大题06 生物技术与工程专练-【大题精做】冲刺2025年高考生物大题突破+限时集训（浙江专用）

大题06 生物技术与工程专练 （一）基因工程 1. 工具酶与载体 限制酶：识别特定核苷酸序列（如EcoRⅠ识别GAATTC），切割产生黏性末端或平末端。 DNA连接酶：连接双链DNA片段，需区分T4 DNA连接酶（连接黏性末端和平末端）与E·coli DNA连接酶（仅连接黏性末端）。 载体选择：质粒需含复制原点、启动子、终止子、标记基因（如氨苄青霉素抗性基因）。 2. 操作流程 目的基因获取：PCR技术（引物设计需含限制酶识别序列）、cDNA文库构建（逆转录法）。 重组载体构建：双酶切（避免载体自连）→ 连接→ 转化（Ca²⁺处理大肠杆菌）。 检测与鉴定： 分子水平：PCR（引物特异性检测）、DNA分子杂交（探针标记）。 个体水平：抗虫接种实验、抗除草剂实验。 3. 典型案例 CRISPR/Cas9基因编辑：向导RNA（gRNA）引导Cas9酶切割DNA，需警惕脱靶效应（通过优化gRNA设计或使用碱基编辑器减少风险）。 疫苗制备：如新冠病毒蛋白疫苗，通过基因工程表达抗原蛋白，激活机体免疫反应。 （二）细胞工程 1. 植物细胞工程 组织培养： 脱分化：生长素/细胞分裂素比例高，形成愈伤组织。 再分化：细胞分裂素/生长素比例高，诱导芽分化。 体细胞杂交：PEG诱导原生质体融合，杂种细胞筛选（如通过荧光标记）。 2. 动物细胞工程 细胞培养：需血清（提供生长因子）、胰蛋白酶处理（分散细胞）、CO₂培养箱（维持pH）。 单克隆抗体： 杂交瘤细胞制备：B淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合，HAT培养基筛选。 抗体纯化：利用抗原-抗体特异性结合。 3. 干细胞技术 胚胎干细胞（ES细胞）：具有发育全能性，可用于器官再生。 诱导多能干细胞（iPSC）：通过导入Oct4等转录因子重编程体细胞。 （三）发酵工程 1. 微生物代谢调控 初级代谢产物：如乙醇、氨基酸，与微生物生长同步。 次级代谢产物：如抗生素，在稳定期大量合成。 2. 发酵条件控制 温度：影响酶活性（如酵母菌发酵最适温度28℃）。 pH：如谷氨酸棒状杆菌产谷氨酸需pH 7.0~8.0。 溶氧量：需氧发酵（如青霉素生产）需通入无菌空气，厌氧发酵（如酒精发酵）需密封。 3. 产物分离纯化 离心：分离菌体与发酵液。 萃取：如用有机溶剂提取脂溶性产物。 1．（2025·浙江·高考真题）3-磷酸甘油脱氢酶（GPD）是酵母细胞中甘油合成的关键酶。利用某假丝酵母菌株为材料，克隆具有高效催化效率的3-磷酸甘油脱氢酶的基因（Gpd）。采用的方案是：先通过第1次PCR扩增出该基因的中间部分，再通过第2次PCR分别扩增出该基因的两侧，经拼接获得完整基因的序列，如图所示，回答下列问题：    (1)分析不同物种的GPD蛋白序列，确定蛋白质上相同的氨基酸区段，依据这些氨基酸所对应的 ，确定DNA序列，进而设计1对引物。以该菌株基因组DNA为模板进行第1次PCR，利用 凝胶电泳分离并纯化DNA片段，进一步测定PCR产物的序列。在制备PCR反应体系时，每次用微量移液器吸取不同试剂前，需要确认或调整刻度和量程，还需要 。 (2)若在上述PCR扩增结果中，除获得一条阳性条带外，还出现了另外一条条带，不可能的原因是__________。 A．DNA模板被其他酵母细胞的基因组DNA污染 B．每个引物与DNA模板存在2个配对结合位点 C．在基因组中Gpd基因有2个拷贝 D．在基因组中存在1个与Gpd基因序列高度相似的其他基因 (3)为获得完整的Gpd基因，分别用限制性核酸内切酶PstⅠ和SalⅠ单酶切基因组DNA后，各自用DNA连接酶连接形成环形DNA，再用苯酚-氯仿抽提除去杂质，最后加入 沉淀环形DNA。根据第一次PCR产物测定获得的序列，重新设计一对引物，以环形DNA为模板进行第二次PCR，最后进行测序。用于第二次PCR的一对引物，其序列应是DNA链上的 （A．P1和P2  B．P3和P4 C．P1和P4 D．P2和P3）。根据测序结果拼接获得完整的Gpd基因序列，其中的启动子和终止子具有 功能。 (4)为确定克隆获得的Gpd基因的准确性，可将获得的基因序列与已建立的 进行比对。将Gpd基因的编码区与 连接，构建重组质粒，再将重组质粒导入酿酒酵母细胞中，实现利用酿酒酵母高效合成甘油的目的。 【答案】(1) 密码子/遗传密码 琼脂糖 更换微量移液器的枪头 (2)C (3) 冷的95%乙醇 D 调控 (4) 基因数据库/序列数据库 表达载体 【分析】基因工程技术的基本步骤：(1) 目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。(2) 基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子、复制原点和标记基因等。(3) 将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。 将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法。(4) 目的基因的检测与鉴定：分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA是否插入目的基因--DNA分子杂交技术；②检测目 的基因是否转录出了mRNA-分子杂交技术；③检测目的基因是否翻译成蛋白质一抗原-抗体杂交技术。 个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。 【详解】（1）分析不同物种的GPD蛋白序列，确定蛋白质上相同的氨基酸区段，依据这些氨基酸所对应的密码子，根据碱基互补配对，确定DNA序列，进而设计1对引物。可通过琼脂糖凝胶电泳分离并纯化目标DNA片段。在制备PCR反应体系时，每次用微量移液器吸取不同试剂前，需要更换微量移液器的枪头，以避免交叉污染。 （2）A、DNA模板被其他酵母细胞的基因组DNA污染，可能扩增出其他DNA，从而出现另外一条条带，A错误； B、每个引物与DNA模板存在2个配对结合位点，从而扩增出不同的DNA片段，从而出现另外一条条带，B错误； C、在基因组中Gpd基因有2个拷贝，扩增出的DNA是相同DNA，电泳时只会出现一个条带，C正确； D、在基因组中存在1个与Gpd基因序列高度相似的其他基因，可能将相似的基因扩增出来，从而出现另外一条条带，D错误。 故选C。 （3）DNA在冷的95%乙醇中溶解度较低，可通过将酶切后的DNA经苯酚-氯仿抽提除去杂质，在加入冷的95%乙醇中沉淀，得到环形DNA。PCR过程中，子链的延伸方向为5'→3'，结合图示可知，应选择P2和P3引物进行第二次扩增。启动子可启动转录，终止子可终止转录，即启动子和终止子具有调控功能。 （4）为确定克隆获得的Gpd基因的准确性，可将获得的基因序列与已建立的基因数据库进行对比，若二者相同，则说明克隆获得的Gpd基因准确。将Gpd基因的编码区与表达载体连接，构建重组质粒，再将重组质粒导入酿酒酵母细胞中，使之进行表达，实现利用酿酒酵母高效合成甘油的目的。 2．（2024·浙江·高考真题）植物体在干旱、虫害或微生物侵害等胁迫过程中会产生防御物质，这类物质属于次生代谢产物。次生代谢产物在植物抗虫、抗病等方面发挥作用，也是药物、香料和色素等的重要来源。次生代谢产物X的研发流程如下： 筛选高产细胞→细胞生长和产物X合成关系的确定→发酵生产X 回答下列问题： (1)获得高产细胞时，以X含量高的植物品种的器官和组织作为 ，经脱分化形成愈伤组织，然后通过液体振荡和用一定孔径的筛网进行 获得分散的单细胞。 (2)对分离获得的单细胞进行 培养，并通过添加 或营养缺陷培养方法获取细胞周期同步、遗传和代谢稳定、来源单一的细胞群。为进一步提高目标细胞的X含量，将微生物菌体或其产物作为诱导子加入到培养基中，该过程模拟了 的胁迫。 (3)在大规模培养高产细胞前，需了解植物细胞生长和产物合成的关系。培养细胞生产次生代谢产物的模型分为3种，如图所示。若X只在细胞生长停止后才能合成，则X的合成符合图 （填“甲”“乙”“丙”），根据该图所示的关系，从培养阶段及其目标角度，提出获得大量X的方法。 (4)多种次生代谢产物在根部合成与积累，如人参、三叶青等药用植物，可通过 培养替代细胞悬浮培养生产次生代谢产物。随着基因组测序和功能基因组学的发展，在全面了解生物体合成某次生代谢产物的 和 的基础上，可利用合成生物学的方法改造酵母菌等微生物，利用 工程生产植物的次生代谢产物。 【答案】(1) 外植体 过滤 (2) 克隆 DNA合成抑制剂 微生物侵害 (3) 丙 先培养大量细胞，改变条件使细胞停止生长，大量产生X (4) 器官 代谢途径 关键酶 发酵 【分析】【关键能力】 （1）信息获取与加工 题干关键信息 所学知识 信息加工 获取细胞周期同步、遗传和代谢稳定、来源单一的细胞群 细胞在外源激素或某些化学物质作用下，或营养缺乏时会停止在细胞周期的特定时期 分离获得的单细胞进行克隆培养，并通过添加DNA合成抑制剂，处于S期的细胞立刻被抑制，洗去TdR后可恢复正常分裂，而处于其它时期的细胞不受过量TdR影响）或营养缺陷培养方法获取细胞周期同步、遗传和代谢稳定、来源单一的细胞群 X只在细胞生长停止后才能合成 观察图形 丙图细胞停止生长后，次生代谢产物才大量增加，符合X的合成特点 （2）逻辑推理与论证： 【详解】（1）植物体的器官和组织、细胞都可以作为外植体，经脱分化形成愈伤组织，将愈伤组织进行振荡培养，使其分散成小的细胞团或单细胞，然后用适当孔径的不锈钢筛网过滤，除去大的细胞团和残渣，离心除去小的残渣，得到单细胞悬浮液。 （2）分离获得的单细胞进行克隆培养，并通过添加DNA合成抑制剂，处于S期的细胞立刻被抑制，洗去TdR后可恢复正常分裂，而处于其它时期的细胞不受过量TdR影响）或营养缺陷培养方法获取细胞周期同步、遗传和代谢稳定、来源单一的细胞群。将微生物菌体或其产物作为诱导子加入到培养基中，模拟了微生物侵害的迫害条件。 （3）由题可知X只在细胞生长停止后才能合成，所以丙图符合。所以要获得大量X的方法，是先培养大量细胞，改变条件使细胞停止生长，大量产生X。 （4）由题知，多种次生代谢产物在根部合成与积累，所以要对根进行培养，为了方便进行次生代谢物的收集，可以通过器官培养替代细胞悬浮培养生产次生代谢产物。要大量获得次生代谢物可以通过基因工程，将相关基因转入酵母菌体内，然后通过发酵工程获得，基因工程的前提是要了解生物体合成某次生代谢产物的代谢途径和关键酶。 3．（2024·浙江·高考真题）小鼠毛囊中表达F蛋白。为研究F蛋白在毛发生长中的作用，利用基因工程技术获得了F基因敲除的突变型纯合体小鼠，简称f小鼠，突变基因用f表示。f小鼠皮毛比野生型小鼠长50%，表现出毛绒绒的样子，其它表型正常。（注：野生型基因用++表示；f杂合子基因型用+f表示） 回答下列问题： (1)F基因敲除方案如图甲。在F基因的编码区插入了一个DNA片段P，引起F基因产生 ，导致mRNA提前出现终止密码子，使得合成的蛋白质因为缺失了 而丧失活性。要达到此目的，还可以对该基因的特定碱基进行 和 。 (2)从野生型、f杂合子和f小鼠组织中分别提取DNA，用限制酶HindⅢ酶切，进行琼脂糖电泳，用DNA探针检测。探针的结合位置如图甲，检测结果如图乙，则f小鼠和f杂合子对应的DNA片段分别位于第 泳道和第 泳道。 (3)g小鼠是长毛隐性突变体（gg），表型与f小鼠相同。f基因和g基因位于同一条常染色体上。f杂合子小鼠与g小鼠杂交，若杂交结果是 ，则g和f是非等位基因；若杂交结果是 ，则g和f是等位基因。（注：不考虑交叉互换；野生型基因用++表示；g杂合子基因型用+g表示） (4)确定g和f为等位基因后，为进一步鉴定g基因，分别提取野生型（++）、g杂合子（+g）和g小鼠（gg）的mRNA，反转录为cDNA后用（2）小题同样的DNA探针和方法检测，结果如图丙。g小鼠泳道没有条带的原因是 。组织学检查发现野生型和g杂合子表达F蛋白，g小鼠不表达F蛋白，因此推测F蛋白具有的作用 。 【答案】(1) 编码序列错位 氨基酸序列 替换 缺失 (2) 3 2 (3) 子代全为野生型 野生型：突变型=1：1 (4) 基因突变丢失了启动子，导致无法转录出 mRNA；反转录没有产物，检测不出结果 抑制毛发生长 【分析】【关键能力】 （1）信息获取与加工 题干关键信息 所学知识 信息加工 mRNA提前出现终止密码子 基因突变对性状的影响 基因的编码区插入DNA片段，引起基因产生编码序列错位，导致mRNA提前出现终止密码子，合成的蛋白质中氨基酸序列变短，蛋白质结构发生改变，结构决定功能，导致合成的蛋白质丧失活性 DNA片段位置判断 PCR及电泳 野生型基因切出来能与探针结合的片段较短，f基因切出来能与探针结合的片段较长，DNA分子越长，分子质量越大，在电泳时迁移速度越慢 （2）逻辑推理与论证 【详解】（1）依据题意，在F基因的编码区插入了一个DNA片段P，引起F基因产生编码序列错位，从而导致mRNA提前出现终止密码子，使得合成的蛋白质中氨基酸序列变短，蛋白质结构发生改变，结构决定功能，导致合成的蛋白质丧失活性。