第3章基因工程知识清单-2024-2025学年高二下学期生物人教版选择性必修3

第3章 基因工程 第1节 重组DNA技术的基本工具 111. 切割 DNA 分子的工具是限制性内切核酸酶，又称限制酶 。这类酶主要是从原核 （原核/真核）生物中分离纯化出来的。迄 今分离的限制酶有数千种，许多已经被商业化生产。限制酶能够识别双链 DNA 分子的特定核苷酸序列 ，并且使每一 条链中特定部位的磷酸二酯键 断开。 112. 大多数限制酶的识别序列由 6 个核苷酸组成。也有少数限制酶的识别序列由4 个、8 个或其他数量的核苷酸组成。当限制酶在它识 别序列的中心轴线两侧 将 DNA 分子的两条链分别切开时，产生的是黏性 末端；当限制酶在它识别序列的中心轴线 处 切开时，产生的是平 末端。 113. 限制酶是细胞的一种防御性工具。当原核细胞遭到外源 DNA 入侵时，它会利用限制酶来切割外源 DNA，使之失效 。 114. 限制酶的命名：用生物属名 的头一个字母与种加词 的头两个字母，组成了 3 个字母的略语，以此来表示这个酶是从哪种 生物中分离出来的。例如， 一种限制酶是从大肠杆菌(Escherichia coli)的 R 型菌株分离来的，就用字母 EcoR 表示；如果它是 从大肠杆菌 R 型菌株中分离出来的第一种限制酶，则进一步表示成EcoRI 。 115. 常用的 DNA 连接酶主要有两类：一类是从大肠杆菌 中分离得到的，称为 E.coli DNA 连接酶；另一类是从 T4 噬菌体 中 分离出来的，称为 T4DNA 连接酶。这两类酶都能将双链 DNA 片段“缝合”起来，恢复被限制酶切开的磷酸二酯键 ，但这两 种酶的作用有所差别。E.coli DNA 连接酶只能将具有互补黏性末端 的 DNA 片段连接起来。而 T4DNA 连接酶既可以“缝合” 双链 DNA 片段互补的黏性末端，又可以“缝合”双链 DNA 片段的平末端，但连接平末端的效率相对较低 （高/低）。 116. 质粒是一种裸露的、结构简单、独立于真核细胞细胞核 或原核细胞拟核 DNA 之外，并具有自我复制 能力的环状双链 DNA 分子。质粒 DNA 分子上有一个至多个限制酶切割位点，供外源 DNA 片段(基因)插入其中 。 携带外源 DNA 片段的质粒进入受体细胞后，能在细胞中进行自我复制，或整合到受体 DNA 上 ，随受体 DNA 同步复制。 在基因工程操作中，真正被用作载体的质粒，都是在天然质粒的基础上进行过人工改造的。这些质粒上常有特殊的 标记 基因， 如四环素抗性基因、氨苄青霉素抗性基因等，便于重组 DNA 分子的筛选 。在基因工程中使用的载体除质粒外，还有 噬菌体 、 动植物病毒 等。 117. DNA 不溶于酒精，但某些蛋白质 溶于酒精，利用这一原理，可以初步分离 DNA 与蛋白质。DNA 在不同浓度 的 NaCl 溶液中 溶解度不同，它能溶于 2mol/L 的 NaCl 溶液。在一定温度下，DNA 遇二苯胺 试剂会呈现蓝 色，因此二苯胺试剂可以作为鉴 定 DNA 的试剂。 第2节 基因工程的基本操作程序 118. 培育转基因抗虫棉主要需要四个步骤： 目的基因的筛选与获取 、基因表达载体的构建 、将目的基因导 入受体细胞 、 目的基因的检测与鉴定 。 119. 在基因工程的设计和操作中，用于改变受体细胞性状 或获得预期表达产物 等的基因就是目的基因。目的基 因主要是指编码蛋白质 的基因。 120. 苏云金杆菌通过产生苏云金杆菌伴胞晶体蛋白（Bt抗虫蛋白），破坏鳞翅目昆虫的消化 系统来杀死棉铃虫。科学家通过实验， 将 该细菌的“杀虫基因”转到棉花里，让棉花也能产生 Bt 抗虫蛋白 抵抗虫害。这个“杀虫基因”就是培育转基因抗虫棉用 到的目的基因——Bt抗虫蛋白基因，简称 Bt 基因 。 