3.1重组DNA技术的基本操作-人教版2019选择性必修3

基因工程 指按照人们的愿望,进行严格的设计并通过体外DNA重组和转基因等技术，赋予生物以新的遗传特性,创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。由于基因工程是在DNA分子水平上进行设计和施工的，因此又叫作DNA重组技术。 生物体外的基因 对象： 原理： 意义： 基本过程： 基因重组 克服远缘杂交不亲和障碍、定向改造生物性状 剪切→拼接→导入→表达 结果： 人类所需的基因产物 1944年艾弗里等人通过肺炎链球菌的转化实验，不仅证明了遗传物质是DNA，还证明了DNA可以在同种生物个体间转移。 1961年尼伦伯格和马太破译了第一个编码氨基酸的密码子。截至19666年，64个密码子均被破译成功。 1970年科学家在细菌中发现了第一个限制性核酸内切酶（简称限制酶） 1972年，伯格首先在体外进行了DNA的改造，成功构建了第一个体外重组DNA分子。 1982年，第一个基因工程药物-重组人胰岛素被批准上市。基因工程药物成为世界各国研究和投资开发的热点。 1953年沃森和克里克建立了DNA双螺旋结构模型并提出了遗传物质自我复制的假说。 1967年，科学家发现，在细菌拟核DNA之外的质粒有自我复制能力，并可以在细菌细胞间转移。 20世纪70年代初，多种限制酶、DNA连接酶和逆转录酶被相继发现。这些发现为DNA的切割、连接以及功能基因的获得创造了条件。 1973年，科学家证明了质粒可以作为基因工程的载体，并实现了物种间的基因交流。至此，基因工程正式问世。 1985年，穆里斯等人发明PCR,为获取目的基因提供了有效手段。 基因工程的发展历程 转移 A生物 B生物 萤火虫 普通动植物 发光基因 问题1:不同生物的基因为什么能拼接？为什么一种生物的基因可以在另一种生物细胞内表达? 基因工程 拼接的基础 ①DNA的基本组成单位相同（四种脱氧核苷酸） 表达的基础 ②都遵循碱基互补配对原则 ③DNA分子的空间结构都是规则的双螺旋结构 ①基因是控制生物性状的结构与功能单位 ②遗传信息的传递都遵循中心法则 ③生物界几乎共用一套遗传密码 问题1:不同生物的基因为什么能拼接？为什么一种生物的基因可以在另一种生物细胞内表达?(基因工程的理论基础 ) 复制 转录 翻译 蛋白质 DNA RNA 技术支持 事件一、1967年，科学家发现，在细菌拟核DNA之外的质粒有自我复制能力，并可以在细菌细胞间转移。 1、质粒可以作为外源基因导入体细胞中的工具 事件2、1970年科学家在细菌中发现了第一个限制性核酸内切酶（简称限制酶） 细菌 细菌 细菌 限制酶 2、限制性核酸内切酶可以对DNA进行剪切，作为切割DNA的工具以及相关酶的发现为DNA重组创造了条件 事件3、20世纪70年代初，多种限制酶、DNA连接酶和逆转录酶被相继发现。这些发现为DNA的切割、连接以及功能基因的获得创造了条件。 第1节 重组DNA技术的基本工具 第3章　基因工程 1、阐明重组DNA技术所需的三种基本工具的作用(重、难点)。 “分子手术刀” “分子缝合针” “分子运输车” 重组DNA技术的基本工具 剪 接 运 准确切割DNA分子 将DNA片段连接起来 将体外重组好的DNA分子导入受体细胞 二、DNA连接酶 ——“分子缝合针” 自主阅读教材P70-71，小组合作思考讨论完成问题。 一、限制性内切核酸酶——“分子手术刀” 1、限制酶的来源？种类？特点？识别序列长度？切割结果？ 2、推测限制酶存在于原核生物中的主要作用是什么？ 3、某个特定性状的基因必须要用限制酶切几个切口？几个末端？ 4、为什么限制酶不切割细菌本身的DNA分子？ 一、限制性内切核酸酶——“分子手术刀” 8 是识别DNA的特异序列,并在识别位点或其周围切割双链DNA的一类内切酶 限制性内切核酸酶，简称限制酶 主要是原核生物 （2）来源： （1）定义： “限制”病毒在细菌内的寄生 “内切”将外源DNA分子从内部剪切成片段，而不是从DNA两端逐步剪切核苷酸 （3）种类 数千种 限制酶不是一种酶，而是一类酶 （4）特点 （1）识别双链DNA分子特定核苷酸序列 （2）断开特定部位的磷酸二酯键 （5）识别序列长度 一般为4~8个或其他数量的核苷酸，最常见的为6个核苷酸。 