2025届高三生物一轮复习课件第6讲 基因工程

第6讲 基因工程 1944年艾弗里等人通过肺炎链球菌的转化实验，不仅证明了遗传物质是DNA，还证明了DNA可以在同种生物个体间转移。 1961年尼伦伯格和马太破译了第一个编码氨基酸的密码子。截至19666年，64个密码子均被破译成功。 1970年科学家在细菌中发现了第一个限制性核酸内切酶（简称限制酶） 1972年，伯格首先在体外进行了DNA的改造，成功构建了第一个体外重组DNA分子。 1982年，第一个基因工程药物-重组人胰岛素被批准上市。基因工程药物成为世界各国研究和投资开发的热点。 1953年沃森和克里克建立了DNA双螺旋结构模型并提出了遗传物质自我复制的假说。 1967年，科学家发现，在细菌拟核DNA之外的质粒有自我复制能力，并可以在细菌细胞间转移。 20世纪70年代初，多种限制酶、DNA连接酶和逆转录酶被相继发现。这些发现为DNA的切割、连接以及功能基因的获得创造了条件。 1973年，科学家证明了质粒可以作为基因工程的载体，并实现了物种间的基因交流。至此，基因工程正式问世。 1985年，穆里斯等人发明PCR,为获取目的基因提供了有效手段。 科技探索之路 基因工程的发展历程 一、基因工程 1、概念辨析： 指按照人们的愿望,进行严格的设计并通过体外DNA重组和转基因等技术，赋予生物以新的遗传特性,创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。由于基因工程是在DNA分子水平上进行设计和施工的，因此又叫作重组DNA技术。 ①原理: 。 ②操作对象: 。 ③操作水平: 。 ④操作环境: 生物 进行 ⑤结果： 。 ⑥优点： a. 。 b. 等。 基因重组 DNA分子水平 基因 体外 创造出符合人们需要的生物类型和生物产品 定向改造生物性状（目的性强） 克服远缘杂交不亲和的障碍 (与杂交育种相比) (与诱变育种相比) 例如，通过转基因技术，可以实现利用大肠杆菌生产人的胰岛素。在此实例中，目的基因是 ，受体细胞是 ，目的基因的表达产物是 人胰岛素基因 大肠杆菌 人胰岛素 2、基因工程的理论基础 一、基因工程 DNA双螺旋的直径只有2nm，对如此微小的分子进行操作，是一项非常精细的工作，更需要专门的“分子工具” 工具 限制性内切核酸酶(限制酶) DNA连接酶 分子手术刀 分子缝合针 分子运输车 载体 准确切割DNA分子 将DNA片段连接起来 将体外重组好的DNA分子导入受体细胞 1、限制性内切核酸酶(也称“限制酶”) 二、基因工程(重组DNA技术)的基本工具 （1）来源： 主要从原核生物中分离纯化来的 （2）种类： 数千种 限制酶不是一种酶，而是一类酶 （3）特点 : 能够识别双链DNA分子的特定核苷酸序列,并使每一条链中特定部位的磷酸二酯键断开。 专一性 一种限制酶可能识别多种核苷酸序列。 1、限制性内切核酸酶(也称“限制酶”) 二、基因工程(重组DNA技术)的基本工具 （4）识别序列长度: 大多数限制酶的识别序列由6个核苷酸组成，少数4个、8个或其他数量 （5）结果： 产生黏性末端或平末端 识别位点也可能在识别序列外部 限制酶在切断DNA时，可在切口处带有几个伸出的核苷酸，碱基正好互补配对，因此称这些片段为黏性末端。 5’ 3’ 5’ 3’ CCCGGG GGGCCC 回文序列：从5’→3’正向读与另一条链从5’→3’反向读的碱基顺序完全一致 限制酶识别过程具有方向性，都是从5’→3’开始读 3’ 5’ 3’ 5’ 1、限制性内切核酸酶(也称“限制酶”) 二、基因工程(重组DNA技术)的基本工具 黏性末端： -G -CTTAA -A -TTCGA -A -TCTAG -G -CCTAG 5’ 【思考】同种限制酶切割产生的黏性末端是否相同？不同限制酶切割产生的黏性末端是否一定不同？ 同种限制酶切割产生的黏性末端相同，不同限制酶可能会形成相同的黏性末端 同尾酶 请写出下列限制酶切割形成的黏性末端 【思考】结合下图，该限制酶切一次可断开 个磷酸二酯键，产生 个游离的磷酸基团，产生 个黏性末端，消耗 分子水 2 2 2 2 【思考】将1个基因从DNA分子上切割下来需要切___处，同时产生___个黏性末端或平末端。 2 4 【思考】原核生物中存在限制酶的意义是什么？ 提示　原核生物中限制酶的作用是切割外源DNA以保证自身安全，防止外来病原物的危害。 【思考】限制酶来源于原核生物，为什么不能切割自己的DNA分子？ 提示　限制酶不切割自身DNA的原因是原核生物DNA分子中不存在该酶的识别序列或识别序列已经被修饰。 ①若酶切后碱基数与原DNA相同，则DNA上只有一个酶切位点，该DNA为环状DNA。 ②若DNA上只有一个酶切位点,同时酶切结果有两个片段,则属于链状DNA. ③酶切结果的片段数不一定等于酶切片段的种类数。 （6）技巧：分析DNA被切割后的片段判断酶切位点数目的方法： 1、限制性内切核酸酶(也称“限制酶”) 二、基因工程(重组DNA技术)的基本工具 EcoRⅠ 属名Escherichia首字母 种名coli前两个字母 R型菌株 从中分离的第一个限制酶 例如：流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae) d株中先后分离到3种限制酶，则分别命名为: Hind I Hind II Hind III EcoRⅠ：大肠杆菌（Escherichia coli）R型菌株中分离出的第一个限制酶； SmaⅠ：粘质沙雷氏菌（Serratia marcescens）中分离出的第一个限制酶。 （7）限制酶的命名： 1、限制性内切核酸酶(也称“限制酶”) 二、基因工程(重组DNA技术)的基本工具 2、DNA连接酶 二、基因工程(重组DNA技术)的基本工具 能将两个DNA片段连接起来，恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的磷酸二酯键。 （1）作用： 2、DNA连接酶 二、基因工程(重组DNA技术)的基本工具 类型 E.coli DNA连接酶 T4 DNA连接酶 来源 功能 只缝合____________ 缝合____________和_________，但平末端效率较低。 大肠杆菌 T4噬菌体 黏性末端 黏性末端 平末端 （2）种类： （3）不具特异性： DNA连接酶对所连接的DNA片段两端的碱基序列没有专一性要求 【思考】.下列所示的黏性末端是由几种限制性内切核酸酶作用产生的（　　） A.1种 B.2种 C.3种 D.4种 D 图中的黏性末端哪些能连接在一起吗？ 、 。 ① ② ③ ④ ①② ③④ 技巧：判断两个末端是否为同一种限制酶切割产生的方法：将其中一个末端旋转180，若与另一个完全相同，则说明这两个末端是由同一种限制酶切割产生的。 稿定PPT 稿定PPT，海量素材持续更新，上千款模板选择总有一款适合你 02 【思考】请判断：DNA片段经限制酶处理后产生的相同黏性末端，再经过DNA连接酶处理后，形成的新的识别序列，能否再被所用的限制酶识别？ (1)若两个相同黏性末端都是由同种限制酶 （EcoRⅠ）切割后所得， （填“能”或“不能”）再被所用的限制酶识别（如图)。 能 (2)若两个相同黏性末端是由不同限制酶切割所得，形成的新的识别序列 （填“能”或“不能”）再被所用的限制酶识别（如图）。 不能 -ACTAGA- -TGATCT- 新序列： -TGATCT- -ACTAGA- b.两种同尾酶切割的DNA片段连接后，原来的酶切位点将不存在，不能再被原来的限制酶识别。 a.若切割产生的黏性末端相同，就可以用DNA连接酶连接起来。 （4）小结： 2、DNA连接酶 二、基因工程(重组DNA技术)的基本工具 1、已知限制酶Ⅰ的识别序列和切点是—GGATCC—，限制酶II的识别序列和切点是—↓GATC—。 (1）则能被限制酶l切割的DNA， 能(能/不能）被限制酶ll切 (2）能被限制酶lI切割的DNA， (能/不能/不一定能）被限制酶I切割。 ( 3)DNA1被限制酶l切割，DNA2被限制酶Ⅱ切割，加入DNA连接酶可得到DNA1和DNA2的重组DNA片段，该重组DNA片段 (能/不能/不一定能)被限制酶l切割, (能/不能/不一定能)被限制酶l切割。 ↓ 不一定能 能 不一定能 能 　实战训练　 酶1 酶2 酶4 酶3 酶5 酶1:限制酶 酶2:DNA连接酶 酶3:DNA解旋酶 酶4:DNA聚合酶 酶5:DNA水解酶 　实战训练　 与DNA有关的几种酶的比较 酶种类 作用底物 作用部位 作用结果 限制酶 将DNA切成两个或多个片段 DNA连接酶 将两个DNA片段连接为一个DNA分子 DNA聚合酶 以DNA单链为模板，将单个脱氧核苷酸连接到已有的核苷酸链(DNA片段)的3’-OH末端 解旋酶 将双链DNA分子局部解旋为单链，形成两条长链 DNA水解酶 将DNA片段水解为单个脱氧核苷酸 DNA分子 DNA分子 DNA分子 DNA分子片段 脱氧核苷酸 磷酸二酯键 磷酸二酯键 磷酸二酯键 磷酸二酯键 碱基对中的氢键 不需要模板 （4）小结： 3、载体 二、基因工程(重组DNA技术)的基本工具 （1）种类： 最常用：质粒 其他：噬菌体、动植物病毒等（病毒具有特异性） （2）作用： 作为运载工具，将目的基因导入受体细胞中，在受体细胞内对目的基因进行复制和表达 不同载体的来源不同，在_____、______、_________以及可以插入外源DNA片段的______上也有很大差别。 