该基因突变是插入一个DNA片段引起的，除此之外，还可以缺失或者替换基因中的碱基，从而导致基因突变。 （2）从图中看出，野生型基因和f基因都含有2个限制酶HindⅢ的识别序列，但f基因中含有P片段，因此限制酶HindⅢ切割野生型基因和f基因后，野生型基因切出来能与探针结合的片段较短，f基因切出来能与探针结合的片段较长，DNA分子越长，分子质量越大，在电泳时迁移速度越慢，因此推测第1泳道中只有野生型基因，第2泳道中既有野生型基因，又有f基因，第3泳道中只有f基因，因此f小鼠和f杂合子对应的DNA片段分别位于第3泳道和第2泳道。 （3）据题意可知，野生型基因用++表示，g小鼠是长毛隐性突变体，基因型用gg表示，f杂合子小鼠基因型用+f表示，f基因和g基因位于同一条常染色体上，如果g和f是非等位基因，f杂合子小鼠（+f/++）与g小鼠（++/gg）杂交，后代为++/+g和+f/+g，全是野生型；如果g和f是等位基因，f杂合子小鼠（+f）与g小鼠（gg）杂交，后代为+g：fg=1：1，即野生型与突变型比例为1：1。 （4）据图可知，野生型基因突变成g基因以后，启动子随着一部分DNA片段丢失，无法转录出 mRNA，也无法形成cDNA，PCR时缺少模板，反转录没有产物，导致最终无结果，因此g小鼠泳道没有条带。g小鼠表型与f小鼠相同，表现出毛绒绒的样子，野生型和g杂合子表达F蛋白，g小鼠不表达F蛋白，即没有F蛋白，表现出长毛，说明F蛋白在毛发生长中起抑制作用。 4．（2024·浙江·高考真题）锌转运蛋白在某种植物根部细胞特异性表达并定位于细胞质膜，具有吸收和转运环境中Zn2+的功能。为研究该植物2种锌转运蛋白M和N与吸收Zn2+相关的生物学功能，在克隆M、N基因基础上，转化锌吸收缺陷型酵母，并进行细胞学鉴定。回答下列问题： (1)锌转运蛋白基因M、N克隆。以该植物 为材料提取并纯化mRNA，反转录合成cDNA。根据序列信息设计引物进行PCR扩增，PCR每个循环第一步是进行热变性处理，该处理的效果类似于生物体内 的作用效果。PCR产物琼脂糖凝胶电泳时，DNA分子因为含 而带负电荷，凝胶点样孔端应靠近电泳槽负极接口；当2个PCR产物分子量接近时，若延长电泳时间，凝胶中这2个条带之间的距离会 。回收DNA片段，连接至克隆载体，转化大肠杆菌，测序验证。 (2)重组表达载体构建。分别将含M、N基因的重组质粒和酵母表达载体同时进行双酶切处理，然后利用 连接，将得到的重组表达载体转化大肠杆菌。用PCR快速验证重组转化是否成功。此反应可以用大肠杆菌悬液当模板的原因是 。 (3)酵母菌转化。取冻存的锌吸收缺陷型酵母菌株，直接在固体培养基进行 培养，活化后接种至液体培养基，采用 以扩大菌体数量，用重组表达载体转化酵母菌。检测M、N基因在受体细胞中的表达水平，无显著差异。 (4)转基因酵母功能鉴定。分别将转化了M、N基因的酵母菌株于液体培养基中培养至OD600为0.6。将菌液用 法逐级稀释至OD600为0.06、0.006和0.0006，然后各取10μL菌液用涂布器均匀涂布在固体培养基上，培养2天，菌落生长如图。该实验中阴性对照为 。由实验结果可初步推测：转运蛋白M和N中，转运Zn2+能力更强的是 ，依据是 。 注：OD600为波长600nm下的吸光值，该值越大，菌液浓度越高；空载体为未插入M或N基因的表达载体。 【答案】(1) 根 解旋酶 磷酸基团 变长 (2) DNA连接酶 热变性使大肠杆菌内的DNA外溢 (3) 划线分离 振荡培养 (4) 梯度稀释 锌吸收缺陷型酵母+空载体 N 转入N基因的这组酵母菌数量多 【分析】【关键能力】 （1）信息获取与加工 题干关键信息 所学知识 信息加工 锌转运蛋白基因M、N克隆 PCR技术扩增目的基因 PCR的原理是DNA分子的复制，包括变性、复性、延伸过程，变性过程类似于体内的解旋酶解旋的过程，利用高温将双链DNA解开 重组表达载体构建 基因表达载体的构建过程 利用限制性内切酶处理后的质粒和目的基因具有黏性末端或者平末端，用DNA连接酶进行连接 转基因酵母功能鉴定 目的基因的检测与鉴定 检测目的基因，需要区分出空白的受体细胞、导入目的基因的受体细胞和导入空白载体的受体细胞 （2）逻辑推理与论证 【详解】（1）由题意可知，锌转运蛋白在某种植物根部细胞特异性表达并定位于细胞质膜，所以以该植物的根为材料提取并纯化mRNA，反转录合成cDNA。热变性处理的目的是使DNA解螺旋，相当于生物体内解旋酶的效果。DNA分子因为含有磷酸基团而带负电荷，所以其点样孔端应靠近电泳槽负极接口。随着时间的推移，不同分子量的DNA分子速度不同，时间越长，距离差越大。 （2）内切酶处理后的质粒和目的基因，用DNA连接酶进行连接。由于PCR过程中热变性使大肠杆菌内的DNA外溢，所以可用大肠杆菌悬液当模板，利用PCR快速验证重组转化是否成功。 （3）冻存的酵母菌浓度较高，必须稀释后涂布，也可直接在固体培养基上划线接种后进行培养，进行活化，然后转至液体培养基增殖，培养过程中进行震荡，有利于增加培养液的溶氧量和使酵母菌和培养液充分接触，从而快速增殖。 （4）由题意可知，菌液稀释后OD600为0.06、0.006和0.0006，说明其进行10指数的梯度稀释。由图可知，锌吸收缺陷型酵母+空载体组不会吸收锌，为阴性对照。由图中光谱吸收值可知，转入N基因的这组酵母菌数量多，说明N转运Zn2+能力更强。 5．（2023·浙江·高考真题）赖氨酸是人体不能合成的必需氨基酸，而人类主要食物中的赖氨酸含量很低，利用生物技术可提高食物中赖氨酸含量。回答下列问题： (1)植物细胞合成的赖氨酸达到一定浓度时，能抑制合成过程中两种关键酶的活性，导致赖氨酸含量维持在一定浓度水平，这种调节方式属于 。根据这种调节方式，在培养基中添加 ，用于筛选经人工诱变的植物悬浮细胞，可得到抗赖氨酸类似物的细胞突变体，通过培养获得再生植株。 (2)随着转基因技术与动物细胞工程结合和发展，2011年我国首次利用转基因和体细胞核移植技术成功培育了高产赖氨酸转基因克隆奶牛。其基本流程为： ①构建乳腺专一表达载体。随着测序技术的发展，为获取富含赖氨酸的酪蛋白基因（目的基因），可通过检索 获取其编码序列，用化学合成法制备得到。再将获得的目的基因与含有乳腺特异性启动子的相应载体连接，构建出乳腺专一表达载体。 ②表达载体转入牛胚胎成纤维细胞（BEF）。将表达载体包裹到磷脂等构成的脂质体内，与BEF膜发生 ，表达载体最终进入细胞核，发生转化。 ③核移植。将转基因的BEF作为核供体细胞，从牛卵巢获取卵母细胞，经体外培养及去核后作为 。将两种细胞进行电融合，电融合的作用除了促进细胞融合，同时起到了 重组细胞发育的作用。 ④重组细胞的体外培养及胚胎移植。重组细胞体外培养至 ，植入代孕母牛子宫角，直至小牛出生。 ⑤检测。DNA水平检测：利用PCR技术，以非转基因牛耳组织细胞作为阴性对照，以 为阳性对照，检测到转基因牛耳组织细胞中存在目的基因。RNA水平检测：从非转基因牛乳汁中的脱落细胞、转基因牛乳汁中的脱落细胞和转基因牛耳组织细胞，提取总RNA，对总RNA进行 处理，以去除DNA污染，再经逆转录形成cDNA，并以此为 ，利用特定引物扩增目的基因片段。结果显示目的基因在转基因牛乳汁中的脱落细胞内表达，而不在牛耳组织细胞内表达，原因是什么？ 。 【答案】(1) 负反馈调节 过量赖氨酸类似物 (2) 基因数据库 融合 核受体细胞 激活 早期囊胚 转基因BEF DNA酶 PCR的模板 构建的表达载体只含有乳腺特异性启动子，只能在乳腺细胞中启动转录，而在牛耳细胞中不能表达。 【分析】负反馈调节是指在一个系统中，系统工作的效果，反过来又作为信息调节该系统的工作，并且使系统工作的效果减弱或受到限制，有助于系统保持稳定。基因工程技术的基本步骤：(1)目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成；(2)基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等；(3)将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样.将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法；(4)目的基因的检测与鉴定：分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA是否插入目的基因-DNA分子杂交技术；②检测目的基因是否转录出了mRNA-分子杂交技术；③检测目的基因是否翻译成蛋白质抗原抗体杂交技术.个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。 【详解】（1）负反馈调节是指在一个系统中，系统工作的效果，反过来又作为信息调节该系统的工作，并且使系统工作的效果减弱或受到限制，有助于系统保持稳定。植物细胞合成的赖氨酸达到一定浓度时，能抑制合成过程中两种关键酶的活性，导致赖氨酸含量维持在一定浓度水平，这种调节方式属于负反馈调节。如果想得到抗赖氨酸类似物的细胞突变体可在培养基中添加过量赖氨酸类似物。 （2）①从基因数据库获取获取目的基因编码序列，用化学合成法制备可得到目的基因。 ②表达载体包裹到磷脂等构成的脂质体内，根据细胞膜成分，其与BEF膜发生融合。 ③去核的卵母细胞作为受体细胞，其处于减数第二次分裂中期，因为卵母细胞中含有促使细胞核表达全能性的物质和营养条件。电融合的作用除了促进细胞融合，同时起到了激活重组细胞发育的作用。 ④胚胎发育到适宜阶段可取出向受体移植。牛、羊一般要培养到桑椹胚或囊胚阶段；植入代孕母牛子宫角，直至小牛出生。 ⑤阳性对照：按照当前实验方案一定能得到正面预期结果的对照实验。阳性对照是已知的对测量结果有影响的因素，目的是确定实验程序无误。阴性对照和阳性对照相反，按照当前的实验方案一定不能得到正面预期结果的对照实验。排除未知变量对实验产生的不利影响。本实验以非转基因牛耳组织细胞作为阴性对照，为了检测到转基因牛耳组织细胞中存在目的基因。应该以含有目的基因的牛耳组织细胞为阳性对照。为了除去DNA污染，可以使用DNA酶使其水解。经逆转录形成cDNA，并以此为PCR的模板进行扩增。目的基因在转基因牛乳汁中的脱落细胞内表达，而不在牛耳组织细胞内表达，原因是构建的表达载体只含有乳腺特异性启动子，只能在乳腺细胞中启动转录，而在牛耳细胞中不能表达。 6．（2023·浙江·高考真题）甲植物细胞核基因具有耐盐碱效应，乙植物细胞质基因具有高产效应。某研究小组用甲、乙两种植物细胞进行体细胞杂交相关研究，基本过程包括获取原生质体、诱导原生质体融合、筛选融合细胞、杂种植株再生和鉴定，最终获得高产耐盐碱再生植株。回答下列问题： (1)根据研究目标，在甲、乙两种植物细胞进行体细胞杂交前，应检验两种植物的原生质体是否具备 的能力。为了便于观察细胞融合的状况，通常用不同颜色的原生质体进行融合，若甲植物原生质体采用幼苗的根为外植体，则乙植物可用幼苗的 为外植体。 (2)植物细胞壁的主要成分为 和果胶，在获取原生质体时，常采用相应的酶进行去壁处理。在原生质体融合前，需对原生质体进行处理，分别使甲原生质体和乙原生质体的 失活。对处理后的原生质体在显微镜下用 计数，确定原生质体密度。两种原生质体1∶1混合后，通过添加适宜浓度的PEG进行融合；一定时间后，加入过量的培养基进行稀释，稀释的目的是 。 (3)将融合原生质体悬浮液和液态的琼脂糖混合，在凝固前倒入培养皿，融合原生质体分散固定在平板中，并独立生长、分裂形成愈伤组织。同一块愈伤组织所有细胞源于 。下列各项中能说明这些愈伤组织只能来自于杂种细胞的理由是哪几项？ A ．甲、乙原生质体经处理后失活，无法正常生长、分裂 B．同种融合的原生质体因甲或乙原生质体失活而不能生长、分裂 C．培养基含有抑制物质，只有杂种细胞才能正常生长、分裂 D．杂种细胞由于结构和功能完整可以生长、分裂 (4)愈伤组织经 可形成胚状体或芽。胚状体能长出 ，直接发育形成再生植株。 (5)用PCR技术鉴定再生植株。已知甲植物细胞核具有特异性DNA序列a，乙植物细胞质具有特异性DNA序列b；M1、M2为序列a的特异性引物，N1、N2为序列b的特异性引物。完善实验思路： Ⅰ．提取纯化再生植株的总DNA，作为PCR扩增的 。 Ⅱ．将DNA提取物加入PCR反应体系， 为特异性引物，扩增序列a；用同样的方法扩增序列b。 Ⅲ．得到的2个PCR扩增产物经 后，若每个PCR扩增产物在凝胶中均出现了预期的 个条带，则可初步确定再生植株来自于杂种细胞。 【答案】(1) 再生 叶 (2) 纤维素 细胞质基因和细胞核基因 血细胞计数板 降低PEG浓度，使其失去融合作用 (3) 同一个杂种融合原生质体 ABD (4) 再分化 根和芽 (5) 模板 M1、M2 凝胶电泳 1 【分析】1、植物组织培养过程：离体的植物组织经过脱分化形成愈伤组织，经过再分化愈伤组织又能重新分化为有结构的组织和器官，最终形成完整的植株。 