3.2实验-DNA片段的扩增及电泳鉴定课件-2024-2025学年高二下学期生物人教版选择性必修3

第3章 基因工程 第2节 基因工程的基本操作程序 Copyright © 2018 芃苇_PengV. All Rights Reserved. 温故知新：基因工程的基本程序 基因工程的基本操作程序 目的基因的筛选与获取 基因表达载体的构建 将目的基因导入受体细胞 第一步 第二步 第三步 第四步 目的基因的检测与鉴定 前提 核心 关键 保证 利用PCR获取和扩增 目的基因、启动子、终止子、标记基因 农杆菌转化法(植物)、显微注射法(动物) 、 感受态细胞转化法(微生物); 分子检测：是否插入、转录、翻译 个体水平：是否具有抗性以及抗性强度等。 Copyright © 2018 芃苇_PengV. All Rights Reserved. 实验原理 材料用具 实验步骤 DNA体外扩增的原理 DNA片段电泳鉴定原理 探究.实验-DNA片段的扩增及电泳鉴定 Copyright © 2018 芃苇_PengV. All Rights Reserved. 1.实验原理 （1）DNA体外扩增的原理： 探究.实验-DNA片段的扩增及电泳鉴定 ①PCR利用了DNA的 ______ 原理，通过 _________ 来控制DNA双链的解聚与结合，PCR仪实质上就是一台能够 _____________ 的仪器，一次PCR一般要经历 ___ 次循环； 热变性 调节温度 自动调控温度 30 ②PCR扩增DNA片段还利用了 ______________ 的原理； DNA半保留复制 变性 90˚C 延伸 72˚C 复性 50˚C PCR 的产物一般通过琼脂糖凝胶电泳来鉴定。 Copyright © 2018 芃苇_PengV. All Rights Reserved. DNA琼脂糖凝胶 琼脂糖的微结构 琼脂糖是一种天然聚合长链状分子，从琼脂中提取而来，在电泳缓冲液中加热到沸点后溶解，冷却后又凝固成均匀的胶体胨，具有刚性的滤孔，凝胶孔径的大小决定于琼脂糖的浓度。 ①DNA分子具有可解离的基团，在一定的PH下，这些基团可以带上正电荷或负电荷。在电场的作用下，这些带电分子会向着与它所带电荷相反的电极移动，这个过程就是电泳。 ③凝胶中的DNA分子通过染色，可以在波长为300nm的紫外灯下被检测出来。 ②在凝胶中DNA分子的迁移速率与凝胶的浓度、DNA分子的大小和构像等有关。 探究.实验-DNA片段的扩增及电泳鉴定 1.实验原理 （2）DNA片段电泳鉴定原理： Copyright © 2018 芃苇_PengV. All Rights Reserved. 带电粒子在电场的作用下发生迁移的过程 6 2.材料用具 （1）仪器： PCR仪 微量离心管 电泳装置 微量移液器 自动控温，实现DNA的扩增 实际上是进行PCR反应的场所 用于向微量离心管转移PCR配方中的液体 包括电泳仪、电泳槽等 探究.实验-DNA片段的扩增及电泳鉴定 Copyright © 2018 芃苇_PengV. All Rights Reserved. （2）材料： ①4种脱氧核苷酸等量混合液、2种引物、TaqDNA聚合酶、模板DNA、扩增缓冲液、无菌水。 ③PCR反应体系的配方(见教材) ②电泳缓冲液、凝胶载样缓冲液、琼脂糖和核酸染料等。 探究.实验-DNA片段的扩增及电泳鉴定 2.材料用具 Copyright © 2018 芃苇_PengV. All Rights Reserved. 3.实验步骤 （1）DNA片段扩增的具体过程： 探究.实验-DNA片段的扩增及电泳鉴定 使DNA充分变性，以利于引物更好地与模板结合 用微量移液器按照PCR反应体系配方或PCR试剂盒的说明书，在微量离心管中依次加入各组分 待所有组分都加入后，盖严离心管的盖子，将微量离心管放入离心机里，离心约10s，使反应液集中在离心管的底部（提高反应速率） 参照右表的参数，设置好PCR仪的循环程序。将装有反应液的微量离心管放入PCR仪中进行反应。 循环程序 变性 复性 延伸 预变性 94℃,5min / / 30次 94℃,30s 55℃,30s 72℃,1min 最后一次 94℃,1min 55℃,30s 72℃,1min ①移液 ②离心 ③扩增 Copyright © 2018 芃苇_PengV. All Rights Reserved. 探究.实验-DNA片段的扩增及电泳鉴定 3.实验步骤 （2）PCR扩增产物的电泳鉴定： Copyright © 2018 芃苇_PengV. All Rights Reserved. （2）PCR扩增产物电泳鉴定的具体过程： 制备凝胶 电泳缓冲液配制琼脂糖溶液，一般配制质量体积比0.8%～1.2%的琼脂糖溶液。