大小　 　结构　 复制方式 大小 （3）质粒： ①本质：一种裸露的、结构简单、独立于真核细胞细胞核或原核细胞拟核DNA之外，并具有自我复制能力的环状双链DNA分子。 （小型环状DNA分子） 可来源于细菌和酵母菌 3、载体 二、基因工程(重组DNA技术)的基本工具 （3）质粒： ②特点： a.携带外源DNA片段的质粒进入受体细胞后，能在细胞内进行自我复制，或整合到受体DNA上，随受体DNA同步复制。 真正被用作载体的质粒，都是在天然质粒的基础上进行过人工改造的。 质粒DNA分子上有复制原点，可以保证质粒在受体细胞中能________ 自我复制 d.必须是安全的，对受体细胞无害、易分离。 b.有一个或多个限制酶切割位点。供外源DNA片段（目的基因）插入其中。 c.经人工改造后，这些质粒上常有特殊的标记基因，便于对重组DNA分子进行鉴定和筛选。检测目的基因是否导入受体细胞。如四环素抗性基因、氨苄青霉素抗性基因等 ③注意： a.载体不等于质粒。并非所有质粒均适合作为载体，有许多质粒未必完全符合作为载体的条件（如没有合适的标记基因） b.载体不等于膜载体。基因工程中的载体与细胞膜上物质运输的载体不同，前者的实质是DNA分子，能将目的基因导入受体细胞，，并利用它在宿主细胞内对目的基因进行大量复制，后者是蛋白质，与细胞膜的选择透过性有关。 3、载体 二、基因工程(重组DNA技术)的基本工具 （3）质粒： 24 目的基因和质粒通常要用相同的限制酶进行切割，从而产生相同的黏性末端，进而DNA连接酶发挥作用 。 4 【思考】 ①质粒有几个游离的磷酸基团？ 0 ②对质粒用不同限制酶切割两次会得到几个产物(片段)？ 2 ③ 25 1．限制酶的选择原则: 【重点难点·透析】 (1)根据目的基因两端的限制酶切割位点确定限制酶的种类 ①应选择切割位点位于目的基因两端的限制酶，以便将目的基因“切出”，如图可选择Pst Ⅰ。 ②不能选择切割位点位于目的基因内部的限制酶，不可破坏目的基因，如图不能选择Sma Ⅰ。 1．限制酶的选择原则: 【重点难点·透析】 (1)根据目的基因两端的限制酶切割位点确定限制酶的种类 ③确保出现相同黏性末端原则：通常选择与切割目的基因相同的限制酶切割质粒，如图中PstⅠ(单酶切)；为避免目的基因、质粒自身环化以及目的基因与质粒反向连接，也可使用不同的限制酶切割目的基因和质粒，如图也可选择PstⅠ和EcoR Ⅰ两种限制酶(双酶切)。 (但要确保质粒上也有这两种限制酶的切割位点，而且这两种限制酶切割后不会完全破坏标记基因)。 用Eco RⅠ限制酶（识别GAATTC，切割GA之间）切割载体和目的基因。 目的基因与质粒正反向连接示意图： 1．限制酶的选择原则: 【重点难点·透析】 保留标记基因、启动子、终止子、复制原点原则：所选择的限制酶尽量不要破坏这些结构。 【重点难点·透析】 (2)根据质粒的特点确定限制酶的种类 1．限制酶的选择原则: 【重点难点·透析】 （3）根据Ti质粒的T-DNA片段选择限制酶，图中甲、乙、丁Ti质粒均不宜选取，丙Ti质粒宜选取(设切割目的基因的限制酶为XbaⅠ和SacⅠ)： 1．限制酶的选择原则: 【重点难点·透析】 2.标记基因的作用： (1)前提：载体上的标记基因一般是一些抗生素的抗性基因。目的基因要转入的受体细胞没有抵抗相关抗生素的能力。 (2)过程：含有某抗生素抗性基因的载体导入受体细胞，抗性基因在受体细胞内表达，目的基因的表达产物使受体细胞对该抗生素产生抗性，然后在培养基中加入该抗生素。 可用于检测目的基因是否导入受体细胞。 √ 3.(2024·广东深圳高三检测)右图为某种质粒的简图，小箭 头所指分别为限制性内切核酸酶EcoRⅠ、BamHⅠ的酶 切位点，P为转录的启动部位。已知目的基因的两端有 EcoRⅠ、BamHⅠ的酶切位点，受体细胞为无任何抗药 性的原核细胞。下列有关叙述正确的是(　　) A．将含有目的基因的DNA与质粒分别用EcoRⅠ酶切，在DNA连接酶作用下，生成的由两个DNA片段连接形成的产物有两种 B．DNA连接酶的作用是将酶切后得到的黏性末端连接起来，形成一个重组质粒时形成两个磷酸二酯键 C．为了防止目的基因反向连接和质粒自身环化，酶切时可选用的酶是EcoRⅠ和BamH Ⅰ D．受体细胞能在含青霉素的培养基中生长，表明目的基因已成功导入该细胞 3.限制酶EcoRⅠ只能识别序列—GAATTC—，并只能在G与A之间切割。若在某目的基因的两侧各有1个EcoRⅠ的切点，请画出目的基因两侧被限制酶EcoRⅠ切割后所形成的黏性末端。 提示： —G　　　AATTC……G　　　　AATTC— —CTTAA G……CTTAA　　　　G— 　　　　　　　 目的基因 1．(2023·湖北等级考)用氨苄青霉素抗性基因(AmpR)、四环素抗性基因(TetR)作为标记基因构建的质粒如下图所示。用含有目的基因的DNA片段和用不同限制酶酶切后的质粒，构建基因表达载体(重组质粒)，并转化到受体菌中。下列叙述错误的是(　　) A．若用Hind Ⅲ酶切，目的基因转录的产物可能不同 B．若用Pvu Ⅰ酶切，在含Tet(四环素)培养基中的菌落，不一定含有目的基因 C．若用Sph Ⅰ酶切，可通过DNA凝胶电泳技术鉴定重组质粒构建成功与否 D．若用Sph Ⅰ酶切，携带目的基因的受体菌在含Amp(氨苄青霉素)和Tet的培养基中能形成菌落 √ 2.(2024·辽宁丹东高三质检)图1是某基因工程中构建重组质粒的过程示意图，载体质粒P0具有四环素抗性基因(TetR)和氨苄青霉素抗性基因(AmpR)。请回答下列问题： (1)EcoRⅤ酶切位点为 ，EcoRⅤ酶切出来的线性载体P1为____末端。 平　 (3)为筛选出含有重组质粒P3的菌落，采用含有不同抗生素的平板进行筛选，得到A、B、C三类菌落，其生长情况见下表(“＋”代表生长，“－”代表不生长)。根据表中结果判断，应选择的菌落是____(填表中字母)类，另外两类菌落质粒导入情况分别是_______________、___________________。 平板类型 菌落类型 A B C 无抗生素 ＋ ＋ ＋ 氨苄青霉素 ＋ ＋ － 四环素 ＋ － － 氨苄青霉素＋四环素 ＋ － － B　 A类菌落含有P0　 C类菌落未导入质粒　 (2)用Taq DNA聚合酶进行PCR扩增获得的目的基因片段，其两端各自带有一个腺嘌呤脱氧核苷酸。载体P1用酶处理，在两端各添加了一个碱基为____________的脱氧核苷酸，形成P2；P2和目的基因片段在__________酶作用下，形成重组质粒P3。 胸腺嘧啶(T) DNA连接　 (4)为鉴定筛选出的菌落中是否含有正确插入目的基因的重组质粒，拟设计引物进行PCR鉴定。图2所示为甲、乙、丙3条引物在正确重组质粒中的相应位置，PCR鉴定时应选择的一对引物是__________。某学生尝试用图中另外一对引物，结果从某一菌落的质粒中扩增出了400 bp 片段，原因是___________________。 乙、丙　 目的基因反向连接 将目的基因导入受体细胞 目的基因的筛选与获取 基因表达载体的构建 目的基因的检测与鉴定 有了目的基因，我们才能赋予一种生物以另一种生物的遗传特性 使目的基因在受体细胞中稳定存在，并可进行遗传、表达和发挥作用 载体进入受体细胞稳定表达，才能实现一种生物的基因在另一种生物中的转化 才能确定目的基因是否真正在受体细胞中稳定遗传和正确表达 （核心） 二、基因工程的基本操作程序 1、目的基因的筛选与获取： 二、基因工程的基本操作程序 （1）目的基因： 在基因工程的设计和操作中，用于改变受体细胞性状或获得预期表达产物等的基因。主要指的是编码蛋白质的基因，也可以是一些具有调控作用的因子。 ①概念： ②实例： 与生物抗逆性、优良品质、生产药物、毒物降解和工业用酶等相关的基因。 40 1、目的基因的筛选与获取： 二、基因工程的基本操作程序 （1）目的基因： ③基因结构： DNA片段 基因1 基因2 基因3 放大 编码区上游 编码区下游 41 1、目的基因的筛选与获取： 二、基因工程的基本操作程序 （1）目的基因： ③基因结构： 由能够编码蛋白质的________和具有调控作用的________区组成的，且编码区是连续的。 编码区 非编码 ii.真核细胞的基因结构： 同上，且编码区是间隔的、不连续的。 有外显子、内含子之分 数量关系：外显子=内含子 + 1 I.原核细胞的基因结构： 非编码区和编码区均具遗传效应，因为均属于基因 42 1、目的基因的筛选与获取： 二、基因工程的基本操作程序 （1）目的基因： ③基因结构： ii.