121. 当 Bt 抗虫蛋白被分解为多肽后，多肽与害虫肠上皮细胞的特异性受体 结合，导致细胞膜穿孔 ，最后造成害虫死 亡。Bt 抗虫蛋白只有在某类昆虫肠道的碱 （酸/碱）性环境中才能表现出毒性，而人和牲畜的胃液呈酸 性，肠道细胞也没有 特异性受体 。 122. 获取目的基因的方法有多种。在我国的转基因抗虫棉的培育过程中，科学家人工合成 了目的基因。现在，常用 PCR 特异性地 快速扩增目的基因 。 123. PCR 是聚合酶链式反应 的缩写。它是一项根据 DNA 半保留复制 的原理，在体外提供参与 DNA 复制的各种组分 与反应条件，对目的基因的核苷酸序列进行大量复制的技术。 参与的组分 在 DNA 复制中的作用 解旋酶（体外用高温 代替） 打开 DNA 双链 DNA 母链 提供 DNA 复制的模板 4 种脱氧核苷酸 合成 DNA 子链的原料 DNA 聚合酶 催化合成 DNA 子链 引物 使 DNA 聚合酶能够从引物的 3' 端开始连接脱氧核苷酸 124. 利用 PCR 技术扩增目的基因的前提，是目的基因的一段核苷酸序列要已知 ，以便根据这一序列合成引物 。引物是一小段能 与 DNA 母链的一段碱基序列互补配对 的短单链核酸。用于 PCR 的引物长度通常为 20～30 个核苷酸。 125. PCR 反应所需的原料是 dATP、dGTP 、dCTP 、dTTP ，其中 dATP 叫做脱氧三磷酸腺苷，就是将 ATP 中的核糖替换为脱氧核 糖 。dATP 可将其两个磷酸基团转移到 DNA 的末端，为 DNA 复制提供能量 。dATP 转移掉两个磷酸基团后剩下的结构就是 腺嘌呤脱氧核苷酸 ，是构成 DNA 的基本单位之一。 126. 真核细胞和细菌的 DNA 聚合酶都需要 Mg2+激活。因此，PCR 反应缓冲溶液中一般要添加 Mg2+ 。PCR 反应需要在一定的缓冲 溶液中 才能进行，需提供 DNA 模板，分别与两条模板链结合的 2 种引物，4 种脱氧核苷酸 和耐高温 的 DNA 聚合酶； 同时通过控制温度 使 DNA 复制在体外反复进行。 127. PCR 扩增的过程是：目的基因 DNA 受热变性 后解为单链，引物 与单链相应互补序列结合；然后以单链 DNA 为模板，在 DNA 聚合酶作用下进行延伸，即将 4 种脱氧核苷酸加到引物的 3' 端，如此重复循环多次。由于延伸后得到的产物又可以作为下一个循 环的模板 ，因而每一次循环后目的基因的量可以增加一倍 。每次循环一般可以分为变性 、复性 和延伸 三步。 变性：当温度上升到 90 ℃以上时，双链 DNA 解聚为单链。 复性：当温度下降到 50 ℃左右时，两种引物 通过碱基互补配对与两条单链 DNA 结合。 延伸：当温度上升到 72 ℃左右时，溶液中的 4 种脱氧核苷酸在耐高温的 DNA 聚合酶的作用下，根据碱基互补配对 原则合成新的 DNA 链。上述过程可以在 PCR 仪 中自动完成，完成以后，常采用琼脂糖凝胶电泳 来鉴定 PCR 的产物。 128. 获取了足够量的 Bt 基因后，下一步就是要让基因在受体细胞中稳定存在 ，并且遗传给下一代 ；同时，使 Bt 基因能 够表达 和发挥作用，这就需要构建基因表达载体 。这一步是培育转基因抗虫棉的核心 工作。 129. 一个基因表达载体的组成，除 目的 基因、标记 基因外，还必须有启动子 、终止子 等。启动子是一段有特殊序 列结构的 DNA 片段，位于基因的上游，紧挨转录的起始位点，它是RNA 聚合酶识别和结合 的部位，有了它才能驱动 基因转录出 mRNA ，最终表达出人类需要的蛋白质。有时为了满足应用需要，会在载体中人工构建 诱导 型启动子，当 诱导物 存在时，可以激活或抑制目的基因的表达。