3.1 重组 DNA 技术的基本工具 课件 2024—2025学年高二下学期生物人教版选择性必修3

第3章 人教版 选择性必修3 基因工程 1 什么是基因工程？基因工程有什么用？ BT蛋白基因 获 取 导 入 普通棉花 植株 抗虫棉花植株 苏云金杆菌 棉花 棉铃虫可以使棉花产量减少三分之一，严重时，甚至能使一片棉田绝收。大量施用农药杀虫不仅会提高生产成本，还可能造成农产品和环境的污染。 基因工程的概念（p67）： 是指按照人们的愿望，通过转基因等技术，赋予生物新的遗传特性，创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。从技术操作层面看，由于基因工程是在DNA分子水平上进行设计和施工的，因此又叫做DNA重组技术（转基因技术）。 操作对象 操作水平 别称 原理 基因 DNA分子水平 重组DNA技术、转基因技术 基因重组 优点： ①与杂交育种相比：能克服远缘杂交不亲和的障碍； ②与诱变育种相比：定向改造生物的遗传特性。 基因工程的基本操作程序 二/ 重组 DNA 技术的基本工具 一/ 目录 CONTENTS 基因工程的应用 三/ 蛋白质工程的原理和应用 四/ 第3章 第1节 人教版 选择性必修3 6 抗虫棉 Bt抗虫蛋白 苏云金杆菌 取出 转移 怎么实现这一操作过程？ 首先要在体外对含有所需要基因的DNA分子进行“切割”、改造和“拼接”；然后，将重组DNA分子导入体细胞内，并使其在细胞中表达。 问题:不同生物的基因为什么能拼接？为什么一种生物的基因可以在另一种生物细胞内表达? 1.基因是什么？ 2.基因的功能是什么？ 直接或间接控制生物的性状。 转录 DNA mRNA 蛋白质 翻译 ——体现相关的生物性状 知识回顾——基因 基因通常是有遗传效应的DNA片段。 8 板书画图 基因是有遗传效应的DNA片段。 ①DNA中文全称:　　　　　　　 ②组成元素:　　　　　　　　 ③基本单位:　　　　　　　　　 脱氧核糖核酸 C H O N P 脱氧核糖核苷酸 = 磷酸 + 脱氧核糖 + 含氮碱基 脱氧 核糖 含氮碱基 磷酸 1′ 4′ 3′ 2′ 5′ A T C G 脱氧核苷酸 (4种) 知识回顾——DNA 胞嘧啶脱氧核苷酸 鸟嘌呤脱氧核苷酸 胸腺嘧啶脱氧核苷酸 腺嘌呤脱氧核苷酸 脱氧 核糖 A 磷酸 脱氧 核糖 G 磷酸 脱氧 核糖 T 磷酸 T 磷酸 脱氧 核糖 C 磷酸 脱氧 核糖 A 磷酸 脱氧 核糖 脱氧核苷酸如何连接成脱氧核苷酸链的呢？ 知识回顾——DNA 氢键 磷酸二酯键 DNA的结构特点： 5’ 3’ 3’ 5’ 知识回顾——DNA ② 和 交替连接，排列在外侧，构成 ； 排列在内侧。 ③两条链上的碱基通过 连接成碱基对，且遵循 。 ①DNA是由两条单链组成的，这两条链 按 方式盘旋成双螺旋结构。 反向平行 脱氧核糖 磷酸 碱基 基本骨架 氢键 碱基互补配对原则 基因工程的理论基础 1.为什么不同生物的DNA分子能拼接起来？ （1）DNA的基本组成单位都是 。 （2）双链DNA分子的空间结构都是 。 （3）都遵循 原则 2.为什么一种生物的基因可以在另一种生物细胞内表达？ （1） 是控制生物性状的独立遗传单位。 （2）遗传信息的传递和表达都遵循 。 （3）生物界共用一套 。 四种脱氧核苷酸 规则的双螺旋结构 基因 中心法则 遗传密码 DNA（基因） 转录 翻译 mRNA 蛋白质 碱基互补配对 拼接的基础 表达的基础 苏-基因1 苏-基因2 苏-基因3 苏-基因4 Bt基因 苏云金杆菌DNA片段中的部分基因 棉-基因1 棉-基因2 棉-基因3 棉-基因4 棉花细胞DNA片段中的部分基因 你觉得要把Bt基因导入棉花细胞应该怎么操作？ 苏-基因1 苏-基因2 苏-基因3 苏-基因4 Bt基因 苏云金杆菌DNA片段中的部分基因 棉-基因1 棉-基因2 棉-基因3 棉-基因4 棉花细胞DNA片段中的部分基因 你觉得要把Bt基因导入棉花细胞应该怎么操作？ 苏-基因1 苏-基因2 苏-基因3 苏-基因4 Bt基因 苏云金杆菌DNA片段中的部分基因 棉-基因1 棉-基因2 棉-基因3 棉-基因4 棉花细胞DNA片段中的部分基因 你觉得要把Bt基因导入棉花细胞应该怎么操作？ 苏-基因1 苏-基因2 苏-基因3 苏-基因4 Bt基因 苏云金杆菌DNA片段中的部分基因 棉-基因1 棉-基因2 棉-基因3 棉-基因4 棉花细胞DNA片段中的部分基因 你觉得要把Bt基因导入棉花细胞应该怎么操作？ 苏-基因1 苏-基因2 苏-基因3 苏-基因4 Bt基因 苏云金杆菌DNA片段中的部分基因 棉-基因1 棉-基因2 棉-基因3 棉-基因4 棉花细胞DNA片段中的部分基因 你觉得要把Bt基因导入棉花细胞应该怎么操作？ “分子手术刀” “分子缝合针” 抗虫棉 Bt抗虫蛋白 苏云金杆菌 取出？ 转移？ 剪下来的bt抗虫基因能否直接把它导入到棉花体内？ 