真核细胞的基因结构： 外显子： 内含子： 能转录相应的mRNA，进一步能编码蛋白质的DNA序列 能转录相应的mRNA，但会被剪切掉因此是不能编码蛋白质的DNA序列 Q：编码相同数目氨基酸的蛋白质，原核细胞与真核细胞基因结构一样长吗？ 真核细胞的基因结构要长一些 43 转录 前体RNA 成熟mRNA 非编码区 非编码区 编码区 与RNA聚合酶结合位点 外显子 内含子 1 2 3 4 5 启动子 终止子 剪切、拼接 DNA聚合酶 单链DNA cDNA 逆转录酶 逆转录 复制 即不含非编码区和内含子 真核生物的基因用逆转录法得到的cDNA与原基因相同吗？ 不同 1、目的基因的筛选与获取： 二、基因工程的基本操作程序 （2）筛选目的基因的方法： 从相关的已知结构和功能清晰的基因中进行筛选是较为有效的方法之一。  （3）获取目的基因的方法： 人工合成目的基因、利用________________目的基因、通过构建基因文库来获取目的基因。 PCR获取和扩增　 45 基因组文库（包含一种生物的所有基因） 部分基因文库（包含一种生物的一部分基因） （cDNA文库） II.基因文库类型: ①从基因文库中直接获取： I.概念：将含有某种生物不同基因的许多DNA片段，导入到受体菌的群体中储存，各个受体菌分别含有这种生物的不同基因。 1、目的基因的筛选与获取： 二、基因工程的基本操作程序 （3）获取目的基因的方法： 提取某种生物的全部DNA 多个一定大小的DNA片段 将DNA片段与载体连接，导入受体菌中储存 用适当的限制酶切割 基因组文库 构建 III.基因组文库的构建 ①从基因文库中直接获取： 1、目的基因的筛选与获取： 二、基因工程的基本操作程序 （3）获取目的基因的方法： 某种生物的单链mRNA 单链互补cDNA 双链cDNA片段 导入受体菌中储存 与载体连接 cDNA文库 逆转录酶催化 DNA聚合酶催化 构建 IV.部分基因文库（如cDNA文库）构建 ①从基因文库中直接获取： 二、基因工程的基本操作程序 （3）获取目的基因的方法： DNA合成仪 I.前提： II.方法： 基因比较小、核苷酸序列已知 通过DNA合成仪用化学方法直接合成目的基因 ②人工合成： 1、目的基因的筛选与获取： 二、基因工程的基本操作程序 （3）获取目的基因的方法： 1、目的基因的筛选与获取： 二、基因工程的基本操作程序 （3）获取目的基因的方法： ③利用PCR获取和扩增目的基因： I.发明者：PCR由穆里斯等人于1985年发明，为此，穆里斯于1993年获得诺贝尔化学奖。 如果说，沃森和克里克发现DNA双螺旋结构，标志着分子生物学时代的开启，那么PCR技术则标志着分子生物学的腾飞。PCR技术的出现，彻底变革了生物化学、分子生物学、遗传学、以及现代医学等等。 50 1、目的基因的筛选与获取： 二、基因工程的基本操作程序 （3）获取目的基因的方法： ③利用PCR获取和扩增目的基因： II.RCR概念： PCR是_______________的缩写，是一项根据________________ 的原理，在_____提供参与DNA复制的_________与_________，对______________________进行_________的技术 聚合酶链式反应 DNA半保留复制 体外 各种组分 反应条件 目的基因的核苷酸序列 大量复制 聚合酶链式反应 DNA半保留复制 体外（PCR扩增仪） 对目的基因的核苷酸序列进行大量复制 原理 操作环境 目的 全称 PCR扩增仪 51 1、目的基因的筛选与获取： 二、基因工程的基本操作程序 （3）获取目的基因的方法： ③利用PCR获取和扩增目的基因： III.条件： 已知基因的核苷酸序列 前提条件： 一定的缓冲溶液(Mg2＋)、DNA模板、2种引物、4种脱氧核糖核苷酸、耐高温的DNA聚合酶、控制温度使DNA复制在体外反复进行 52 1、目的基因的筛选与获取： 二、基因工程的基本操作程序 （3）获取目的基因的方法： ③利用PCR获取和扩增目的基因： III.条件： a.引物： 定义： 引物是一小段能与DNA母链的一小段碱基序列互补配对的短单链核酸（单链DNA或单链RNA）。用于PCR的引物长度通常为20-30个核苷酸。 它是以 为模板，在 酶的作用下合成的 DNA单链 引物 设计原则： 引物自身不能环化； 两种引物之间不能互补配对； 引物长度不宜过短，防止引物随机结合,产生非特异性条带，不可过长，导致扩增效率低。。 GC含量适宜； 5‘端可被修饰 53 1、目的基因的筛选与获取： 二、基因工程的基本操作程序 （3）获取目的基因的方法： ③利用PCR获取和扩增目的基因： III.条件： a.引物： 2种，引物的5′端分别与两条模板链3′端结合，为DNA聚合酶提供了游离的3’端，使耐高温的DNA聚合酶能够从引物的3’端开始连接脱氧核苷酸 作用： 54 1、目的基因的筛选与获取： 二、基因工程的基本操作程序 （3）获取目的基因的方法： ③利用PCR获取和扩增目的基因： III.条件： b.4种脱氧核苷酸： 合成DNA子链的原料(dNTP),又提供能量。 包括：dATP、dTTP、dGTP、dCTP c.真核细胞和细菌的DNA聚合酶都需要Mg2＋激活。因此，PCR反应缓冲溶液中一般要添加Mg2＋。 d.模板DNA两条母链:提供DNA复制的模板 55 二、基因工程的基本操作程序 1、目的基因的筛选与获取： （3）获取目的基因的方法： ③利用PCR获取和扩增目的基因： III.条件： e.耐高温的DNA聚合酶:催化合成DNA子链 f.高温： 断开氢键，打开DNA双链 或 Taq DNA聚合酶 体内进行DNA复制时需要解旋酶断开氢键。 56 耐高温的DNA聚合酶(Taq酶） 4种脱氧核苷酸（DNTP） 引物 待扩增的DNA片段（模板） 5’ 5’ 变性 复性 延伸 温度上升到90℃以上，双链DNA解聚为单链 当温度下降到50℃左右时，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合。 温度上升到72℃左右时，溶液中的4种脱氧核苷酸在耐高温的DNA聚合酶的作用下合成新的DNA链。 引物 断开氢键，形成单链DNA ③利用PCR获取和扩增目的基因： IV.过程： 第一轮循环的产物作为第二轮反应的模板，经过变性、复性和延伸三步产生第二轮循环的产物； 第二轮循环的产物作为第三轮反应的模板，经过变性、复性和延伸三步产生第三轮的产物； 第二轮循环的产物 第三轮的产物 完成后，常采用琼脂糖凝胶电泳来鉴定PCR的产物 ③利用PCR获取和扩增目的基因： IV.过程： 复性时引物与DNA模板的结合是随机的，也存在解开的两条DNA单链的结合，但两条模板链重新结合的概率较低，原因是：①模板链一般比较长，比引物复杂得多，重新结合的概率较低。②加入引物的量足够多，而模板链数量少，引物与模板之间的碰撞结合机会，远远高于模板互补链之间的碰撞机会。 58 注意： 复性温度需适宜。复性温度高，扩增特异性强，复性温度低，扩增效率高。 ③利用PCR获取和扩增目的基因： IV.过程： 如果引物碱基数较少，可适当提高复性温度，从而增加PCR的特异性；如果引物碱基数较多，可适当降低复性温度，从而增加PCR的扩增效率。 一对引物的复性温度相差4℃～6℃不会影响PCR的产率，但是理想情况下一对引物的复性温度是一样的。 复性温度与设计的引物（长度、碱基组成）有关。 G、C含量高、长的引物，Tm较高，复性温度可设置的最值____。提高PCR的特异性 变大 ③利用PCR获取和扩增目的基因： IV.过程： 引物与模板链形成的杂合分子的解链温度称为引物的Tm值 复性温度应设置为略_____Tm值 低于 注意： 1.(选择性必修3 P79旁栏思考)PCR不可以扩增mRNA的原因是_________________________________________________________________________________________________________________。 PCR是以DNA双链作模板的，不能直接用单链RNA进行PCR，必须把mRNA逆转录成cDNA之后再进行PCR mRNA 杂交双链 单链cDNA 双链cDNA 逆转录酶 核酸酶H DNA聚合酶 RNA链 DNA链 Q：复性的过程 （一定/不一定）是引物与DNA模板链结合。 复性时引物与DNA模板的结合是随机的，也存在解开的两条DNA单链的结合，但两条模板链重新结合的概率较低。 原因是： ①模板链一般比较长，比引物复杂得多，重新结合的概率较低。 ②加入引物的量足够多，而模板链数量少，引物与模板之间的 碰撞结合机会，远远高于模板互补链之间的碰撞机会。 不一定 Q:引物在PCR中能重复利用吗？ 不能 长链-中长链DNA____个 含有引物A的DNA____个 含有引物B的DNA____个 2 1 1 引物A 引物B 第一次扩增 第一轮循环结束：获得2个DNA分子（4条链）。