3.2 实验：PCR扩增和琼脂糖凝胶电泳（第3课时）课件-2024-2025学年高二下学期生物人教版（2019）选择性必修3

目的基因的筛选与获取 基因表达载体的构建 将目的基因导入受体细胞 第一步 第二步 第三步 第四步 目的基因的检测与鉴定 核心 目的基因 启动子 终止子 标记基因 农杆菌转化法(植物)显微注射法(动物) Ca2+处理法(微生物） 分子水平检测： 是否插入、转录、翻译 个体生物学水平检测： 是否具有抗性以及抗性强度等。 温故知新：基因工程的基本程序 人工合成 利用PCR获取和扩增 构建基因文库 1 实验原理 材料用具 实验步骤 DNA体外扩增（PCR）原理 DNA片段 电泳鉴定原理 实验探究：DNA片段的扩增及电泳鉴定 第四 步：目的基因的检测与鉴定 一、实验原理 （一）DNA体外扩增的原理： PCR扩增仪 ①PCR利用了DNA的热变性原理，通过调节温度来控制DNA双链的解聚与结合 ②PCR扩增DNA片段还利用了DNA半保留复制的原理； 二、材料用具 （一）仪器： PCR仪 微量离心管 微量移液器 自动控温， 实现DNA的扩增 实际上是进行PCR反应的场所 用于向微量离心管转移PCR配方中的液体 离心机 使反应液集中在管的底部 （提高反应速率） 第三步：将目的基因导入受体细胞 二、材料用具 （二）试剂： PCR反应体系的配方 材料 用量 10倍浓缩的扩增缓冲液（含Mg2+） 5μL 20mmol/L的4种脱氧核苷酸的等量混合液 （实为dNTP） 1μL 20μmol/L的引物Ⅰ 2.5μL 20μmol/L的引物Ⅱ 2.5μL H2O 28～33μL 1-5U/μL的Taq DNA聚合酶 （即耐高温的DNA聚合酶） 1～2U 模板DNA （用量为1pg-1μg） 5～10μL 移液 离心 扩增 用微量移液器按照PCR反应体系配方或PCR试剂盒的说明书，在微量离心管中依次加入各组分 待所有组分都加入后，盖严离心管的盖子，将微量离心管放入离心机里，离心约10s，使反应液集中在离心管的底部（提高反应速率） 参照下表的参数，设置好PCR仪的循环程序。将装有反应液的微量离心管放入PCR仪中进行反应。 循环程序 变性 复性 延伸 预变性 94℃,5min 30次 94℃,30s 55℃,30s 72℃,1min 最后一次 94℃,1min 55℃,30s 72℃,1min / / 可根据目的片段长度 适当调整延伸时间 预变性：使DNA充分变性，以利于引物更好地和模板结合。 三、PCR方法步骤 预变性：使DNA充分变性，以利于引物更好地和模板结合。 可根据目的片段长度适当调整延伸时间 PCR 的产物一般通过琼脂糖凝胶电泳鉴定 DNA片段电泳鉴定 电泳鉴定原理 DNA分子具有可解离的基团，在一定的PH下，这些基团可以带上正电荷或负电荷。在电场的作用下，这些带电分子会向着与它所带电荷相反的电极移动，这个过程就是电泳。 凝胶中的DNA分子通过染色，可以在波长为300nm的紫外灯下被检测出来。 在凝胶中DNA分子的迁移速率与凝胶的浓度、DNA分子的大小和构象等有关。 琼脂糖凝胶电泳 凝胶的浓度越大迁移速率越慢 DNA分子越大 迁移速率越慢 DNA分子构像有环状、链状等 （1）无菌水、琼脂糖； （2）电泳缓冲液 （3）凝胶载样缓冲液（内含指示剂） （4）核酸染料 (电泳缓冲液用来维持pH值，使DNA带负电荷) （一）材料用具 1、试剂： 电泳装置 包括电泳仪、电泳槽等 电泳仪 电泳槽 梳子 琼脂糖是一种天然聚合长链状分子，从琼脂中提取而来，在电泳缓冲液中加热到沸点后溶解，冷却后又凝固成均匀的胶体胨，具有刚性的滤孔，凝胶孔径的大小决定于琼脂糖的浓度。 原理：pH=8左右时，DNA分子带负电。