3.2.5 DNA片段的扩增及电泳鉴定-【省心备课】2024-2025学年高二生物同步教学精优课件（人教版2019选择性必修3）

第2节 基因工程的基本操作程序 DNA片段的扩增及电泳鉴定 贺老师 第3章 基因工程 1 (1)PCR利用了 原理，通过调节 来控制DNA双链的解聚与结合，PCR仪实质上就是一台能够自动调控温度的仪器。 (2)PCR扩增DNA片段还利用了 的原理。一次PCR一般要经历 次循环。 DNA的热变性 温度 DNA半保留复制 30 5’- -3’ 3’- -5’ 3’- -5’ 5’- -3’ 5’- -3’ -5’ 5’- 3’- -5’ 5’- -3’ -5’ 5’- 3’- -5’ 3’- -3’ 高温 变性 中温 低温 复性 延伸 1次循环 利用PCR在体外进行DNA片段扩增 1 实验原理 2 利用PCR在体外进行DNA片段扩增 3 ①PCR仪 ②微量离心管 ③微量移液器 ④一次性吸液枪头 利用PCR在体外进行DNA片段扩增 2 材料用具 ——自动控温，实现DNA的扩增 ——实际上是进行PCR反应的场所 PCR仪 微量离心管 推动杆 调节旋钮 卸枪头按钮 体积刻度 吸液杆 枪头 （注意：加不同样品时，需要更换枪头） （用于向微量离心管转移PCR配方中的液体） 4 10倍浓缩的扩增缓冲液（含Mg2+） 5μL 20mmol/L的4种脱氧核苷酸的等量混合液（实为dNTP） 1μL 20μmol/L的引物Ⅰ 2.5μL 20μmol/L的引物Ⅱ 2.5μL H2O 28～33μL 1-5U/μL的Taq DNA聚合酶（即耐高温的DNA聚合酶） 1～2U 模板DNA （1pg～1μg） 5～10μL 总体积 50μL ⑤PCR反应体系的配方 2 材料用具 注意：酶和缓冲液要在冰块上缓慢融化，用后置于-20℃冰箱中保存。酶和缓冲液一般分装成小份，避免反复融化导致 。 活性降低甚至失活 5 利用PCR在体外进行DNA片段扩增 3 方法步骤 1.加样： 用微量移液器按照PCR反应体系配方，在微量离心管中依次加入各组分。 2.离心： 待所有组分都加入后，盖严离心管的盖子，将微量离心管放入离心机里，离心约10s，使反应液集中在离心管的底部。 ——提高反应速率 6 3.反应：参照下表的参数，设置好PCR仪的循环程序。将装有反应液的微量离心管放入PCR仪中进行反应。 循环程序 变性 复性 延伸 预变性 94℃，5min — — 30次 94℃，30s 55℃，30s 72℃，1min 最后1次 94℃，1min 55℃，30s 72℃，10min 使DNA充分变性，双链打开，以利于引物更好地和模板结合。 问题1：预变性的目的是什么？ 问题2：为什么最后1次变性和延伸时间都延长了？ Taq 酶活性会随着循环次数增加而下降。在每一轮循环中，部分片段可能没有完全延伸完，Taq 酶就脱落了。最后1次变性、延伸时间延长，让这些DNA打开，重新充分延伸。 利用PCR在体外进行DNA片段扩增 3 方法步骤 7 问题1：PCR的产物是什么？ 问题2：如何鉴定PCR的产物？ DNA片段 琼脂糖凝胶电泳 利用琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR产物 8 （1）电泳：DNA分子具有_______________，在一定的 ________下，这些基团可以带上正电荷或负 电荷，在电场的作用下，这些带电分子会向着与它所带电荷________的电极移动，这个过程就是电泳。 可解离的基团 pH 相反 利用琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR产物 1 实验原理 一般使用的电泳缓冲液pH=8，DNA分子带 ，在电场中DNA便向 泳动。 负电荷 正极 磷酸电离形成的磷酸基团带负电 样品点样孔应靠近 极。 负 9 （2）鉴定方法：PCR的产物一般通过 来鉴定。 琼脂糖来源于红藻的多糖，其主要成分为多聚半乳糖，琼脂糖在水中一般加热到90℃以上溶解，温度下降到35-40℃时形成良好的半固体状的凝胶。 琼脂糖凝胶具有网络结构（孔径），孔径大小与琼脂糖凝胶浓度有关，浓度越高，孔径越 ，能够通过的核酸分子越 。 1 实验原理 琼脂糖凝胶电泳 在凝胶中DNA分子的迁移速率与_____________、_________________和______等有关 凝胶的浓度 DNA分子的大小 构象 小 小 DNA的迁移速率与其构象密切相关，超螺旋结构迁移最快，开环结构最慢。在实验中，可通过优化凝胶条件（如浓度、电压）和DNA构象（如酶切处理）来提高分辨率和分离效果。