得到的DNA片段只有一种引物，且比所需DNA片段长 V.PCR相关计算： ③利用PCR获取和扩增目的基因： 中长链-短链DNA____个 2 长链-中长链DNA____个 含有引物A的DNA____个 含有引物B的DNA____个 2 3 3 第二次扩增 第二轮循环结束：获得四个DNA分子（ 8条链）。才出现所需DNA片段，这样的片段存在两种引物。 ③利用PCR获取和扩增目的基因： V.PCR相关计算： 第三次扩增 中长链-短链DNA____个 4 长链-中长链DNA____个 含有引物A的DNA____个 含有引物B的DNA____个 2 7 7 短链-短链DNA______个 2 （等于上一轮中长链数，中长链每扩增一次，会增加两条） 即含脱氧核苷酸链等长的DNA分子数（目的基因） ③利用PCR获取和扩增目的基因： V.PCR相关计算： 第四次扩增 中长链-短链DNA____个 6 长链-中长链DNA____个 含有引物A的DNA____个 含有引物B的DNA____个 2 15 15 短链-短链DNA______个 8 ③利用PCR获取和扩增目的基因： V.PCR相关计算： 扩增次数 第1次 第2次 第3次 第4次 第n次 DNA总数 21 22 23 24 2n 长链-中长链DNA 中长链-短链DNA 短链-短链 DNA 2 0 0 2 2 2 4 0 2 2 6 8 2 2(n-1) 2n-2n ③利用PCR获取和扩增目的基因： 等长的DNA分子数（目的基因） 含引物A(或B) 的DNA 1 3 7 15 2n-1 因为必然第一次扩增结束后的两条子链，只含引物A或引物B 扩增次数 1 2 3 n 含引物的DNA分子数 2 4 8 2n 同时含两种引物的DNA分子数 0＝21—2 2＝22－2 6＝23－2 2n－2 共消耗引物的分子数　 2＝22－2 6＝23－2 14＝24－2 2n＋1－2 第n次复制需要引物__个 2n ③利用PCR获取和扩增目的基因： V.PCR相关计算： 思考? ①获取目的基因时至少要经过 次循环才能分离出目的基因. 三 ②PCR反应的结果不都是所需DNA片段。 类型 体内DNA复制 PCR 时期 细胞分裂前的间期 人工控制，随时进行 场所 细胞内（主要在细胞核内） 细胞外 是否需要ATP 需要 不需要（能量由dNTP（原料）提供 解旋方式 在解旋酶作用下，细胞提供能量，部分DNA双链解开 90 ℃以上高温解聚，DNA双链全部解开，不需要解旋酶 酶 解旋酶、DNA聚合酶、DNA连接酶等 耐高温的DNA聚合酶 VI.PCR技术与体内DNA复制过程比较 类型 体内DNA复制 PCR 合成 子链 一条链连续合成；另一条链不连续合成，再由DNA连接酶连接或两条链均连续合成 （半保留半不连续全链复制） 分别从两种引物的3′端开始延伸，都是连续合成（半保留全连续局部区域复制） 过程 VI.PCR技术与体内DNA复制过程比较 类型 体内DNA复制 PCR 循环次数 受生物体自身控制 一般要经历30次 产物 完整DNA 大量的界于两种引物之间的DNA片段 相同点 (1)都需要提供DNA模板；(2)都需要在一定环境中进行，原料相同，都需要能量，都有酶的参与，都遵循碱基互补配对原则；(3)DNA合成方向都是从子链的5′端向3′端延伸 VI.PCR技术与体内DNA复制过程比较 Q:获取了足够量的目的基因后，能直接把目的基因导入受体细胞吗？ 就算可以进行转录和翻译成蛋白质，游离的DNA片段也无法随着细胞分裂进行复制，导致子代细胞不再含有目的基因 游离的DNA片段进入受体细胞，一般会直接被分解 不能原因 那怎样才能让基因在受体细胞中稳定存在，并且遗传给下一代呢？ 2、基因表达载体的构建： 二、基因工程的基本操作程序 （1）构建目的： —基因工程的核心： 使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传给下一代，同时使目的基因能够表达和发挥作用。 （2）基因表达载体的组成： 2、基因表达载体的构建： 二、基因工程的基本操作程序 （2）基因表达载体的组成： ①目的基因： ②启动子 启动子具有物种和组织特异性。即只有使用受体生物自身基因的启动子才能比较有利于基因的表达。如：构建在水稻胚乳细胞内表达的表达载体需要选择的启动子是 。 水稻胚乳细胞启动子 2、基因表达载体的构建： 二、基因工程的基本操作程序 （2）基因表达载体的组成： ①目的基因 ②启动子 ③终止子 ④复制原点： ⑤标记基因 DNA分子复制的起点 含有插入目的基因的重组质粒的大肠杆菌 Q：某一质粒载体如图所示，外源DNA插入到Ampr或Tetr中会导致相应的基因失活（Ampr衣示氨苄青霉素抗性基因，Tetr表示四环素抗性基因)。有人将此质粒载体用BamH l酶切后，与用BamHI酶切获得的目的基因混合，加入DNA连接酶进行连接反应，用得到的混合物直接转化大肠杆菌。结果大肠杆菌有的未被转化，有的被转化。被转化的大肠杆菌有三种，分别是含有环状目的基因、含有质粒载体、含有插入了目的基因的重组质粒的大肠杆菌。 未被转化的大肠杆菌； 含有环状目的基因的大肠杆菌 含有质粒载体的大肠杆菌 77 (2）如果用含有氨苄青霉素的培养基进行筛选，在上述四种大肠杆菌细胞中，未被转化的和仅含环状目的基因的细胞不能区分的，其原因是 ； 二者均不含氨苄青霉素抗性基因，在该培养基上均不能生长 78 (2）如果用含有氨苄青霉素的培养基进行筛选，在上述四种大肠杆菌细胞中， 和 的细胞也是不能区分的，其原因是____________________________________________________ 在上述筛选的基础上，若要筛选含有插入了目的基因的重组质粒的大肠杆菌单菌落，还需使用含 培养基。 含有质粒载体 含有插入了目的基因的重组质粒 二者均含氨苄青霉素抗性基因，在该培养基上均能生长。 四环素 1、2、3、6、9就是插入了目的基因的重组质粒的大肠杆菌 79 2、基因表达载体的构建： 二、基因工程的基本操作程序 —基因工程的核心： （2）基因表达载体的组成： 注意：①载体≠表达载体的区别：二者都有标记基因和复制原点两部分DNA片段。基因表达载体在载体基础上增加了目的基因。 ②目的基因插入位点不是随意的：基因表达载体需要启动子与终止子的调控，所以目的基因应插入 ， 启动子和终止子之间 项目 位置 作用 启动子 位于DNA分子上 RNA聚合酶识别和结合部位，启动转录过程 起始密码子 位于mRNA分子上 决定翻译的开始 终止子 位于DNA分子上 决定转录的结束 终止密码子 位于mRNA分子上 决定翻译的结束 [易错提醒]　启动子、起始密码子、终止子、终止密码子的区别 二、基因工程的基本操作程序 2、基因表达载体的构建： 二、基因工程的基本操作程序 —基因工程的核心： （3）基因表达载体的构建过程： 同种限制酶/ 同尾酶 即基因表达载体 Q:如果用一种限制酶分别切割目的基因和质粒，再用DNA连接酶处理后会出现几种产物？(只考虑两两结合) ？ b.质粒与目的基因会发生反向连接 a.质粒、目的基因会发生自身环化连接 ②单酶切的缺点： 2、基因表达载体的构建： 二、基因工程的基本操作程序 ·—基因工程的核心： （3）基因表达载体的构建过程： ①单酶切时，若考虑两两相连，则DNA连接酶连接DNA片段会出现三种情况：目的基因与目的基因连接；目的基因与质粒连接；质粒与质粒的连接，需筛选出重组质粒。 -G -CTTAA AATTC- G- AATTC-…………-G G-…………-CTTAA 单酶切：质粒与目的基因会发生自身环化、质粒与目的基因会发生反向连接 Q:如何防止目的基因和质粒的自身环化以及目的基因的反向连接？ -G -CTTAA GATCT- A- AATTC-…………-A G-…………-TCTAG 双酶切 2、基因表达载体的构建： 二、基因工程的基本操作程序 —基因工程的核心： （3）基因表达载体的构建过程： a.质粒、目的基因不会发生自身环化连接 b.质粒与目的基因不会发生反向连接 ③双酶切的优点： 3、将目的基因导入受体细胞： 二、基因工程的基本操作程序 常用方法 将目的基因导入 植物细胞 将目的基因导入 动物细胞 将目的基因导入 微生物细胞 农杆菌转化法 花粉管通道法 ——显微注射法 ——Ca2+处理法 我国科学家独创 (常用) 载体进入受体细胞稳定表达，才能实现一种生物的基因在另一种生物中的转化 3、将目的基因导入受体细胞： 二、基因工程的基本操作程序 （1）导入至植物细胞的方法： ①花粉管通道法： 方法1：用微量注射器将含目的基因的DNA溶液直接注入子房中 方法2：在植物受粉后的一定时间内，剪去柱头，将DNA溶液滴加在花柱切面上，使目的基因借助花粉管通道进入胚囊。 我国科学家独创 3、将目的基因导入受体细胞： 二、基因工程的基本操作程序 （1）导入至植物细胞的方法： ②农杆菌转化法： I.