专一性 一、限制性内切核酸酶——“分子手术刀” T G C C G T A A 5' 3' 5' 3' 氢键 ② ① 磷酸二酯键 …… ATGCCGTGGAATTCC …… …… TACGGCACCTTAAGG …… ① ② ①磷酸二酯键 ②氢键 简图： 一、限制性内切核酸酶——“分子手术刀” 1.下面哪项不具有限制酶识别序列的特征（ ） A．GAATTC B．GGGGCCCC C．CTGCAG D．CTAAATC 注： 限制酶所识别的序列，遵循碱基互补配对原则，无论是奇数个碱基还是偶数个碱基，都可以找到一条中心轴线，中轴线两侧的双链DNA上的碱基是反向对称重复排列的。 如 以AT为轴，两侧碱基互补对称； Sma I 识别序列为 CCCGGG 切割部位为 CG之间 EcoR Ⅰ 识别序列GAATTC切割部位为 GA之间 中轴线 黏性末端 平末端 结果1、当限制酶在它识别序列的中轴线两侧将DNA分子的两条链分别切开时，产生的是黏性末端。 结果2、当限制酶在它识别序列的中轴线处将DNA分子的两条链分别切开时，产生的是平末端。 中轴线 一、限制性内切核酸酶——“分子手术刀” EcoRⅠ 属名Escherichia首字母 种名coli前两个字母 R型菌株 从中分离的第一个限制酶 例如：流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae)d株中先后分离到3种限制酶，则分别命名为: Hind I Hind II Hind III 限制酶的命名 EcoRⅠ：大肠杆菌（Escherichia coli）R型菌株中分离出的第一个限制酶； SmaⅠ：粘质沙雷氏菌（Serratia marcescens）中分离出的第一个限制酶。 一、限制性内切核酸酶——“分子手术刀” 一、限制性内切核酸酶——“分子手术刀” g1 g2 g3 1.现有一段DNA，含有g1、g2、g3，若要将g2提取出来，如何操作？ 需要有几个酶切位点？ 2 产生几个末端？共产生几个磷酸基团？ 4 4 使用EcoRⅠ酶剪切 识别序列GAATTC g1 g2 g3 CT TCATG AATTCCCTAA GAAGTACTTAA GGGAT T GGCATCTTAA AATTCCGTAG 5‘ 5‘ 3‘ 3‘ 拓展延伸 三、基因进入受体细胞的载体 ——“分子运输车” *形成 *一个限制酶切割一次形成2个黏性末端 *同一种限制酶切割形成的黏性末端相同 *两个黏性末端有2个游离的磷酸基团。 能切下目的基因且不破坏目的基因 2.下图中，选择哪种限制酶来获得抗病基因（目的基因）？ 选择限制酶切割目的基因的基本原则是： ____________________________________________________。 拓展训练 三、基因进入受体细胞的载体 ——“分子运输车” 问题2: 推测限制酶存在于原核生物中的主要作用是什么？ 限制酶是原核生物的一种防御工具，用来切割侵入细胞的外源DNA，以保证自身安全。 问题3: 为什么限制酶不切割细菌本身的DNA分子？ 细菌等宿主细胞既有限制酶，也有能识别并且甲基化相同DNA 位点的甲基化酶。在甲基化后，DNA 位点被保护起来，所以宿主细胞中甲基化的DNA不会被自身的限制酶切割。 原核生物容易受到自然界外源 DNA 的入侵，当外源 DNA 入侵时(病毒，如噬菌体，在细菌内寄生)，细菌会利用限制酶将外源DNA切割成片段，使之失效，而不破坏自身DNA，这样就能够起到抵御菌体DNA入侵进而自我保护的作用。所以原核生物在长期的进化过程中形成了一套完善的防御机制。限制酶就是它的一种防御性工具。 一、限制性内切核酸酶——“分子手术刀” 一边阅读，一边完成学案上的表格 活动2 分析限制酶和DNA连接酶 3.请结合限制酶的作用特点，回答以下问题： （1）限制酶能切开RNA分子的磷酸二酯键吗？ 不能 （2）请结合右图，推断限制酶切一次可断开 个磷酸二酯键，产生 个游离的磷酸基团，产生 个黏性末端，消耗 分子水。 