4.1基因工程赋予生物新的遗传特性第4课时课件-2024-2025学年高二下学期生物浙科版选择性必修3

基因工程赋予生物新的遗传特性 1 目 录 将目的基因导入受体细胞 01 目的基因的检测与鉴定 02 2 1.将目的基因导入受体细胞的具体操作方法 2.目的基因的检测与鉴定的方法 3.阐明基因工程的原理和基本操作程序 【学习目标】 基因表达载体 上节内容回顾 基因表达载体的组成： 课后思考：如何选择适合的限制酶？ 4 基因表达载体 基因表达载体的构建过程如右图： 思考： 1.得到的一定是重组DNA分子吗？ 用DNA连接酶连接时，可形成3 种不同的连接物： 目的基因—载体连接物（正反向） 载体—载体连接物（自身环化） 目的基因—目的基因连接物（自身环化） 5 基因表达载体 2.如何避免质粒或目的基因自身环化？ 双酶法：使用两种限制酶分别对目的基因和质粒进行切割(目的基因的两侧和质粒上含有这两种限制酶的酶切位点),且两种限制酶产生的黏性末端不同(不互补),这样能有效地避免质粒与目的基因的反向连接以及自身环化 质粒自身环化 正向连接 反向连接 目的基因多拷贝与质粒连接 6 基因表达载体 3.限制酶的选择原则 （1）不破坏目的基因：切点应位于目的基因两端，如图甲中可选择Pst Ⅰ，而不选择Sma Ⅰ 至少要保留一个标记基因，以用于重组DNA的鉴定和筛选 （2）保留标记基因、启动子、终止子、复制原点：所选择的限制酶尽量不要破坏这些结构，如图乙中不选择Sma Ⅰ 7 基因表达载体 （3）确保出现相同黏性末端原则： 切割目的基因与质粒所选的限制酶应产生相同的黏性末端 ①可以选择与切割目的基因相同的限制酶切割质粒，如图中Pst Ⅰ ②为避免目的基因和质粒自身环化和随意连接（或为了保证目的基因和质粒发生定向连接），应使用不同的限制酶切割目的基因和质粒，如图也可选择Pst Ⅰ和EcoR Ⅰ两种限制酶。 8 01 将目的基因导入受体细胞 9 将目的基因导入受体细胞 1.受体细胞：接受目的基因的细胞 2.根据受体细胞类型可选择不同的基因导入方法 （1）导入微生物细胞 受体细胞：常用原核生物作为受体细胞，其中以大肠杆菌最广泛 导入方法：Ca2+处理法 原理：细胞膜通透性改变，成为感受态细胞 10 将目的基因导入受体细胞 ④ Ca2+处理法的一般过程 低温、Ca2+处理大肠杆菌 使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态 将重组的基因表达载体导入其中 Ca2+的作用：增加细胞膜通透性 这种细胞称为感受态细胞 一般利用温度变化导入 （短暂热刺激） 11 将目的基因导入受体细胞 （2）导入动物细胞 受体细胞：受精卵 导入方法：显微注射法 体积大 易操作 全能性高 易培养成完整个体 12 将目的基因导入受体细胞 ③ 过程 构建基因表达载体并提纯 利用显微注射将基因表达载体 注入动物的受精卵中 早期胚胎培养 胚胎移植 获得具有新性状的动物 13 将目的基因导入受体细胞 （3）导入植物细胞 受体细胞：受精卵或体细胞 导入方法：农杆菌转化法 转化：目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程。