不可行;因为目的基因直接导入受体细胞后无法稳定存在和进行自我复制以及表达。 “分子运输车” 实现这一精确的操作过程至少需要三种“分子工具”，即 准确切割DNA分子的“分子手术刀”、 将DNA片段再连接起来的“分子缝合针”和 将体外重组好的DNA分子导入受体细胞的“分子运输车”。 “分子缝合针” “分子运输车” “分子手术刀” 总结： 01 限制性内切核酸酶 — “分子手术刀” （1）限制酶的来源？种类？特点？识别序列长度？切割结果？ （4）为什么限制酶不切割细菌本身的DNA分子？ 合作探究一：请同学们自主阅读教材P70-71，小组合作思考讨论完成问题。 （3）推测限制酶存在于原核生物中的主要作用是什么？ （2）某个特定性状的基因必须要用限制酶切几个切口？几个末端？ 一 限制性内切核酸酶 — “分子手术刀” 20 限制酶不是一种酶，而是一类酶 例如：EcoRⅠ酶、SmaⅠ酶 (迄今分离的限制酶有数千种，许多已经被商业化生产)。 一 限制性内切核酸酶 — “分子手术刀” 苏-基因1 苏-基因2 苏-基因3 苏-基因4 Bt基因 苏云金杆菌DNA片段中的部分基因 限制性内切核酸酶 （限制酶） 主要是从原核生物（细菌等）中分离纯化出来的 21 一 限制性内切核酸酶 — “分子手术刀” EcoRⅠ Escherichia coli 属名 种名 属名的头一个字母 （大写） 种加词的头两个字母 （小写） 大肠杆菌的R型菌株分离来的 R型菌株中分离出来的第一种限制酶 一 限制性内切核酸酶 — “分子手术刀” 流感嗜血杆菌的d菌株( Haemophilus influenzae d )中先后分离到3种限制酶，则分别命名为:___________________________________。 HindⅠ、HindⅡ、 HindⅢ 练习：粘质沙雷氏杆菌（Serratia marcesens）中分离的第一种限制酶即_______； SmaⅠ 23 (迄今分离的限制酶有数千种，许多已经被商业化生产)。 一 限制性内切核酸酶 — “分子手术刀” 苏-基因1 苏-基因2 苏-基因3 苏-基因4 Bt基因 苏云金杆菌DNA片段中的部分基因 限制性内切核酸酶 （限制酶） 主要是从原核生物（细菌等）中分离纯化出来的 24 一 限制性内切核酸酶 — “分子手术刀” 苏-基因1 苏-基因2 苏-基因3 苏-基因4 Bt基因 苏云金杆菌DNA片段中的部分基因 限制性内切核酸酶 （限制酶） 主要是从原核生物（细菌等）中分离纯化出来的 你知道限制酶是如何精确切割的吗？ 25 一 限制性内切核酸酶 — “分子手术刀” 限制性内切核酸酶 （限制酶） 你知道限制酶是如何精确切割的吗？ 识别：能够识别双链DNA分子的特定核苷酸序列， 切割：并且使每一条链中特定部位的磷酸二酯键断开。 还记得磷酸二酯键在哪吗 “两个特定” 26 T T A A C G C G 1’ 2’ 3’ 4’ 5’ O 1’ 2’ 3’ 4’ 5’ O 5’ 3’ 3’ 5’ 磷酸二酯键 限制酶切割 磷酸二酯键 27 T T A A C G C G 1’ 2’ 3’ 4’ 5’ O 1’ 2’ 3’ 4’ 5’ O 5’ 3’ 3’ 5’ 磷酸二酯键 限制酶切割磷酸二酯键 28 T T A A C G C G 1’ 2’ 3’ 4’ 5’ O 1’ 2’ 3’ 4’ 5’ O 5’ 3’ 3’ 5’ 磷酸二酯键 具体结构 限制酶切割磷酸二酯键 限制酶切割磷酸二酯键 脱氧核糖和磷酸交替连接构成的基本骨架是一样的 简化 磷酸二酯键 T A T A C G C G 5’ 3’ 3’ 5’ 29 T T A A C G C G 1’ 2’ 3’ 4’ 5’ O 1’ 2’ 3’ 4’ 5’ O 5’ 3’ 3’ 5’ 磷酸二酯键 脱氧核糖和磷酸交替连接构成的基本骨架是一样的 简化 磷酸二酯键 简化 — AGTC— — TCAG — 5’ 3’ 3’ 5’ 磷酸二酯键 30 一 限制性内切核酸酶 — “分子手术刀” 限制性内切核酸酶 （限制酶） 你知道限制酶是如何精确切割的吗？ 识别：能够识别双链DNA分子的特定核苷酸序列， 切割：并且使每一条链中特定部位的磷酸二酯键断开。 “两个特定” 31 一 限制性内切核酸酶 — “分子手术刀” 识别序列： 大多数限制酶的识别序列由6个核苷酸组成； 也有少数限制酶的识别序列由4个、8个或其他数量的核苷酸组成。 特点1：都可以找到一条中（心）轴线； 特点2：中轴线两侧的双链DNA上的碱基是反向对称重复排列的 ，称为回文序列。 （正向读与另一条链反向读的碱基顺序完全一致） 中轴线 5' 5' 3' 3' EcoRⅠ 限制酶 中轴线 5' 5' 3' 3' SmaⅠ 限制酶 5’ 3’ 5’ 3’ 一 限制性内切核酸酶 — “分子手术刀” 例如，EcoRⅠ限制酶的识别序列为 从5’→3’方向的识别序列均为GAATTC，并切断G和A之间的磷酸二酯键 你知道限制酶是如何精确切割的吗？ 