合图示回答下列问题。 (1)构建基因表达载体时，能否用SmaⅠ酶切割质粒？为什么？ (2)与只使用EcoRⅠ相比较，使用BamHⅠ和Hind Ⅲ 两种限制酶同时处理质粒、外源DNA的优点是什么？ --------〔强化重点〕-------- · 1.PCR扩增过程中的循环图示与规律 循环次数 1 2 3 n DNA分子数 2 4 8 2n 含引物A(或B)的DNA分子数 1 3 7 2n－1 同时含引物A、B的DNA分子数 0＝21－2 2＝22－2 6＝23－2 2n－2 共消耗的引物数量 2＝21+1－2 6＝22+1－2 14＝23+1－2 2n+1－2 · 2．生物体内DNA复制与PCR技术的比较 (1)大多数限制酶的识别序列由6个核苷酸组成，也有少数限制酶的识别序列由4个、8个或其他数量的核苷酸组成。 (2)能被限制酶特异性识别的序列一般都为回文序列，也就是说，在该序列片段，一条链上按5′→3′读取的序列与其互补链上按5′→3′读取的序列完全一致。 例如：EcoRⅠ限制酶识别的DNA序列为，为回文序列。 · 3．区分启动子和终止子与起始密码子和终止密码子 启动子和终止子位于DNA上，是基因表达载体必需的部分，而起始密码子和终止密码子位于mRNA上，决定翻译的开始和结束。 · 4．图解限制酶的选择原则 (1)不破坏目的基因原则：如图甲中可选择PstⅠ，而不选择SmaⅠ。 (2)保留标记基因、启动子、终止子、复制原点原则：所选择的限制酶尽量不要破坏这些结构，如图乙中不选择SmaⅠ。 (3)确保出现相同黏性末端原则：通常选择与切割目的基因相同的限制酶或能产生相同平末端的限制酶切割质粒，如图中PstⅠ；为避免目的基因和质粒自身环化和反向连接，也可使用不同的限制酶切割目的基因和质粒，如图也可选择PstⅠ 和EcoR Ⅰ 两种限制酶。 · 5.真、原核细胞基因的结构 第2课时　将目的基因导入受体细胞、目的基因的检测与鉴定 --------〔感知教材〕-------- 三、将目的基因导入受体细胞 1．将目的基因导入植物细胞 (1)花粉管通道法 ①用微量注射器将含目的基因的DNA溶液直接注入 中。 ②在植物受粉后的一定时间内，剪去柱头，将DNA溶液滴加在花柱切面上，使目的基因借助 进入胚囊。 (2)农杆菌转化法 ①转化的概念：目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内 的过程。 ②农杆菌特点 a．能在 条件下侵染双子叶植物和裸子植物，而对大多数单子叶植物没有侵染能力。 b．农杆菌细胞内含有 ，当它侵染植物细胞后，能将Ti质粒上的T－DNA转移到被侵染的细胞，并且将其整合到该细胞的染色体DNA上。 ③转化方法 实例1：可以将新鲜的从叶片上取下的圆形小片与农杆菌共培养，然后筛选 ，并再生成植株。 实例2：可以将花序直接浸没在含有农杆菌的溶液中一段时间，然后培养植株并获得种子再进行筛选、鉴定等。 2．将目的基因导入动物细胞 (1)方法： 技术。 (2)受体细胞： 。 (3)过程：目的基因表达载体提纯→取卵(受精卵)→ →受精卵发育→获得具有新性状的动物。 3．将目的基因导入微生物细胞 (1)受体细胞：常以 作为受体细胞。 (2)过程：一般先用 处理大肠杆菌细胞，使细胞处于一种能 周围环境中DNA分子的生理状态，然后再将重组的基因表达载体导入其中。 四、目的基因的检测与鉴定 1．目的基因的检测与鉴定 (1)分子水平的检测 ①通过 等技术检测受体细胞的 上是否插入了 。 ②利用PCR技术检测目的基因是否转录出了 。 ③用相应抗体进行 检测目的基因是否翻译成相应蛋白质等。 (2)个体生物学水平的鉴定：抗虫、抗病 实验等。 2．基因工程的基本操作程序 --------〔明辨是非〕-------- 4.将人的生长激素基因与某种细菌的DNA分子进行重组,若要检测该细菌中生长激素基因是否成功表达,可采用抗原—抗体杂交技术,是否正确? 5.