转化：目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程。实质是基因重组。 (常用) 举例：根据受体植物的不同，所用的具体转化方法有所区别，例如，可以将新鲜的从叶片上取下的圆形小片与农杆菌共培养，然后筛选出转化细胞，并再生成植株；可以将花序直接浸没在含有农杆菌的溶液中一段时间，然后培养植株并获得种子，在进行筛选、鉴定。 3、将目的基因导入受体细胞： 二、基因工程的基本操作程序 （1）导入至植物细胞的方法： ②农杆菌转化法： (常用) II.农杆菌特点： 易感染双子叶植物和裸子植物，对大多数单子叶植物没有感染能力。 农杆菌细胞内含Ti质粒，当它侵染植物细胞后，能将Ti质粒上的T­DNA转移到被侵染的细胞，并且将其整合到该细胞的染色体DNA上。 III.原理： 目前用农杆菌侵染水稻、玉米等多种单子叶植物也取得了成功。 T-DNA 目的基因 构建表达载体 含目的基因的重组Ti质粒 转入农杆菌 含重组Ti质粒的农杆菌 导入植物细胞 表现出新性状的植物 植物细胞 将目的基因插入染色体DNA中 植物组织培养 目的基因插入 Ti质粒的T-DNA上 导入植物细胞 整合到受体细胞的染色体DNA上 表达 转入 农杆菌 IV.过程： 3、将目的基因导入受体细胞： 二、基因工程的基本操作程序 农杆菌转化法中的两次拼接 第一次拼接是将目的基因拼接到Ti质粒的T­DNA上，第二次拼接(非人工操作)是指插入目的基因的T­DNA拼接到受体细胞的染色体DNA上； IV.过程： （1）导入至植物细胞的方法： ②农杆菌转化法： 3、将目的基因导入受体细胞： 二、基因工程的基本操作程序 两次导入：第一次导入是将含目的基因的重组Ti质粒导入农杆菌，第二次导入(非人工操作)是指含目的基因的T­DNA导入受体细胞。 IV.过程： （1）导入至植物细胞的方法： ②农杆菌转化法： 导入的目的基因，可能存在于细胞质中，也可能整合到染色体DNA上。存在于染色体DNA上的目的基因有可能通过花粉传播进入杂草或其他作物中，造成“基因污染”。 3、将目的基因导入受体细胞： 二、基因工程的基本操作程序 （1）导入至植物细胞的方法： ②农杆菌转化法： 【易错积累】 a.农杆菌的作用是 。 b.用农杆菌感染时，优先选择 （受伤的/完好的）叶片与重组质粒的农杆菌培养，选用该叶片的理由是 。 感染植物细胞，把目的基因插入到植物细胞的染色体的DNA上 受伤的 叶片伤口处的细胞可释放大量的酚类物质，可吸引农杆菌 3、将目的基因导入受体细胞： 二、基因工程的基本操作程序 （1）导入至植物细胞的方法： ②农杆菌转化法： c.若要利用农杆菌转化法转化单子叶植物细胞，可采取添加 ，其目的是 。 d.利用Ti质粒构建重组质粒的目的是： 。 酚类物质 吸引农杆菌移向受体细胞，有利于目的基因成功转化 将目的基因插入到Ti质粒上的T-DNA上，利用其将目的基因导入受体细胞并整合到受体细胞染色体DNA上，使目的基因的遗传特性稳定维持和表达 3、将目的基因导入受体细胞： 二、基因工程的基本操作程序 （2）导入至动物细胞的方法： ①病毒介导法： 科学家也用病毒DNA与目的基因一起构建的载体，去感染受体动物细胞，也能使目的基因导入动物细胞内。如用腺病毒载体，搭载新冠病毒S基因，进入人体内，使人体产生对S蛋白的免疫记忆。 3、将目的基因导入受体细胞： 二、基因工程的基本操作程序 （2）导入至动物细胞的方法： ②显微注射法： I.受体细胞: II.常选用受精卵作为受体细胞的原因： a.体积大，易操作； b.全能性高，易培养成完整个体，易表现出全能性。 受精卵 构建基因表达载体并提纯 利用显微注射法将基因表达载体注入动物的受精卵中 早期胚胎培养 胚胎移植（移植到同期发情的母畜子宫内） 获得具有新性状的动物 3、将目的基因导入受体细胞： 二、基因工程的基本操作程序 （2）导入至动物细胞的方法： ②显微注射法： III.过程 3、将目的基因导入受体细胞： 二、基因工程的基本操作程序 （3）导入至微生物细胞的方法： ①常用法: . ②常用菌： 。 ③微生物作为受体细胞的原因是 。 ④过程： Ca2+处理细胞 感受态细胞 表达载体与感受态细胞混合 感受态细胞吸收DNA Ca2+处理法(感受态细胞法) 大肠杆菌 繁殖快、多为单细胞、遗传物质相对少 ⑤受体细胞用Ca2+处理的目的是 ________。 ⑥用Ca2+处理受体细胞是通过改变 的通透性来完成 使其变为感受态细胞，容易吸收周围环境中的DNA分子的状态 细胞壁 3、将目的基因导入受体细胞： 二、基因工程的基本操作程序 （3）导入至微生物细胞的方法： Q：酵母菌可以作为受体细胞吗？ 酵母菌为真核细胞，具多种细胞器，所以在生产需要加工和分泌的蛋白质时，酵母菌比大肠杆菌有优势。 稿定PPT 稿定PPT，海量素材持续更新，上千款模板选择总有一款适合你 02 4、目的基因的检测与鉴定： 二、基因工程的基本操作程序 目的基因在受体细胞中稳定遗传的关键是目的基因要整合到受体细胞中的染色体DNA 上。 检测目的基因进入受体细胞后，是否稳定维持和表达其遗传特性 (1)目的： 4、目的基因的检测与鉴定： 二、基因工程的基本操作程序 类型 检测内容 方法 分子水平的检测 个体生物学水平的鉴定 受体细胞的染色体DNA上是否插入了目的基因 目的基因是否转录出了mRNA PCR/分子杂交等技术 目的基因是否翻译成蛋白质（检测目的基因是否表达） 抗原-抗体杂交技术 个体是否具有相应性状（检测转基因生物是否培育成功） 抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等 (2)类型： 原理：抗原-抗体的特异性结合 PCR扩增技术 转基因生物 提取DNA DNA作为模板 用与目的基因相关的引物进行PCR扩增 是否扩增出目的基因 琼脂糖凝胶电泳鉴定 (1)是否插入目的基因 转基因生物 提取mRNA mRNA cDNA作为模板 逆转录 (2)目的基因是否转录出mRNA 用与目的基因相关的引物进行PCR扩增 琼脂糖凝胶电泳鉴定 是否扩增出目的基因 4、目的基因的检测与鉴定： 分子杂交技术（DNA分子杂交技术、RNA分子杂交技术) 碱基互补配对原则 原理： (1)是否插入目的基因 (2)目的基因是否转录出mRNA ①将含目的基因的DNA片段用放射性同位素等作标记，以此做探针 ②取出转基因生物的基因组DNA ③使探针和转基因生物的基因组DNA杂交，若显示出杂交带，表明目的基因已插入染色体DNA中 是一段带有检测标记（荧光或同位素标记），且顺序已知的，与目的基因能互补的核酸序列（DNA或RNA）。应是单链，若为双链，必须先行变性处理成单链。 基因探针 变性 变性 转基因生 物的DNA 基因探针 用上述探针和转基因生物的mRNA杂交，若出现杂交带，表明目的基因转录出mRNA 4、目的基因的检测与鉴定： 个体生物学水平的鉴定具体方法举例 转基因生物 鉴定方法 成功标志 抗虫植物 抗病毒（菌）植物 抗盐碱植物 抗除草剂植物 获取目的基因产物的转基因生物 饲喂害虫（抗虫接种实验） 害虫死亡 病毒（菌）接种实验 未染病 种植在盐碱地 正常生长 喷洒除草剂 正常生长 提取细胞产物与天然产品进行功能活性比较 功能、活性正常 用棉铃饲喂棉铃虫，如虫吃后不出现中毒症状，说明未插入目的基因或插入目的基因未表达。如虫吃后中毒死亡，则说明插入了抗虫基因并得到表达。 3．(2024·武汉高三调研)由于某目的基因酶切后的末端为平末端，载体E只有产生黏性末端的酶切位点，需借助中间载体P将目的基因接入载体E。据图分析，下列叙述正确的是(　　) A．通过PCR扩增获取目的基因是基因 工程的核心工作 B．为了便于该目的基因接入载体E，可 用限制酶EcoRⅤ或SmaⅠ切割载体P C．载体P只能作为中间载体，是因为其没有表达该目的基因的启动子与终止子 D．若受体细胞表现出抗性基因的相应性状，则表明重组载体成功导入受体细胞 √ [教材新命题点思考] 1.目前在PCR反应中使用Taq DNA聚合酶而不使用大肠杆菌DNA聚合酶的主要原因是什么？ 提示：在PCR过程中，要加热超过90 ℃，所以使用Taq DNA聚合酶，而不使用在高温下会失活的大肠杆菌DNA聚合酶。 2.以mRNA为材料可以获得DNA，其原理是__________________________ ________________________________________________________________。 在逆转录酶的作用下，以mRNA为模板按照碱基互补配对的原则可以合成DNA 3.从受体细胞中分离纯化出目的蛋白，该蛋白作为抗原注入机体后，刺激机体产生的可与此蛋白结合的相应分泌蛋白是________，该分泌蛋白可用于检测受试者血清中的HIV，检测的原理是_________________________。 4.为确定转基因抗盐烟草是否培育成功，既要用______________检测目的基因是否已插入，又要在个体水平上鉴定，后者的具体过程是_________ _________________________________________________________________。 