终止子相当于一盏红色信号灯，使转录 在所需要的地方停下来，它 位于基因的下游，也是一段有特殊序列结构的 DNA 片段。 130. 转化是指 目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程 。 131. 我国科学家采用他们独创的一种方法——花粉管通道 法，将 Bt 基因导入了棉花细胞。其操作为：在植物受粉后的一定时间 内，剪去柱头 ，将含目的基因的 DNA 溶液滴加在花柱切面上，使目的基因借助花粉管通道 进入胚囊。 132. 农杆菌是一种在土壤中生活的微生物，能在自然条件下侵染双子叶 植物和裸子 植物，而对大多数单子叶 植物没有 侵染能力。农杆菌细胞内含有 Ti 质粒，当它侵染植物细胞后，能将 Ti 质粒 上的 T-DNA 转移到被侵染的细胞，并且将其整 合到该细胞的染色体 DNA 上 。根据农杆菌的这种特点，如果将 目的基因 插入 Ti 质粒的 T-DNA 中，通过农 杆菌的转化 作用，就可以使目的基因进入植物细胞。可以将新鲜的从叶片上取下的圆形小片与农杆菌共培养，然后筛选转化细 胞，并再生成植株；可以将花序 直接浸没在含有农杆菌的溶液中一段时间，然后培养植株并获得种子 ，再进行筛选、鉴定 等。随着转化方法的突破，用农杆菌侵染水稻、玉米等多种单子叶 植物也取得了成功。 133. 将目的基因导入动物受精卵最常用的一种方法是利用显微注射 直接将目的基因注入动物的受精卵 中，这个受精卵将发 育成为具有新性状的动物。在基因工程操作中，常用原核生物作为受体细胞 ，其中以 大肠杆菌 应用最为广泛。研究 人员一般先用 Ca2+ 处理大肠杆菌细胞，使细胞处于一种能吸收周围环境中 DNA 分子 的生理状态，然后再将重组的基 因表达载体导入其中。 134. 分子水平的检测，包括通过 PCR 等技术检测棉花的染色体 DNA 上是否插入了 Bt 基因 或检测 Bt 基因是否转录出了 mRNA ；从转基因棉花中提取蛋白质，用相应的 抗体 进行抗原—抗体 杂交，检测位基因是否翻译 成 Bt 抗虫蛋白等。 135. 个体生物学 水平的鉴定。例如， 通过采摘抗虫棉的叶片饲喂棉铃虫来确定 Bt 基因是否赋予了棉花抗虫特性 以及抗 性的程度 。 136. DNA 分子具有可解离 的基团，在一定的 pH 下，这些基团可以带上正电荷 或负电荷 。在电场的作用下，这些带 电分子会向着与它所带电荷相反 的电极移动，这个过程就是电泳。PCR 的产物一般通过琼脂糖凝胶电泳来鉴定。在凝胶中 DNA 分 子的迁移速率与凝胶的浓度 、DNA 分子的大小 和构象等有关。凝胶中的DNA 分子通过染色，可以在波长为 300nm 的紫外灯 下 被检测出来。 137. 为避免外源 DNA 等因素的污染，PCR 实验中使用的微量离心管、枪头和蒸馏水等在使用前必须进行高压灭菌 处理。在向 微量离心管中添加反应组分时，每吸取一种试剂后，移液器上的枪头 都必须更换。可以通过在紫外灯 下直接观察 DNA 条 带的分布 及粗细程度 来评价扩增的结果。如果扩增结果不止一条条带，可能的原因有：引物设计不合理 ，它 们与非目的序列有同源性或容易聚合形成二聚体 ；退火 温度过低；DNA 聚合 酶的质量不好等。 第3节 基因工程的应用 138. 将必需氨基酸含量多的蛋白质编码 基因导入植物中，可以提高这种氨基酸的含量。我国科学家成功地将与植物花 青素 代谢相关的基因导入矮牵牛中，使它呈现出自然界没有的颜色变异，大大提高了它的观赏价值。 139. 由于外源生长激素基因 的表达可以使转基因动物生长得更快，因此科学家将这类基因导入动物体内，以提高动物的生长速率。 140. 有些人由于乳糖酶 分泌少，不能完全消化牛奶中的乳糖，食用牛奶后会出现腹泻等不适症状，这称为乳糖不耐受 。 