抗虫基因即使成功地插入植物细胞染色体上也未必能正常表达,是否正确? 6.将目的基因导入原核细胞时,对受体细胞不需做任何处理,是否正确? --------〔拓展深化〕-------- 5.如图为利用农杆菌转化法制备转基因植物的过程图，据图回答下列问题。 (1)在用土壤农杆菌转化法将目的基因导入植物细胞的过程中，一定要将目的基因插入到Ti质粒的T－DNA上的原因是什么？ (2)将基因表达载体导入农杆菌细胞时，应怎样处理农杆菌细胞？ (3)目的基因导入受体细胞时，不同生物常用的受体细胞分别是什么？ 6．用什么方法检测目的基因是否插入受体细胞的染色体DNA上？ 7．用什么方法检测目的基因是否发挥作用？ 8．如果目的基因是抗虫基因，在个体生物学水平上怎样检测？如果目的基因是耐盐基因呢？ 9．基因表达载体中具备标记基因(如抗生素抗性基因)，已经对受体细胞进行了筛选，为什么基因工程的第四步还要对目的基因进行检测和鉴定？ --------〔强化重点〕-------- · 6．目的基因导入不同受体细胞的方法 · 7．农杆菌转化法中的两次拼接和两次导入 (1)第一次拼接是将目的基因拼接到Ti质粒的T－DNA上，第二次拼接(非人工直接操作)是指插入目的基因的T－DNA拼接到受体细胞的染色体DNA上。 (2)第一次导入是将含目的基因的Ti质粒导入农杆菌(Ca2+处理法)，第二次导入(非人工直接操作)是指含目的基因的T－DNA导入受体细胞(农杆菌转化法)。 · 8．目的基因的检测与鉴定 · 9．个体生物学水平检测的具体方法及成功标志 转基因生物 鉴定方法 成功标志 抗虫植物 饲喂害虫(抗虫接种实验) 害虫死亡 抗病毒(菌)植物 病毒(菌)接种实验 未染病 抗盐植物 盐水浇灌 正常生长 抗除草剂植物 喷洒除草剂 正常生长 获取目的基因产物的转基因生物 提取细胞产物与天然产品进行功能、活性比较 细胞产物功能活性正常 --------〔教材习题〕-------- 从社会中来 参见本节正文中的内容。 旁栏思考题 1． 提 mRNA 不可以直接扩增，需要将它逆转录成 cDNA 再进行扩增。由 mRNA 逆转录形成 cDNA 的过程是： 第一步，逆转录酶以 RNA 为模板合成一条与 RNA 互补的 DNA 链，形成 RNA - DNA 杂交分子； 第二步，核酸酶 H 降解 RNA - DNA 杂交分子中的 RNA 链，使之变成单链 DNA ； 第三步，以单链 DNA 为模板，在 DNA 聚合酶的作用下合成另一条互补的 DNA 链，形成双链 DNA 分子。 2．提示有人采用总 DNA 注射法进行遗传转化，即将一个生物的总 DNA 提取出来，通过注射或花粉管通道法将这些 DNA 导入受体植物，没有进行基因表达载体的构建。这种方法针对性差，完全靠运气，也无法确定哪些基因导入了受体植物。 到社会中去 1． 提示这是一个开放性的问题，需要学生查找资料来回答。随着田间监测数据的更新及新的科研论文发表，每年学生获得的证据是不一样的。例如，科研人员对长江流域种植的转基因抗虫棉进行了监测，2011年的数据显示，大部分转基因抗虫棉品种的抗虫性属于中抗及高抗水平；2013年的数据表明，如果棉田周围存在大量天然庇护所，靶标害虫棉铃虫、红铃虫等并未对转 Bt 基因的抗虫棉产生明显抗性。在我国、澳大利亚、印等国的多个实验室中，科研人员通过毒素的连续抗性筛选，已经培育出多个高抗水平的转基因抗虫棉品种。教师要注意引导学生搜集科学、可靠的证据，如科研论文、权威的官方报道等。 2． 2．科研人员想出的延缓棉铃虫对 Bt 抗虫蛋白产生抗性的措施有很多，主要可以分为以下几个方面： （1） 基因策略：该策略是在分子水平上提高转基因抗虫棉的抗虫性和抗虫持久性，包括在棉花中转入多个杀虫基因、构建组织特异性表达的启动子、提高杀虫基因的表达量等。