抗体　 抗原、抗体特异性结合 PCR技术 将培育的烟草幼苗栽培于含有一定盐的土壤中，观察该烟草植株的生长状态 [模型新命题点思考] 5.据图回答下列问题。  (1)从图中可以看出，目的基因是________________，使用的载体是________，将目的基因导入受体细胞的方法是________________。 (2)若进行个体生物学水平的鉴定，则采用的方法是___________________。 Bt抗虫蛋白基因　 Ti质粒　 农杆菌转化法 用棉叶饲喂棉铃虫 1. (2024·江苏百校联考)重叠延伸PCR是一种通过寡聚核苷酸链之间重叠的部分互相搭桥、互为模板，经过多次PCR扩增，获得目的基因的方法。该技术在扩增较长片段的DNA、不同来源的DNA片段拼接、基因的定点诱变等方面具有广泛的应用前景，下图表示利用重叠延伸PCR技术扩增某目的基因的过程。下列叙述错误的是(　　) A．引物中G＋C的含量越高，引物与模板DNA结合的稳定性越高 B．在第一阶段由于引物2和引物3发生碱基互补配对，因此两者置于不同反应系统中 √ 1. (2024·江苏百校联考)重叠延伸PCR是一种通过寡聚核苷酸链之间重叠的部分互相搭桥、互为模板，经过多次PCR扩增，获得目的基因的方法。该技术在扩增较长片段的DNA、不同来源的DNA片段拼接、基因的定点诱变等方面具有广泛的应用前景，下图表示利用重叠延伸PCR技术扩增某 目的基因的过程。下列叙述错误的是(　　) C．引物1、2组成的反应系统和引物3、4组成的反应系统中均进行一次复制后，共产生4种双链DNA分子 D．在引物1、2组成的反应系统中，经第一阶段要形成图示双链DNA，至少要经过2次复制 二、非选择题 1．(2024·华中师大一附中高三模拟)幽门螺杆菌是一种常见的人类致病菌，其骨架蛋白MreB通过影响脲酶活性而参与调控其致病性。为了更准确地分离出MreB蛋白，用重叠延伸PCR技术(指在PCR的基础上，采用具有互补末端的引物，使PCR产物形成重叠链，通过重叠链的延伸，将不同来源的片段重叠拼接起来的一项技术)将幽门螺杆菌MreB基因中编码终止密码子前的DNA序列与TAP标签(可以标记幽门螺杆菌基因组中任何一个基因，且不会影响基因的表达)进行连接，构建了融合表达蛋白MreB和TAP标签的质粒，实验流程如下图所示。据图回答下列问题： (1)重叠PCR获得带有标签的MreB基因 ①获得两种具有重叠片段DNA的过程中，PCR1和PCR2必须在不同的反应体系中，原因是_________________________________________________ ______________________________。 ②PCR3反应体系中所加入的引物是__________________。 引物2和引物3中存在互补配对的片段，置于同一反应体系中时，它们会发生结合而失去作用 引物1、引物4　 (2)重组质粒的构建 ①为将带有标签的MreB基因定向插入pK18mobsacB质粒中，需要在引物末端添加限制酶识别序列，据图分析，在引物1末端添加的序列所对应的限制酶是________，在引物4末端添加的序列所对应的限制酶是_________。 经过这两种酶酶切的带有标签的MreB基因和pK18mobsacB质粒进行连接时，可选用__________________(填“E.coli DNA连接酶”或“T4 DNA连接酶”)。 ②重组质粒中，KmR的作用是_______________________________________ ______________________________________。 SmaⅠ 　T4 DNA连接酶 XhoⅠ 鉴别受体细胞中是否含有目的基因，从而将含有目的基因的细胞筛选出来 2．(2024·湖北高三联考)基因敲减主要是指从转录水平或翻译水平使基因表达失活的技术，其中RNA干扰技术是常用的基因敲减技术，该技术首先要根据目的基因序列设计出反义RNA和正义RNA构建成双链RNA(shRNA)，然后用相关酶切割shRNA形成反义RNA片段，其可与目的基因转录的mRNA碱基互补配对，进而诱导相关酶水解mRNA，实现对基因的敲减。为检测设计出的shRNA是否能成功敲减基因还需要利用荧光酶报道基因系统进行验证。图1表示敲减载体构建，图2表示荧光酶报道基因系统检测的原理。回答下列问题： (1)据图1分析，若要从含shRNA基因的DNA分子中扩增出shRNA基因并能使其在受体细胞中表达，则需要用到的引物是____________________，为使扩增出的shRNA基因能够和质粒构建敲减载体，在设计引物时需在引物的________(填“5′”或“3′”)端分别添加____________________酶能够识别的序列。 引物2、引物5　 5′　 BamHⅠ、Hind Ⅲ (2)已知mRNA末端缺失会导致mRNA水解。荧光酶报道基因与欲敲减的目的基因串联可构成荧光酶报道基因系统，荧光酶报道基因与目的基因的连接点是终止密码子对应的序列，而不是终止子，其原因是_____________________________________________________________________________________。 解析：终止子是一段特殊的DNA序列，位于基因的下游，转录过程在终止子处会终止，若连接点为终止子则不能实现两基因的mRNA的串联，故荧光酶报道基因与目的基因的连接点是终止密码子对应的序列，而不是终止子。 转录过程在终止子处会终止，若连接点为终止子则不能实现两基因的mRNA的串联 若敲减载体能够敲减目的基因，则荧光酶报道基因和目的基因转录形成的mRNA会被水解，荧光酶报道基因不能正常表达，无法检测到荧光 (3)荧光酶报道基因系统与敲减载体一同导入受体细胞中可以根据荧光的有无检测敲减载体是否成功敲减目的基因，其机理是________________________________________________________________________________________________________________________________。 解析：由题意可知，若敲减载体能够敲减目的基因，则荧光酶报道基因和目的基因转录形成的mRNA会被水解，荧光酶报道基因不能正常表达，无法检测到荧光，故荧光酶报道基因系统与敲减载体一同导入受体细胞中可以根据荧光的有无检测敲减载体是否成功敲减目的基因。 3.(2023·山东等级考)科研人员构建了可表达J－V5融合蛋白的重组质粒并进行了检测，该质粒的部分结构如图甲所示，其中V5编码序列表达标签短肽V5。 (1)与图甲中启动子结合的酶是___________。除图甲中标出的结构外，作为载体，质粒还需具备的结构有____________________________________ ________________________(答出2个结构即可)。 RNA聚合酶 限制酶切割位点、标记基因、复制原点(答出2个结构即可)　 (2)构建重组质粒后，为了确定J基因连接到质粒中且插入方向正确，需进行PCR检测，若仅用一对引物，应选择图甲中的引物_________________。已知J基因转录的模板链位于b链，由此可知引物F1与图甲中J基因的______(填“a链”或“b链”)相应部分的序列相同。 F2和R1(或F1和R2)　 a链　 (3)重组质粒在受体细胞内正确表达后，用抗J蛋白抗体和抗V5抗体分别检测相应蛋白是否表达以及表达水平，结果如图乙所示。其中，出现条带1证明细胞内表达了________________，条带2所检出的蛋白_______(填“是”或“不是”)由重组质粒上的J基因表达的。 J－V5融合蛋白　 不是 1、DNA的粗提取与鉴定： 三、DNA的粗提取与鉴定、DNA片段的扩增及电泳鉴定 (1)基本思路： DNA、RNA、蛋白质和脂质等在物理和化学性质方面存在差异，可以利用这些差异，选用适当的物理或化学方法对它们进行提取 (2)实验原理： ①提取原理： b.DNA在不同浓度的NaCl溶液中溶解度不同，能溶于2 mol/L的NaCl溶液中 a.DNA不溶于酒精溶液，但细胞中某些蛋白质则溶于酒精。利用这一原理，可初步分离DNA与蛋白质。 1、DNA的粗提取与鉴定： 三、DNA的粗提取与鉴定、DNA片段的扩增及电泳鉴定 (2)实验原理： ②鉴定原理： 在一定温度下(沸水浴)，DNA遇二苯胺试剂会呈现蓝色 (3)实验选材： ①材料： DNA含量相对较高的生物组织，如新鲜洋葱、香蕉、菠菜、菜花和猪肝等。 【思考】能否选用牛、羊、马、猪等哺乳动物成熟的红细胞做实验材料？ 不能， 哺乳动物成熟的红细胞中无细胞核和线粒体，几乎不含DNA 【思考】能否选用鸡血细胞做实验材料？ 