2.2利用动物细胞工程改良动物细胞课件-2024-2025学年高二下学期生物沪科版选择性必修3

第二章 细胞工程 利用动物细胞工程改良动物细胞 第2节(1) 动物细胞工程的发展历程 动物细胞培养是在适宜的条件下使细胞生长增殖的过程 细胞核移植技术是动物克隆技术的主要手段 细胞融合技术是单克隆抗体制备的重要技术 干细胞在生物医学工程中具有广泛的应用价值 胚胎工程快速繁育优良品种 动物细胞工程 动物细胞培养技术 细胞核移植技术 细胞融合技术 干细胞 技术 胚胎工程 小面积烧伤:植皮(自身)后恢复 1)使用他人皮肤? 患者自身的不够用,如何解决? 大面积烧伤? 2)培养自身细胞? 皮肤的自体移植 1. 动物细胞培养技术是动物细胞工程的基础 1.概念: 指从动物体内取出组织或细胞,在体外模拟体内的生理条件,使之得以生存和生长并维持其结构与功能的技术 2.目的: 获得细胞或细胞产物;不能获得完整动物个体 3.原理: 细胞增殖(有丝分裂) 那么,动物细胞的培养需要哪些条件呢? 动物体 组织 单个细胞 细胞生长和增殖 取出 分散 适宜条件 1. 动物细胞培养技术是动物细胞工程的基础 动物细胞培养的条件 营养物质 其他条件 < < 糖类 氨基酸 无机盐 维生素 无菌、无毒的环境 适宜的温度、pH和渗透压 适宜的气体环境 4.动物细胞培养的条件 1. 动物细胞培养技术是动物细胞工程的基础 4.动物细胞培养的条件 葡萄糖、氨基酸、无机盐、维生素、动物血清等 合成培养基 (将细胞所需的营养物质按种类和所需量严格配置而成的培养基) 液体培养基 (培养液) 含有多种未知的促细胞生长因子及其他活性物质,可以补充合成培养基中缺乏的物质 (1)营养 1. 动物细胞培养技术是动物细胞工程的基础 4.动物细胞培养的条件 (2)无菌、无毒的环境 无菌 ①对培养液和所有培养用具进行灭菌处理 ②在无菌环境下进行操作 定期更换培养液,以便清除代谢物 无毒 超净工作台 1. 动物细胞培养技术是动物细胞工程的基础 4.动物细胞培养的条件 (3)适宜的温度、pH和渗透压 哺乳动物多以(36.5 0.5) 温度: pH: 多数细胞生存的适宜pH在7.2-7.4 渗透压: 需要考虑的一个重要环境参数 O2: 细胞代谢所必需 CO2: 维持培养液的pH (95%空气和5% CO2 ) CO2 培养箱 微生物培养中的作用不同(为自养型微生物提供碳源) (4)气体环境 1. 动物细胞培养技术是动物细胞工程的基础 5.动物细胞培养的过程 获取组织 分散细胞 原代培养 传代培养 并分离 5.动物细胞培养的过程 取动物组织 分散成单个细胞 悬浮生长 贴壁生长 (大多数) 用机械法或用胰蛋白酶、胶原蛋白酶等处理 细胞悬液 原代培养 ①原代培养:指动物组织经处理后的初次培养。 ②细胞贴壁:某些细胞需要贴附于某些基质表面才能增殖,这类细胞往往贴附在培养瓶的瓶壁上。 加培养液 在培养皿或培养瓶内 细胞贴壁:在培养瓶悬液中分散的细胞很快就贴附在瓶壁上。 培养皿 培养瓶 5.