2、植物体细胞杂交可以克服植物有性杂交不亲和性、打破物种之间的生殖隔离，操作过程包括:原生质体制备、原生质体融合、杂种细胞筛选、杂种细胞培养、杂种植株再生以及杂种植株鉴定等步骤。 【详解】（1）在甲、乙两种植物细胞进行体细胞杂交前，应检验两种植物的原生质体是否具备再生的能力。为了便于观察细胞融合的状况，通常用不同颜色的原生质体进行融合，若甲植物原生质体采用幼苗的根为外植体，则乙植物可用幼苗的叶为外植体。 （2）植物细胞壁的主要成分为纤维素和果胶，在获取原生质体时，常采用相应的酶进行去壁处理。甲植物细胞核基因具有耐盐碱效应，乙植物细胞质基因具有高产效应，在原生质体融合前，需对原生质体进行处理，分别使甲原生质体和乙原生质体的细胞质基因和细胞核基因失活，融合后具有甲植物的细胞核基因和乙植物的细胞质基因。对处理后的原生质体在显微镜下用血细胞计数板计数，确定原生质体密度。两种原生质体1∶1混合后，通过添加适宜浓度的PEG进行融合；一定时间后，加入过量的培养基进行稀释，稀释的目的是降低PEG浓度,使其失去融合作用。 （3）将融合原生质体悬浮液和液态的琼脂糖混合，在凝固前倒入培养皿，融合原生质体分散固定在平板中，并独立生长、分裂形成愈伤组织。同一块愈伤组织所有细胞源于同一个杂种融合的原生质体。未融合的原生质体因为细胞质或细胞核的失活，无法正常生长、分裂；同种融合的原生质体也因为甲原生质体细胞质或乙原生质体细胞核失活而不能生长、分裂；只有杂种细胞才具备有活性的细胞质和细胞核，可以生长、分裂，因此这些愈伤组织只能来自于杂种细胞。故选ABD。 （4）愈伤组织经再分化可形成胚状体或芽。胚状体能长出根和芽，直接发育形成再生植株。 （5）Ⅰ．提取纯化再生植株的总DNA，作为PCR扩增的模板。 Ⅱ．将DNA提取物加入PCR反应体系，M1、M2为特异性引物，扩增序列a；用同样的方法扩增序列b。 Ⅲ．得到的2个PCR扩增产物经凝胶电泳后，若每个PCR扩增产物在凝胶中均出现了预期的1个条带，则可初步确定再生植株来自于杂种细胞。 7．（2022·浙江·高考真题）回答下列（一）、（二）小题： （一）红曲霉合成的红曲色素是可食用的天然色素，具有防腐、降脂等功能。研究者进行了红曲色素的提取及红色素的含量测定实验，流程如下： (1)取红曲霉菌种斜面，加适量 洗下菌苔，制成菌悬液并培养，解除休眠获得 菌种。经液体发酵，收集红曲霉菌丝体，红曲霉菌丝体与70%乙醇溶液混合，经浸提、 ，获得的上清液即为红曲色素提取液。为进一步提高红曲色素得率，可将红曲霉细胞进行 处理。 (2)红曲色素包括红色素、黄色素和橙黄色素等，红色素在390nm、420nm和505nm波长处均有较大吸收峰。用光电比色法测定红曲色素提取液甲的红色素含量时，通常选用505nm波长测定的原因是 。测定时需用 作空白对照。 (3)生产上提取红曲色素后的残渣，经 处理后作为饲料添加剂或有机肥，这属于废弃物的无害化和 处理。 （二）我国在新冠疫情方面取得了显著的成效，但全球疫情形势仍然非常严峻、尤其是病毒出现了新变异株——德尔塔、奥密克戎，更是威胁着全人类的生命健康。 (4)新冠病毒核酸定性检测原理是：以新冠病毒的单链RNA为模板，利用 酶合成DNA，经PCR扩增，然后在扩增产物中加入特异的 ，如果检测到特异的杂交分子则核酸检测为阳性。 (5)接种疫苗是遏制新冠疫情蔓延的重要手段。腺病毒疫苗的制备技术要点是：将腺病毒的复制基因敲除；以新冠病毒的 基因为模板合成的DNA插入腺病毒基因组，构建重组腺病毒。重组腺病毒在人体细胞内表达产生新冠病毒抗原，从而引发特异性免疫反应。在此过程中，腺病毒的作用是作为基因工程中目的基因的 。将腺病毒复制基因敲除的目的是 。 (6)单克隆抗体有望用于治疗新冠肺炎。单克隆抗体的制备原理是：取免疫阳性小鼠的 细胞与骨髓瘤细胞混合培养，使其融合，最后筛选出能产生特定抗体的杂交瘤细胞。与植物组织培养相比，杂交瘤细胞扩大培养需要特殊的成分，如胰岛素和 。 【答案】(1) 无菌水 活化 离心 破碎 (2) 其它色素对该波长光的吸收相对较少，干扰相对较小 70%乙醇溶液 (3) 灭菌 资源化 (4) 逆转录 核酸探针 (5) 抗原 载体 使腺病毒失去复制能力 (6) 脾 动物血清 【分析】1、无菌操作包括灭菌和消毒两种方式。消毒的方法有巴氏消毒法、酒精消毒、煮沸消毒法；灭菌的方法有干热灭菌、灼烧灭菌和高压蒸汽灭菌。2、微生物接种：微生物接种的方法很多，最常用的是平板划线法和稀释涂布平板法，常用来统计样品活菌数目的方法是稀释涂布平板法。3、平板划线法：通过接种环在琼脂固体培养基表面连续划线的操作，将聚集的菌种逐步稀释分散到培养基表面。 【详解】（1）防止污染，洗菌苔可加适量的无菌水，制成菌悬液并培养，解除休眠获得活化菌种。红曲霉菌丝体与70%乙醇溶液混合，经浸提、离心，获得的上清液即为红曲色素提取液。为进一步提高红曲色素得率，可将红曲霉细胞进行破碎处理，使细胞内的红曲色素释放出来。 （2）用光电比色法测定红曲色素提取液甲的红色素含量时，通常选用505nm波长测定的原因是其它色素对该波长光的吸收相对较少，干扰相对较小。由于提取红曲色素是用的70%乙醇溶液，故测定时需用70%乙醇溶液作空白对照。 （3）生产上提取红曲色素后的残渣，经灭菌处理残渣后，作为饲料添加剂或有机肥，这属于废弃物的无害化和资源化处理。 （4）RNA做模板合成DNA，利用逆转录酶；PCR扩增，然后在扩增产物中加入特异的核酸探针，检测新冠病毒核酸。如果检测到特异的杂交分子则核酸检测为阳性。 （5）腺病毒疫苗的制备技术要点是：将腺病毒的复制基因敲除；以新冠病毒的抗原基因为模板合成的DNA插入腺病毒基因组，构建重组腺病毒。重组腺病毒在人体细胞内表达产生新冠病毒抗原，从而引发特异性免疫反应。在此过程中，腺病毒的作用是作为基因工程中目的基因的载体。将腺病毒复制基因敲除的目的是使腺病毒失去复制能力。 （6）单克隆抗体的制备原理是：取免疫阳性小鼠的脾细胞与骨髓瘤细胞混合培养，使其融合，最后筛选出能产生特定抗体的杂交瘤细胞。与植物组织培养相比，杂交瘤细胞扩大培养需要特殊的成分，如胰岛素和动物血清。 【点睛】本题考查微生物的分离与培养等相关知识，要求考生识记培养基的成分、无菌技术、微生物分离的过程，能正确理解图形和表格中隐含的知识和结论。 8．（2021·浙江·高考真题）回答下列（一）、（二）小题： （一）回答与甘蔗醋制作有关的问题： （1）为了获得酿造甘蔗醋的高产菌株，以自然发酵的甘蔗渣为材料进行筛选。首先配制醋酸菌选择培养基：将适量的葡萄糖、KH2PO4、MgSO4溶解并定容，调节pH，再高压蒸汽灭菌，经 后加入3%体积的无水乙醇。然后将10 g自然发酵的甘蔗渣加入选择培养基，振荡培养24 h。用 将少量上述培养液涂布到含CaCO3的分离培养基上，在30 ℃培养48h。再挑取分离培养基上具有 的单菌落若干，分别接种到与分离培养基成分相同的 培养基上培养24 h后，置于4 ℃冰箱中保存。 （2）优良产酸菌种筛选。将冰箱保存的菌种分别接入选择培养基，培养一段时间后，取合适接种量的菌液在30 ℃、150 r/min 条件下振荡培养。持续培养至培养液中醋酸浓度不再上升，或者培养液中 含量达到最低时，发酵结束。筛选得到的优良菌种除了产酸量高外，还应有 （答出2点即可）等特点。 （3）制醋过程中，可将甘蔗渣制作成固定化介质，经 后用于发酵。其固定化方法为 。 （二）斑马鱼是一种模式动物，体外受精发育，胚胎透明、便于观察，可用于水质监测，基因功能分析以及药物毒性与安全性评价等。 （1）由于人类活动产生的生活污水日益增多，大量未经处理的污水直接排入河流、湖泊会引起水体 ，导致藻类大量繁殖形成水华。取水样喂养斑马鱼，可用斑马鱼每周的体重和死亡率等指标监测水体污染程度。 （2）为了研究某基因在斑马鱼血管发育过程中的分子调控机制，用 DNA 连接酶将该基因连接到质粒载体形成 ，导入到大肠杆菌菌株 DH5α 中。为了能够连接上该目的基因、并有利于获得含该目的基因的 DH5α 阳性细胞克隆，质粒载体应含有 （答出2点即可）。提取质粒后，采用 法，将该基因导入到斑马鱼受精卵细胞中，培养并观察转基因斑马鱼胚胎血管的发育情况。 （3）为了获取大量斑马鱼胚胎细胞用于药物筛选，可用 分散斑马鱼囊胚的内细胞团，取分散细胞作为初始材料进行 培养。培养瓶中添加成纤维细胞作为 ，以提高斑马鱼胚胎细胞克隆的形成率。 【答案】 冷却 玻璃刮刀 较大透明圈 斜面 乙醇 耐酒精度高、耐酸高 灭菌 吸附法 富营养化 重组DNA分子 限制性核酸内切酶的识别序列、抗生素抗性基因 显微注射 胰蛋白酶 原代 饲养层细胞 【分析】1、涂布法：将待分离的菌液经过大量稀释后，均匀涂布在固体培养皿表面，经培养后可形成单个菌落，是筛选高表达量菌株的常用方法； 2、基因工程的基本操作步骤为：获取目的基因、形成重组DNA分子、将重组DNA分子导入受体细胞、筛选含有目的基因的受体细胞和目的基因的表达。 【详解】（一） （1）高压蒸汽灭菌刚结束时，培养基温度较高，要等培养基冷却后再加入3%体积的无水乙醇。涂布分离法可用于单菌落分离，使用玻璃刮刀将待分离的菌液涂布到分离培养基的整个平面上。醋酸菌发酵产生的醋酸会使培养基中的CaCO3分解，形成透明圈。菌落小，透明圈大，代表着高产醋酸菌。菌种的贮存方法：在无菌操作下将单菌落用接种环取出，再用划线法接种在斜面培养基上，培养24h后，置于4℃冰箱中保存。 （2）醋酸发酵结束的标志性：产物不再增加（醋酸浓度不再上升）或原料消耗到最低值（乙醇含量达到最低）。优质菌种不光要产酸高，还要耐高酸，同时还要耐酒精（原料）等特点。 （3）我们在利用微生物时，常常要求所利用的微生物不被其他微生物污染。因此，在培养微生物时必须进行无菌操作，所以作为固定化介质的甘蔗渣需要经过灭菌处理。甘蔗渣类似果醋发酵装置中的锯末，可使醋杆菌吸附在甘蔗渣上进行发酵。 （二） （1）生活污水富含N、P，未经处理就大量排放，会导致水体富营养化，导致藻类大量繁殖形成水华或赤潮。 （2）具有相同黏性末端的目的基因和载体DNA（如质粒），经DNA连接酶处理后，会形成重组DNA分子。与目的基因相同的限制性核酸内切酶识别序列，可以确保限制性内切酶处理后与目的基因形成相同的黏性末端，以便于和目的基因的连接。标记基因（抗生素抗性基因）的存在，便于筛选含有目的基因的受体细胞。动物基因工程，通常采用显微注射法将重组DNA分子导入动物受精卵中。 （3）使用胰蛋白酶处理囊胚的内细胞团，借助酶的专一性，可分解细胞间质的蛋白质，让细胞分散，便于培养。将分散的细胞初次在卡氏瓶中培养，称之为原代培养。提高细胞克隆形成率的措施有：选择适宜的培养基、添加血清（胎牛血清最好）、饲养层细胞（滋养细胞如经射线照射本身失去增殖力的小鼠成纤维细胞）支持生长、激素（胰岛素等）刺激、使用CO2培养箱、调节pH等。 【点睛】1、熟练掌握微生物的筛选、分离和保存，以及微生物固定化方法是解题的关键； 2、熟练掌握基因工程的基本操作步骤，并了解每一步的目的是解题的关键。 1．（2024·广西·高考真题）M蛋白与“记忆”的形成密切相关。科研人员制备了M基因表达可控的实验模型小鼠，主要制作流程见下图，实验模型小鼠通过特异性表达Cre重组酶来敲除两个LoxP位点间的序列，同时利用体内表达的蛋白A激活诱导型T启动子。利用融合绿色荧光蛋白基因的M基因（M-GFP）的表达，恢复小鼠自身被敲除的M基因功能，同时便于示踪。回答下列问题： 注：基因型A/+指的是A基因被嵌合在细胞同源染色体中的一条，即可表示为Aa；两端添加上LoxP位点的M基因称为floxM。 (1)在PCR扩增片段①和②时，通常会在所用引物的一端添加被限制酶识别的序列，该序列添加的位置位于引物 （选填“3'端”或“5'端”）。在构建载体1时，为了阻断A基因的表达，从转录水平考虑，连接的片段可以是 ；而从翻译水平考虑，连接的片段可以是 。为了鉴定载体2是否构建成功，需要限制酶切割载体后，再进行 。 (2)培养小鼠胚胎干细胞需定时更换培养液，其目的是 （至少答2方面）。 (3)为了快速高效繁育出含有4对基因（遵循自由组合定律）的实验模型小鼠，应将培育出的基因型Cre/+A/+小鼠和M-GFP/+floxM/+小鼠分别与基因型floxM/floxM小鼠杂交，杂交获得的子代，再进行一代杂交后最终获得基因型为 实验模型小鼠。 (4)为了实现M基因的表达可控，在实验模型小鼠喂食时，可添加竞争性结合A蛋白的四环素，抑制T启动子的活性。添加四环素与未添加相比，目的是 。 【答案】(1) 5′端 两端包含loxP序列的终止子 两端包含loxP序列的可转录出终止密码子相应的DNA序列 电泳 (2)清除代谢产物、提供营养物质、调节pH、维持渗透压 (3)cre/+A/+M-GFP/+floxM/floxM (4)添加四环素会竞争性结合A蛋白，无法激活T启动子，导致M-GFP基因不能表达，从而不能恢复被敲除的M基因的功能；不添加四环素，A蛋白基因表达激活T启动子，启动M-GFP基因表达，从而恢复被敲除的M基因的功能。通过添加和不添加四环素的自身对照，增加实验的准确性。 