为了解决这一问题，科学家将肠乳糖酶 基因导入奶牛基因组，使获得的转基因牛分泌的乳汁中，乳糖的含量大大降低，而其 他营养成分不受影响。 141. 对微生物或动植物的细胞进行基因改造，使它们能够生产药物 ，是目前基因工程取得实际应用成果非常多的领域。 142. 干扰素是一种具有干扰病毒复制 作用的糖蛋白 ，在临床上被广泛用于治疗病毒感染性疾病。 143. 利用基因工程技术，还可以让哺乳动物批量生产药物。科学家将药用蛋白 基因与乳腺中特异表达的基因 的启动子等调控元件重组在一起，通过显微注射 的方法导入哺乳动物的受精卵 中，由这个受精卵发育成的转基因动物在进入 泌乳期后，可以通过分泌乳汁来生产所需要的药物，这称为乳腺（房）生物反应器 。 144. 猪的内脏构造、大小、血管分布与人的极为相似，而且与灵长类动物相比，猪体内隐藏的、可导致人类疾病的病毒 要少得多， 是否可以用猪的器官来解决人类器官移植的来源问题呢？实现这一目标的最大难题是免疫排斥 。目前， 科学家正尝试利用基 因工程技术对猪的器官进行改造，采用的方法是在器官供体的基因组中导入某种调节因子 ，以抑制抗原决定 基因的 表达，或设法除去抗原决定基因 ，然后再结合克隆技术，培育出不会引起免疫排斥反应的转基因克隆猪器官。 145. 奶酪是一种被广泛食用的发酵奶制品。大多数奶酪的生产需要使用凝乳酶 来凝聚固化奶中的蛋白质。科学家将编码牛凝乳 酶 的基因导入大肠杆菌、黑曲霉或酵母菌的基因组中，再通过工业发酵批量生产凝乳酶。 第4节 蛋白质工程的原理和应用 146. 对蛋白质分子的设计和改造是通过蛋白质工程来实现的。蛋白质工程是指以蛋白质分子的 结构规律 及其与生物功能 的 关系作为基础，通过改造 或合成 基因，来改造现有蛋白质 ，或制造一种新的蛋白质 ，以满足人类生 产和生活的需求。它是在基因工程的基础上，延伸出来的第二代 基因工程，是包含多学科的综合科技工程。 147. 基因工程原则上只能生产 自然界中已存在 的蛋白质，这些天然蛋白质是生物在长期进化过程中形成的，它们的结构和功能 符合特定物种生存的需要，却不一定完全符合人类生产和生活 的需要。例如， 玉米中赖氨酸的含量比较低，原因是赖氨酸 合成过程中的两种关键酶——天冬氨酸激酶和二氢吡啶二羧酸合成酶的活性，受细胞内赖氨酸浓度 的影响较大。赖氨酸达 到一定浓度就会抑制 这两种酶的活性，所以赖氨酸含量很难提高。如果我们将天冬氨酸激酶中第 352 位的苏氨酸变成异亮氨酸， 将二氢吡啶二羧酸合成酶中第 104 位的天冬酰胺变成异亮氨酸，就可以使玉米叶片和种子中游离赖氨酸的含量分别提高 5 倍和 2 倍。 148. 任何一种天然蛋白质都是由基因 编码的，改造了基因即对蛋白质进行了改造，而且改造过的基因可以遗传 下去。此外，对 基因进行改造比对蛋白质直接改造要容易操作，难度要小得多。 149. 天然蛋白质合成的过程是按照中心法则进行的：基因表达（ 转录 和翻译 ）→形成具有特定氨基酸 序列的多肽链→形 成具有高级结构 的蛋白质→行使生物功能。而蛋白质工程却与之相反，它的基本思路是：从预期的蛋白质功能 出发 →设计预期的蛋白质结构 →推测应有的氨基酸 序列→找到并改变相对应的脱氧核苷酸序列（基因）或合成新的基因→ 获得所需要的蛋白质。 150. 蛋白质工程经常要借助计算机来建立蛋白质的三维结构模型；要利用晶体学技术来获得蛋白质的结晶体，然后通过 X 射线衍射 技 术，分析晶体的结构；要用到基因的定点突变 技术来进行碱基的替换。 151. 蛋白质工程是一项难度很大的工程，主要是因为蛋白质发挥功能必须依赖于正确的高级结构 ，而这种高级结构往往十 分复杂。而目前科学家对蛋白质的高级结构 的了解还很不够，要设计出更加符合人类需要的蛋白质还需经过艰辛的探索。 12 学科网（北京）股份有限公司 $$