在碱性环境下，不同的DNA分子具有相同的电荷密度。DNA分子在凝胶中的迁移率与其所含碱基对数目的对数值成反比。可以近似用于估算分子的大小。 DNA分子越大，迁移速率越慢 凝胶的浓度越大，迁移速率越慢 四、电泳方法步骤 配制琼脂糖溶液 根据待分离DNA片段的大小，用电泳缓冲液配制琼脂糖溶液，一般配制质量体积比0.8%～1.2%的琼脂糖溶液。在沸水浴或微波炉内加热至琼脂糖熔化。稍冷却后，加入适量的核酸染料混匀 制备凝胶 将温热的琼脂糖溶液迅速倒入模具，并插入合适大小的梳子，以形成加样孔。待凝胶溶液完全凝固，小心拔出梳子，取出凝胶放入电泳槽内。将电泳缓冲液加入电泳槽中，电泳缓冲液没过凝胶1mm为宜 加样 将扩增得到的PCR产物与凝胶载样缓冲液（内含指示剂）混合，再用微量移液器将混合液缓慢注入凝胶的加样孔内。留一个加样孔加入指示分子大小的标准参照物（Marker） 电泳 接通电源，根据电泳槽阳极至阴极之间的距离来设定电压，一般为1～5V/cm。待指示剂前沿迁移接近凝胶边缘时，停止电泳 观察记录 取出凝胶置于紫外灯下观察和照相 (梳子孔为加样孔，加样孔侧连电极负极) 第四 步：目的基因的检测与鉴定 DNA片段的扩增及电泳鉴定 探究.实验 注意事项 为避免外源DNA等因素的污染，PCR实验中使用的微量离心管、枪头和蒸馏水等在使用前必须进行高压灭菌处理。 该实验所需材料可以直接从公司购买，缓冲液和酶应分装成小份，并在-20℃储存。使用前，将所需试剂从冰箱拿出，放在冰块上缓慢融化。 在向微量离心管中添加反应组分时，每吸取一种试剂后，移液器上的枪头都必须更换。 在进行操作时，一定要戴好一次性手套。 PCR扩增不能随意加大试剂用量。 结果分析与评价 1.你是否成功扩增出DNA片段？判断的依据是什么？ 2.你进行电泳鉴定的结果是几条条带？如果不止一条条带，请分析产生这个结果的可能原因。 可以在紫外灯下直接观察到DNA条带的分布及粗细程度来评价扩增的结果。进行电泳鉴定的结果应该是一条条带，该片段大小约为750bp。 如果扩增不成功，可能的原因有：漏加了PCR的反应成分，各反应成分的用量不当，PCR程序设置不当等。 如果扩增结果不止一条条带，可能的原因有：引物设计不合理，它们与非目的序列有同源性或容易形成二聚体；复性温度过低；DNA聚合酶的质量不好等。 DNA片段的扩增及电泳鉴定 第三步：将目的基因导入受体细胞 用PCR方法检测转基因植株是否成功导入目的基因时，得到以下电泳图谱，其中1号为DNA标准样液(Marker)，10号为蒸馏水。PCR时加入的模板DNA如图所示。据此做出分析不合理的是(　　) A.PCR产物的分子大小在250至500 bp之间 B.3号样品为不含目的基因的载体DNA C.9号样品对应植株不是所需的转基因植株 D.10号的电泳结果能确定反应体系等对实验结果没有干扰 B 解析　PCR过程中，可以通过设计特定的引物来扩增特定的DNA片段。4～9号是转基因植株，理论上应包含目的基因，结合2号野生型和10号蒸馏水组的结果，推测包含目的基因的片段大小应为250～500 bp，A正确；3号PCR结果包含250～500 bp片段，应包含目的基因，B错误；9号PCR结果不包含250～500 bp片段，所以不是所需转基因植株，C正确；10号放入蒸馏水，可排除反应体系等对结果的干扰，由图可知，10号的电泳结果能确定反应体系等对实验结果没有干扰，D正确。 19 Multimedia Cloud Transcode (cloud.baidu.com) Lavf58.51.100 Lavf58.29.100 Bilibili VXCode Swarm Transcoder v0.6.10 $$