基因工程阶段复习课件-2024-2025学年高二下学期生物人教版选择性必修3

第三章 基因工程 大家好，今天我们一起进行高中生物选择性必修三第三章第二节基因工程的基本操作程序内容的学习 1 1. 限制性内切核酸酶 （1）来源： （2）作用： （3）结果： 黏性末端 GGCATGGG AATTCCGTACCC CTTCATG GAAGTACTTAA 平末端 GGGCCTAA CCCGGATT …TACCC …ATGGG 主要从原核生物中分离出来 识别双链DNA分子的特定核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开。 考点一 重组DNA技术的基本工具 与DNA相关的五种酶的比较 名称 作用部位 作用结果 限制酶 DNA连接酶 DNA聚合酶 DNA(水解)酶 解旋酶 碱基对之间 的氢键 磷酸二酯键 磷酸二酯键 磷酸二酯键 磷酸二酯键 将DNA切成两个片段 将双链DNA分子局部解旋为单链，形成两条长链 将DNA片段水解为单个脱氧核苷酸 将单个脱氧核苷酸依次连接到单链末端 将两个DNA片段连接为一个DNA分子 2．基因工程的基本工具——DNA连接酶 (1)作用：将 “缝合”起来，恢复被 切开的两个核苷酸之间的 。 双链DNA片段 限制酶 磷酸二酯键 类型 E·coli DNA连接酶 T4DNA连接酶 来源 ____________ ____________ 功能 缝合____________ 缝合____________________ 结果 恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的_________________ 大肠杆菌 T4噬菌体 黏性末端 黏性末端 和平末端(效率较低) 磷酸二酯键 (2)类型： 3.载体 （1）作用： （2）种类： （3）质粒作为运载体的条件: 条件 原因 稳定存在并能自我复制或整合到受体DNA上 有一个至多个限制酶切割位点 使目的基因稳定存在且数量可扩增 具有特殊的标记基因 无毒害作用 供外源DNA片段(基因)插入其中 便于重组DNA分子的筛选 对受体细胞无毒害作用，避免受体细胞受到损伤 质粒、噬菌体、动植物病毒 携带外源基因进入受体细胞 拟核DNA 质粒 大肠杆菌细胞 （2021 全国乙卷）用 DNA 重组技术可以子生物以新的进传特性，创进出更符合人类需要的生物产品。在此过程中需要使用多种工具酶，其中 4 种限制性核酸内切酶的切割位点如图所示 考点一 基因工程及基因工程的基本工具 回答下列问题： (1)常用的 DNA 连接酶有 E.coli DNA 连接酶和 T4 DNA 连接酶。上图中 酶切割后的DNA片段可以用E.coli DNA连接酶连接。上图中 酶切割后的DNA片段可以用T4 DNA连接酶连接。 (2) DNA 连接酶催化目的基因片段与质粒载体片段之间形成的化学键是 。 EcoRⅠ PstⅠ EcoRⅠ PstⅠSmaⅠ EcoRⅤ 磷酸二酯键 （2021 全国乙卷）用 DNA 重组技术可以子生物以新的进传特性，创进出更符合人类需要的生物产品。在此过程中需要使用多种工具酶，其中 4 种限制性核酸内切酶的切割位点如图所示 考点一 基因工程及基因工程的基本工具 (3)DNA 重组技术中所用的质粒载体具有一些特征。如质粒 DNA 分子上有复制原点可以保证质粒在受体细胞中能 ；质粒 DNA 分子上有 ，便于外源 DNA 插入；质粒 DNA 分子上有标记基因(如某种抗生素抗性基因)，利用抗生素可筛选出含质粒载体的宿主细胞，方法是 。 自我复制 一至多个限制酶切割位点 用含有该抗生素的培养基培养宿主细胞，能够存 活的即为含有质粒载体的宿主细胞。 （2021 全国乙卷）用 DNA 重组技术可以子生物以新的进传特性，创进出更符合人类需要的生物产品。