DNA的构象:迁移速率：双螺旋环状DNA＞双螺旋链状DNA＞单链DNA。 10 核酸染色剂 常用的核酸染色剂有EB（溴化乙锭）、GoldView等，EB能插入DNA分子中的碱基对之间，导致EB与DNA结合。嵌入核酸碱基间的EB能吸收300nm波长的紫外光，发出可见荧光。其荧光强度与DNA分子的含量成正比。 1 实验原理 11 标准参照物（Marker） DNA Marker是 的片段，在实验时和样本DNA同时进行凝胶电泳，通过对比两者的迁移速率，可以大致估计 。 1 实验原理 样本DNA的大小 已知的DNA分子大小 12 琼脂糖凝胶电泳装置 利用琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR产物 2 实验器材 13 制备凝胶 观察鉴定 进行电泳 电泳缓冲液配制琼脂糖溶液，一般配制质量体积比0.8%～1.2%的琼脂糖溶液。在沸水浴或微波炉内加热至琼脂糖熔化。稍冷却后，加入适量的核酸染料混匀。 将温热的琼脂糖溶液迅速倒入模具，并插入合适大小的梳子，以形成加样孔。 待凝胶溶液完全凝固，小心拔出梳子，取出凝胶放入电泳槽内。 ①熔化： ②倒模: ③凝固: 3 方法步骤 利用琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR产物 14 制备凝胶 观察鉴定 进行电泳 将电泳缓冲液加入电泳槽中，电泳缓冲液没过凝胶1mm为宜 扩增得到的PCR产物与凝胶载样缓冲液(内含指示剂)混合，再用微量移液器将混合液缓慢注入凝胶的加样孔内。留一个加样孔加入指示分子大小的标准参照物（marker）。 接通电源，根据电泳槽阳极至阴极之间的距离来设定电压，一般为1～5V/cm。待 前沿迁移接近凝胶边缘时，停止电泳 ①加液 ②加样 ③电泳 3 方法步骤 利用琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR产物 指示剂 ①有颜色，使样品呈现颜色，便于加样。 ②分子量较小，指示样品迁移的速率及方向。 ①常使用一种有颜色的标记物指示样品迁移的速率及方向；通过观察指示剂位置变化判断电泳是否完成 ②使样品呈现颜色，便于加样。 15 制备凝胶 观察鉴定 进行电泳 取出凝胶置于 下观察和照相。 3 方法步骤 利用琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR产物 紫外灯 16 一条条带（目的基因片段） 1.本实验进行电泳鉴定的结果应该是几条条带？ 2.如图所示，该片段大小约为 。 750bp 思考·讨论 0次 12次 12次 30次 30次 Marker 根据条带的 及 来评价扩增的结果 3.判断成功扩增出DNA片段的依据是什么？ 分布 粗细程度 估计DNA的大小 估计DNA的数量 17 4.你进行电泳鉴定的结果是几条条带？如果不止一条条带，请分析产生这个结果的可能原因？ 未出现扩增条带可能的原因有： ①引物出现质量问题； ②变性时温度 ，变性时间 ，模板DNA链未打开。 ③Taq酶失活； ④Mg2+浓度过 。 出现非特异性扩增带可能的原因有： ①引物特异性不强或容易聚合成二聚体 ②复性时的温度过低，引物随机连接到非目的基因片段 ③DNA聚合酶的浓度过高，即使引物与模板的结合并不完全匹配，酶仍可能催化延伸反应，生成非特异性扩增产物。 ④Mg2+浓度过高 ⑤模板DNA出现污染 低 低 短 思考·讨论 18 注意： 1. 为避免外源DNA等因素的污染，PCR实验中使用的微量离心管、枪头和蒸馏水等在使用前必须进行 处理。 2. 该实验所需材料可以直接从公司购买，缓冲液和酶应分装成小份，并在 储存。使用前，将所需试剂从冰箱拿出，放在冰块上 。 3. 在向微量离心管中添加反应组分时，每吸取一种试剂后，移液器上的枪头都必须 。 4. 在进行操作时，一定要戴好 。 5. PCR扩增不能随意加大试剂用量。 高压灭菌 -20℃ 缓慢融化 更换 一次性手套 19 ③迁移速率：在凝胶中DNA分子的迁移速率与凝胶的浓度、DNA分子的大小和构象等有关。 ④检测：凝胶中的DNA分子通过染色，可以在波长为300nm的紫外灯下被检测出来。 琼脂糖凝胶浓度（%） 分离DNA分子大小（Kb） 迁移速率 0.6 1～20 慢 快 0.7 0.8～10 0.9 0.5～7 1.2 0.4～6 1.5 0.2～4 2.0 0.1～3 琼脂糖凝胶浓度越大，分离的DNA分子越小，迁移速率越快 20 Multimedia Cloud Transcode (cloud.baidu.com) Lavf58.20.100 Packed by Bilibili XCoder v2.0.2 $$