能够识别双链DNA分子的特定核苷酸序列， 并且使每一条链中特定部位的磷酸二酯键断开。 第一步 第二步 中轴线 5’ 3’ 5’ 3’ 一 限制性内切核酸酶 — “分子手术刀” 例如，EcoRⅠ限制酶的识别序列为 从5’→3’方向的识别序列均为GAATTC，并切断G和A之间的磷酸二酯键 你知道限制酶是如何精确切割的吗？ 能够识别双链DNA分子的特定核苷酸序列， 并且使每一条链中特定部位的磷酸二酯键断开。 第一步 第二步 3’ 5’ 5’ 3’ 黏性末端 黏性末端 当限制酶在它识别序列的中心轴线两侧将DNA分子的两条链分别切开时，产生的是黏性末端； 注意：限制酶切割磷酸二酯键后氢键会自动断裂！ 5’ 3’ 5’ 3’ 一 限制性内切核酸酶 — “分子手术刀” 例如，SmaⅠ限制酶的识别序列为 从5’→3’方向的识别序列均为CCCGGG，并切断C和G之间的磷酸二酯键 中轴线 5’ 3’ 5’ 3’ 一 限制性内切核酸酶 — “分子手术刀” 例如，SmaⅠ限制酶的识别序列为 从5’→3’方向的识别序列均为CCCGGG，并切断C和G之间的磷酸二酯键 平末端 当限制酶在它识别序列的中心轴线处切开时，产生的是平末端。 3’ 5’ 5’ 3’ 一 限制性内切核酸酶 — “分子手术刀” 现学现用：写出下列限制酶切割形成的黏性末端 BamHⅠ________ EcoRⅠ________ HindⅢ________ BglⅡ ________ -G -CCTAG -G -CTTAA -A -TTGGA -A -TCTAG *思考：不同种限制酶切出的黏性末端一定不同吗？ 不同的限制酶也可能切割形成相同的黏性末端（同尾酶）。 同种限制酶产生的黏性末端相同， B 下列黏性末端最可能由同种限制酶切割而成的是( ) ① ② ③ 　　　 　④ 　　　　　　　　　　　　　　　　　　 A.①② B.①③ C.①④ D.②③ 同种限制酶产生的黏性末端相同 38 【P71旁栏思考题】限制酶存在于原核生物中的作用是什么吗？ 原核生物易受自然界外源DNA的入侵，但生物在长期的进化过程中形成了一套完善的防御机制，以防止外来病原物的侵害。限制酶就是细菌的一种防御性工具，当外源DNA侵入时，会利用限制酶将外源DNA切割掉，以保证自身的安全。所以，限制酶在原核生物中主要起到切割外源DNA、起防御作用。 原核细胞DNA中不存在限制酶的识别序列或能被识别的序列被修饰了。 【P74拓展应用1】为什么限制酶不切割细菌本身的DNA分子？ 尾部 头部 DNA 蛋白质 39 1、别称： 2、来源： 【总结】限制性内切核酸酶 ——“分子手术刀” 主要来自原核生物 限制酶 3、种类： 数千种 4、化学本质 : 蛋白质 5、作用 : （1）识别：能够识别双链DNA分子的特定核苷酸序列； （2）切割：使每一条链中特定部位的磷酸二酯键断开。 （1）大多数限制酶识别序列由6个核苷酸组成，例如EcoRⅠ、SmaⅠ， （2）少数由4个、8个或其他数量的核苷酸组成。 6、识别序列： 7、结果： （1）不同酶可能会产生相同的黏性末端。 （1）当限制酶在它识别序列的中心轴线两侧将DNA的两条链分别切开时， 产生的是黏性末端； （2）当限制酶在它识别序列的中心轴线处切开时，产生的则是平末端。 8、特点： （2）同种限制酶切割的黏性末端一定相同。 如：同尾酶 一 限制性内切核酸酶 — “分子手术刀” 限制酶切割特定核苷酸序列的特定部位的磷酸二酯键怎么应用呢？ --ATGCATGCAT……CCAGAATTCCCA ……TCCCTAAGAATTC CCATCCCAGATG …… CATGCATCCATGC--- --TACGTACGTA……GGTCTTAAGGGT……AGGGATTCTTAAGGGTAGGGTCTAC …… GTACGTAGGTACG--- 苏-基因2 Bt基因 苏云金杆菌DNA片段中的部分基因 3’ 5’ 5’ 3’ 用EcoRⅠ限制酶切割该DNA片段 一 限制性内切核酸酶 — “分子手术刀” 限制酶切割特定核苷酸序列的特定部位的磷酸二酯键怎么应用呢？ --ATGCATGCAT……CCAGAATTCCCA ……TCCCTAAGAATTC CCATCCCAGATG …… CATGCATCCATGC--- --TACGTACGTA……GGTCTTAAGGGT……AGGGATTCTTAAGGGTAGGGTCTAC …… GTACGTAGGTACG--- 苏-基因2 Bt基因 苏云金杆菌DNA片段中的部分基因 3’ 5’ 5’ 3’ 一 限制性内切核酸酶 — “分子手术刀” 苏-基因2 Bt基因 苏云金杆菌DNA片段中的部分基因 3’ 5’ 5’ 3’ 一 限制性内切核酸酶 — “分子手术刀” 苏-基因2 Bt基因 苏云金杆菌DNA片段中的部分基因 3’ 5’ 5’ 3’ 5’ 3’ 3’ 5’ 3’ 5’ 5’ 3’ 目的基因切割下来后怎么把它重新连起来呢？ 