在沸水浴或微波炉内加热至琼脂糖熔化。稍冷却后，加入适量的核酸染料混匀。 将温热的琼脂糖溶液迅速倒入模具，并插入合适大小的梳子，以形成加样孔。 待凝胶溶液完全凝固，小心拔出梳子，取出凝胶放入电泳槽内。 进行电泳 将电泳缓冲液加入电泳槽中，电泳缓冲液没过凝胶1mm为宜。 扩增得到的PCR产物与凝胶载样缓冲液(内含指示剂)混合，再用微量移液器将混合液缓慢注入凝胶的加样孔内。留一个加样孔加入指示分子大小的标准参照物。 接通电源，根据电泳槽阳极至阴极之间的距离来设定电压，一般为1～5V/cm。待指示剂前沿迁移接近凝胶边缘时，停止电泳 观察鉴定 取出凝胶置于紫外灯下观察和照相。 ①融化： ②倒模: ③凝固: ①加液： ②加样： ③电泳： 探究.实验-DNA片段的扩增及电泳鉴定 Copyright © 2018 芃苇_PengV. All Rights Reserved. 电泳一般需要Marker（标记），为一组已知分子量的标准DNA片段，在电泳中作为未知样品大小的参照物。如D2000 plus DNA Ladder含有9条双链DNA分子，其分子量为100，250，500，750，1000，1500 ， 2000，3000，5000 bp。 电泳结果 探究.实验-DNA片段的扩增及电泳鉴定 探究.实验-DNA片段的扩增及电泳鉴定 4.注意事项 （1）为避免外源DNA等因素的污染，PCR实验中使用的微量离心管、枪头和蒸馏水等在使用前必须进行高压灭菌处理。 （2）该实验所需材料可以直接从公司购买，缓冲液和酶应分装成小份，并在-20℃储存。使用前，将所需试剂从冰箱拿出，放在冰块上缓慢融化。 （3）在向微量离心管中添加反应组分时，每吸取一种试剂后，移液器上的枪头都必须更换。 （4）在进行操作时，一定要戴好一次性手套。 （5）PCR扩增不能随意加大试剂用量。 Copyright © 2018 芃苇_PengV. All Rights Reserved. 探究.实验-DNA片段的扩增及电泳鉴定 1.你是否成功扩增出DNA片段？判断的依据是什么？ 以在紫外灯下直接观察到DNA条带的分布及粗细程度来评价扩增的结果。 该片段大小约为750bp。 Copyright © 2018 芃苇_PengV. All Rights Reserved. 探究.实验-DNA片段的扩增及电泳鉴定 2.你进行电泳鉴定的结果是几条条带？如果不止一条条带，请分析产生这个结果的可能原因？ 未出现扩增条带可能的原因有： ①TaqDNA聚合酶失活； ②引物出现质量问题； ③变性时温度低，变性时间短 ④Mg2+浓度过低 出现非特异性扩增带可能的原因有： ①引物特异性不强或容易聚合成二聚体 ②复性时的温度过低 ③DNA聚合酶的浓度过高 ④模板DNA出现污染 ⑤Mg2+浓度过高 Copyright © 2018 芃苇_PengV. All Rights Reserved. 　实战训练　 1.用PCR方法检测转基因植株是否成功导入目的基因时，得到以下电泳图谱，其中1号为DNA标准样液(Marker)，10号为蒸馏水。PCR时加入的模板DNA如图所示。据此做出分析不合理的是(　　) A.PCR产物的分子大小在250至500 bp之间 B.3号样品为不含目的基因的载体DNA C.9号样品对应植株不是所需的转基因植株 D.10号的电泳结果能确定反应体系等对实验结果没有干扰 Copyright © 2018 芃苇_PengV. All Rights Reserved. A.该 DNA 最可能是线状 DNA 分子 B.两种限制酶在该 DNA 上各有两个酶切位点 C.限制酶 R1与 R2的切点最短相距约 200 bp D.限制酶 R1与 R2的切点最长相距约 800 bp 　实战训练　 2.在基因工程操作过程中，科研人员利用识别两种不同序列的限制酶(R1和 R2)处理某 DNA，进行凝胶电泳检测，结果如图所示。以下相关叙述中，正确的是( ) Copyright © 2018 芃苇_PengV. All Rights Reserved. 课堂小结 （1）获取目的基因 人工合成 利用PCR 从基因文库 （2）构建基因表达载体 目的基因、启动子、终止子、标记基因 （3）将目的基因导入受体细胞 植物细胞、动物细胞、微生物细胞 （4）目的基因的检测与鉴定 检测：是否插入、转录、翻译 Copyright © 2018 芃苇_PengV. All Rights Reserved. 18 EVCapture4.1.9软件录制 Lavf57.25.100 本视频由湖南一唯信息科技开发的EV录屏软件录制，www.ieway.cn $$