限制酶只能识别并切开双链DNA分子 两 2 2 两 酶的专一性 一边阅读，一边完成学案上的表格 活动2 分析限制酶和DNA连接酶 4．有2个不同来源的DNA片段A和B，A片段用限制酶SpeⅠ进行切割，B片段分别用限制酶HindⅢ、XbaⅠ、EcoRⅤ和XhoⅠ进行切割。各限制酶的识别序列和切割位点如下。 (1)请写出限制酶SpeⅠ、HindⅢ、XbaⅠ和XhoⅠ切割形成的黏性末端。 SpeⅠ：　　　　HindⅢ：　　　　XbaⅠ：　　　　XhoⅠ： 一边阅读，一边完成学案上的表格 活动2 分析限制酶和DNA连接酶 4．有2个不同来源的DNA片段A和B，A片段用限制酶SpeⅠ进行切割，B片段分别用限制酶HindⅢ、XbaⅠ、EcoRⅤ和XhoⅠ进行切割。各限制酶的识别序列和切割位点如下。 (2)同种限制酶切割产生的黏性末端是否相同？不同限制酶切割产生的黏性末端是否一定不同？ 同种限制酶产生的黏性末端相同。不同的限制酶可能会形成相同的黏性末端。 一边阅读，一边完成学案上的表格 活动2 分析限制酶和DNA连接酶 4．有2个不同来源的DNA片段A和B，A片段用限制酶SpeⅠ进行切割，B片段分别用限制酶HindⅢ、XbaⅠ、EcoRⅤ和XhoⅠ进行切割。各限制酶的识别序列和切割位点如下。 (3)哪种限制酶切割B片段产生的DNA片段能与限制酶SpeⅠ切割A片段产生的DNA片段相连接？为什么？连接完成后，该重组DNA分子的新连接处能否再被所用的限制酶识别？为什么？ XbaⅠ。因为XbaⅠ与SpeⅠ切割产生了相同的黏性末端。不能。因为所用的两种限制酶均不能识别该重组DNA分子的新连接处的脱氧核苷酸序列。 2.下列黏性末端属于由同种限制酶切割而成的是( ) ① ② ③　　　 　④ 　　　　　　　　　　　　　　　　　　 A.①② B.①③ C.①④ D.②③ 用同种限制酶切割(EcoRⅠ) T G A A T T C G A C T T A A G C A G A A T T C T T C T T A A G A 问题4: 把两种来源不同的DNA进行重组，应该怎样处理？ 缺口怎么办 二、DNA连接酶 ——“分子缝合针” ③用相同的限制酶切割目的基因和运载体（产生相同末端，便于连接）； ④双酶切：确保目的基因与运载体定向连接（减少重组杂物）。 ★重组质粒的形成：用相同的限制酶处理目的基因和运载体，获得相同的末端，然后用DNA连接酶对其进行连接。 将双链DNA片段“缝合”起来，恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的磷酸二酯键。 (2)作用: (3)种类: 类型 E.coli DNA连接酶 T4 DNA连接酶 来源 功能 可以缝合____________，连接具有平末端的DNA片段的效率要远远低于T4 DNA连接酶 缝合____________和____________ 结果 恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的_________________ 大肠杆菌 T4噬菌体 互补黏性末端 黏性末端 平末端 磷酸二酯键 催化两个相邻的3'-OH和5'-磷酸基团形成3'，5'-磷酸二酯键，从而使DNA片段或单链断裂形成的缺口连接起来。 (1)概念: 二、DNA连接酶 ——“分子缝合针” A G T C A T T C G A T A (1)可把黏性末端之间的缝隙“缝合”起来； E.coli DNA连接酶 (2)两DNA片段要具有互补的黏性末端才能拼起来。 T C G A T C 注意：DNA连接酶可连接双链DNA中的DNA单链缺口，但不能将单个脱氧核苷酸连接到DNA链上！ 二、DNA连接酶 ——“分子缝合针” T4 DNA连接酶 既可把黏性末端“缝合”起来，又可把平末端“缝合”起来，但连接平末端效率较低。 