【分析】基因工程技术的基本步骤：  1、目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。  2、基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。  3、将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法。  4、目的基因的检测与鉴定：（1）分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA是否插入目的基因--DNA分子杂交技术；②检测目的基因是否转录出了mRNA--分子杂交技术；③检测目的基因是否翻译成蛋白质--抗原-抗体杂交技术。（2）个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。 【详解】（1）PCR扩增DNA时，子链的合成方向是5'→3'，故应在引物的5'端添加被限制酶识别的序列。终止子：使转录在所需要的地方停下来，它位于基因的下游，也是一段有特殊序列结构的DNA片段。转录是以DNA为模板合成RNA的过程。从转录水平考虑为了阻断A基因的表达，连接的片段可以是两端包含LoxP序列的终止子。终止密码子：蛋白质翻译过程中终止肽链合成的mRNA上的三联体碱基序列。从翻译水平考虑为了阻断A基因的表达，连接的片段可以是两端包含LoxP序列的可转录出终止密码子相应的DNA序列。为鉴定载体2是否构建成功，需利用限制酶切割载体后进行电泳，观察是否出现预期大小的目标条带。 （2）细胞培养液需要定期更换，以便清除代谢物，防止细胞代谢物积累对细胞自身造成危害。此外，定期更换培养液还能维持细胞生存适宜的pH 和渗透压、确保细胞获得充足的营养，保证细胞的健康生长和繁殖。 （3）实验的目的是制备M基因表达可控的实验模型小鼠，对M基因的控制是通过蛋白A激活诱导型T启动子来调控的。为了便于追踪，构建了带绿色荧光蛋白基因的M基因，方便观察 M基因的表达情况，而自身所带的M基因则需要被敲除，已知两端添加LoxP位点的M基因可被Cre重组酶敲除，所以需要构建两端添加了LoxP 位点的M 基因纯合小鼠，相关基因型为foxM/1oxM。该小鼠体内需要有Cre重组酶来切除自身的M基因，同时还要有表达蛋白A的基因以及融合了绿色荧光蛋白基因的M基因来替换被敲除的M基因。综上分析，需进行如下杂交： 最终获得基因型为cre/+A/+M-GFP/+floxM/floxM的实验模型小鼠。 （4）添加四环素与未添加相比，添加四环素会竞争性结合A蛋白，无法激活T启动子，导致M-GFP基因不能表达，从而不能恢复被敲除的M基因的功能；不添加四环素，A蛋白基因表达激活T启动子，启动M-GFP基因表达，从而恢复被敲除的M基因的功能。通过添加和不添加四环素的自身对照，增加实验的准确性。 2．（2024·天津·高考真题）金黄色葡萄球菌（简称Sa）是人体重要致病细菌、不规范使用抗生素易出现多重抗药性Sa。 (1)Sa产生抗药性可遗传变异的来源有 （至少答出2点）。 (2)推测Sa产生头孢霉素抗性与其R基因有关。为验证该推测，以图1中R基因的上、下游片段和质粒1构建质粒2，然后通过同源重组（质粒2中的上、下游片段分别与Sa基因组中R基因上、下游片段配对，并发生交换）敲除Sa的R基因。    ①根据图1信息，简述质粒2的构建过程（需包含所选引物和限制酶）： ，然后回收上、下游片段，再与SacII酶切质粒1所得大片段连接，获得质粒2。 ②用质粒2转化临床分离的具有头孢霉素抗性、对氯霉素敏感的Sa，然后涂布在含 的平板上，经培养获得含质粒2的Sa单菌落。 ③将②获得的单菌落多次传代以增加同源重组敲除R基因的几率，随后稀释涂布在含 的平板上，筛选并获得不再含有质粒2的菌落。从这些菌落分别挑取少许菌体，依次接种到含 的平板上，若无法增殖，则对应菌落中细菌的R基因疑似被敲除。 ④以③获得的菌株基因组为模板，采用不同引物组合进行PCR扩增，电泳检测结果如图2，表明R基因已被敲除的是 。    【答案】(1)基因突变、基因重组、表观遗传等 (2) 采用引物1和4进行PCR扩增（或采用引物1和3以及引物2和4分别进行PCR扩增），用SacⅡ和EcoRⅠ对PCR产物进行酶切 氯霉素（或氯霉素+头孢霉素） 脱水四环素 头孢霉素 D 【分析】【关键能力】 （1）信息获取与加工 题干关键信息 所学知识 信息加工 判断可遗传变异的来源 可遗传变异来源有：基因突变、基因重组、染色体变异及表观遗传 Sa是原核生物，没有染色体 简述基因表达载体构建过程 利用PCR扩增目的基因时，需要目的基因两端的一段已知序列构建引物 质粒1及Sa的基因组中都含有SacII酶识别位点，质粒2上含有R基因上下游片段 筛选含质粒2的Sa菌落 用标记基因筛选目的菌 质粒2上有氯霉素抗性基因 筛选并获得不再含有质粒2的菌落 用标记基因筛选目的菌 质粒2中的上、下游片段分别与Sa基因组中R基因上、下游片段配对，并发生交换，R基因被交换至质粒2上，则Sa的基因组中没有了R基因；Sa产生头孢霉素抗性与其R基因有关，失去R基因，Sa没有头孢霉素抗性；质粒2上含有的Y是可被脱水四环素诱导表达的Sa致死基因，则含质粒2的Sa在含脱水四环素的培养基中会死亡 筛选R基因被敲除的Sa PCR扩增目的基因时需要目的基因两端的一段已知序列构建引物 发生同源重组时，质粒2中的上、下游片段分别与Sa基因组中R基因上、下游片段配对，并发生交换，敲除Sa的R基因，但R基因两端的上、下游片段仍在Sa基因组中 （2）逻辑推理与论证 【详解】（1）Sa为原核生物产生抗药性可遗传变异的来源有基因突变、基因重组、表观遗传等。 （2）①由图1可知，质粒2上依次接有SacⅡ、EcoRⅠ、SacⅡ三个酶切位点，而质粒1上只有SacⅡ酶切位点，R基因的上下游依次含有SacⅡ、EcoRⅠ、EcoRⅠ、SacⅡ酶切位点，若要构建质粒2，可以采用引物1和4进行PCR扩增可得到整个R基因，以及上下游片段（或采用引物1和3以及引物2和4分别进行PCR扩增），用SacⅡ和EcoRⅠ对PCR产物进行酶切，然后回收上、下游片段，再与SacII酶切质粒1所得大片段连接，获得质粒2。 ②用质粒2转化临床分离的具有头孢霉素抗性、对氯霉素敏感的Sa，因为重组的质粒2上含有氯霉素抗性基因，所以可以将重组后的含质粒2的菌落涂布在含氯霉素（或氯霉素+头孢霉素）的平板上，能生存下来的菌落就是，含质粒2的Sa单菌落。 ③推测Sa产生头孢霉素抗性与其R基因有关。为验证该推测需要敲除R基因，因为质粒2上含有Y可被脱水四环素又到表达的Sa致死基因，所以将②获得的单菌落多次传代以增加同源重组敲除R基因的几率，随后稀释涂布在含脱水四环素的平板上，可诱导R基因死亡，若无法增殖，则对应菌落中细菌的R基因疑似被敲除。 ④以③获得的菌株基因组为模板，采用不同引物组合进行PCR扩增，电泳检测结果如图2，表明R基因已被敲除的是D组，由图1可知，R基因两侧含有的引物为2和3，所以扩增后含有引物2或3，或者2和3的可能含有R基因，所以表明R基因已被敲除的是D组。 3．（2024·福建·高考真题）病毒感染初期，机体会分泌干扰素并作用于细胞受体IFNAR来应对感染。麻疹是由麻疹病毒感染引起的急性传染病。已知人白细胞分化抗原46（hCD46）是麻疹病毒入侵细胞的主要受体，小鼠没有该受体，科研人员构建hCD46转基因小鼠用于相关研究，部分流程如图所示。 回答下列问题： (1)利用PCR技术获取目的基因hCD46，复性温度下发生的扩增过程是 。 (2)将hCD46接入质粒应选用的限制酶组合是 。为提高转基因效率，同时避免标记基因进入胚胎体内，应选用 限制酶组合将重组质粒变为线性DNA。 (3)为获取大量胚胎用于移植，可用激素处理小鼠a，使其 。将胚胎移植到小鼠c的子宫中，应选用桑葚胚的原因是 。 (4)利用PCR技术对子代小鼠进行hCD46基因检测，应设置不加DNA模板的对照组，目的是 。 (5)若能进一步构建既表达hCD46受体又敲除IFNAR基因的小鼠，则该小鼠对麻疹病毒具有高易感性，原因是 。 【答案】(1)两种引物分别与含hCD46基因的两条模板链结合 (2) EcoRⅠ和NotI AgeⅠ和HindⅢ (3) 超数排卵 桑葚胚易于在小鼠子宫着床 (4)排除PCR体系中外源DNA的污染 (5)该小鼠能被麻疹病毒感染，且干扰素无法作用于IFNAR以应对感染 【分析】PCR是聚合酶链式反应的缩写。PCR是一项在生物体外复制特定DNA片段的核酸合成技术。通过这一技术，可以获取大量的目的基因。PCR扩增反应需要两种引物、模板DNA、原料（4种脱氧核苷酸）、酶（耐高温的DNA聚合酶）。PCR反应过程是：变性→复性→延伸。 【详解】（1）利用PCR技术获取目的基因hCD46，复性温度下发生的变化是两种引物分别与解开的两条模板链进行碱基互补配对，为子链的延伸做准备，即表现为两种引物分别与含hCD46基因的两条模板链结合 （2）结合图示可知，质粒中以及目的基因的两端含有限制酶EcoRⅠ和NotI的识别序列，且这两个序列位于启动子和终止子之间，因此，将hCD46接入质粒应选用的限制酶组合是EcoRⅠ和NotI。为提高转基因效率，同时避免标记基因进入胚胎体内，应选用AgeⅠ和HindⅢ限制酶组合将重组质粒变为线性DNA，因为这两种限制酶可以将重组质粒分为含目的基因的片段和含有标记基因的片段。 （3）为获取大量胚胎用于移植，可用激素处理小鼠a，使其超数排卵，为获取大量的供体胚胎做准备。将胚胎移植到小鼠c的子宫中，通常选用桑葚胚的原因是因为桑葚胚易于在小鼠子宫着床，进而可以提高胚胎的存活率。 （4）利用PCR技术对子代小鼠进行hCD46基因检测，应设置不加DNA模板的对照组作为空白对照，这样可以排除PCR体系中外源DNA的污染，提高实验结果的可信度。 （5）若能进一步构建既表达hCD46受体又敲除IFNAR基因的小鼠，则该转基因小鼠能接受抗原刺激，进而机体会分泌干扰素，但干扰素无法与相应的受体结合，因为转基因小鼠的受体IFNAR无法表达，因而干扰素无法起作用，因此，该小鼠对麻疹病毒具有高易感性。 4．（2024·海南·高考真题）酿酒酵母是重要的发酵菌种，广泛应用于酿酒、食品加工及生物燃料生产等。研究人员对酿酒酵母菌株A进行基因工程改造以提高发酵中的乙醇产量。回答下列问题： (1)酿酒酵母在有氧和无氧的条件下都能生存，属于 微生物，在无氧条件下能进行 发酵，可用于制作果酒等。 (2)传统发酵中，新鲜水果不接种酿酒酵母也能制备果酒，原因是 。 (3)工业上常采用单一菌种发酵生产食品。菌株A存在于环境中，实验室获得该单一菌种的分离方法有 和 。 (4)菌株A含有1个FLO基因，其表达的FLO蛋白可提高发酵中乙醇产量，且FLO蛋白量与乙醇产量成正相关，研究人员基于菌株A构建得到菌株B、C、D（如图）。该实验中，构建菌株B的目的是 ，预期菌株A、B、C、D发酵中乙醇产量的高低为 。 (5)菌株A中，X和Y基因的表达均可以提高发酵中乙醇产量。研究人员将X和Y基因融合在一起，构建了XY融合基因能表达的菌株E（如图），其在发酵中具有更高的乙醇产量。菌株E中无单独的X和Y基因，且其他基因未被破坏。简要写出由菌株A到菌株E的构建思路 。 【答案】(1) 异养兼性厌氧 酒精 (2)新鲜水果表皮附着酵母菌 (3) 平板划线法 稀释涂布平板法 (4) 作为空白对照组，排除基因表达载体对乙醇产量的影响 菌株C＞菌株A=菌株B＞菌株D (5)从菌株A获得X、Y基因，使用4种引物分别扩增X、Y基因，其中X基因后端和Y基因前端的引物末端部分序列互补配对，可形成具有重叠链的PCR产物，接着利用融合PCR技术构建融合基因，再将获得的融合基因构建基因表达载体，将基因表达载体导入菌株，进行目的基因检测与鉴定，最终获得菌株E。 【分析】酵母菌是兼性厌氧菌，在无氧条件下进行酒精发酵；醋酸菌是好氧细菌，当氧气、糖源都充足时，能将糖分分解成醋酸，当缺少糖源时，则将乙醇转化为乙醛，再将乙醛变成醋酸。 【详解】（1）酿酒酵母在有氧和无氧的条件下都能生存，属于异养兼性厌氧型微生物，在无氧条件下能进行酒精发酵，因此常用于制作果酒。 （2）传统发酵中，新鲜水果不接种酿酒酵母也能制备果酒，因为新鲜水果表面附着着酵母菌。 （3）实验室获得该单一菌种的分离方法有稀释涂布平板法和平板划线法，稀释涂布平板法中，经过一定的稀释后将菌液涂布在固体培养基上，可以获得单菌落；平板划线法是在无菌平板表面进行连续划线，微生物细胞数量将随着划线次数的增加而减少，并逐步分散开来，经多次划线培养后，可在平板表面得到单菌落。 （4）菌株B导入不含FLO基因的表达载体作为空白对照组，可以排除表达载体对乙醇产量结果的影响，根据题干可知，FLO基因表达的FLO蛋白可提高发酵中乙醇产量，且FLO蛋白量与乙醇产量成正相关，FLO基因数：菌株C＞菌株B＞菌株D，所以乙醇产量：菌株C＞菌株A=菌株B＞菌株D。 （5）菌株E中无单独的X和Y基因，菌株A含有X和Y基因，需要先利用限制酶从菌株A获得X、Y基因，使用4种引物分别扩增X、Y基因，其中X基因后端和Y基因前端的引物末端部分序列互补配对，可形成具有重叠链的PCR产物，利用融合PCR技术构建融合基因，再将获得的融合基因构建基因表达载体，将基因表达载体导入菌株，进行目的基因检测与鉴定，最终获得菌株E。 