02 DNA连接酶 — “分子缝合针” 二 DNA连接酶 — “分子缝合针” 苏-基因2 Bt基因 5’ 3’ 3’ 5’ 目的基因切割下来后怎么把它重新连起来呢？ 某DNA片段 5’ 3’ 3’ 5’ 某DNA片段 …… TCCCTAAGGAATTCCATCCCAGATG……CATGCA……CCACATG …… …… AGGGATTCCTTAAGGTAGGGTCTAC……GTACGT……GGTGTAC …… 5’ 3’ 3’ 5’ 你知道如何将Bt基因插入下面DNA片段中吗？ 用EcoRⅠ限制酶切割该DNA片段 二 DNA连接酶 — “分子缝合针” 苏-基因2 Bt基因 5’ 3’ 3’ 5’ 某DNA片段 5’ 3’ 3’ 5’ 你知道如何将Bt基因插入下面DNA片段中吗？ 用EcoRⅠ限制酶切割该DNA片段 如何将他们连接起来呢？ 它们具有相同的黏性末端! 5’ 3’ 3’ 5’ 二 DNA连接酶 — “分子缝合针” 苏-基因2 Bt基因 5’ 3’ 3’ 5’ 用EcoRⅠ限制酶切割该DNA片段 如何将他们连接起来呢？ DNA连接酶 — “分子缝合针” 它们具有相同的黏性末端! 恢复被限制酶切开的磷酸二酯键 完全互补的黏性末端能通过氢键暂时连接在一起，但并不稳定。 二 DNA连接酶 — “分子缝合针” 苏-基因2 Bt基因 5’ 3’ 3’ 5’ 用EcoRⅠ限制酶切割该DNA片段 如何将他们连接起来呢？ DNA连接酶 — “分子缝合针” 它们具有相同的黏性末端! 恢复被限制酶切开的磷酸二酯键 完全互补的黏性末端能通过氢键暂时连接在一起，但并不稳定。 二 DNA连接酶 — “分子缝合针” 苏-基因2 Bt基因 5’ 3’ 3’ 5’ 用EcoRⅠ限制酶切割该DNA片段 如何将他们连接起来呢？ DNA连接酶 — “分子缝合针” 它们具有相同的黏性末端! 恢复被限制酶切开的磷酸二酯键 磷酸二酯键形成 完全互补的黏性末端能通过氢键暂时连接在一起，但并不稳定。 而要形成重组DNA分子，还必须使基本骨架之间通过磷酸二酯键 “ 缝 ” 上，就像断成两截的梯子，不仅要把中间的踏板连接起来，还要把两边的扶手连接在一起一样 。 DNA连接酶: 一种能够将两个DNA片段连接起来的酶 片段1 片段2 片段3 50 二 DNA连接酶 — “分子缝合针” 5’ 3’ 3’ 5’ DNA连接酶: 一种能够将两个DNA片段连接起来的酶 片段1 片段2 片段3 DNA连接酶 不是连接氢键（氢键的形成不需要酶的催化） ①作用部位 ②作用底物 磷酸二酯键 DNA片段 51 二 DNA连接酶 — “分子缝合针” 5’ 3’ 3’ 5’ DNA连接酶: 一种能够将两个DNA片段连接起来的酶 片段1 片段2 片段3 DNA连接酶 DNA连接酶种类 E·coli DNA连接酶 T4 DNA连接酶 52 二 DNA连接酶 — “分子缝合针” 5’ 3’ 3’ 5’ DNA连接酶: 一种能够将两个DNA片段连接起来的酶 片段1 片段2 片段3 将片段1与片段2连接 将片段2与片段3连接 DNA连接酶 DNA连接酶种类 E·coli DNA连接酶 T4 DNA连接酶 从大肠杆菌（Escherichia coli） 中分离得到的 从T4噬菌体中分离出来的 两种都可以“缝合” 但E·coli DNA连接酶连接平末端的效率远远低于T4 DNA连接酶 53 二 DNA连接酶 — “分子缝合针” 两个DNA片段要具有互补（相同的）黏性末端才能连接起来。 把两个DNA片段黏性末端间的缝隙“缝合”起来：， 二 DNA连接酶 — “分子缝合针” 把两个DNA片段平末端间的缝隙“缝合”起来：， 二 DNA连接酶 — “分子缝合针” 二 DNA连接酶 — “分子缝合针” DNA连接酶: 一种能够将两个DNA片段连接起来的酶 DNA聚合酶: 将单个核苷酸连接到已有的DNA片段上 二 DNA连接酶 — “分子缝合针” DNA连接酶 DNA聚合酶 相同 作用实质 化学本质 不 同 点 模板 作用对象 作用结果 用途 都能催化形成磷酸二酯键 都是蛋白质 不需要 需要DNA的一条链作模板 形成完整的重组DNA分子 形成DNA的一条链 基因工程 DNA复制 在两个DNA片段间形成磷酸二酯键 将单个核苷酸连接到已有DNA片段，形成磷酸二酯键 二 DNA连接酶 — “分子缝合针” 拓展：与DNA相关的几种酶的比较 名称 作用部位 作用结果 限制酶 DNA连接酶 DNA聚合酶 DNA(水解)酶 DNA解旋酶 磷酸二酯键 碱基对之间的氢键 将DNA切成两个片段 磷酸二酯键 将两个DNA片段连接为一个DNA分子 磷酸二酯键 将单个脱氧核苷酸依次连接到单链末端 磷酸二酯键 将DNA片段水解为单个脱氧核苷酸 将双链DNA分子局部解旋为单链 二 DNA连接酶 — “分子缝合针” (1)通过基因工程产生的变异是不定向的(　　) (2) 限制性内切核酸酶均能特异性地识别6个核苷酸序列( ) (3) DNA连接酶能将两碱基间通过氢键连接起来( ) (4) E.coli DNA连接酶既可连接平末端，又可连接黏性末端( ) (5) 限制酶和解旋酶的作用部位相同( ) × × √ × × 二 DNA连接酶 — “分子缝合针” 2.