例如，最早种植的抗虫棉中只转入了一种 Br 基因，抗性比较单一；现在经常将两种或两种以上的 Br 基因（如 CrylAa 和 CrylAc 基因）同时转入棉花细胞，这样既可以提高杀虫活性，又可以延缓害虫抗性的产生和发展，还可以通过不同基因间的互补作用扩大抗虫范围。 （2） 田间策略：这是在种植时采取的措施，如提供庇护所、与其他作物轮作或套作等。例如，澳大利亚和美国等地普遍采取的措施是在转基因棉田中，总面积的4％种植不使用任何杀虫剂的非转基因棉花，或在转基因棉田周围种植20%~30％面积的可使用化学杀虫剂的非转基因棉花；在印度，一些地区要求，在转基因棉田周围至少种植5行或者20％面积的非转基因棉花。我国除新疆棉区及大型农场需设计专门的庇护所外，其他棉区如长江、黄河流域棉区多采用多种作物混作的耕作制度（如将转基因抗虫棉与番茄、向日葵、高粱、玉米、辣椒等棉铃虫宿主作物混作），这些作物可以构成天然的庇护所，一般无须种植非转基因棉花作为庇护所。这样做的原理是为少部分害虫提供一个正常的取食环境，始终保持一定的敏感目标害虫种群。这样，即使目标害虫对转基因抗虫棉产生了抗性，但是因为其与敏感目标害虫交配，后代抗性基因会发生分离，所以抗性目标害虫的种群也不至于迅速增加。 （3） 国家宏观调控策略：该策略包括实施分区种植管理、加强抗性监测、进行严格的安全性评价等。 练习与应用 一、概念检测 1.(1) √ ;(2) × ;(3) × 2.D。 二、拓展应用 外源基因插入基因组中可能为单位点插入，或者同一染色体多位点插入，或者不同染色体多位点插入。大多数情况下，难以做到定点插入；插入的拷贝数也是随机的。因此，外源基因在转基因植物中的遗传是很复杂的。例如，科研人员在对转 GUS 基因( B 葡糖醛酸糖苷酶基因）的烟草进行基因表达分析时，发现部分转基因植株的染色体 DNA 整合了多个拷贝的基因，从而导致 GUS 基因失活。除此之外，外源基因丢失、基因重排等也都可能影响外源基因的稳定性。 探究·实践 1．提示可以通过在紫外灯下直接观察 DNA 条带的分布及粗细程度来评价扩增的结果。 2．提示如果扩增不成功，可能的原因有：漏加了 PCR 的反应成分，反应成分的用量不当， PCR 程序设置不当等。如果扩增结果不止一条条带，可能的原因有：引物设计不合理，它们与非目的序列有同源性或容易聚合形成二聚体；退火温度过低； DNA 聚合酶的质量不好；等等。 学科网（北京）股份有限公司 $$ 第三章第2节　基因工程的基本操作程序导学案 参考答案 第1课时　目的基因的筛选与获取和基因表达载体的构建 --------〔感知教材〕-------- 一、筛选合适的目的基因 1.(1)表达产物 编码蛋白质 生物抗逆性 生产药物 毒物降解 Bt抗虫蛋白基因，即Bt基因。 (2)相关的已知结构和功能清晰 2．(1)人工合成 3．(1)聚合酶链式反应 各种组分 反应条件， 核苷酸序列进 (2)DNA半保留复制。 (3)缓冲 脱氧核苷酸 耐高温 3′端 (4)受热变性 引物 耐高温的DNA聚合酶 (5)鉴定：常采用琼脂糖凝胶电泳来鉴定PCR的产物。 二、基因表达载体的构建 1．(1)稳定存在 遗传 (2)表达 2．启动子 上游 RNA聚合酶 终止子 下游 转录 标记 3．(1)限制酶 (2)同种 (3)DNA连接酶 --------〔明辨是非〕-------- 1.不相同。体内DNA复制所需的酶有解旋酶和DNA聚合酶,而PCR所需的酶是耐高温的DNA聚合酶,不需要解旋酶。 2.不正确。利用PCR扩增目的基因时,知道扩增的目的基因的一段序列即可,可根据这段序列合成引物,不需要知道目的基因的全部序列。 3.不正确。复制需要以复制原点为起点,而启动子和终止子是转录的起止点。 --------〔拓展深化〕-------- 1.（1）引物是一小段能与DNA母链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸，既可以是DNA单链，也可以是RNA单链。细胞内的DNA进行复制时，也需要引物，一般是RNA片段。 （2）用于PCR的引物长度通常为20～30个核苷酸。 （3）需要。因为DNA聚合酶不能从头开始合成DNA单链，只能将游离的脱氧核苷酸连接在一条DNA单链的3′端，所以在延伸子链前，需要提前合成一小段RNA或DNA作为引物。 （4）DNA是两条反向平行的双链结构，而复制时只能从固定的方向(模板链的3′端)开始，所以引物的碱基序列是不同的。 （5）根据目的基因两端的核苷酸序列设计引物。 2.（1）不是。PCR扩增的仅仅是两种引物之间所对应的特定DNA片段。 （2）要在两种引物的5′端分别添加上限制酶的识别序列。 （3）第3轮。1/4。 （4）共需消耗(2n－1)对引物 3.不能。因为游离的DNA进入受体细胞，一般会直接被分解，即使可以转录翻译成蛋白质，游离的DNA片段也无法随着细胞分裂而进行复制，导致子代细胞中不再含有目的基因。 4.（1）不能。因为SmaⅠ会破坏质粒的抗生素抗性基因。该基因是标记基因，用于重组DNA分子的筛选，若被破坏，则无法进一步筛选。 （2）可以防止质粒和目的基因的自身环化以及目的基因与载体的反向连接。 第2课时　将目的基因导入受体细胞、目的基因的检测与鉴定 --------〔感知教材〕-------- 三、将目的基因导入受体细胞 1．(1)子房 花粉管通道 (2)维持稳定和表达 自然 Ti质粒 转化细胞 2．(1)显微注射技术 (2)受精卵 (3)显微注射 3．(1)大肠杆菌 (2Ca2+ 吸收 四、目的基因的检测与鉴定 1．(1)PCR 染色体DNA 目的基因 mRNA 抗原—抗体杂交 (2)接种 2．基因工程的基本操作程序 目的基因 限制酶 DNA连接酶 基因表达载体 表达载体 检测和鉴定 --------〔明辨是非〕-------- 4.正确。生长激素的化学本质是蛋白质,利用抗原—抗体杂交技术可以检测目的基因是否成功表达出生长激素。 5.正确。抗虫基因成功地插入植物细胞染色体上后,其表达需要经过转录和翻译。若转录或翻译过程受阻,如RNA聚合酶不能正常与抗虫基因启动子结合,则抗虫基因不能正常表达。 6.不正确。将目的基因导入原核细胞前,一般先用Ca2+处理原核细胞,使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态。 --------〔拓展深化〕-------- 5.（1）农杆菌中的Ti质粒上的T－DNA(可转移的DNA)可转移至被侵染的细胞，并且整合到该细胞的染色体DNA上。 （2）提示：基因表达载体(重组质粒)导入农杆菌细胞时，要用Ca2+处理农杆菌细胞，使其处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态，利于重组质粒的导入。 （3）①对于植物来说，受体细胞可以是受精卵或体细胞，因为植物细胞具有且容易表现全能性。 ②对于动物来说，受体细胞一般是受精卵，因为受精卵表现全能性相对容易，而高度分化的动物体细胞的全能性不易表现。 ③大肠杆菌和酵母菌在基因工程中都可以作为受体细胞，但又有所不同。大肠杆菌为原核细胞，而酵母菌为真核细胞(具有多种细胞器)，所以酵母菌在用于生产需要加工和分泌的蛋白质时比大肠杆菌有优势。 6.PCR技术。 7.用PCR技术检测目的基因是否转录出mRNA；用抗原—抗体杂交技术检测目的基因是否翻译出相应蛋白质。 8.如果目的基因是抗虫基因，则要进行抗虫接种实验。如果目的基因是耐盐基因，则要用一定浓度的盐水浇灌。 9.在含抗生素的选择培养基上能生长的是导入了载体的细胞，这里的载体可能是基因表达载体，也可能是未插入目的基因的空载体，因此第四步需要对目的基因是否成功导入进行进一步的检测。此外，即便在选择培养基上能生长的细胞中导入的是基因表达载体，但是仍然不知道目的基因插入的位置、方向等是否正确，能否正确表达，因此也需要在转录和翻译以及个体生物学水平上进行检测和鉴定。 学科网（北京）股份有限公司 $$