在此过程中需要使用多种工具酶，其中 4 种限制性核酸内切酶的切割位点如图所示 考点一 基因工程及基因工程的基本工具 (4)表达载体含有启动子，启动子是指 。 位于基因首端的一段特殊 DNA 序列，是 RNA 聚合酶识别及结合的部位，能驱动转录过程。 人工合成 从基因文库中获取 PCR扩增 考点二 基因工程的基本操作程序 1. 利用PCR获取和扩增目的基因 1.PCR扩增的原理和过程是什么？ 2.利用DNA分子扩增目的基因时至少经过几次循环才能得到等长的目的基因？ 3. PCR扩增中引物的作用是什么？设计引物时应注意哪些问题？ 想一想 想一想 1.PCR扩增的原理和过程是什么？ 2.利用DNA分子扩增目的基因时至少经过几次循环才能得到等长的目的基因？ 3. PCR扩增中引物的作用是什么？设计引物时应注意哪些问题？ 1. 利用PCR获取和扩增目的基因 [归纳提升] 引物设计应注意的问题 ①设计引物的依据:目的基因两端的核苷酸序列。 ②设计出的两种引物要分别结合在DNA模板链的3'端;脱氧核苷酸连接在引物的3'端进行延伸。 ③引物设计的要求(或引物失效的原因):每种引物内部不能发生局部碱基互补配对;两种引物之间不能在局部发生碱基互补配对。 ④引物设计时既要考虑目的基因序列,又要考虑载体序列,为了便于扩增的DNA片段与表达载体连接,有时还需在引物的5'端加上限制酶的酶切位点。 1. 利用PCR获取和扩增目的基因 有关核酸的方向性问题： ①核苷酸： 1 2 3 4 5 1’碳连碱基 2’碳（脱氧核糖连无氧；核糖有氧） 3’碳连羟基（-OH） 5’碳连磷酸 ②一条脱氧核苷酸链（DNA单链）: ③DNA是由两条脱氧核苷酸链，按反向平行的方式构成 一端的3’碳上有游离的羟基（-OH），叫3’端； 另一端的5’碳上有游离的磷酸基团，叫5’端。 一条核糖核苷酸链（RNA链）也是如此。 有关核酸的方向性问题： ④DNA聚合酶： ⑤RNA聚合酶： 总是从引物的 端连接脱氧核苷酸（DNA的复制方向：?） 总是从引物的 端连接核糖核苷酸（转录的方向：?） 3’ 3’ 有关核酸的方向性问题： ⑥tRNA的 端结合氨基酸； 读反密码子时从 端读起（即结合氨基酸的一端） ⑦翻译时核糖体的移动方向：沿着 方向移动 ⑧限制性内切核酸酶识别的序列：沿 方向读取 3’ 3’ mRNA的5’-3’ 5’-3’ 循环数 1 2 3 n DNA分子数 2 4 8 含引物的DNA分子数 2 4 8 同时含引物A、B的DNA分子数 0＝21－2 2＝22－2 6＝23－2 含引物A(或B)的DNA分子数 1＝21－1 3＝22－1 7＝23－1 共消耗引物的数量 2＝22－2 6＝23－2 14＝24－2 第n次时需要消耗引物数量 2＝21 4＝22 8＝23 含与脱氧核苷酸链等长的DNA分子数 0＝21－2 0＝22－4 2＝23－6 PCR反应相关计算: 2n 2n 2n－1 2n－2 2n+1－2 2n－2n 2n 2. 基因表达载体构建 启动子 终止子 目的基因 复制原点 标记基因 例2 某个目的基因所在的DNA 片段和载体限制酶切割位点分别如图所示，分析并回答下列问题: (1)若选用一种限制酶切割目的基因,应该选哪种？为什么？ (2)若选用两种限制酶切割目的基因，应选哪两种?为什么?这种做法与选择一种限制酶相比有什么优点? (3)在切割质粒时使用限制酶应注意什么? 选择PstI，因为SmaI的切割位点在目的基因的内部会破坏目的基因的结构而 EcoRI 只能在目的基因的右侧切开而不能在目的基因左侧切开，所以目的基因不能从该整个DNA分子中剪下来 选择PstI和EcoRI，因为作 SmaI的切割位点在目的基因的内部会破坏目的基因的结构:因为这两种酶切割后产生的粘性末端不同这样可以避免目的基因和质粒自身环化，保证目的基因与质粒的定向连接 用限制酶切割质粒时，注意不要破坏质粒上的标记基因，启动子，终止子和复制原点等 2. 