备课素材：限制酶拓展与预测-2024——2025学年度第二学期高中生物学选择性必修三

限制酶拓展与预测 人教2020版高中生物学选择性必修三第71页： 第74页： 如何透彻理解这两个问题？ （1）科学史  在1952-1953年，Luria和Bertani分别发现了噬菌体宿主控制性现象。随后Arber采用放射性同位素标记发现，在噬菌体入侵宿主细胞时，进入细胞内的噬菌体DNA被降解掉，而宿主自身的DNA未被降解。因此，他们提出了限制-修饰(R-M)假说，认为细菌等一些原核生物存在一种可保护自身免于被外来DNA(如噬菌体)侵入的防卫系统，即限制修饰系统，该系统包括限制和修饰两个方面的作用。限制是指细菌的限制性核酸酶对入侵DNA的降解作用，这就限制了外源DNA侵入所造成的危害。修饰是指细菌的修饰酶对于自身DNA碱基分子的甲基化等化学修饰作用，经修饰酶修饰后的DNA分子可免遭细菌限制酶的降解。“限制”是对入侵DNA的防御，而“修饰”是对自身DNA分子的保护。Arber发现了具有“限制”功能的切割酶，也就是限制性内切酶，这种酶后来被广泛地应用在基因工程的研究中，Arber也因此获得了1978年度诺贝尔生理学或医学奖。 限制酶降解入侵的外源DNA；修饰酶使限制酶识别位点甲基化，从而避免自身DNA被降解。 （2）类型 限制性内切核酸酶有三种类型，如下表： 特征 I型 II型 III型 限制修饰活性 单一多功能酶 限制和修饰活性分开 双功能酶 蛋白质结构 三种不同亚基 单一成分 两种不同亚基 限制作用的辅因子 ATP、Mg2+ Mg2+ ATP、Mg2+ 切割位点 距特异性位点1000bp外的位置随机切割 特异性位点或附近 距特异性位点3`端24~26bp位置 甲基化作用位点 特异性位点 特异性位点 特异性位点 识别未甲基化位点进行核酸内切酶切割 能 能 能 序列特异性切割 否 是 是 在基因工程中应用广泛 否 是 否 I型和III型酶由于识别或切割的特异性不高，实际应用困难，因而在基因工程研究中的应用价值不大，通常所说的限制性内切核酸酶都是II型酶。 （3）特性 ①特异性识别并切割脱氧核苷酸序列 教材第71页讲解非常详细，这里就不再赘述。 ②识别序列都是回文序列 限制酶所识别的序列呈回文结构。像“画上荷花和尚画”就是一种语音上的回文体，这句话从前向后和从后向前读是一样的，在对称轴两边是镜像对称的。而这里所说的回文结构也是引申其中意义，其特征是在识别序列中可以找出一条对称轴，轴两侧是两两对称互补配对的，而且两条互补链5`到3`的序列相同，将一条链旋转180°后可与另一条链重叠。如教材第71页图3-3：   ③切割后形成各种黏性末端或平整末端 由上图可知，限制性内切酶切割DNA分子后产生两种类型的断裂：DNA两条链上的断裂位置不在同一碱基对处，而是交错地切开，这样会形成黏性末端；而在同一碱基对处切割DNA两条链形成的双链末端，称为平末端。黏性末端能够通过互补碱基的配对而重新连接起来，但具有平整末端的DNA片段其重新连接效率没有黏性末端高。 （4）特殊类型 ①同尾酶 限制性内切酶中有一些特殊的类型，这些酶的识别序列互不相同，但切割后产生相同的突出末端，这一类酶互称为同尾酶。如教材第75页图：SpeI、XbaI切割DNA都产生CTAG突出末端。 再比如BamHI、BclI和Sau3AI就是一类同尾酶。它们切割DNA链都产生GATC突出末端。这些酶切割过的 DNA片段，可以通过其突出末端碱基间的互补作用而彼此连接起来，因此在基因克隆过程中应用较多。如图3-7所示，使用Sau3AI切割过的基因组DNA片段，就可以很方便地连接到BamHI切割过的载体上，用来进行功能性基因的筛选。 ②同裂酶（同工异源酶） 那些来源不同，但识别的是相同的核苷酸靶序列，切割DNA链后产生相同末端的一类酶则称为同裂酶(也称同工异源酶)。如 BamHI和 BstI(G↓GATCC)是一对同工异源酶，XhoI和 PaeR7(C↓TCGAG)也是一对同工异源酶，这些同工异源酶可以相互替代。 目前注意到有一些同工异源酶对于切割位点上的甲基化碱基的敏感度有所不同，如 HapⅡ和MspI是一对同工异源酶，它们共同的靶序列为CCGG。当序列中出现一个甲基化的胞嘧啶时，HapⅡ就不能够切割它，而MspI则不受影响。这样细微的差异可以用来研究DNA的甲基化作用。而不同甲基化状况下的基因在表达上会有差异，这种差异与人类的一些遗传性疾病相关。 预测： 2025年高考中，限制性内切酶可能主要考查其定义、功能、应用以及在基因工程中的作用： 1、定义和功能 限制性内切酶是一种能够识别并切割双链DNA分子中特定核苷酸序列的酶。它们通常从原核生物中分离纯化出来，具有专一性，能够识别并切割DNA分子中的特定序列，产生黏性末端和平末端‌ 考生需要理解限制性内切酶的定义、来源、功能及其在基因工程中的作用。 2、应用和重要性 在基因工程中，限制性内切酶主要用于DNA的切割和重组。它们在基因工程的基本操作程序中扮演重要角色，特别是在目的基因的获取、载体构建和基因转移等步骤中不可或缺。通过限制酶切割DNA，可以产生特定的末端，进而通过DNA连接酶将外源基因插入载体中，完成基因工程的操作 通过具体的基因工程案例，考查考生对限制性内切酶在实际操作中的应用理解。 其他生物技术的关系：如与DNA连接酶的区别和联系，以及在基因工程中的具体应用步骤和注意事项。 复习建议 理解基本概念：掌握限制性内切酶的定义、来源和功能。 熟悉应用实例：通过具体的基因工程案例，理解其在实践中的应用。 例、基因工程中，通常使用无甲基化酶活性的大肠杆菌菌株来制备质粒DNA的原因 。 答案：避免被限制性内切酶局部消化（降解），甚至完全不被消化（降解）。 学科网（北京）股份有限公司 $$