根据所学知识，完成以下填空： ①限制酶 ②解旋酶 ③DNA连接酶 ④DNA聚合酶 ⑤RNA聚合酶 b a A.切断a处的酶为_______ B.连接a处的酶为_______ C.切断b处的酶为_______ ① ③④ ② a： b： 磷酸二酯键 氢键 03 基因进入受体细胞的载体 — “分子运输车” 三 基因进入受体细胞的载体 — “分子运输车” 1.载体的作用是什么？ 2.有哪些种类？ 3.常用的载体是哪种？其有什么特征？ 4.作为载体应具备什么条件？ ①载体能与外源基因连接需具备什么条件？ ②载体要使携带的外源基因在受体细胞中稳定存在需具备什么条件？ ③我们用肉眼看不到载体是否进入受体细胞，为了便于筛选重组DNA分子，载体需要具备什么条件？ 阅读教材P73，回答下列问题： 三 基因进入受体细胞的载体 — “分子运输车” 怎样才能将外源基因送入细胞呢？ 通常是利用质粒作为载体，将基因送入细胞。 为什么不能直接将外源基因送入细胞呢？ 游离的DNA片段进入受体细胞，一般会直接被分解，就算可以进行转录并翻译成蛋白质、游离的DNA片段也无法随着细胞分裂而进行复制，导致子代细胞中不再含有目的基因。 若将目的基因插入载体，由于载体可以在细胞内复制，随着细胞分裂，载体会带着目的基因存在于每个子代细胞中。这样，基因工程才有意义。 三 基因进入受体细胞的载体 — “分子运输车” 怎样才能将外源基因送入细胞呢？通常是利用质粒作为载体，将基因送入细胞。 为什么不能直接将外源基因送入细胞呢？ 游离的DNA片段进入受体细胞，一般会直接被分解，就算可以进行转录并翻译成蛋白质、游离的DNA片段也无法随着细胞分裂而进行复制，导致子代细胞中不再含有目的基因。若将目的基因插入载体，由于载体可以在细胞内复制，随着细胞分裂，载体会带着目的基因存在于每个子代细胞中。这样，基因工程才有意义。 什么是质粒？ 大肠杆菌细胞 拟核 DNA 质粒 通常是大型环状DNA携带着细菌的遗传信息，它的功能是决定遗传性状和传递遗传信息，是重要的遗传物质。 三 基因进入受体细胞的载体 — “分子运输车” 什么是质粒？ 大肠杆菌细胞 拟核 DNA 质粒 通常是大型环状DNA携带着细菌的遗传信息，它的功能是决定遗传性状和传递遗传信息，是重要的遗传物质。 质粒是一种裸露的、结构简单、独立于真核细胞（如酵母菌等）细胞核或原核细胞（如细菌等）拟核DNA之外，并具有自我复制能力的环状双链DNA分子。 细菌中的拟核DNA与质粒DNA有什么差异和联系呢？ 复制原点 三 基因进入受体细胞的载体 — “分子运输车” 什么是质粒？ 大肠杆菌细胞 拟核 DNA 质粒 质粒是一种裸露的、结构简单、独立于真核细胞（如酵母菌等）细胞核或原核细胞（如细菌等）拟核DNA之外，并具有自我复制能力的环状双链DNA分子。 细菌中的拟核DNA与质粒DNA有什么差异和联系呢？ 复制原点 (2)作用不同： 拟核DNA是细菌的主要遗传物质，包含细菌生命活动的遗传信息，没有了它细菌就无法存活、繁殖；质粒DNA是附加的遗传物质，使生物表达一些特殊的性状，如耐药性、特定物质的降解能力等，如果没有了质粒细菌依然可以正常生活、繁殖。 (1)分子量不同： 拟核DNA分子量较大：质粒DNA分子量较小。如大肠杆菌细胞内的质粒仅为拟核DNA分子的1%-2%。 三 基因进入受体细胞的载体 — “分子运输车” 什么是质粒？ 大肠杆菌细胞 拟核 DNA 质粒 质粒是一种裸露的、结构简单、独立于真核细胞（如酵母菌等）细胞核或原核细胞（如细菌等）拟核DNA之外，并具有自我复制能力的环状双链DNA分子。 细菌中的拟核DNA与质粒DNA有什么差异和联系呢？ 复制原点 氨苄青霉素抗性基因 （四环素抗性基因等） 便于重组DNA分子的筛选 三 基因进入受体细胞的载体 — “分子运输车” 【核心探讨】标记基因的筛选原理 载体上的标记基因一般是某种抗生素的抗性基因，而受体细胞没有抵抗该抗生素的能力。将含有某抗生素抗性基因的载体导入受体细胞，抗性基因在受体细胞内表达，受体细胞对该抗生素产生抗性。在含有该抗生素的培养基上，能够生存的是被导入了载体的受体细胞。 导入 受体细胞 培养 加入氨苄青霉素 只有含有载体，并且载体上的抗性基因表达的大肠杆菌才能存活并增殖 含有氨苄青霉素抗性基因载体（如质粒） 标记基因通常有: ①抗生素的抗性基因，如: 抗氨苄青霉素基因(ampr)、抗四环素基因(tetr) ②荧光蛋白基因，如: 绿色荧光蛋白基因(GFP)、红色荧光蛋白基因(RFP) 三 基因进入受体细胞的载体 — “分子运输车” 什么是质粒？ 