5．（2024·江苏·高考真题）为了高效纯化超氧化物歧化酶（SOD），科研人员将ELP50片段插入pET-SOD构建重组质粒pET-SOD-ELP50，以融合表达SOD-ELP50蛋白，过程如图1。其中，ELP50是由人工合成的DNA片段，序列为：限制酶a识别序列-（GTTCCTGGTGTTGGC）50-限制酶b识别序列，50为重复次数。请回答下列问题：    (1)步骤①双酶切时，需使用的限制酶a和限制酶b分别是 。 (2)步骤②转化时，科研人员常用 处理大肠杆菌，使细胞处于感受态；转化后的大肠杆菌采用含有 的培养基进行筛选。用PCR技术筛选成功导入pET-SOD-ELP50的大肠杆菌，应选用的一对引物是 。 (3)步骤③大肠杆菌中RNA聚合酶与 结合，驱动转录，翻译SOD-ELP50蛋白。已知蛋白质中氨基酸残基的平均相对分子质量约为0.11kDa，将表达的蛋白先进行凝胶电泳，然后用SOD抗体进行杂交，显示的条带应是 （从图2的“A~D”中选填）。    (4)步骤④为探寻高效纯化SOD-ELP50蛋白的方法，科研人员研究了温度、NaCl对SOD-ELP50蛋白纯化效果的影响，部分结果如图3。    （ⅰ）20℃时，加入NaCl后实验结果是 。 （ⅱ）100℃时，导致各组中所有蛋白都沉淀的原因是 。 （ⅲ）据图分析，融合表达SOD-ELP50蛋白的优点有 。 【答案】(1)EcoR I、Hind Ⅲ (2) CaCl2 卡那霉素 S-F和E-R (3) 启动子 C (4) SOD-ELP50组纯化蛋白数量更多 高温使蛋白变性 低温下添加NaCl有利于SOD蛋白纯化，杂蛋白较少，有利于酶活性的保持 【分析】将目的基因插入载体时，应保证目的基因插入启动子和终止子之间，以便目的基因的表达。由图可知，PCR扩增SOD-ELP50时，应选择引物S-F和E-R。 【详解】（1）目的基因应插入启动子和终止子之间，结合题意可知，ELP50应插入pET-SOD之后，由图可知，限制酶a和限制酶b分别是EcoR I、Hind Ⅲ。 （2）将目的基因导入细菌时常用CaCl2处理细菌，使其处于容易吸收外来DNA分子的状态。由图可知，重组DNA含有标记基因卡那霉素抗性基因，所以转化后的大肠杆菌采用含有卡那霉素的培养基进行筛选。成功导入pET-SOD-ELP50同时含有pET-SOD和ELP50，结合图示可知，引物S-F和E-R对应序列包含SOD和ELP50的相应序列，可特异性对pET-SOD-ELP50进行扩增，如果用S-F和P-R，无论ELP50是否插入，都有扩增产物，无法区分是导入了重组质粒还是空质粒。用S-F和E-R，导入重组质粒的有产物，空质粒的无产物，可以区分。 （3）RNA聚合酶与启动子结合后，启动转录。由图可知，决定SOD-ELP50融合蛋白的基因长度为462+750=1212bp，编码1212÷3=404个氨基酸，已知蛋白质中氨基酸残基的平均相对分子质量约为0.11kDa，融合蛋白的相对分子质量约为404×0.11kDa=44.44kDa，电泳后应该为条带C。 （4）（ⅰ）由图可知，20℃时，较不加NaCl，加入NaCl后纯化蛋白数量更多。 （ⅱ）100℃时，温度过高，导致蛋白质变性而沉淀。 （ⅲ）20℃，加入NaCl时，较SOD，SOD-ELP50组沉淀中蛋白质相对含量较高，说明低温下添加NaCl有利于SOD蛋白纯化，杂蛋白较少，有利于酶活性的保持。 6．（2024·重庆·高考真题）大豆是重要的粮油作物，提高大豆产量是我国农业领域的重要任务。我国研究人员发现，基因S在大豆品种DN（种子较大）中的表达量高于品种TL（种子较小），然后克隆了该基因（两品种中基因S序列无差异）及其上游的启动子序列，并开展相关研究。 (1)基因S启动子的基本组成单位是 。 (2)通过基因工程方法,将DN克隆的“启动子D+基因S”序列导入无基因S的优质大豆品种YZ。根据题19图所示信息（不考虑未标明序列）判断构建重组表达载体时，为保证目标序列的完整性，不宜使用的限制酶是 ；此外，不宜同时选用酶SpeⅠ和XbaⅠ。原因是 。 (3)为验证“启动子D+基因S”是否连接在表达载体上，可用限制酶对重组表达载体酶切后进行电泳。电泳时，对照样品除指示分子大小的标准参照物外，还应有 。经验证的重组表达载体需转入农杆菌，检测转入是否成功的技术是 。 (4)用检测后的农杆菌转化品种YZ所得再生植株YZ-1的种子变大。同时将从TL克隆的“启动子T+基因S”序列成功导入YZ，所得再生植株YZ-2的种子也变大，但小于YZ-1。综合分析，大豆品种DN较TL种子大的原因是 。 【答案】(1)脱氧核糖核苷酸（脱氧核苷酸） (2) EcoRⅠ 酶切后形成的片段黏性末端相同，易自我环化；不能保证目标片段与载体定向链接（反向链接） (3) 酶切后的空载体片段，启动子D+基因S片段      PCR (4)品种DN的基因S上游启动子效应比TL强，使得基因S表达量更高，种子更大 【分析】【关键能力】 （1）信息获取与加工 题干关键信息 所学知识 信息加工 启动子的基本组成单位 基因的结构 启动子是RNA聚合酶识别和结合的部位，用于启动DNA的转录，是一段DNA片段，其基本组成单位是四种脱氧核糖核苷酸 电泳时，对照样品除指示分子大小的标准参照物外，还应有哪些成分 PCR及琼脂糖凝胶电泳 电泳可以分离不同大小的DNA片段，用限制酶对重组表达载体酶切后的产物不仅有“启动子D+基因S”片段，还有酶切后的空载体片段，因此电泳时，对照样品除指示分子大小的标准参照物外，还应有酶切后的空载体片段和“启动子D+基因S”片段 检测转入是否成功的技术 检测目的基因是都导入受体细胞的方法 在分子水平上检测目的基因是否转入成功可通过PCR等技术检测受体细胞的DNA上是否插入目的基因或目的基因是否转录出mRNA （2）逻辑推理与论证 【详解】（1）启动子是RNA聚合酶识别和结合的部位，用于启动DNA的转录，是一段DNA片段，其基本组成单位是四种脱氧核糖核苷酸。 （2）①根据图示信息可知，“启动子D＋基因S”的DNA序列上存在EcoR Ⅰ的识别序列，若使用限制酶EcoR Ⅰ，会使目的基因序列被破坏； ②根据图中限制酶的识别序列可知，酶Spe Ⅰ和Xba Ⅰ切割产生的黏性末端相同，若用这两种限制酶切割，形成的DNA片段在构建基因表达载体时，容易出现自我环化，以及无法保证目的基因片段与载体片段单向连接，影响目的基因在受体细胞中的表达。 （3）①DNA电泳可以分离不同大小的DNA片段，用限制酶对重组表达载体酶切后的产物不仅有“启动子D+基因S”片段，还有酶切后的空载体片段，因此电泳时，对照样品除指示分子大小的标准参照物外，还应有酶切后的空载体片段和“启动子D+基因S”片段； ②在分子水平上检测目的基因是否转入成过可通过PCR等技术检测受体细胞的DNA上是否插入目的基因或目的基因是否转录出mRNA。 （4）根据（4）题目信息可知，再生植株YZ-1导入的目的基因为取自品种DN的“启动子D＋基因S”序列，再生植株YZ-2导入的目的基因为取自品种TL的“启动子T＋基因S”序列，结合题干信息“两品种中基因S序列无差异”可推测：品种DN的基因S上游的启动子D的效应强于品种TL的启动子T，启动子D使基因S表达量更高，因而种子更大。 7．（2024·贵州·高考真题）研究者用以蔗糖为唯一碳源的液体培养基，培养真菌A的野生型（含NV基因）、突变体（NV基因突变）和转基因菌株（转入NV基因），检测三种菌株NV酶的生成与培养液中的葡萄糖含量，结果如表所示（表中“+”表示有，“—”表示无）。 检测用菌株 蔗糖 NV酶 葡萄糖（培养液中） 野生型 + + + 野生型 — — — 突变体 + — — 转基因菌株 + + + 回答下列问题。 (1)据表可推测 诱导了NV基因表达。NV酶的作用是 。检测NV酶活性时，需测定的指标是 （答出1点即可）。 (2)表中突变体由T-DNA随机插入野生型菌株基因组DNA筛选获得。从野生型与突变体中分别提取基因组DNA作为模板，用与 （选填“T-DNA”或“NV基因”）配对的引物进行PCR扩增。若突变体扩增片段长度 （选填“>”“=”或“<”）野生型扩增片段长度，则表明突变体构建成功，从基因序列分析其原因是 。 (3)为进一步验证NV基因的功能，表中的转基因菌株是将NV基因导入 细胞获得的。在构建NV基因表达载体时，需要添加新的标记基因，原因是 。 【答案】(1) 蔗糖 参与蔗糖分解代谢，将蔗糖分解生成葡萄糖 单位时间内葡萄糖的生成量（或蔗糖的减少量等） (2) NV 基因 > T-DNA 插入导致 NV 基因增加部分碱基序列 (3) 突变体 便于筛选出成功导入 NV 基因的细胞 【分析】【关键能力】 （1）信息获取与加工 题干关键信息 所学知识 信息加工 表中有蔗糖一组则有NV酶 蔗糖诱导了NV基因表达，产生NV酶 测NV酶活性时，可用单位时间内，蔗糖的消耗量或葡萄糖的增加量来表示 表中有NV酶一组则有葡萄糖 NV酶可催化蔗糖水解，产生葡萄糖 表中突变体由T-DNA随机插入野生型菌株基因组DNA筛选获得 野生型无T-DNA，扩增时选与NV基因配对的引物 扩增片段突变体长度大于野生型长度，说明突变体构建成功 （2）逻辑推理与论证 【详解】（1）根据表格，野生型菌株加入蔗糖就会合成NV酶，不加就不会合成，推测蔗糖诱导了 NV 基因表达。 分析表可知有NV 酶，菌株就能将蔗糖分解出葡萄糖，因此NV酶可能参与蔗糖的分解代谢过程，将蔗糖分解生成葡萄糖。 检测 NV 酶活性时，可以测定单位时间内葡萄糖的生成量或蔗糖的减少量等。 （2）从题目中可知，突变体是通过 T-DNA 随机插入野生型菌株基因组 DNA 筛选获得的。在进行 PCR 扩增时，使用的引物需要与特定的 DNA 序列配对结合，才能启动 DNA 的扩增。野生型菌株的基因组 DNA 中没有 T-DNA 的插入，所以用与 NV 基因配对的引物进行扩增时，可以扩增出完整的 NV 基因片段。而突变体由于 T-DNA 的随机插入，导致 NV 基因中增加部分序列。这样一来，使用同样的引物进行扩增时，扩增片段的长度就会大于野生型扩增片段的长度。因此若突变体扩增片段长度>野生型扩增片段长度，则表明突变体构建成功。 从基因序列分析其原因是 T-DNA 插入导致 NV 基因增加部分序列。 （3）为进一步验证 NV 基因的功能，表中的转基因菌株是将 NV 基因导入突变体细胞获得的。突变体由于 NV 基因发生突变，无法正常表达 NV 酶，导致相关生理功能缺失或异常。通过将正常的 NV 基因导入突变体细胞，如果能够恢复原本在突变体中缺失或异常的生理功能，就可以有力地证明 NV 基因确实具有特定的功能。 在构建 NV 基因表达载体时，需要添加新的标记基因，原因是便于筛选出成功导入 NV 基因的细胞。 8．（2024·江西·高考真题）聚对苯二甲酸乙二醇酯（PET）是一种聚酯塑料，会造成环境污染。磷脂酶可催化PET降解。为获得高产磷脂酶的微生物，研究人员试验了2种方法。回答下列问题： (1)方法1从土壤等环境样品中筛选高产磷脂酶的微生物。以磷脂酰乙醇酯（一种磷脂类物质）为唯一碳源制备 培养基，可提高该方法的筛选效率。除碳源外，该培养基中至少还应该有 、 、 等营养物质。 (2)方法2采用 技术定向改造现有微生物，以获得高产磷脂酶的微生物。除了编码磷脂酶的基因外，该技术还需要 、 、 等“分子工具”。 (3)除了上述2种方法之外，还可以通过 技术非定向改造现有微生物，筛选获得能够高产磷脂酶的微生物。 (4)将以上获得的微生物接种到鉴别培养基（在牛肉膏蛋白胨液体培养基中添加2%的琼脂粉和适量的卵黄磷脂）平板上培养，可以通过观察卵黄磷脂水解圈的大小，初步判断微生物产磷脂酶的能力，但不能以水解圈大小作为判断微生物产磷脂酶能力的唯一依据。从平板制作的角度分析，其原因可能是 。 【答案】(1) 选择 水 无机盐 氮源 (2) 基因工程（或转基因） 限制酶 DNA连接酶 载体（或质粒） (3)诱变育种 (4)不同平板中培养基量的差异以及平板内和平板间培养基厚度不均匀 【分析】1、培养基的基本成分：水、无机盐、碳源、氮源及特殊生长因子； 2、微生物的接种：微生物接种的方法很多，最常用的是平板划线法和稀释涂布平板法，常用来统计样品活菌数目的方法是稀释涂布平板法。 【详解】（1）方法1从土壤等环境样品中筛选高产磷脂酶的微生物。以磷脂酰乙醇酯为唯一碳源制备选择培养基，在该培养基中只有能利用磷脂酰乙醇酯的微生物能生长，其他微生物的生长被抑制，进而获得筛选出所需要的微生物，为了提高该方法的筛选效率。除碳源外，该培养基中至少还应该有水分、无机盐和氮源等营养物质，同时还需要提供微生物生长所需要的外界环境条件。 （2）方法2采用基因工程技术定向改造现有微生物，以获得高产磷脂酶的微生物。除了编码磷脂酶的基因，即目的基因外，该技术还需要限制酶、DNA连接酶和载体（或质粒）等“分子工具”，进而可以实现目的基因表达载体的构建。 （3）除了上述2种方法之外，还可以通过诱变育种技术非定向改造现有微生物，筛选获得能够高产磷脂酶的微生物，该该技术的原理是基因突变，由于基因突变具有不定向性，因而该技术具有盲目性。 （4）将以上获得的微生物接种到鉴别培养基（在牛肉膏蛋白胨液体培养基中添加2%的琼脂粉和适量的卵黄磷脂）平板上培养，可以通过观察卵黄磷脂水解圈的大小，初步判断微生物产磷脂酶的能力，但不能以水解圈大小作为判断微生物产磷脂酶能力的唯一依据。从平板制作的角度分析，即倒平板过程中没有经过定量检测，且平板倒置的实际可能也会影响平板中培养基厚度的不同，因此不同平板中培养基量的差异以及平板内培养基厚度不均匀以及平板间厚度不均匀都会影响实验结果的判断，因此可采用降解圈的直径和菌落直径的比值作为判断依据。 9．（2024·北京·高考真题）学习以下材料，回答（1）～（4）题。 筛选组织特异表达的基因 筛选组织特异表达的基因，对研究细胞分化和组织、器官的形成机制非常重要。“增强子捕获”是筛选组织特异表达基因的一种有效方法。 真核生物的基本启动子位于基因5'端附近，没有组织特异性，本身不足以启动基因表达。增强子位于基因上游或下游，与基本启动子共同组成基因表达的调控序列。基因工程所用表达载体中的启动子，实际上包含增强子和基本启动子。 很多增强子具有组织特异的活性，它们与特定蛋白结合后激活基本启动子，驱动相应基因在特定组织中表达（图A）。基于上述调控机理，研究者构建了由基本启动子和报告基因组成的“增强子捕获载体”（图B），并转入受精卵。捕获载体会随机插入基因组中，如果插入位点附近存在有活性的增强子，则会激活报告基因的表达（图C）。 获得了一系列分别在不同组织中特异表达报告基因的个体后，研究者提取每个个体的基因组DNA，通过PCR扩增含有捕获载体序列的DNA片段。对PCR产物进行测序后，与相应的基因组序列比对，即可确定载体的插入位点，进而鉴定出相应的基因。 研究者利用各种遗传学手段，对筛选得到的基因进行突变、干扰或过表达，检测个体表型的改变，研究其在细胞分化和个体发育中的作用，从而揭示组织和器官形成的机理。 (1)在个体发育中，来源相同的细胞在形态、结构和功能上发生 的过程称为细胞分化，分化是基因 的结果。 (2)对文中“增强子”的理解，错误的是________。 A．增强子是含有特定碱基序列的DNA片段 B．增强子、基本启动子和它们调控的基因位于同一条染色体上 C．一个增强子只能作用于一个基本启动子 D．很多增强子在不同组织中的活性不同 (3)研究者将增强子捕获技术应用于斑马鱼，观察到报告基因在某幼体的心脏中特异表达。鉴定出捕获载体的插入位点后，发现位点附近有两个基因G和H，为了确定这两个基因是否为心脏特异表达的基因，应检测 。 (4)真核生物编码蛋白的序列只占基因组的很少部分，因而在绝大多数表达报告基因的个体中，增强子捕获载体的插入位点位于基因外部，不会造成基因突变。研究者对图B所示载体进行了改造，期望改造后的载体随机插入基因组后，在“捕获”增强子的同时，也造成该增强子所调控的基因发生突变，以研究基因功能。请画图表示改造后的载体，并标出各部分名称 （略）。 【答案】(1) 稳定性差异 选择性表达 (2)C (3)各组织器官中G和H的mRNA (4) 【分析】【关键能力】 （1）信息获取与加工 题干关键信息 所学知识 信息加工 细胞分化 细胞分化是指在个体发育中，由一个或一种细胞增殖产生的后代，在形态、结构和生理功能上发生稳定性差异的过程 分化是基因选择性表达的结果 基因表达 包括转录和翻译 若要确定这两个基因是否为心脏特异表达的基因，可通过PCR等技术检测其他器官细胞中G和H两个基因是否转录出相应的mRNA （2）逻辑推理与论证 【详解】（1）细胞分化是指在个体发育中，由一个或一种细胞增殖产生的后代，在形态、结构和生理功能上发生稳定性差异的过程。分化是基因选择性表达的结果。 （2）AB、依据题干“增强子位于基因上游或下游，与基本启动子共同组成基因 表达的调控序列”可知,增强子是含有特定碱基序列的DNA片 段，增强子、基本启动子和它们调控的基因位于同一条染色体 上，AB正确； C、由图C可知，一个增强子可作用于多个基本启动子，C错误； C、依据题干“很多增强子具有组织特异的活性”可知，很多增强子在不同组织中的活性不同，D正确。 故选C。 （3）若要确定这两个基因是否为心脏特异表达的基因，可通过PCR等技术检测其他器官细胞中G和H两个基因是否转录出相应的 mRNA。 （4）增强子位于基因上游或下游，与基本启动子共同组成基因表达的调控序列。基因工程所用表达载体中的启动子，实际上包含增强子和基本启动子。增强子捕获载体的插入位点位于基因外部，不会造成基因突变。而当增强子捕获载体的插入位点位于基因内部，会引起造成该增强子所调控的基因发生突变，为研究某目的基因的功能，可将图B所示载体去掉基本启动子，则该载体插入基因内部后才会发挥作用，图如下： 。 10．（2024·北京·高考真题）啤酒经酵母菌发酵酿制而成。生产中，需从密闭的发酵罐中采集酵母菌用于再发酵，而直接开罐采集的传统方式会损失一些占比很低的独特菌种。研究者探究了不同氧气含量下酵母菌的生长繁殖及相关调控，以优化采集条件。 (1)酵母菌是兼性厌氧微生物，在密闭发酵罐中会产生 和CO2。有氧培养时，酵母菌增殖速度明显快于无氧培养，原因是酵母菌进行有氧呼吸，产生大量 。 (2)本实验中，采集是指取样并培养4天。在不同的气体条件下从发酵罐中采集酵母菌，统计菌落数（图甲）。由结果可知，有利于保留占比很低菌种的采集条件是 。 (3)根据上述实验结果可知，采集酵母菌时O2浓度的陡然变化会导致部分菌体死亡。研究者推测，酵母菌接触O2的最初阶段，细胞产生的过氧化氢（H2O2）浓度会持续上升，使酵母菌受损。已知H2O2能扩散进出细胞。研究者在无氧条件下从发酵罐中取出酵母菌，分别接种至含不同浓度H2O2的培养基上，无氧培养后得到如图乙所示结果。请判断该实验能否完全证实上述推测，并说明理由 。 (4)上述推测经证实后，研究者在有氧条件下从发酵罐中取样并分为两组，A组菌液直接滴加到H2O2溶液中，无气泡产生；B组菌液有氧培养4天后，取与A组活菌数相同的菌液，滴加到H2O2溶液中，出现明显气泡。结果说明，酵母菌可通过产生 以抵抗H2O2的伤害。 【答案】(1) 酒精/C2H5OH ATP (2)无氧取样，无氧培养 (3)不能，因为没有“接触 O2 后，酵母菌内源 H2O2 浓度上升”的证据 (4)过氧化氢酶/H2O2 酶 【分析】【关键能力】 （1）信息获取与加工 题干关键信息 所学知识 信息加工 酵母菌 兼性厌氧型微生物 无氧条件（密闭发酵罐）：酵母进进行无氧呼吸，产生酒精和CO2 有氧条件：酵母菌进行有氧呼吸，大量繁殖 研究者探究了不同氧气含量下酵母菌的生长繁殖及相关调控 自变量是不同氧气含量，因变量是酵母菌生长分支即相关调控情况 图甲中，无氧取样，无氧培养条件下，菌落数最多，说明该条件下，占比较低的菌种也会产生菌落，有利于保留占比很低菌种 （2）逻辑推理与论证 【详解】（1）酵母菌在密闭发酵罐中进行无氧呼吸，会产生酒精（C2H5OH）和CO2。有氧培养时，酵母菌进行有氧呼吸，有机物被彻底氧化分解，产生大量能量，而无氧呼吸中有机物不能彻底分解，只产生少量能量，故有氧培养时酵母菌增殖速度明显快于无氧培养。 （2）由图甲结果可知，无氧/无氧条件下，菌落数最多，因此有利于保留占比很低菌种的采集条件是无氧/无氧。 （3）依据图乙结果可知，随着H2O2浓度的持续上升，酵母菌存活率下降（酵母菌受损程度加深），但不能证明酵母菌接触O2的最初阶段，细胞产生的H2O2浓度会持续上升，因为没有“接触 O2 后，酵母菌内源 H2O2 浓度上升”的证据。 （4）过氧化氢酶能催化H2O2分解出现明显气泡，因此实验结果说明，酵母菌可通过产生过氧化氢酶以抵抗H2O2的伤害。 1．（2025·浙江·二模）某二倍体两性植物，抗病与感病、高产与低产、糯性与非糯性分别由A/a、B/b、D/d三对等位基因控制。研究发现在正常条件下，基因表达正常。在干旱环境胁迫下，紧密连锁的基因会受到调控因子的调控而不成功表达。为研究上述性状的遗传特性，进行了如表所示的杂交实验。(不考虑突变和交叉互换；各相对性状呈完全显隐性关系) 组别 环境条件 亲本杂交组合 F₁的表型及比例。 甲 正常条件 抗病高产非糯性×感病低产糯性 全部为抗病高产非糯性 乙 干旱胁迫 抗病高产非糯性×感病低产糯性 全部为抗病低产非糯性 (1)据表分析： ①能判断显隐性的是 组，判断理由是 。 ②甲组F₁随机交配，若子代中抗病高产植株占比为 ，则能推断A与B基因紧密连锁。 (2)在干旱条件下，用乙组 F₁自交获得的F₂中所有抗病低产糯性植株的叶片为材料，通过 PCR 检测每株个体中控制这3种性状的所有等位基因，以辅助确定这些基因在染色体上的相对位置关系。预期对被检测群体中所有个体按PCR 产物的电泳条带组成(即基因型)相同的原则归类后，该群体电泳图谱只有类型I或类型II，如图所示，其中条带④和⑤分别代表基因b和d。 (注：各基因的 PCR 产物通过电泳均可区分) ①图中条带③代表的基因是 ； ②若电泳图谱为类型II，则被检测群体在 F₂中占比为 。 (3)研究发现DR基因产生的调控因子(sRNA)，通过靶向介导紧密连锁基因转录后mRNA的切割实现对高产基因表达的调控，从而使得产量降低。为了获得在干旱条件下的高产品种，利用PCR 技术对DR 基因进行点突变改造，使其不影响高产基因的表达。其过程如图： ①DR 基因的表达包括 过程，其产物通过影响基因表达的 过程实现调控。 ②据图分析，若使A-T突变为G-C，引物2中突变位点(突起)处应设计为 (填“碱基”)。第二阶段，杂交后的DNA分子首先在 酶作用下延伸，然后使用 (引物1、引物2、引物3、引物4)进行PCR 扩增得到突变后的基因。 【答案】(1) 甲 正常条件下，基因正常表达且亲本为相对性状杂交，后代只出现了亲本中的一种性状 3/4 (2) a 3/16 (3) 转录和翻译 翻译 C (Taq)DNA 聚合酶 引物1和引物4 【分析】基因自由组合定律的实质是：位于非同源染色体上的非等位基因的分离或自由组合是互不干扰的；在减数分裂过程中，同源染色体上的等位基因彼此分离的同时，非同源染色体上的非等位基因自由组合 【详解】（1）在正常条件下，基因表达正常，甲环境条件正常，亲本组合抗病高产非糯性×感病低产糯性，F₁的表型及比例全部为抗病高产非糯性，抗病高产非糯性为显性，故能判断显隐性的是甲，理由是正常条件下，基因正常表达且亲本为相对性状杂交，后代只出现了亲本中的一种性状。亲本组合抗病高产非糯性（AABBDD）×感病低产糯性（aabbdd）,产生F1为AaBbDd，F₁随机交配，若A与B基因紧密连锁，则F1为AaBbDd产生配子为ABD、ABd、abD、 abd，子代中抗病高产植株（A-B-——）占比为3/4， （2）在干旱条件下，抗病高产非糯性（AABBDD）×感病低产糯性（aabbdd）,产生F1为AaBbDd，F₁自交获得的F₂中所有抗病低产糯性植株的叶片为材料，在干旱环境胁迫下，紧密连锁的基因会受到调控因子的调控而不成功表达。F₂中所有抗病低产糯性植株有A-B-dd、A-bbdd,通过 PCR 检测每株个体中控制这3种性状的所有等位基因，条带④和⑤分别代表基因b和d。Ⅰ类型中左列含④b，有四种基因，基因型可能是AaBbdd,右列不含④b，有三种基因，基因型可能是AABBdd,Ⅰ类型和Ⅱ类型都有①（A)，Ⅱ类型中左列3种基因，含有基因b和d，基因型可能为AAbbdd,右列4种基因，含有基因b和d，基因型可能为Aabbdd、AABbdd，综上分析，图中条带③代表的基因是a。若电泳图谱为类型II，即A与b紧密连锁，则被检测群体在 F₂中占比为3/16. （3）DR 基因的表达包括转录和翻译过程，DR基因产生的调控因子(sRNA)，通过靶向介导紧密连锁基因转录后mRNA的切割实现对高产基因表达的调控，从而使得产量降低。故其产物通过影响基因表达的翻译过程实现调控。 据图分析，若使A-T突变为G-C，引物2中突变位点(突起)处应设计为C，第二阶段，杂交后的DNA分子首先在(Taq)DNA 聚合酶作用下延伸，然后使用引物1和引物4进行PCR 扩增得到突变后的基因。 2．（2025·浙江·二模）甲流病毒是一种RNA 包膜病毒。机体感染后容易表现为口渴、高热、肌肉酸痛等症状。下图是其引发高热过程的部分示意图。 (注：a表示某物质；①表示某种神经；EP：内源性致热源；PGE：前列腺素)    (1)甲流病毒通过表面的蛋白质与细胞膜上的 结合后侵入宿主细胞。当机体感染时，识别感染源的淋巴细胞主要在 截获抗原，并启动特异性免疫应答。 (2)下面对发热症状者进行检测的方法中，能确诊感染甲流病毒的有 A．核酸检测 B．血常规检测 C．抗原检测 D．血清检测 (3)据图分析，能直接使体温调节中枢“调定点”上移的条件有 ，①属于 (填“交感”、“副交感”)神经，发热者出现肌肉酸痛的可能原因是 。 (4)研究发现前列腺素受体激动剂(W)也能影响体温且不同剂量的W对体温的影响不同。研究人员欲通过脑室注射手术的方法探究其作用机制及与PGE的关联性。