C C C G G G G G G C C C 二、DNA连接酶 ——“分子缝合针” DNA连接酶和DNA聚合酶的比较 DNA连接酶 DNA聚合酶 相同点 作用实质 化学本质 不 同 点 模板 作用对象 作用结果 用途 都能催化形成磷酸二酯键 都是蛋白质 不需要 需要DNA的一条链作模板 形成完整的重组DNA分子 形成DNA的一条链 基因工程 DNA复制 只能将单个核苷酸连接到已有的DNA片段上，形成磷酸二酯键 在两个DNA片段之间形成磷酸二酯键 二、DNA连接酶 ——“分子缝合针” 名称 作用部位 作用结果 限制酶 DNA连接酶 DNA聚合酶 DNA(水解)酶 解旋酶 磷酸二酯键 碱基对之间的氢键 将DNA切成两个片段 磷酸二酯键 将两个DNA片段连接为一个DNA分子 磷酸二酯键 将单个脱氧核苷酸依次连接到单链末端 磷酸二酯键 将DNA片段水解为单个脱氧核苷酸 将双链DNA分子局部解旋为单链 二、DNA连接酶 ——“分子缝合针” 1.以下是几种不同限制酶切割DNA分子后形成的部分片段。下列叙述正确的是   A.以上DNA片段是由4种限制酶切割后产生的 B.②片段是在识别序列为 的限制酶作用下形成的 C.①和④两个片段在DNA聚合酶的作用下可形成重组DNA分子 D.限制酶和DNA连接酶作用的部位都是磷酸二酯键 √ 2.(多选)DNA连接酶是基因工程的必需工具。下列有关DNA连接酶的叙述，错误的是 A.DNA连接酶可以将任意的两个DNA片段连接成一个重组DNA分子 B.DNA连接酶发挥作用时需要识别特定的脱氧核苷酸序列 C.DNA连接酶可以催化两个脱氧核苷酸之间磷酸二酯键的形成 D.有些DNA连接酶既能连接黏性末端，又能连接平末端 √ √ 31 质粒是一种裸露的、结构简单、独立于真核细胞细胞核或原核细胞拟核DNA之外，并具有自我复制能力的环状双链DNA分子。 质粒DNA分子上有一个至多个限制酶切割位点，携带外源基因的质粒进入受体细胞后，能在细胞中进行自我复制，或整合到受体DNA上，随受体DNA复制。 供外源基因插入其中 能在宿主细胞中稳定存在 具有特殊的标记基因，便于重组DNA分子的筛选 三、基因进入受体细胞的载体 ——“分子运输车” 质粒是基因工程中最常用的载体 01 02 03 04 自我复制或整合到受体DNA上，随受体DNA同步复制 有一个至多个限制酶切割位点 对受体细胞无害、易分离 具有多种特殊的标记基因 真正被用作载体的质粒，都是在天然质粒的基础上进行过人工改造的。 三、基因进入受体细胞的载体 ——“分子运输车” 32 载体的 作用 载体的必 要条件 载体 的种 ①能够在宿主细胞中复制并稳定地保存。 ②具一个或多个限制酶切点，供外源DNA片段（目的基因）插入其中。 ③具有某些标记基因，便于进行鉴定和选择。 ④必须是安全的 ，对受体细胞无害。 ①作为运载工具，将目的基因导入受体细胞中 ②在受体细胞内对目的基因进行大量复制 ①细菌的质粒：质粒是一种裸露的、结构简单、独立于真核细胞细胞核或原核细胞拟核DNA之外，并具有自我复制能力的环状双链DNA分子。 ②病毒：λ噬菌体衍生物、动植物病毒等。 三、基因进入受体细胞的载体 ——“分子运输车” 33 实践活动：将Bt基因插入质粒中，并连接 Bt基因 质粒 1.质粒用什么限制酶（EcoRI还是SmaI）进行切割,才能使Bt基因插入； 2.确定质粒的切割位置； BT基因即是苏云金芽胞杆菌基因，因其表达产物Bt毒蛋白具有杀虫效果. 三、基因进入受体细胞的载体 ——“分子运输车” 实践活动：将Bt基因插入质粒中，并连接 3.把Bt基因和质粒放在一起如何构成重组DNA分子呢？ DNA连接酶 三、基因进入受体细胞的载体 ——“分子运输车” 实践活动：将Bt基因插入质粒中，并连接，完成重组质粒的制作 将重组质粒导入棉花细胞，表达出相应的性状。 重组质粒 转基因抗虫棉 三、基因进入受体细胞的载体 ——“分子运输车” 3.如图为DNA分子的某一片段，其中①②③分别表示某种酶的作用部位，则相应的酶依次是（ ） A．DNA连接酶、限制性核酸内切酶、解旋酶 B．限制性核酸内切酶、解旋酶、DNA连接酶 C．解旋酶、限制性核酸内切酶、DNA连接酶 D．限制性核酸内切酶、DNA连接酶、解旋酶 　实战训练　 4.DNA连接酶是重组DNA技术中常用的一种工具酶。下列相关叙述正确的是（ ） A.