大肠杆菌细胞 拟核 DNA 质粒 质粒是一种裸露的、结构简单、独立于真核细胞（如酵母菌等）细胞核或原核细胞（如细菌等）拟核DNA之外，并具有自我复制能力的环状双链DNA分子。 细菌中的拟核DNA与质粒DNA有什么差异和联系呢？ 复制原点 氨苄青霉素抗性基因 （四环素抗性基因等） 便于重组DNA分子的筛选 你能总结作为载体需具备的条件吗？ 外源DNA（基因）要能插入质粒，质粒还需要满足什么条件？ 目的基因插入位点 （限制酶切割位点） 一个至多个 三 基因进入受体细胞的载体 — “分子运输车” 什么是质粒？ 大肠杆菌细胞 拟核 DNA 质粒 质粒是一种裸露的、结构简单、独立于真核细胞（如酵母菌等）细胞核或原核细胞（如细菌等）拟核DNA之外，并具有自我复制能力的环状双链DNA分子。 细菌中的拟核DNA与质粒DNA有什么差异和联系呢？ 复制原点 氨苄青霉素抗性基因 （四环素抗性基因等） 便于重组DNA分子的筛选 外源DNA（基因）要能插入质粒，质粒还需要满足什么条件？ 目的基因插入位点 （限制酶切割位点） 一个至多个 你能总结作为载体需具备的条件吗？ （1）有一个至多个限制酶切割位点，供外源DNA片段（基因）插入其中。 （2）能在细胞中进行自我复制或整合到受体DNA上，随受体DNA同步复制。 （3）常有特殊的标记基因，便于重组DNA分子的筛选。如四环素抗性基因、氨苄青霉素抗性基因、产物具有颜色反应的基因等。 （4）易分离，对受体细胞无害。 在基因工程操作中，天然的载体很难满足上述全部要求，真正被用作载体的质粒，都是在天然质粒的基础上进行过人工改造的。 载体都是质粒吗？ 三 基因进入受体细胞的载体 — “分子运输车” 若用家蚕作为某基因表达载体的受体细胞，在噬菌体和昆虫病毒两种载体中，不选用 作为载体，其原因是 。 噬菌体 噬菌体的宿主细胞是细菌， 而不是家蚕 种类 用途 不同点 质粒、噬菌体 植物病毒 动物病毒 将外源基因导入大肠杆菌等受体细胞 将外源基因导入植物细胞 将外源基因导入动物细胞 它们来源不同，在大小、结构、复制方式以及可以插入外源DNA片段的大小也有很大差别 “分子缝合针” “分子运输车” “分子手术刀” 三 基因进入受体细胞的载体 — “分子运输车” 实现这一精确的操作过程至少需要三种“分子工具”，即 准确切割DNA分子的“分子手术刀” 将DNA片段再连接起来的“分子缝合针” 将体外重组好的DNA分子导入受体细胞的“分子运输车” 总结： 限制酶 DNA连接酶 载体 课堂活动 ——体验用限制酶切割和DNA连接酶连接及可能出现的结果 第一步：按上图所示剪好两个大小相同的纸条并写上碱基序列 第二步：用EcoRⅠ酶切割这个DNA片段，展示结果 注：DNA连接酶无特异性，符合要求的DNA片段都能连接！ 课堂活动 ——体验用限制酶切割和DNA连接酶连接及可能出现的结果 哪些片段可以被DNA连接酶连接？ 环化DNA片段是怎样的？ 怎么避免该问题？ 展示再用SpeⅠ限制酶切割后的片段 现在还会不会出现自身环化和反向连接等问题？ 二 DNA连接酶 — “分子缝合针” 怎么解决这个问题？ ②质粒自身环化 ①目的基因自身环化 ③目的基因与质粒连接 正向连接 反向连接 单酶切可能出现的结果： 双酶切 三 基因进入受体细胞的载体 — “分子运输车” 限制酶的选择原则 (1)选择限制酶应遵循不破坏目的基因的原则； (2)选择限制酶应遵循保留质粒标记基因； (3)选择限制酶应遵循确保出现相同黏性末端原则； (4)为避免目的基因、质粒自身环化和反向连接，也可使用两种不同的限制酶（双酶切）分别切割含目的基因的DNA片段和质粒。 三 基因进入受体细胞的载体 — “分子运输车” (1) 作为载体的质粒通常采用抗生素合成基因作为筛选基因( ) (2) 质粒是环状双链DNA分子，是基因工程常用的载体( ) (3) 载体（如质粒）和细胞膜中的载体蛋白的成分相同( ) (4) 作为载体必须要有标记基因( ) × √ × √ 三 基因进入受体细胞的载体 — “分子运输车” 图甲是含有目的基因的外源DNA片段，图乙是用于将目的基因导入受体细胞的质粒（阴影部分表示抗生素抗性基因），相关限制酶的作用部位如图所示，现欲培养转基因抗病植株，回答下列问题。 1. 上述操作中不宜选用Sma I，原因是Sma I会破坏 和 。 2. 在基因工程的操作中，不宜选用EcoR I，原因是用EcoR I切割外源DNA片段后， 。 目的基因 抗性基因 目的基因只有一侧含有黏性末端，不能插入到质粒中 三 基因进入受体细胞的载体 — “分子运输车” 下列操作中选用哪种限制酶切割来构建重组质粒？ ①构建重组质粒，不能使用SmaⅠ切割，原因是 。 ②图2不选用EcoRⅠ切割，原因是 。 SmaⅠ会破坏破坏目的基因 防止目的基因自身环化 三 基因进入受体细胞的载体 — “分子运输车” 下列操作中选用哪种限制酶切割构建重组DNA分子？