请完善下列实验：实验材料及试剂：若干体重相同的雄性大鼠、人工脑脊液、用人工脑脊液配制的高(200 ng/ rat)、中(100 ng/ rat)、低(50ng/ rat)三种剂量的 W溶液、PGE(150ng/ rat)及手术相关器具。 实验材料及器具的预处理： ①动物的适应与分组：实验室环境及模拟实验操作1 周，正式实验前两天同一时间分别测定直肠温度(Tr)，与实验当天同一时间 Tr 的 作为基础体温，同时舍弃3次 Tr中最高值与最低值之差大于0.5℃的大鼠。符合要求的大鼠随机分成七组。 ②防污染措施：所用玻璃器材及手术器械等耐热器具经 180℃、2h干热消毒；液体制剂经 滤过灭菌。 实验分组及操作： 第1组：正常大鼠组(不做任何操作)； 第2组: ; 第3组: ; 第4、5、6组：高浓度 W组、中浓度W组、低浓度 W组； 第7组: PGE组。 用微量进样器侧脑室注射相应制剂，总体积为10uL，推注时间30s。侧脑室注射后连续观察体温2h, 测温间隔30min。计算 。实验的结果：    实验结论: (答2点) 【答案】(1) 受体 淋巴结和脾脏 (2)ACD (3) PGE(增加)和Na⁺/Ca²⁺ 比值(增加) 交感神经 肌肉剧烈运动进行厌氧呼吸导致乳酸堆积 (4) 平均值 G6玻璃砂漏斗 假手术/人工脑脊液 人工脑脊液/假手术 各测定时间点体温与基础体温差值 ①高、中剂量W 可以诱导明显的发热反应，小剂量不能诱导明显的发热反应；②大、中剂量W 强于 PGE 且作用较后者持久；③假手术和脑室注射人工脑脊液对大鼠体温无明显影响；④前列腺素可能主要通过前列腺素受体诱导大鼠发热 【分析】体温调节是指温度感受器接受体内、外环境温度的刺激，通过体温调节中枢的活动，相应地引起内分泌腺、骨骼肌、皮肤血管和汗腺等组织器官活动的改变，从而调整机体的产热和散热过程，使体温保持在相对恒定的水平。 【详解】（1）病毒与细胞膜表面的受体结合，侵入细胞；淋巴结和脾脏是截获抗原的主要部位。 （2）A、检测有无甲流病毒的RNA，可以确诊感染甲流病毒，A正确； B、血常规检测不能确定一定是感染甲流病毒，B错误； C、检测是否存在甲流病毒的蛋白质（抗原），可以确诊感染甲流病毒，C正确； D、血清检测可以检测是否存在针对甲流病毒的抗体，来确诊是否感染甲流病毒，D正确。 故选ACD。 （3）结合图示可知，PGE(增加)和Na⁺/Ca²⁺ 比值(增加)，会使“调定点”上移；交感神经系统通过作用于肾上腺髓质使其分泌肾上腺素，使得皮肤血管收缩，散热减少；肌肉剧烈运动进行厌氧呼吸导致乳酸堆积，导致发热者出现肌肉酸痛。 （4）①几天的同一时间的温度，取平均值，作为基础体温，可以排除偶然因素的干扰。②液体制剂可以经G6玻璃砂漏斗进行过滤除菌，避免高温等其它方式对制剂的破坏；要研究不同剂量的W对体温的影响且与PGE的关联性，实验分为7组，1组为正常组，2组为假手术，排除手术本身的影响，3组为人工脑脊液组，人工脑脊液是W试剂的溶剂，可以排除溶剂本身的干扰；计算各测定时间点体温与基础体温差值，以推测W对体温的影响及与PGE的关联；结合图示可知，①高、中剂量W 可以诱导明显的发热反应，小剂量不能诱导明显的发热反应；②大、中剂量W 强于 PGE 且作用较后者持久；③假手术和脑室注射人工脑脊液对大鼠体温无明显影响；④前列腺素可能主要通过前列腺素受体诱导大鼠发热。 3．（2025·浙江·二模）灵芝是一种药用真菌，它的多糖和三萜类化合物是主要的活性物质，具有抗氧化、抗癌、抗衰老等多种生理功能。科研者通过多种育种方式的结合选育出具有优良性状的菌种，再利用液态深层发酵技术生产功能活性物质。 (1)育种 ①获得原生质体：活化的原始菌种培养4-5天，对发酵液进行 操作，取菌体加入已灭菌的溶壁酶和较高渗透压的甘露醇溶液进行酶解获得原生质体，利用 (填仪器)对其进行显微镜观察计数。 ②人工诱导变异：对原生质体进行化学诱导选育出高产多糖的菌种A和高产三萜类化合物的B，其育种原理是 。相对于整个细胞，诱导原生质体更容易达到目的，原因是 。 ③诱导原生质体融合：对菌种A、B的原生质体加入聚乙二醇和 Ca²⁺辅助诱导剂诱导融合，进一步 出具有同时高产多糖和三萜类化合物的新菌种Y。Ca²⁺辅助诱导剂作用机理可能是 。 (2)深层液体发酵 基本过程：菌种Y→试管斜面培养→摇瓶种子培养→繁殖罐培养→发酵罐培养→发酵产品处理。 ①菌种是发酵工业的关键，用于发酵生产的菌种Y除了高产多糖和三萜类化合物外，还应满足的条件有 A．菌种发酵产物易于分离            B．培养基来源充足且廉价，被转化的效率高 C．菌种遗传特性和生产能力稳定      D．菌种对环境没有明显危害 ②摇瓶培养的目的是 。深层发酵技术相较于传统农业栽培具有 等方面的优势。 ③优化培养条件是发酵生产高效顺利进行的重要措施。科研者以葡萄糖、蛋白胨、pH值三个因素为自变量，以获得较高灵芝浸膏多糖产量，实验结果见表。 试验序号 A．葡萄糖浓度(%) B．蛋白胨(%) C． pH值 灵芝浸膏多糖含量(%) 菌丝干重(g/100mL) 1 1(2%) 1(0.2%) 1(pH5.0) 10.3 14.9 2 1(2%) 2(0.4%) 2(pH6.0) 11.2 16.5 3 1(2%) 3(0.6%) 3(pH7.0) 10.8 15.2 4 2(3%) 1(0.2%) 3(pH7.0) 8.9 10.6 5 2(3%) 2(0.4%) 2(pH6.0) 9.2 12.4 6 2(3%) 3(0.6%) 1(pH5.0) 7.1 9.9 7 3(4%) 1(0.2%) 2(pH6.0) 8.1 10.2 8 3(4%) 2(0.4%) 3(pH7.0) 7.2 8.6 9 3(4%) 3(0.6%) 1(pH5.0) 6.8 8.4 从表中可得，对灵芝浸膏多糖含量影响最重要的因素为 。当培养基组成为 为最优条件组合。 【答案】(1) 离心/沉淀 血细胞计数板 基因突变 原生质体无细胞壁对诱导剂更加敏感(防止细胞壁的存在，对诱导剂的作用效果有影响) 筛选 增加细胞膜的通透性/膜的流动性/膜成分的运动性 (2) ABCD 增加菌体和培养液及氧气的接触面积(或扩大培养) 缩短生产周期、提高产量及可控的产品质 葡萄糖浓度(A) AlB2C2 【分析】1、植物组培技术： （1）过程：在无菌条件下，将植物器官或组织（如芽、茎尖、根尖或花药）的一部分切下来，用纤维素酶与果胶酶处理用以去掉细胞壁，使之露出原生质体，然后放在适当的人工培养基上进行培养，这些器官或组织就会进行细胞分裂，形成新的组织。不过这种组织没有发生分化，只是一团薄壁细胞，叫做愈伤组织。在适合的光照、温度和一定的营养物质与激素等条件下，愈伤组织便开始分化，产生出植物的各种器官和组织，进而发育成一棵完整的植株； （2）技术原理：植物组织培养即植物无菌培养技术，又称离体培养，是根据植物细胞具有全能性的理论； 2、植物体细胞杂交技术，又称原生质体融合技术，是指将植物不同种、属，甚至科间的原生质体通过人工方法诱导融合，然后进行离体培养，使其再生杂种植株的技术。植物细胞具有细胞壁，未脱壁的两个细胞是很难融合的，植物细胞只有在脱去细胞壁成为原生质体后才能融合，所以植物的细胞融合也称为原生质体融合。 【详解】（1）要获得菌体，对发酵液应进行离心操作，使菌体沉淀下来，从而与发酵液中的其他成分分离； 对原生质体进行显微镜观察计数，常用血细胞计数板； 对原生质体进行化学诱导选育菌种，其育种原理是基因突变，化学诱导剂能使基因结构发生改变，从而产生新的性状； 相对于整个细胞，诱导原生质体更容易达到目的，原因是原生质体无细胞壁，对诱导剂更加敏感，诱导剂更容易进入细胞内部，从而更容易引起基因突变； 对融合后的原生质体要筛选出具有同时高产多糖和三萜类化合物的新菌种Y ； Ca2+辅助诱导剂作用机理可能是增加细胞膜的通透性（或膜的流动性或膜成分的运动性），促进原生质体的融合； （2）①A、菌种发酵产物易于分离，这样便于后续的产品提取和纯化，若产物难以分离，会增加生产成本和工艺难度，A合理； B、培养基来源充足且廉价，被转化的效率高，可降低生产成本，提高生产效益，是菌种应满足的条件之一，B合理； C、菌种遗传特性和生产能力稳定，才能保证发酵生产的稳定性和可重复性，若菌种特性不稳定，会导致产品质量和产量波动较大，不利于工业化生产，C合理； D、菌种对环境没有明显危害，这是从环保和安全角度考虑，避免对环境造成不良影响，也是菌种需要满足的条件，D合理。 故选ABCD； ②摇瓶培养的目的是增加菌体和培养液及氧气的接触面积(或扩大培养)，使其达到一定的浓度，为后续的繁殖罐培养和发酵罐培养提供充足的种子；深层发酵技术相较于传统农业栽培具有缩短生产周期、提高产量及可控的产品质等方面的优势； ③分析表格数据，当葡萄糖浓度从1(2%)变为2(3%)再变为3(4%)时，灵芝浸膏多糖含量有明显变化；蛋白胨从1(0.2%)变为2(0.4%)再变为3(0.6%)时，灵芝浸膏多糖含量变化相对较小；pH值从1(pH5.0)变为2(pH6.0)再变为3(pH7.0)时，灵芝浸膏多糖含量变化也不如葡萄糖浓度变化明显。所以对灵芝浸膏多糖含量影响最重要的因素为葡萄糖浓度（A）；从表格中可以看出，灵芝浸膏多糖含量最高的是试验序号2，其对应的培养基组成是葡萄糖浓度为1（2%）、蛋白胨浓度为2（0.4%）、pH值为2（pH6.0），所以当培养基组成为葡萄糖浓度为2%、蛋白胨浓度为0.4%、pH值为6.0时为最优条件组合，即AlB2C2为最优条件组合。 4．（2024·浙江嘉兴·一模）小鼠淋巴细胞常作为免疫学研究的模型。回答下列问题： (1)淋巴细胞都起源于造血干细胞分化而来的 细胞。T淋巴细胞在 中成熟，该过程包括早期发育、阳性选择和阴性选择三个阶段。其中阳性选择保留了能识别自身MHC分子的T淋巴细胞，其余T细胞将通过 而淘汰；通过阴性选择，将能与 （填“自身抗原-MHC复合体”“异体抗原-MHC复合体”）结合的T淋巴细胞淘汰，一定程度上避免了自身免疫病的发生。 (2)获取小鼠淋巴细胞的主要步骤如下：Ⅰ将小鼠脾脏置于冰缓冲液（PBS）研磨，获得细胞悬液；Ⅱ细胞悬液中加入分离液后离心，分为上层、中间层和底层；Ⅲ吸取中间层，加入含多种离子的等渗的红细胞裂解液，红细胞吸水涨破；Ⅳ经离心获得淋巴细胞。 ①步骤Ⅰ中，加入缓冲液的目的是维持pH和 的稳定。 ②步骤Ⅱ中，上层液体除PBS、分离液外，还来自于血浆、组织液、淋巴和 ；底层主要是 。 ③步骤Ⅲ中，红细胞比淋巴细胞更易 ，细胞内渗透压增大，红细胞吸水涨破。 (3)利用小鼠B淋巴细胞制备的单克隆抗体（鼠源抗体）注入人体，可能引起HAMA效应（人抗鼠反应），这是因为人体内活化了的B淋巴细胞分泌抗 的抗体。B淋巴细胞的活化需要鼠源抗体与人B淋巴细胞表面的 结合，还需要与 细胞表面受体结合作为第二信号以及细胞因子的作用。 【答案】(1) 淋巴干 胸腺 细胞凋亡 自身抗原-MHC复合体 (2) 离子浓度 细胞内液 红细胞 吸收裂解液中的离子 (3) 鼠源抗体 抗原受体 活化的辅助性T 【分析】单克隆抗体制备的过程中，需要经过动物细胞的培养和动物细胞的融合，单克隆抗体的特点是特异性强、灵敏度高、可大量制备。抗体的化学本质是蛋白质，合成场所是核糖体，需要经过内质网的加工才能形成特定的空间结构，即内质网是蛋白质加工的主要场所。 【详解】（1）淋巴细胞都起源于淋巴干细胞，淋巴干细胞由造血干细胞分化而来。T淋巴细胞迁移到胸腺中成熟，该过程包括早期发育、阳性选择和阴性选择三个阶段。其中阳性选择保留了能识别自身MHC分子的T淋巴细胞，其余T细胞将通过细胞凋亡而淘汰；通过阴性选择，将能与自身抗原-MHC复合体结合的T淋巴细胞淘汰，防止攻击自身细胞，一定程度上避免了自身免疫病的发生。 （2）①步骤Ⅰ中，加入缓冲液可以维持pH和离子浓度的稳定，保证细胞生命活动正常的pH和渗透压。 ②步骤Ⅱ中，上层液体除PBS、分离液外，还来自于血浆、组织液、淋巴和细胞内液；底层主要是红细胞。 ③步骤Ⅲ中，吸取中间层，加入含多种离子的等渗的红细胞裂解液，红细胞比淋巴细胞更易吸收裂解液中的离子，细胞内渗透压增大，红细胞吸水涨破。 （3）利用小鼠B淋巴细胞制备的单克隆抗体（鼠源抗体）注入人体，可能引起HAMA效应（人抗鼠反应），因为单克隆抗体是鼠源抗体，鼠源抗体对人体来讲是外来抗原物质，则人体内活化了的B淋巴细胞能分泌抗鼠源抗体的抗体。鼠源抗体与人B淋巴细胞表面的抗原受体结合，活化的辅助性T细胞表面受体结合作为第二信号以及细胞因子的作用，活化B淋巴细胞，B淋巴细胞分裂分化为浆细胞和记忆B细胞。 5．（2024·浙江嘉兴·一模）愈创木烷型内酯具有药用活性，在植物中含量很低，其内酯基团决定其药用价值。在特种细胞色素作用下，细胞内化合物可以形成内酯基团。中国科研人员将这一特种细胞色素基因导入了酵母细胞，结合大根香叶烯A酸合成通路的引入，发现人工构建的酵母工程菌能够合成具有药用价值的内酯化合物。回答下列问题： (1)酵母细胞的转化流程大致如下：低浓度醋酸锂溶液处理酵母细胞；加入重组质粒和35%的聚乙二醇并在30℃水浴1小时；42℃转化5分钟；室温下培养筛选。