动物细胞培养的过程 取动物组织 分散成单个细胞 悬浮生长 贴壁生长 (大多数) 细胞密度过大、有害代谢物积累、营养物质缺乏等 接触抑制 用机械法或用胰蛋白酶、胶原蛋白酶等处理 细胞悬液 原代培养 ①原代培养:指动物组织经处理后的初次培养。 ②细胞贴壁:某些细胞需要贴附于某些基质表面才能增殖,这类细胞往往贴附在培养瓶的瓶壁上。 ③接触抑制:当贴壁细胞分裂生长到表面相互接触时,细胞停止分裂增殖的现象。 加培养液 在培养皿或培养瓶内 瓶壁上的细胞层数是:一层(或单层) 贴壁细胞分裂生长到表面相互接触时,细胞通常会停止分裂增殖。 接触抑制 癌变细胞没有接触抑制现象,可以在培养瓶中形成多层细胞 5.动物细胞培养的过程 取动物组织 分散成单个细胞 解决 悬浮生长 贴壁生长 (大多数) 细胞密度过大、有害代谢物积累、营养物质缺乏等 接触抑制 传代培养 用机械法或用胰蛋白酶、胶原蛋白酶等处理 细胞悬液 原代培养 分瓶 培养 ①原代培养:指动物组织经处理后的初次培养。 ②细胞贴壁:某些细胞需要贴附于某些基质表面才能增殖,这类细胞往往贴附在培养瓶的瓶壁上。 ③接触抑制:当贴壁细胞分裂生长到表面相互接触时,细胞停止分裂增殖的现象。 ④传代培养:分瓶后的细胞培养。 加培养液 在培养皿或培养瓶内 悬浮培养的细胞:直接用离心法收集 贴壁细胞:用胰蛋白酶处理分散成单个细胞,用离心法收集 细胞分裂受阻 ②制成细胞悬液,分瓶培养 ①收集细胞 1. 动物细胞培养技术是动物细胞工程的基础 5.动物细胞培养的过程 思考: 1.选动物幼龄个体的器官或组织做动物细胞培养材料的原因? 因为其细胞生命力旺盛,分裂能力强,分化程度低。 2.用胰蛋白酶、胶原蛋白酶处理组织块,使组织块分散成单个细胞的目的是什么? ①使细胞与培养液充分接触,一方面保证细胞所需的O2和营养物质的供应,另一方面保证细胞内代谢废物的及时排出; ②使得在细胞水平操作的其它技术得以实现。 1. 动物细胞培养技术是动物细胞工程的基础 5.动物细胞培养的过程 思考: 3.用胰蛋白酶分散细胞,由此可说明细胞间的物质主要是什么成分? 4.胰蛋白酶能将细胞消化掉吗?那将动物组织分散成单个细胞时要注意什么问题呢? 主要是蛋白质(胶原蛋白等) 能,应注意时间的控制。因为胰蛋白酶不仅能分解细胞间的蛋白质,长时间还会分解膜蛋白,对细胞造成损伤。 1. 动物细胞培养技术是动物细胞工程的基础 5.动物细胞培养的过程 思考: 5.能够用胃蛋白酶代替胰蛋白酶吗?为什么? 不能,因为动物细胞培养适宜的PH为7.2—7.4,此环境下胃蛋白酶(2.0)没有活性,而胰蛋白酶(7.2-8.4)的活性较高。 6.用胰蛋白酶两次处理的目的是? 第一次处理的目的是使组织细胞分散开; 第二次处理的目的是使细胞从瓶壁上脱离下来,便于分瓶后继续培养。 1. 动物细胞培养技术是动物细胞工程的基础 思考: 7.幼龄动物的细胞与老龄动物的细胞比较,分化程度低的细胞与分化程度高的细胞比较,哪些细胞更易于培养?为什么? 幼龄动物的细胞增殖能力强,有丝分裂旺盛,老龄动物的细胞则相反; 所以,一般来说幼龄动物的细胞比老龄动物的细胞易于培养。 同样,分化程度越低的细胞,増殖能力越强,所以更容易培养。 