能连接DNA分子双链碱基对之间的氢键 B.能将单个脱氧核苷酸加到DNA片段的末端，形成磷酸二酯键 C.能连接用同种限制酶切开的两条DNA片段，重新形成磷酸二酯键 D.DNA连接酶只能连接双链DNA片段互补的黏性末端 　实战训练　 6.限制酶和DNA连接酶是基因工程的工具酶，以下说法正确的是 （ ） A.DNA连接酶连接的是两条链碱基对之间的氢键 B.限制酶只能切割双链DNA片段，不能切割烟草花叶病毒的核酸 C.E.coli DNA连接酶既能连接黏性末端，也能连接平末端 D.限制酶主要从原核生物中分离纯化而来，所以也能剪切自身的DNA 　实战训练　 7.质粒是基因工程中最常用的运载体，它的主要特点是（ 　） ①能自主复制 ②不能自主复制 ③结构很小 ④蛋白质 ⑤环状RNA ⑥环状DNA ⑦能“友好”地“借居” A．①③⑤⑦ B．①④⑥ C．①③⑥⑦ D．②③⑥⑦ 　实战训练　 8.下列关于质粒的叙述，正确的是（ ） A.质粒是广泛存在于细菌细胞中的一种颗粒状细胞器 B.质粒是细菌细胞质中能自主复制的小型环状DNA分子 C.质粒只有在侵入宿主细胞后在宿主细胞内复制 D.细菌质粒的复制过程一定是在宿主细胞外独立进行 　实战训练　 9.下列关于基因运输工具——载体，必须具备的条件之一及理由均正确的是（ ） A.能够复制，以便目的基因插入其中 B.具有多个限制酶切割位点，便于目的基因的表达 C.具有某些标记基因，便于重组DNA的筛选 D.对受体细胞无害，便于重组DNA的筛选 限制酶 DNA连接酶 载体 ①对受体细胞无害； ②有一个至多个限制酶切割位点； ③有特殊的标记基因； ④能自我复制或能整合到宿主DNA上。 质粒、噬菌体 、动植物病毒 基因工程的基本工具 作为载体的条件 种类： 磷酸二酯键 来源 ： 主要来源于原核生物 特点： 作用部位： 具有专一性 结果： 形成黏性末端或平末端 连接部位：磷酸二酯键 种类： E.coliDNA连接酶、T4 DNA连接酶 作用： 把两条双链DNA片段拼接起来 课堂小结 探究.实践： DNA的粗提取与鉴定 44 一、实验原理 DNA、RNA、蛋白质和脂质等在物理和化学性质方面存在差异，可以利用这些差异，选用适当的物理或化学方法对它们进行提取。 DNA不溶于酒精，但某些蛋白质溶于酒精 DNA能溶于物质的量浓度为2mol/L的NaCl溶液 在一定温度下沸水浴冷却后，DNA被二苯胺试剂染成蓝色 初步分离DNA和蛋白质 溶解DNA 鉴定DNA 0 0.14 NaCI浓度（mol/L） DNA溶解度 探究.实践： DNA的粗提取与鉴定 二、材料用具 45 04 DNA含量相对较高的生物组织，如新鲜洋葱、香蕉、菠菜、菜花和猪肝等。 （注意：不能选择哺乳动物成熟的红细胞，因为哺乳动物成熟的红细胞中没有细胞核和线粒体，几乎不含DNA。） 1.选材： 2.试剂： ——溶解并提取DNA ——析出DNA ——溶解DNA ——鉴定DNA，要现配现用 研磨液、二苯胺的配制方法 课本P117 ①研磨液 ②体积分数为95%的酒精 ③2mol/L 的NaCl溶液 ④二苯胺试剂 ⑤蒸馏水 探究.实践： DNA的粗提取与鉴定 三、方法步骤 46 称取 ，切碎，放入研钵，倒入 ，充分研磨。 在漏斗中垫上纱布过滤研磨液，4℃冰箱中静置后取 ；或将研磨液倒入塑料离心管中离心，取 。 在上清液中加入体积相等的、 溶液, 静置2~3min，溶液中出现的 就是粗提取的DNA 。 2.去除杂质—— 3.DNA的析出—— 1.破碎细胞—— 洋葱 研磨液 上清液 上清液 预冷的酒精 白色丝状物 用玻璃棒沿一个方向搅拌，卷起丝状物；或将溶液倒入塑料离心管中离心，取沉淀物晾干。 析出DNA 探究.实践： DNA的粗提取与鉴定 三、方法步骤 47 将丝状物或沉淀物溶于 溶液中，加入 试剂，混合均匀后，将试管置于沸水中加热5min 4.DNA的鉴定—— 二苯胺 2mol/L的NaCl 空白对照组： 在等体积的NaCl溶液中加入二苯胺试剂，将试管置于同等沸水浴中加热5min。 思考：如何评价结果？ ——看提取物颜色 ——看与二苯胺反应颜色的深浅 DNA纯度 DNA的量 $$