基因表达载体构建 归纳提升：选择限制酶的原则 (1)不破坏目的基因原则:如图甲中可选择PstI而不选择 SmaI。 (2)保留标记基因、启动子、终止子、复制原点原则:质粒作为载体必须具备标记基因，所以所选择的限制酶尽量不要破坏这些结构,如图乙中不选择SmaI。 (3)确保出现相同黏性末端原则:通常选择与切割目的基因相同的限制酶，如图甲中PstI;为避免目的基因和质粒自身环化和随意连接，也可使用不同的限制酶切割目的基因和质粒，如图甲也可选择PstI和EcoRI两种限制酶 2. 基因表达载体构建 对应训练（不定项）下表中列出了几种限制酶识别序列及其切割位点，图1、图2中箭头表示相关限制酶的酶切位点。下列说法正确的是（ ) A．一个图1所示的质粒分子经SmaI切割后，含有4个游离的磷酸基团 B．用图1中的质粒和图2中的目的基因构建重组质粒，不能使用SmaI切割 C．图2中为防止酶切后单个含目的基因的DNA片段自身连接成环状，不能使用EcoRI D. 为了获取重组质粒，最好用BamHI和HindII同时切割质粒和外源DNA BCD 2. 基因表达载体构建 3. 将目的基因导入受体细胞 植物细胞：花粉管通道法、农杆菌转化法 动物细胞：显微注射法 微生物细胞：Ca2+处理法 对应训练（不定项)采用基因工程的方法培育抗虫棉,下列导入目的基因的做法正确的是( ) A.将毒素蛋白注射到棉花受精卵中 B.将编码毒素蛋白的 DNA序列注射到棉花植株受精卵中 C.将编码毒素蛋白的DNA序列与质粒重组,导入细菌,用该细菌感染棉花植株的体细胞，再进行组织培养 D.将编码毒素蛋白的DNA序列与细菌质粒重组,注射到棉花植株的子房并进入受精卵 CD 3. 将目的基因导入受体细胞的方法 4. 目的基因的检测与鉴定 1.分子水平 2.个体生物学水平 4. 目的基因的检测与鉴定 例3(不定项)研究人员将 GNA 基因和ACA基因连接成融合基因，再与pBI121质粒载体结合，导入玉米细胞,最终获得了抗蚜虫玉米新品种，部分操作如下图，下列相关叙述错误的是（ ） A.①②过程均需使用DNA连接酶，②过程是基因工程的核心步骤 B.与只用KpnI相比，用KpnI和XhoI处理融合基因和载体可保证基因转录方向正确 C.只要检测出玉米细胞中含有融合基因，就说明抗蚜虫玉米培育成功 D.在加入卡那霉素的培养基上存活下来的细胞,一定是成功导入重组载体的细胞 CD 4. 目的基因的检测与鉴定 例4（2022 山东25）某种类型的白血病由蛋白P引发，蛋白UBC可使P被蛋白酶识别并降解，药物A可通过影响这一过程对该病起到治疗作用。为探索药物A治疗该病的机理，需构建重组载体以获得融合蛋白FLAG-P和FLAG-P△。P△是缺失特定氨基酸序列的P，FLAG是一种短肽，连接在P或P△的氨基端，使融合蛋白能与含有FLAG抗体的介质结合，但不影响P或P△的功能。 （1）为构建重组载体，需先设计引物，通过PCR特异性扩增P基因。用于扩增P基因的引物需满足的条件是 。为使PCR产物能被限制酶切割，需在引物上添加相应的限制酶识别序列，该限制酶识别序列应添加在引物的______（填“3'端”或“5'端”）。 两种引物分别与两条模板链3'端的碱基序列互补配对 5'端 真 题 感 悟 （2）PCR扩增得到的P基因经酶切连接插入载体后，与编码FLAG的序列形成一个融合基因，如图甲所示，其中“ATGTGCA”为P基因编码链起始序列。将该重组载体导入细胞后，融合基因转录出的mRNA序列正确，翻译出的融合蛋白中FLAG的氨基酸序列正确，但P基因对应的氨基酸序列与P不同。据图甲分析，出现该问题的原因是 。 