传代培养视频演示 比较项目 植物组织培养 动物细胞培养 原理 培养基 培养基特有成分 过程 结果 相同点 固体培养基 葡萄糖、动物血清 液体培养基 细胞增殖 植物细胞的全能性 许多细胞 蔗糖、植物激素 ①都进行有丝分裂,不涉及减数分裂; ②均需无菌操作,需要适宜的温度、pH等条件 新的植株 外植体 脱分化 愈伤组织 再分化 芽、根或胚状体 生长发育 植物体 动物的组织 机械法或胰蛋白酶、 胶原蛋白酶处理 细胞悬液 原代培养 细胞悬液 传代培养 植物组织培养与动物细胞培养比较 植物体细胞杂交 植物细胞融合 植物组织培养 意义:打破生殖隔离,实现远缘杂交育种,培育植物新品种。 动物细胞可以发生融合吗? 图片来自电影《splice》 2. 动物细胞融合 资料1:1970年,两位科学家做了人、鼠细胞的融合实验。 用绿色荧光素和红色荧光素分别标记人、鼠细胞的细胞膜。在细胞融合剂的诱导下,将标记红色荧光素的人细胞与标记绿色荧光素的小鼠细胞进行融合。 ③在荧光显微镜下观察,开始时,细胞膜一半呈红色,一半呈绿色。在37 下培养40min后,两种颜色呈均匀分布。 这个实验说明了什么? 动物细胞可以融合 2. 细胞膜具有半流动性 原理 2. 动物细胞融合 19世纪30年代,科学家曾在患肺结核、天花和麻疹等疾病的病人的病理组织中观察到多核细胞。如何解释这一现象? 病人体内的病毒可以诱导多个体细胞融合形成了多核细胞。 病毒颗粒 灭活的病毒颗粒粘附于细胞表面 细胞膜融合 细胞核融合 形成杂交瘤细胞 在病毒的作用下细胞膜打开 灭活:指用物理或化学手段使病毒失去感染能力(不感染细胞), 但是并不破坏病毒的抗原结构(诱导细胞融合)。 2. 动物细胞融合 在离体条件下,用人工方法将不同生物或同种生物不同类型的单细胞融合成一个杂合细胞 形成具有原来两个或多个细胞的遗传信息的杂交细胞 细胞膜具有一定的流动性 1.概念: 4.结果: 2.原理: 3.诱导方式 物理法:电融合法 化学法:聚乙二醇(PEG) 生物法:灭活病毒诱导法 与植物原生质体融合的方法相同 ——动物细胞融合特有 2. 动物细胞融合 正在融合的淋巴细胞与骨髓瘤细胞 7.应用: 突破了有性杂交方法的局限,使远缘杂交成为可能。 6.意义: 至今,种间、属间、科间,甚至动物和植物之间的细胞融合都已获得成功。 研究细胞遗传、细胞免疫、肿瘤和培育生物新品种等的重要手段。 为制造单克隆抗体开辟了新途径。 2. 动物细胞融合 2. 动物细胞融合 资料2:被狗咬如果伤口严重或靠近头部的话越有发病的危险,是需要抗狂犬病抗体和疫苗的联合注射。疫苗可以通过血源或基因工程制备。 如何生产出大量单一抗体? 浆细胞可以产生抗体,不可增殖。 肿瘤细胞不可以产生抗体,可增殖。 请你设计实验制备大量 抗狂犬病毒抗体 2. 动物细胞融合是单克隆抗体制备的关键技术 抗狂犬病单克隆抗体的制备 浆细胞 肿瘤细胞 杂交瘤细胞 浆 +肿瘤 浆+浆 肿瘤 +肿瘤 肿瘤细胞 浆细胞 细胞融合 筛选 2. 动物细胞融合是单克隆抗体制备的关键技术 资料四: 细胞中的DNA合成有两条途径: 一条途径是生物合成途径(“D途径”) ,即由氨基酸及其他小分子化合物合成核苷酸,为DNA分子的合成提供原料。