此处“转化”与肺炎链球菌转化实验中的“转化”含义相同，实质都是基因重组 14 将目的基因导入受体细胞 ④ 农杆菌特点 易感染双子叶植物和裸子植物 内含Ti质粒，其上的T-DNA可转移至受体细胞的染色体DNA上 ⑤ 利用农杆菌进行转化的思路： 将目的基因插入Ti质粒的T-DNA中，通过农杆菌的转化作用，就可以使目的基因进入植物细胞 15 将目的基因导入受体细胞 ⑥ 过程： 植物细胞 染色体DNA 新性状植株 农杆菌 植物细胞 表达载体 目的基因 Ti质粒 构建 转入 导入 插入 表达 导入植物细胞：还有电击法、基因枪法与花粉管通道法 16 02 目的基因的检测与鉴定 17 目的基因的检测与鉴定 目的基因进入受体细胞后，是否稳定维持和表达其遗传特性，只有通过检测与鉴定才能知道。 从DNA 、RNA、蛋白质和个体性状四个方面来进行 检测DNA 检测RNA、蛋白质 以及个体水平 -----确定目的基因在受体细胞内是否稳定存在 -----确定目的基因是否正确表达 18 目的基因的检测与鉴定 (1)借助载体上的标记基因可以检测目的基因是否在受体细胞中稳定地存在并遗传。 1.检测目的基因是否稳定存在： 例如，某些应用于大肠杆菌的质粒具有氨苄青霉素抗性基因和LacZ基因两种标记基因。可使大肠杆菌具有青霉素抗性并能够合成β-半乳糖苷酶，该酶能催化无色的X-gal（5-溴-4氯-3吲哚-D-半乳糖苷)分解为半乳糖和蓝色的5-溴-4-氯淀，使菌落呈现蓝色，将目的基因插入这种质粒上的LacZ基因中，使该基因失活，再将重组质粒导入大肠杆菌中，从而使含有重组DNA的大肠杆菌在含有X-gal和青霉素的培养基上形成白色菌落；而只导入不含目的基因的载体的大肠杆菌则形成蓝色菌落，不含有载体的大肠杆菌无法生长。 含重组DNA的大肠杆菌：白色 不含目的基因的载体的大肠杆菌：蓝色 不含有载体的大肠杆菌：不能生存 19 目的基因的检测与鉴定 (2)利用PCR技术检测 更精准地鉴定受体细胞中是否转入了目的基因的方法 根据目的基因的序列设计引物 利用待检DNA为模板进行PCR 通过电泳或DNA测序技术鉴定PCR产物 20 目的基因的检测与鉴定 (3)利用核酸分子杂交技术检测 原理：两个不同来源核酸单链的核苷酸之间碱基互补配对 ①核酸探针：是带有放射性或荧光标记的具有特定核苷酸序列 的DNA或RNA ②过程： 使待检的DNA变性成单链并固定在硝酸纤维素膜上 加入探针 漂洗硝酸纤维素膜去除未互补结合的探针 检测硝酸纤维素膜的放射性或荧光 21 目的基因的检测与鉴定 2.检测目的基因是否正确表达： （1）检测mRNA ------运用核酸分子杂交技术 （2）检测蛋白质 ------运用抗原-抗体杂交技术 （3）个体水平 -----观察测定个体是否表现出目的基因控制的特定性状并稳定遗传（是判断转基因成功的直接证据） 22 目的基因的检测与鉴定 如：检测 Bt 基因是否翻译出 Bt 抗虫蛋白 从转基因棉花中提取蛋白质，用相应的抗体进行抗原-抗体杂交，若出现杂交带，则目的基因成功翻译出蛋白质 抗原—抗体杂交 23 目的基因的检测与鉴定 个体水平鉴定 例：通过采摘抗虫棉的叶片饲喂棉铃虫来确定Bt基因是否赋予了棉花抗虫特性以及抗性的程度 生物体是否表达出目标性状及其表达水平——抗虫性、抗旱性、抗病性检测 24 目的基因的检测与鉴定 目的基因表达检测 是否转录检测——核酸分子杂交 是否翻译检测——抗原-抗体杂交 分子检测法 抗虫鉴定 抗病鉴定 活性鉴定等 个体水平的鉴定 目的基因是否真正插入受体细胞的DNA中——核酸分子杂交、PCR、标记基因 25 课堂小结 基因工程赋予生物新的遗传特性 基因表达载体：筛选适合的限制酶 将目的基因导入受体细胞 目的基因的检测与鉴定 双酶法 植物细胞：农杆菌转化法 动物细胞：显微注射法 微生物细胞：Ca2+处理法 检测DNA 检测RNA、蛋白质、个体性状 26 随堂练习 1.