在转录出的mRNA中，限制酶识别序列对应的最后两个碱基与P基因对应的第一个碱基构成一个密码子，导致读取的密码子顺序改变，翻译出的氨基酸序列改变 真题感悟 （2022 山东25）某种类型的白血病由蛋白P引发，蛋白UBC可使P被蛋白酶识别并降解，药物A可通过影响这一过程对该病起到治疗作用。为探索药物A治疗该病的机理，需构建重组载体以获得融合蛋白FLAG-P和FLAG-P△。P△是缺失特定氨基酸序列的P，FLAG是一种短肽，连接在P或P△的氨基端，使融合蛋白能与含有FLAG抗体的介质结合，但不影响P或P△的功能。 （1）为构建重组载体，需先设计引物，通过PCR特异性扩增P基因。用于扩增P基因的引物需满足的条件是_______。为使PCR产物能被限制酶切割，需在引物上添加相应的限制酶识别序列，该限制酶识别序列应添加在引物的______（填“3'端”或“5'端”）。 （2）PCR扩增得到的P基因经酶切连接插入载体后，与编码FLAG的序列形成一个融合基因，如图甲所示，其中“ATGTGCA”为P基因编码链起始序列。将该重组载体导入细胞后，融合基因转录出的mRNA序列正确，翻译出的融合蛋白中FLAG的氨基酸序列正确，但P基因对应的氨基酸序列与P不同。据图甲分析，出现该问题的原因是______。修改扩增P基因时使用的带有EcoRⅠ识别序列的引物来解决该问题，具体修改方案是______。 长句答题 真题感悟 （3）融合蛋白表达成功后，将FLAG-P、FLAG-P△、药物A和UBC按照图乙中的组合方式分成5组。各组样品混匀后分别流经含FLAG抗体的介质，分离出与介质结合的物质并用UBC抗体检测，检测结果如图丙所示。已知FLAG-P和FLAG-P△不能降解UBC，由①②③组结果的差异推测，药物A的作用是______；由②④组或③⑤组的差异推测，P△中缺失的特定序列的作用是______。 （4）根据以上结果推测，药物A治疗该病的机理是______。 长句答题 解题技巧 利用“因果搭桥法”解决 首先审题，找出因果，然后利用生物学知识搭桥完善逻辑链条。 描述事实（起因） 分析本质（媒介） 得出结果 一般来自题干信息 依据题干信息和教材有关生物学原理、规律等 一般来自题干信息，可以照抄 答题模板 （2）修改扩增P基因时使用的带有EcoRⅠ识别序列的引物来解决该问题，具体修改方案是______。 在EcoRI识别序列前后增加碱基，使其碱基数目加上FLAG的碱基数目为3的倍数 （3）融合蛋白表达成功后，将FLAG-P、FLAG-P△、药物A和UBC按照图乙中的组合方式分成5组。各组样品混匀后分别流经含FLAG抗体的介质，分离出与介质结合的物质并用UBC抗体检测，检测结果如图丙所示。已知FLAG-P和FLAG-P△不能降解UBC，由①②③组结果的差异推测，药物A的作用是 ；由②④组或③⑤组的差异推测，P△中缺失的特定序列的作用是 。 （4）根据以上结果推测，药物A治疗该病的机理是 。 促进UBC与FLAG-P的结合 P△中缺失的特定序列是与UBC 结合的关键序列 药物A促进UBC与FLAG-P的结合，从而促进蛋白P被蛋白酶识别并降解，达到治疗的目的 知识网络 DNA连接 限制性内切核酸 目的基因 基因表达载体 受体 目的基因 达标检测 答案 1.D 2.AD 3.(1)逆转录酶(或反转录酶) (2)一段特异性核苷酸序列 复性 (3)该人近期可能感染新冠病毒，经自身免疫系统的作用，体内病毒被消灭，但体内抗体仍存在 该人感染了新冠病毒，且机体免疫系统产生了相应抗体，但还未将病毒完全消灭 (4)获得编码S蛋白的目的基因→基因表达载体的构建→将目的基因导入受体细胞→目的基因的检测与鉴定 谢谢 大家好，今天我们一起进行高中生物选择性必修三第三章第二节基因工程的基本操作程序内容的学习 36 Lavf58.20.100 $$