氨基喋呤是一种可以阻断“D途径”DNA合成的物质。 另一条途径是应急途径或补救途径(“S途径”),细胞内可以产生HGPRT和TK两种酶,增殖细胞可以利用HGPRT和TK这两种酶共同作用催化次黄嘌呤和胸腺嘧啶核苷生成相应的核苷酸,而不增殖细胞无法利用。 资料五:骨髓瘤细胞是HGPRT缺陷型细胞,无法自身合成HGPRT酶。 阅读材料,思考如何筛选出真正的杂交瘤细胞? 选用骨髓瘤细胞与浆细胞杂交, 培养液中加入氨基喋呤、次黄嘌呤和胸腺嘧啶进行筛选 2. 动物细胞融合是单克隆抗体制备的关键技术 从小鼠脾脏中取出的B淋巴细胞的特异性不同, 经培养液筛选的杂交瘤细胞特异性也不同, 所以必须从杂交瘤细胞群中筛选出能产生针对某一预定抗原快定簇的特异性杂交瘤细胞 浆细胞 骨髓瘤细胞 杂交瘤细胞 细胞融合 小鼠注射狂犬病毒 (筛选) 抗狂犬病抗体 ? (筛选) 2. 动物细胞融合是单克隆抗体制备的关键技术 浆细胞 骨髓瘤细胞 杂交瘤细胞 细胞融合 小鼠注射狂犬病毒 (筛选) 杂交瘤 细胞群 (筛选) 抗狂犬病抗体 2. 动物细胞融合是单克隆抗体制备的关键技术 2. 动物细胞融合是单克隆抗体制备的关键技术 【两次筛选的比较】 项目 第一次筛选 第二次筛选(需要多次筛选) 筛选原因 筛选方法 筛选结果 诱导融合后得到多种杂交细胞,还有未融合的细胞等。 用特定的选择培养基筛选:未融合的亲本和融合的具有同种核的细胞都会死亡,只有融合的杂交瘤细胞才能生长。 得到杂交瘤细胞 因为小鼠在生活中还受到其他抗原的刺激,所以经选择培养获得的杂交瘤细胞中有能产生其他抗体的细胞 用96孔板培养,在每个孔中尽量接种一个杂交瘤细胞的情况下进行克隆化培养和抗体检测,经多次筛选得到足够数量的能分泌所需抗体的细胞 得到能分泌所需抗体的杂交瘤细胞 ④应用:鉴定抗原以及疾病的诊断、治疗 2. 动物细胞融合是单克隆抗体制备的关键技术 抗原-抗体杂交法 (1)诊断试剂——最广泛应用 抗人绒毛促性腺激素单克隆抗体 在妊娠第8天就可以作出诊断, 比原来诊断方法提前了10d左右,准确率在90﹪以上。 具有准确、高效、简易、快速特点 诊断优点: ④应用:鉴定抗原以及疾病的诊断、治疗 2. 动物细胞融合是单克隆抗体制备的关键技术 乙肝测定试剂 艾滋病检测试剂 血型检测试剂 新冠病毒检测试剂 (1)诊断试剂——最广泛应用 ④应用:鉴定抗原以及疾病的诊断、治疗 2. 动物细胞融合是单克隆抗体制备的关键技术 单克隆抗体+接头+药物(如细胞毒素)=ADC(抗体-药物偶联物) 优点:位置准确、疗效高、副作用小 主要用于癌症治疗。 单克隆抗体+药物 =“生物导弹” (2)运载药物 小结 单克隆抗体 筛选二 杂交细胞 杂交瘤细胞 体外或 体内培养 筛选一 骨髓瘤 细胞 诱导融合 分泌特异抗体 的杂交瘤细胞 杂交瘤细胞群 提取 已免疫的 B淋巴细胞 动物细胞融合技术 动物细胞培养技术 单克隆抗体的制备 既能大量繁殖 又能产生专一抗体 特异性强 灵敏度高 可大量制备 注射 抗原 Lavf58.51.100 Lavf58.51.100 $$