（注：AmpR表示氨苄青霉素抗性基因，neo表示新霉素抗性基因） Hind Ⅲ和Pst Ⅰ 三 基因进入受体细胞的载体 — “分子运输车” 例、下图表示四种质粒，其中箭头所指部位为限制酶的识别位点，质粒的阴影部分表示标记基因。适合作为载体的质粒是哪一种？说明理由。 答案：适合作为载体的质粒是①。 质粒②上无标记基因，不适合作为载体；质粒③和④的标记基因上都有限制酶的识别位点，使用该酶后将会破坏标记基因，故均不宜选作载体。 三 基因进入受体细胞的载体 — “分子运输车” 1. 获取目的基因和切割载体时, 通常使用同种限制酶，目的是： 。 但是使用该法缺点是容易发生 ， 为了避免上述情况发生，可采取的措施是： 。 为了产生相同的黏性末端，便于目的基因与载体连接 分别使用两种限制酶去切割目的基因和载体 目的基因、载体的自身环化以及目的基因与载体反向连接 学习了如何对DNA进行操作，大家想不想见一见我们的主角——DNA? 四 DNA 的粗提取与鉴定 四 DNA 的粗提取与鉴定 （一）实验原理 1.DNA不溶于酒精，但是细胞中的某些蛋白质溶于酒精，利用这一原理，可以初步分离DNA和蛋白质。 2.DNA在不同浓度的NaCl溶液中的溶解度不同，它能溶于2mol/L的NaCl溶液。 3.在沸水浴的条件下，DNA遇二苯胺试剂会呈现蓝色，因此二苯胺试剂可作为鉴定DNA的试剂。 （提取原理） （提取原理） （鉴定原理） DNA + 二苯胺 沸水浴 蓝色 四 DNA 的粗提取与鉴定 （一）实验原理 1.DNA不溶于酒精，但是细胞中的某些蛋白质溶于酒精，利用这一原理，可以初步分离DNA和蛋白质。 2.DNA在不同浓度的NaCl溶液中的溶解度不同，它能溶于2mol/L的NaCl溶液。 3.在沸水浴的条件下，DNA遇二苯胺试剂会呈现蓝色，因此二苯胺试剂可作为鉴定DNA的试剂。 （二）目的要求 1.了解DNA的物理和化学性质，理解DNA粗提取和鉴定的原理。 2.学会DNA粗提取的方法以及用二苯胺试剂对DNA进行鉴定。 （三）材料用具 四 DNA 的粗提取与鉴定 （三）材料用具 不同生物的组织中DNA含量不同。在选取材料时，应本着DNA含量高、材料易得、便于提取的原则。 新鲜洋葱（也可以选择香蕉、菠菜、菜花或猪肝等作为实验材料，提取DNA的方法可能稍有不同） 如果用鸡血动物细胞做材料，也需要研磨裂解释放细胞中的DNA吗？ 用洋葱做材料，为什么要充分研磨？ 充分研磨，可以破坏细胞壁，裂解细胞，释放DNA。 猪血和鸡血，哪个适合用作提取DNA的材料？操作时如何防止血液凝固？ 猪血（哺乳动物的成熟红细胞）无细胞核，不适合； 鸡血中红细胞有核DNA，且核DNA的量较多，适合。 鸡血中加入柠檬酸钠，可防止血液凝固。 四 DNA 的粗提取与鉴定 （三）材料用具 不同生物的组织中DNA含量不同。在选取材料时，应本着DNA含量高、材料易得、便于提取的原则。 新鲜洋葱（也可以选择香蕉、菠菜、菜花或猪肝等作为实验材料，提取DNA的方法可能稍有不同） 用洋葱做材料，为什么要充分研磨？ 充分研磨，可以破坏细胞壁，裂解细胞，释放DNA。 猪血和鸡血，哪个适合用作提取DNA的材料？操作时如何防止血液凝固？ 猪血（哺乳动物的成熟红细胞）无细胞核，不适合； 鸡血中红细胞有核DNA，且核DNA的量较多，适合。 鸡血中加入柠檬酸钠，可防止血液凝固。 如果用鸡血动物细胞做材料，也需要研磨裂解释放细胞中的DNA吗？ 加入清水，让细胞吸水胀破，释放DNA。 四 DNA 的粗提取与鉴定 （四）实验步骤 取材、研磨 过滤 分离 鉴定 结果观察 四 DNA 的粗提取与鉴定 （四）实验步骤 取材、研磨 过滤 分离 鉴定 结果观察 称取30g洋葱，切碎，然后放入研钵中，倒入10mL 研磨液，充分研磨。 SDS（十二烷基疏酸钠） 可使蛋白质变性与DNA分离 EDTA（乙二胺四乙酸） DNA酶抑制剂，可防止细胞破碎后DNA酶降解DNA Tris（三羟甲基氨基甲烷） 提供缓冲体系，使DNA在缓冲体系中呈稳定状态 研磨液 P117 四 DNA 的粗提取与鉴定 （四）实验步骤 取材、研磨 过滤 分离 鉴定 结果观察 (1)研磨的目的 破碎细胞，使核物质容易溶解在研磨液中 (2)研磨时间不宜太长 防止研磨时产生的热量影响DNA的提取量 (3)有条件的可以在材料处理的过程中加入纤维素酶、果胶酶 研磨效果好（有利于充分研磨） (4)研磨不宜太用力 四 DNA 的粗提取与鉴定 （四）实验步骤 取材、研磨 过滤 分离 鉴定 结果观察 (1)研磨的目的 破碎细胞，使核物质容易溶解在研磨液中 (2)研磨时间不宜太长 防止研磨时产生的热量影响DNA的提取量 (3)有条件的可以在材料处理的过程中加入纤维素酶、果胶酶 研磨效果好（有利于充分研磨） (4)研磨不宜太用力 在漏斗中垫上纱布，将洋葱研磨液过滤到烧杯中，在4℃冰箱中放置几分钟后，再取上清液。