图1为某种质粒简图，图2表示某外源DNA上的目的基因，小箭头所指分别为限制性内切核酸酶EcoR I、BamH I、Hind Ⅲ的酶切位点。下列有关叙述错误的是(   ) A.在基因工程中若只用一种限制酶完成对质粒和外源DNA的切割，则可选EcoR I B.如果将一个外源DNA分子和一个质粒分别用EcoR I酶切后，再用DNA连接酶连接，形成一个含有目的基因的重组DNA，此重组DNA中EcoR I酶切点有1个 C.使用EcoR Ⅰ处理外源DNA分子时需消耗4分子H2O D.一个图1所示的质粒分子经EcoR I切割后，含有2个游离的磷酸基团 解析：A、目的基因两侧都有且质粒也有的限制酶是EcoR Ⅰ，所以在基因工程中若只用一种限制酶完成对质粒和外源DNA的切割，可选EcoR Ⅰ，A正确；B、若将一个外源DNA分子和一个质粒分别用EcoR Ⅰ酶切后再用DNA连接酶连接，则形成的重组DNA中，目的基因两端应各含1个EcoR Ⅰ酶切位点，即重组DNA中EcoR Ⅰ酶切点有2个，B错误；C、使用EcoR Ⅰ处理外源DNA分子时（两个切口，断裂4个磷酸二酯键）需消耗4分子H2O，C正确；D、环状质粒无游离磷酸基团，一个图1所示的质粒分子经EcoR I切割后，含有2个游离的磷酸基团（环状质粒称为链状DNA分子），D正确。 B 27 解析：真核细胞和细菌的DNA聚合酶都需Mg2+激活,因此,用PCR仪进行扩增时,扩增缓冲液中一般要添加Mg2+,A错误;基因片段扩增过程中,脱氧核苷酸会依次加到引物的3’端,B错误；电泳时,在凝胶中基因片段的迁移速率与DNA分子的大小、构象都有关,C错误；将基因片段与凝胶载样缓冲液的混合液加入凝胶加样孔时,要留一个加样孔加指示分子大小的标准参照物,D正确。 2.科学家在人类的基因组中发现36种病毒基因的片段,并提取相关基因片段进行扩增及电泳鉴定。下列叙述正确的是(    ) A.用PCR仪进行扩增时,扩增缓冲液中一般要添加Ca2+ B.基因片段扩增过程中,脱氧核苷酸会依次加到引物的5'端 C.电泳时,在凝胶中基因片段的迁移速率与DNA分子的构象无关 D.将基因片段与凝胶载样缓冲液的混合液加入凝胶加样孔时,要留一个加样孔加标准参照物 D 3.基因工程、细胞工程都可以克服远缘杂交不亲和的障碍，在农作物新品选育等方面具有广阔的前景和较高的应用价值。下列叙述错误的是(   ) A.实验室中将目的基因导入植物细胞采用最多、最有效的方法是显微注射法 B.农杆菌转化法的原理是Ti质粒中的T-DNA具有转移到受体细胞并整合到受体细胞DNA上的特性 C.植物体细胞杂交诱导原生质融合时常用聚乙二醇（PEG）做诱导剂 D.含有目的基因的细胞或融合形成的杂种细胞能培育成植株的理论基础是细胞的全能性 解析：A、显微注射法是实验室中将目的基因导入动物细胞采用最多、最有效的方法，A错误；B、农杆菌的Ti质粒存在T-DNA片段，它具有可转移到受体细胞并整合到受体细胞的染色体DNA上，B正确；C、常用化学诱导法聚乙二醇（PEG）诱导植物原生质体的融合，C正确；D、植物组织培养的原理是细胞的全能性，D正确。 A $$