能，鸡是鸟类动物 1、DNA的粗提取与鉴定： 三、DNA的粗提取与鉴定、DNA片段的扩增及电泳鉴定 (3)实验选材： ②试剂： 二苯胺试剂要现配现用 用棕色瓶保存 a.研磨液: b.体积分数为95%的酒精： c.2mol/L 的NaCl溶液： d.二苯胺试剂： 含有NaCl、EDTA、SDS、Tris和HCl 析出DNA 溶解DNA 鉴定DNA 研磨液成分 作用 Tris-HCl缓冲液 稳定DNA EDTA 抑制DNA酶 SDS(洗涤剂) 使蛋白质变性 研磨液： · 溶/瓦解细胞膜 · 使蛋白质变性与DNA分离 1、DNA的粗提取与鉴定： 三、DNA的粗提取与鉴定、DNA片段的扩增及电泳鉴定 (4)实验步骤： ①研磨材料：新鲜洋葱，加研磨液充分研磨。 目的：破碎细胞膜，释放DNA。若研磨不充分，会使DNA分子不能从细胞核中释放出来，从而影响提取的DNA含量。 利用动物细胞提取DNA破碎细胞的方法：动物细胞无细胞壁,可直接吸水涨破(省去研磨步骤) 1、DNA的粗提取与鉴定： 三、DNA的粗提取与鉴定、DNA片段的扩增及电泳鉴定 (4)实验步骤： ②提取上清液：纱布过滤，在4℃冰箱中放置几分钟后,再取上清液。也可以直接将研磨液倒入塑料离心管中,在1500r/min的转速下离心5min,再取上清液放入烧杯中。 用纱布可以减少DNA损失，不可用滤纸，因为DNA会被吸附到滤纸上而大量损失。 过滤液沉淀过程在4℃冰箱中进行的原因：低温时，DNA酶的活性较低，抑制DNA降解 上清液中可能含有DNA、RNA、蛋白质、脂质、糖类 离心或过滤研磨液的目的：使细胞碎片沉淀，获得含有DNA的上清液。 1、DNA的粗提取与鉴定： 三、DNA的粗提取与鉴定、DNA片段的扩增及电泳鉴定 (4)实验步骤： ③析出DNA：在上清液中加入体积相等的、预冷的酒精溶液(体积分数为95%),静置2~3 min,溶液中出现的白色丝状物就是粗提取的DNA。 用玻璃棒沿一个方向搅拌,卷起丝状物,并用滤纸吸去上面的水分;或者将溶液倒入塑料离心管中,在10000r/min的转速下离心5min,弃上清液,将管底的沉淀物(粗提取的DNA)晾干。 实验中的预冷、低温处理目的:抑制DNA水解酶的活性，进而抑制DNA降解,抑制分子运动,使DNA易形成沉淀析出、低温有利于增加DNA分子的柔韧性,减少其断裂 1、DNA的粗提取与鉴定： 三、DNA的粗提取与鉴定、DNA片段的扩增及电泳鉴定 (4)实验步骤： ③析出DNA：在上清液中加入体积相等的、预冷的酒精溶液(体积分数为95%),静置2~3 min,溶液中出现的白色丝状物就是粗提取的DNA。 用玻璃棒沿一个方向搅拌,卷起丝状物,并用滤纸吸去上面的水分;或者将溶液倒入塑料离心管中,在10000r/min的转速下离心5min,弃上清液,将管底的沉淀物(粗提取的DNA)晾干。 DNA的析出中搅拌时应轻缓、并沿一个方向：减少DNA断裂,以便获得较完整的DNA分子 1、DNA的粗提取与鉴定： 三、DNA的粗提取与鉴定、DNA片段的扩增及电泳鉴定 (4)实验步骤： ④溶解DNA 将丝状物或沉淀物溶解在2mol/L的NaCl溶液中 ⑤DNA的鉴定 实验组：在溶有DNA的溶液中加入二苯胺（现配现用）试剂，混合均匀后将试管在沸水中加热5min，溶液变成蓝色（冷却后观察） 对照组：2mol/L的NaCl溶液中加入二苯胺（现配现用）试剂，混合均匀后将试管在沸水中加热5min，溶液不变成蓝色（冷却后观察） 为除去粗提取的DNA中的蛋白质可用_______________________ 酶解法（蛋白酶水解）、高温 为除去粗提取的DNA中的RNA可用_______________________ 酶解法（RNA酶） 2、DNA片段的扩增： 三、DNA的粗提取与鉴定、DNA片段的扩增及电泳鉴定 (1)原理： ①DNA的热变性原理，即通过调节温度来控制DNA双链的解聚与结合。 ②PCR扩增DNA片段还利用了DNA半保留复制的原理。 2、DNA片段的扩增： 三、DNA的粗提取与鉴定、DNA片段的扩增及电泳鉴定 (2)材料用具： ①PCR扩增仪（自动控温，实现DNA的扩增） ②微量离心管（置于PCR扩增仪中，实际上是进行PCR反应的场所） ③微量移液器（用于向微量离心管转移PCR配方中的液体） ④一次性吸液枪头（微量移液器吸取一种试剂更换一次枪头） 2、DNA片段的扩增： 三、DNA的粗提取与鉴定、DNA片段的扩增及电泳鉴定 (2)材料用具： 10倍浓缩的扩增缓冲液（含Mg2+） 5μL 20mmol/L的4种脱氧核苷酸的等量混合液（实为dNTP） 1μL 20μmol/L的引物Ⅰ 2.5μL 20μmol/L的引物Ⅱ 2.5μL H2O 28～33μL 1-5U/μL的Taq DNA聚合酶（即耐高温的DNA聚合酶） 1～2U 模板DNA （用量为1pg-1μg） 5～10μL 总体积 50μL ⑥PCR反应体系的配方 ⑤4种脱氧核苷酸等量混合液(实际为dNTP)、2种引物、TaqDNA聚合酶、模板DNA、扩增缓冲液、无菌水 2、DNA片段的扩增： 三、DNA的粗提取与鉴定、DNA片段的扩增及电泳鉴定 (3)实验步骤： ①准备： ②移液： 用微量移液器按照PCR反应体系配方或PCR试剂盒的说明书，在微量离心管中依次加入各组分 ③混合： ④离心： 待所有组分都加入后，盖严离心管的盖子，将微量离心管放入离心机里，离心约10s，使反应液集中在离心管的底部（提高反应速率） 离心的目的是使挂在管壁上的液体全部甩下。 ⑤反应： 参照下表的参数，设置好PCR仪的循环程序。将装有反应液的微量离心管放入PCR仪中进行反应。 循环程序 变性 复性 延伸 预变性 94℃,5min / / 30次 94℃,30s 55℃,30s 72℃,1min 最后一次 94℃,1min 55℃,30s 72℃,10min 使DNA充分变性，以利于引物更好地和模板结合 预变性： 2、DNA片段的扩增： 三、DNA的粗提取与鉴定、DNA片段的扩增及电泳鉴定 (3)实验步骤： 3、DNA片段的电泳鉴定： 三、DNA的粗提取与鉴定、DNA片段的扩增及电泳鉴定 (1)原理： a.DNA分子具有可解离的基团，在一定的PH下，这些基团可以带上正电荷或负电荷。在电场的作用下，这些带电分子会向着与它所带电荷相反的电极移动，这个过程就是电泳。 b.PCR的产物一般通过_________________来鉴定 琼脂糖凝胶电泳 DNA分子在一定pH的缓冲液中可以带负电荷，在电场中DNA便向正极端移动 3、DNA片段的电泳鉴定： 三、DNA的粗提取与鉴定、DNA片段的扩增及电泳鉴定 (1)原理： d.凝胶中的DNA分子通过染色，可以在波长为300nm的紫外灯下被检测出来。 c.在凝胶中DNA分子的迁移速率与凝胶的浓度、DNA分子的大小和构像等有关。 速度：环状>线性>开环 ①微量移液器（用于向加样孔中添加相应样液） ②一次性吸液枪头（微量移液器吸取一种试剂更换一次枪头） ③电泳装置（包括电泳仪、电泳槽等） ④电泳缓冲液 ⑤凝胶载样缓冲液 ⑥琼脂糖 ⑦核酸染料 3、DNA片段的电泳鉴定： 三、DNA的粗提取与鉴定、DNA片段的扩增及电泳鉴定 (2)材料用具： （内含指示剂——溴酚蓝） （常用核酸染料如EB即溴化乙锭） 作用：指示DNA的迁移的位置（非具体） 3、DNA片段的电泳鉴定： 三、DNA的粗提取与鉴定、DNA片段的扩增及电泳鉴定 (2)材料用具： 加样孔 负电极 运动方向 电泳缓冲液 正电极 ①配制琼脂糖溶液 根据待分离DNA片段的大小，用电泳缓冲液配制琼脂糖溶液，一般配制质量体积比0.8%-1.2%的琼脂糖溶液。在沸水浴或微波炉内加热至琼脂糖熔化。稍冷却后，加入适量的核酸染料混匀。 ②制备凝胶 a.将温热的琼脂糖溶液迅速倒入模具，并插入合适大小的梳子，以形成加样孔 c.将电泳缓冲液加入电泳槽中，电泳缓冲液没过凝胶1mm为宜 b.待凝胶溶液完全凝固，小心拔出梳子，取出凝胶放入电泳槽内 梳子孔为加样孔， 加样孔侧连电极负极 3、DNA片段的电泳鉴定： 三、DNA的粗提取与鉴定、DNA片段的扩增及电泳鉴定 (3)实验步骤： 3、DNA片段的电泳鉴定： 三、DNA的粗提取与鉴定、DNA片段的扩增及电泳鉴定 (3)实验步骤： ③加样 将扩增得到的PCR产物与凝胶载样缓冲液(内含指示剂）混合，再用微量移液器将混合液缓慢注入凝胶的加样孔内。留一个加样孔加入指示分子大小的标准参照物(Marker) ⑤观察记录 取出凝胶置于紫外灯下观察和照相 marker中就是不同长度的双链DNA标准品混合物，通过对比可以知道帮助我们知道样品DNA大小 接通电源，根据电泳槽阳极至阴极之间的距离来设定电压，一般为1～5V/cm，待指示剂前沿迁移接近凝胶边缘时，停止电泳 ④电泳 非紫外灯下 紫外灯下 3、DNA片段的电泳鉴定： 三、DNA的粗提取与鉴定、DNA片段的扩增及电泳鉴定 (3)实验步骤： 3、DNA片段的电泳鉴定： 三、DNA的粗提取与鉴定、DNA片段的扩增及电泳鉴定 (4)实验结果： 3、DNA片段的电泳鉴定： 三、DNA的粗提取与鉴定、DNA片段的扩增及电泳鉴定 (5)实验注意事项： ①为避免外源DNA等因素的污染，PCR实验中使用的微量离心管、枪头和蒸馏水等在使用前必须进行高压灭菌处理。 ③该实验所需材料可以直接从公司购买，缓冲液和酶应分装成小份，并在-20℃储存。使用前，将所需试剂从冰箱拿出，放在冰块上缓慢融化。 ②在进行操作时，一定要戴好一次性手套。 ⑤在向微量离心管中添加反应组分时，每吸取一种试剂后，移液器上的枪头都必须更换。 ④PCR扩增不能随意加大试剂用量。 3、DNA片段的电泳鉴定： 三、DNA的粗提取与鉴定、DNA片段的扩增及电泳鉴定 (5)实验注意事项： ⑥电泳时，DNA的相对分子量越大，迁移速率越慢；DNA的相对分子量越小，迁移速率越快,离加样孔越远。　 若想让分子量大的迁移速度变快可适当加大电压、降低琼脂糖凝胶浓度 Q：如果只扩增目的基因，那么是否成功扩增出DNA片段的判断的依据是什么？ 可以在紫外灯下直接观察到DNA条带的分布及粗细程度来评价扩增的结果，进行电泳鉴定的结果应该是一条条带 该图示目的基因片段大小约为750bp 3、DNA片段的电泳鉴定： 三、DNA的粗提取与鉴定、DNA片段的扩增及电泳鉴定 Q：如果只扩增目的基因，电泳结果理应只有一个条带，如果不止一条条带，请分析产生这个结果的可能原因。 未出现扩增条带可能的原因有： ①TaqDNA聚合酶失活； ②引物出现质量问题； ③变性时温度低，变性时间短； ④Mg2+浓度过低 …… 出现非特异性扩增条带可能的原因有： ①引物特异性不强或容易聚合成二聚体 ②模板DNA出现污染 ③复性时的温度过低 ④引物浓度过高 ⑤DNA聚合酶的浓度过高 ⑥Mg2+浓度过高 …… 3、DNA片段的电泳鉴定： 三、DNA的粗提取与鉴定、DNA片段的扩增及电泳鉴定 1、为检测启动子变化对Wx基因表达的影响，科研人员需要检测Wx基因转录产生的mRNA (Wx mRNA)的量。检测时分别提取各品系胚乳中的总RNA，经________过程获得总cDNA。为了确保PCR扩增出的是Wx基因的cDNA，关键操作是____________________________________________。 逆转录　 设计并添加与Wx基因两端互补的引物 2．采用IRES序列连接AFP基因(甲胎蛋白基因)和IL­-2基因(白细胞介素-­2基因)构建双基因共表达重组载体，能够利用同一载体同时表达出人甲胎蛋白以及人白细胞介素-­2。该重组载体可用于肝癌的基因免疫治疗，既能发挥细胞因子的免疫调节作用，又能靶向性地针对肝癌产生特异性抗肿瘤效应。下图为双基因共表达重组载体的结构示意图。回答下列问题： (1)从肝癌HepG2细胞中获取mRNA并逆转录成cDNA作为模板，用含有BglⅡ和EcoRⅠ酶切位点序列的AFP特异性引物进行PCR扩增，得到含有BglⅡ和EcoRⅠ酶切位点的AFP基因片段。 ①AFP基因PCR反应体系中需要加入模板、酶、引物和维持pH稳定的__________，还需加入__________以激活耐高温DNA聚合酶的活性。 ②将限制酶BglⅡ、EcoRⅠ的识别序列接在AFP引物的5′端，原因是_____________________________________________________，上游引物与下游引物四种碱基的碱基比相当，若上游引物核苷酸数目较多，这一差异会直接影响PCR中的______步骤。 缓冲液 Mg2＋ 使引物的3′端与模板链严格互补配对，且不影响子链的延伸 复性 (2)用限制酶BglⅡ、EcoRⅠ分别酶切PIRES2­-EGFP质粒得到AFP基因片段，并使用T4 DNA连接酶进行连接，得到PIRES2­-AFP-­EGFP重组载体；从CIK细胞获取cDNA作为模板，用含有BstXⅠ和NotⅠ酶切黏性末端的IL-­2特异性引物进行PCR扩增，得到的IL­-2基因与酶切后PIRES2­-AFP­-EGFP重组载体混合，得到PIRES2­-AFP­-IL-­2重组载体。上述表达载体的构建过程中，获取目的基因及切割质粒均使用两种限制酶的目的是_____________________________________________________________________________________________________________________。 防止目的基因及质粒自身环化；保证目的基因和载体之间的定向、准确连接(或防止目的基因与载体反向连接) (3)IRES是mRNA 5′端具有的一段较短的RNA序列，这类RNA序列能折叠成类似于起始tRNA的结构，从而介导核糖体与RNA结合，开启蛋白质翻译过程。与两个基因直接连接形成融合基因相比，两个基因之间插入IRES序列的意义是_________________________________________。 解析：IRES能介导核糖体与RNA结合，与两个基因直接连接形成融合基因相比，两个基因之间插入IRES序列的意义是利用一种mRNA可连续翻译出两种蛋白质。 利用一种mRNA可连续翻译出两种蛋白质　 (4)人的AFP基因和IL­-2基因能在奶牛膀胱上皮细胞中表达的原因是_________________________。 解析：人的AFP基因和IL­-2基因能在奶牛膀胱上皮细胞中表达的原因是生物界共用一套遗传密码。 生物界共用一套遗传密码 3．报告基因是指一类易于检测且实验材料本身不具备的基因。阿尔茨海默病(AD)是由淀粉样前体蛋白(APP)过量表达导致的神经系统退变性疾病，用增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因作为报告基因，将EGFP基因与APP基因融合，可方便、经济、快速地筛选出促进人APP基因mRNA降解的药物。研究表明，EGFP基因与APP基因融合后，虽能全部转录但仅可合成EGFP。EGFP基因与APP基因融合过程如下图所示。回答下列问题： (2)据图分析，Klenow酶的作用是____________________________________ ___________。切割pcDNA 3.1质粒获得APP751基因时，研究人员没有选择直接用HindⅢ、Xba Ⅰ同时切割，而是历经①→②→③的复杂过程，原因是_______________________________________________________________ _____________________________________________________________________________________________。 将Xba Ⅰ切割获得的黏性末端催化产生平末端　 若直接用Hind Ⅲ、Xba Ⅰ同时切割，产物两端都是黏性末端，而经过①→②→③可使目的基因两端分别为平末端和黏性末端，能与被Sma Ⅰ和Hind Ⅲ酶切的载体连接 (1)APP751、EGFP基因的cDNA是以其mRNA为模板经_______过程形成的。 解析：以mRNA为模板获得cDNA的过程称为逆转录。  逆转录　 4．多不饱和脂肪酸(PUFAs)是人体必需脂肪酸，猪肉是我国主要的肉类消费品，提高其PUFAs含量对居民健康具重要意义。为解决猪肉中PUFAs含量不足的问题，研究者从线虫中获得控制PUFAs合成的必需酶基因fat-­1，培育转fat­1基因猪，操作过程如下图所示，图中GFP基因表达出绿色荧光蛋白。请回答下列问题： (1)利用PCR扩增fat­-1基因时，为了将目的基因与质粒定向连接，应在两种引物的一端分别加上限制酶________________识别与切割的序列；PCR产物经电泳结果符合预期，但仍需通过基因测序进一步确认，原因是_______________________________________________________________。 EcoRⅠ、BamHⅠ 电泳技术仅能检测DNA分子的大小，无法确定其碱基序列　 (3)图中的连接产物需要导入大肠杆菌中的原因是______________________ ___________________________________________________________，导入 前一般用________处理大肠杆菌使其处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态。 解析：由于连接产物为混合物，即存在连接正确的基因表达载体、没有导入目的基因的质粒等，所以需先导入大肠杆菌筛选正确的重组表达载体，以提高转基因的成功率。大肠杆菌作为受体细胞，需用Ca2＋处理使其处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态，易于接受外源基因。 连接产物为混合物，需先导入大肠杆菌筛选正确的重组表达载体，以提高转基因的成功率 Ca2＋ Lavf58.29.100 Packed by Bilibili XCoder v2.0.2 $$