也可直接将研磨液倒入塑料离心管中，1500r/min的转速下离心5min，再取上清液放入烧杯中。 四 DNA 的粗提取与鉴定 （四）实验步骤 取材、研磨 过滤 分离 鉴定 结果观察 (1)研磨的目的 破碎细胞，使核物质容易溶解在研磨液中 (2)研磨时间不宜太长 防止研磨时产生的热量影响DNA的提取量 (3)有条件的可以在材料处理的过程中加入纤维素酶、果胶酶 研磨效果好（有利于充分研磨） (4)研磨不宜太用力 ①上清液中除DNA之外，可能含有哪些杂质？ 可能含有核蛋白、多糖等杂质 ②低温放置几分钟的作用 可抑制核酸水解酶的活性，进而抑制DNA降解； 抑制DNA分子运动，使DNA易形成沉淀析出； 低温有利于增加DNA的柔韧性，减少其断裂； 四 DNA 的粗提取与鉴定 （四）实验步骤 取材、研磨 过滤 分离 鉴定 结果观察 (1)研磨的目的 破碎细胞，使核物质容易溶解在研磨液中 (2)研磨时间不宜太长 防止研磨时产生的热量影响DNA的提取量 (3)有条件的可以在材料处理的过程中加入纤维素酶、果胶酶 研磨效果好（有利于充分研磨） (4)研磨不宜太用力 在上清液中加入体积相等的、预冷的酒精溶液(体积分数为95%)，静置2-3min，溶液中出现的白色丝状物就是粗提取的DNA。用玻璃棒沿一个方向搅拌，卷起丝状物，并用滤纸吸去上面的水分；或将溶液倒入塑料离心管中，在10000r/min的转速下离心5min，弃上清液，将管底的沉淀物(粗提取的DNA)晾干。 (1)搅拌时应轻缓、并沿一个方向 减少DNA断裂，以便获得较完整的DNA分子 (2)酒精预冷的作用: 同“低温放置的作用” 四 DNA 的粗提取与鉴定 （四）实验步骤 取材、研磨 过滤 分离 鉴定 结果观察 (1)研磨的目的 破碎细胞，使核物质容易溶解在研磨液中 (2)研磨时间不宜太长 防止研磨时产生的热量影响DNA的提取量 (3)有条件的可以在材料处理的过程中加入纤维素酶、果胶酶 研磨效果好（有利于充分研磨） (4)研磨不宜太用力 取两支20mL的试管，各加入2mol/L的NaCl溶液5mL。将丝状物或沉淀物溶于其中一支试管的NaCI溶液中。向两支试管中各加入4mL的二苯胺试剂。混合均匀后，将试管置于沸水中加热5min。待试管冷却后，比较两支试管中溶液颜色的变化。 加入2mol/L氯化钠溶液 不加入丝状物 加入4ml二苯胺试剂 实验组 对照组 水浴加热 加入2mol/L氯化钠溶液 加入丝状物 加入4ml二苯胺试剂 P117 现配现用 易被空气氧化，颜色改变 练习与应用 一、概念检测 1. DNA连接酶是重组DNA技术常用的一种工具酶。下列相关叙述正确的是 （ ） A. 能连接DNA分子双链碱基对之间的氢键 B. 能将单个脱氧核苷酸加到DNA片段的末端，形成磷酸二酯键 C. 能连接用同种限制酶切开的两条DNA片段，重新形成磷酸二酯键 D. 只能连接双链DNA片段互补的黏性末端，不能连接双链DNA片段的平末端 C 练习与应用 一、概念检测 2. 在重组DNA技术中，将外源基因送入受体细胞的载体可以是 （ ） A. 大肠杆菌的质粒 B. 切割DNA分子的酶 C. DNA片段的黏性末端 D. 用来识别特定基因的DNA探针 A 练习与应用 二、拓展应用 1. 想一想，为什么限制酶不切割细菌本身的DNA分子？ 是因为含有某种限制酶的细胞的DNA分子不具备这种限制酶的识别序列，或者通过甲基化酶将甲基转移到了限制酶所识别序列的碱基上，使限制酶不能将其切开。 这样，尽管细菌中含有某种限制酶，也不会使自身的DNA被切断，并且可以防止外源DNA入侵。 2．有2个不同来源的DNA片段A和B，A片段用限制酶SpeⅠ进行切割，B片段分别用限制酶Hind Ⅲ、XbaⅠ、EcoRⅤ和XhoⅠ进行切割。各限制酶的识别序列和切割位点如下。 A片段 B片段 练习与应用 二、拓展应用 练习与应用 二、拓展应用 A片段 B片段 （1）哪种限制酶切割B片段产生的DNA片段能与限制酶SpeⅠ切割A片段产生的DNA片段相连接？为什么？ XbaⅠ。 因为XbaⅠ与SpeⅠ切割产生了相同的黏性末端。 练习与应用 二、拓展应用 A片段 B片段 (2)不同的限制酶切割可能产生相同的黏性末端，这在基因工程操作中有什么意义？ 识别DNA分子中不同核苷酸序列，但能切割产生相同黏性末端的限制酶被称为同尾酶。同尾酶使构建载体时，切割位点的选择范围扩大。例如，我们选择了用某种限制酶切割载体，如果目的基因的核苷酸序列中恰好含有该限制酶的识别序列，那么用该限制酶切割含有目的基因的DNA片段时，目的基因就很可能被切断；这时可以考虑用合适的同尾酶(目的基因的核苷酸序列中不能有它的识别序列)来获取目的基因。 104 G C A T T A G A T C T A 5’ 3’ 5’ 3’ A A T T G C G C A T G C C T G A A T C G A T T T A A C G 原始素材： $$