用低浓度锂离子溶液处理酵母细胞的目的，是使酵母细胞暂时进入 ，有利于重组质粒的导入。聚乙二醇的作用是保护细胞膜和促进 黏附于酵母细胞膜表面。 (2)鉴定转基因酵母细胞时常采用核酸分子杂交法，大致流程如下图。 电泳前需利用 酶处理获取的DNA．变性和转膜的目的是将凝胶中的DNA变成单链并转移至硝酸纤维素膜上，DNA变成单链的目的是便于与 结合。硝酸纤维素膜可通过静电吸附DNA，因为DNA具有 而带负电。检测时应洗去 ，再观察结果。 (3)转基因酵母的工业发酵受很多因素影响。发酵过程中多采用补加氨水的方法来调节发酵液中的 ，同时氨水也可以作为酵母菌的 ，使菌体快速生长。发酵罐中溶解氧回升，表明酵母细胞处于“饥饿”状态，需要及时补充 。 【答案】(1) 感受态 重组质粒 (2) 限制性内切核酸 探针 磷酸基团 多余探针 (3) pH 氮源 碳源 【分析】基因工程的四个基本步骤包括：目的基因的获取、基因表达载体的构建、将目的基因导入受体细胞、目的基因的检测与鉴定‌。‌ 【详解】（1）用低浓度锂离子溶液处理酵母细胞的目的，是使酵母细胞暂时进入感受态，感受态细胞能够更容易吸收外界的DNA，从而有利于重组质粒的导入。聚乙二醇的作用是保护细胞膜和促进重组质粒黏附于酵母细胞膜表面，这样有助于重组质粒进入酵母细胞。 （2）电泳前需利用限制性核酸内切酶处理获取的DNA，这样可以将DNA切割成合适大小的片段以便于电泳分析。-变性和转膜的目的是将凝胶中的DNA变成单链并转移至硝酸纤维素膜上，DNA变成单链的目的是便于与探针结合，核酸探针是一段带有标记（如放射性标记或荧光标记等）的单链核酸序列，它能够与目标DNA单链特异性结合。 硝酸纤维素膜可通过静电吸附DNA，因为DNA具有磷酸基团而带负电。检测时应洗去未结合的多余探针，这样可以减少背景干扰，再观察结果。 （3）发酵过程中多采用补加氨水的方法来调节发酵液中的pH，因为发酵过程中微生物的代谢会改变发酵液的pH值，通过添加氨水可以维持适宜的pH环境。 同时氨水也可以作为酵母菌的氮源，氮元素是微生物生长所必需的营养元素，使菌体快速生长。发酵罐中溶解氧回升，表明酵母细胞处于“饥饿”状态，需要及时补充营养物质（如碳源等），因为酵母细胞在进行有氧呼吸时会消耗氧气和营养物质，当溶解氧回升时说明酵母细胞缺乏营养物质而减少了对氧气的消耗。 6．（2024·浙江绍兴·模拟预测）科研人员对蓝细菌的光合放氧、呼吸耗氧、ATP含量和14C固定率等进行了系列研究。图1是蓝细菌光合作用部分过程，图2是蓝细菌相对密度对光合放氧和呼吸耗氧影响的曲线图。回答下列问题： (1)蓝细菌类囊体膜的成分除了磷脂、蛋白质以外还应具有 ，图1中结构a具有 的功能，光反应产生的ATP和NADPH在 中将C3转变为（CH2O）。 (2)将蓝细菌培养液进行一定浓度梯度稀释，用 对蓝细菌进行计数。在相应密度下测定氧气变化速率，建立相关曲线如图2，其中光合放氧的曲线是 ，理由为 。 (3)已知NH4Cl可消除类囊体膜内外的质子梯度（△H+），科研人员利用不同浓度的NH4Cl溶液处理蓝细菌，测定ATP的相对含量，结果如图3所示。 ①实验结果： 。 ②出现上述结果的原因： 。 (4)蓝细菌在高密度培养时，由于互相遮挡，菌体环境也会出现光线强弱变化，从而影响光合速率。为验证该现象选用如下______条件组合进行实验，定时测定14C固定率和胞内ATP浓度。 A．持续光照 B．光暗交替 C．培养基中加入NaH14CO3 D．培养基中加入14C6H12O6 【答案】(1) 光合色素 ATP合酶和通道蛋白（催化和运输） 细胞溶胶（细胞质基质） (2) 血细胞计数板 乙 光合作用产生氧气的量开始时会随着蓝细菌密度的增加而增加，但当密度过高时反而会下降 (3) 随着NH4Cl溶液浓度的增加类囊体产生ATP的相对含量减少 NH4Cl能消除内外质子梯度（△H+）从而降低质子动力势能 (4)AC 【分析】1、蓝细菌为原核生物，蓝细菌细胞内含有藻蓝素和叶绿素，是能进行光合作用的自养生物。蓝细菌暗反应的场所为细胞质基质。 2、光合作用通常是指绿色植物(包括藻类)吸收光能，把二氧化碳和水合成富能有机物，同时释放氧气的过程。光合作用分为光 反应阶段和暗反应阶段。光反应阶段的特征是在光驱动下生成氧气、ATP和NADPH的过程。暗反应阶段是利用光反应生成 NADPH和ATP进行碳的同化作用，使气体二氧化碳还原为糖。由于这阶段基本上不直接依赖于光，而只是依赖于NADPH和ATP的提供，故称为暗反应阶段。 【详解】（1）蓝细菌为原核生物，无叶绿体，但能进行光合作用，因为类囊体膜的成分除了磷脂、蛋白质以外还具有光合色素，ADP＋Pi在结构a的作用下形成ATP，说明结构a具有ATP合成酶的催化功能，同时H+通过结构a运出类囊体，此时结构a起到运输的功能，光反应产生的ATP和NADPH在暗反应中被利用，蓝细菌暗反应的场所为细胞质基质。 （2）将蓝细菌培养液进行一定浓度梯度稀释，用血细胞计数板对蓝细菌进行计数。图2中曲线甲随蓝细菌相对密度的增大而增大，是耗氧的曲线，曲线乙开始时会随着蓝细菌密度的增加而增加，但当密度过高时由于互相遮挡，光合速率下降，曲线乙也下降，是放氧曲线。 （3）分析图3可知，随着NH4Cl溶液浓度的增加类囊体产生ATP的相对含量减少。出现上述结果的原因是NH4Cl能消除类囊体膜内外质子梯度（△H+）从而降低质子动力势能，由图1可知，类囊体膜内外质子动力势能为ATP的形成提供能量，故随着NH4Cl溶液浓度的增加类囊体产生ATP的相对含量减少。 （4）蓝细菌在高密度培养时，由于互相遮挡，菌体环境也会出现光线强弱变化。为验证该现象，可使用持续光照和培养基中加入NaH14CO3进行实验探究，在选材料时应该选择高浓度蓝细菌，才能达到实验环境的要求，光反应为暗反应提供ATP和NADPH，光反应正常进行进而保证暗反应的正常进行，故实验条件应该是持续光照，由于蓝细菌光合作用暗反应阶段利用的是二氧化碳，故需要给培养基中加入NaH14CO3而非14C6H12O6，实时测量14C固定率和胞内ATP浓度。 故选AC。 7．（2024·浙江绍兴·模拟预测）研究人员利用基因编辑技术和体细胞克隆技术成功获得了载脂蛋白E（ApoE）基因和低密度脂蛋白受体（LDLR）基因双敲除（即两个基因都失活）的五指山小型猪，该小型猪在饲喂普通饲料的情况下会出现高血脂，并能自发产生明显的动脉粥样硬化（AS），为后继研究提供了重要的AS动物模型。 回答下列问题： (1)基因编辑载体构建。从 中获取猪的ApoE和LDLR基因序列，设计相应引物，人工合成。将pX458质粒酶切后电泳，加样孔在 极一端，上样缓冲液中需要加入少许 ，它迁移速度较快，在其迁移出凝胶前停止电泳。胶回收产物与引物连接，转化处于 的大肠杆菌，经过筛选、DNA测序确认目标大肠杆菌，将菌液扩增培养，提取质粒备用。 (2)体细胞电转和鉴定。用 擦拭30日龄雌性和雄性猪耳朵消毒，剪取耳组织，眼科剪剪碎，用胰蛋白酶或 等分散耳组织，筛选分散细胞中的成纤维细胞作为初始材料进行 培养。贴壁细胞达到生长基质80%表面面积后，37.5℃，用0.1%胰蛋白酶处理2分钟，加入5倍体积的细胞培养液以 ，制成细胞悬液。将质粒和成纤维细胞置于离心管中，用电击法处理，分选、鉴定、 得到目标成纤维细胞株。 (3)细胞核移植。从屠宰场收集卵巢，人工抽取卵母细胞，在培养液中培养42~44小时至其 ，去除细胞核，将目标成纤维细胞与去核卵细胞进行电融合，电融合可以促进细胞融合，同时还起到 的作用。 (4)胚胎移植。由于 ，胚胎移植成为胚胎工程中获得后代的唯一方法。选择手术移植前一天开始 的母猪作为代孕母体，将发育良好的囊胚植入输卵管，共出生健康的F0代雌性仔猪22头，雄性仔猪10头。 (5)仔猪鉴定、检测和繁育。提取仔猪耳部细胞DNA，PCR扩增目的基因，PCR时预变性时间较长的目的是 ，以利于引物更好的和模板结合。通过凝胶电泳回收扩增产物，测序结果显示32头仔猪均为ApoE和LDLR两基因双敲猪。使用普通饲料饲养克隆猪，产生了明显的AS，这属于 水平的检测。F0代新生仔猪自然交配，F1代仔猪都是ApoE和LDLR两基因双敲猪，表明 ，为医学应用提供理想的实验群体。 【答案】(1) 基因（DNA序列）数据库 负 电泳指示剂（溴酚蓝） 感受态 (2) 酒精棉/75%酒精 胶原蛋白酶 原代 终止消化 克隆培养 (3) 成熟 激活重组细胞发育 (4) 无法对哺乳动物进行全体外胚胎培养 发情 (5) 使模板DNA充分变性 个体 F0代仔猪都是ApoE/LDLR两基因双敲除纯合子（克隆猪都能稳定遗传） 【分析】基因工程技术的基本步骤：（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法。（4）目的基因的检测与鉴定：分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA是否插入目的基因——DNA分子杂交技术；②检测目的基因是否转录出了mRNA——分子杂交技术；③检测目的基因是否翻译成蛋白质——抗原—抗体杂交技术。个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。 【详解】（1）可从基因（DNA序列）数据库中获取猪的ApoE和LDLR基因序列，设计相应引物，人工合成目的基因。进行电泳时，加样孔在负极一端，电泳时需将待测样品与.上样缓冲液混合后加入加样孔，缓冲液中含有的溴酚蓝作为电泳指示剂，通过该指示剂可显示溴酚蓝在凝胶中的扩散速率，而溴酚蓝在凝胶中的扩散速率比DNA的扩散速率快，故可以防止条带迁移出凝胶。转化即将目的基因导入受体细胞并使其表达，处于感受态的大肠杆菌易于吸收周围的DNA分子，所以选择感受态的大肠杆菌进行转化。 （2）常选用75%的酒精用于消毒。分散动物组织，常用胰蛋白酶或胶原蛋白酶。初始材料培养称为原代培养。培养一段时间后，细胞贴壁生长，需用0.1%胰蛋白酶处理2分钟，加入5倍体积的细胞培养液以终止消化，制成细胞悬液。将质粒和成纤维细胞置于离心管中，用电击法处理，使质粒转入成纤维细胞，经分选、鉴定、克隆化培养后即可得到目标成纤维细胞株。 （3）从屠宰场收集卵巢，人工抽取卵母细胞，在培养液中培养42~44小时至其成熟（减数第二次分裂中期），去除细胞核，将目标成纤维细胞与去核卵细胞进行电融合，电融合可以促进细胞融合，同时还可以激活重组细胞，使其开始发育。 （4）目前还不能对哺乳动物进行全体外胚胎培养，只能进行胚胎移植获得后代。对受体母猪需进行同期发情处理，即择手术移植前一天开始发情的母猪作为代孕母体，将发育良好的囊胚植入输卵管，是胚胎进一步发育成完整个体。 （5）高温可是DNA变性，PCR时预变性时间较长的目的是使模板DNA充分变性以利于引物更好的和模板结合。题干所述检测是对仔猪进行检测，属于个体水平的检测。F0代新生仔猪自然交配，F1代仔猪都是ApoE和LDLR两基因双敲猪，不出现性状比，表明亲本是F0代仔猪都是ApoE/LDLR两基因双敲除纯合子。 8．（2025·浙江温州·二模）帕金森病是常见的中枢神经系统疾病。酪氨酸羟化酶在帕金森病中起着关键作用，其表达水平的下降与帕金森病的病理过程密切相关。当前研究发现由干细胞分泌的外泌体对该病有一定的治疗作用，回答下列问题。    (1)如图所示，外泌体是一类包含有复杂成分的小膜泡，干细胞分泌外泌体的方式为 ，这种方式体现了细胞膜具有 的结构特点。外泌体与其他细胞膜上的 结合后，将信息传递给靶细胞，发挥调节作用。 (2)为验证干细胞分泌的外泌体对帕金森病有一定的治疗作用，根据以下材料和用具，完善实验思路，设计实验记录表。 材料和用具：正常小鼠若干只，生理盐水配制的MPTP溶液（腹腔注射，用于制备急性帕金森小鼠模型），缓冲液配制的外泌体溶液（静脉注射），生理盐水，缓冲液等。 （要求与说明：实验中涉及的剂量不作具体要求。旋转试验可用于评估小鼠神经系统的功能，其结果可用转圈数进行表示。） ①完善实验思路： 将45只正常小鼠随机分为A、B、C三组，每组15只，其中B、C两组 ，制备成急性帕金森病小鼠模型； A组、B组 ，C组 。 将小鼠置于相同且适宜的条件下饲养，并在T1、T2、T3天， 。 进行数据的统计与分析。 ②设计一张表格，用于记录实验数据。 。 ③实验结果表明，使用外泌体治疗后，在一定时间范围内帕金森病小鼠转圈数明显减少，说明外泌体对帕金森病有一定的治疗作用。请结合信息预测A、B、C三组小鼠体内酪氨酸羟化酶的表达量大小： 。结合上述研究，除注射外泌体外，请再提出1种可能的治疗帕金森病的思路： 。 【答案】(1) 胞吐 一定的流动性 受体 (2) 腹腔注射MPTP溶液 腹腔注射生理盐水 静脉注射外泌体溶液 对每组小鼠进行旋转实验，记录转圈数 A组 > C组 > B组 通过基因治疗提高酪氨酸羟化酶基因的表达量 【分析】一些大分子的物质可以通过胞吞、胞吐的方式进出细胞，体现了细胞膜的流动性。 【详解】（1）外泌体是一类包含有复杂成分的小膜泡，外泌体通过胞吐释放，体现细胞膜具有一定的流动性；外泌体通过膜表面配体与靶细胞受体结合传递信息，发挥调节作用。 （2）①根据题意信息可知，为了验证干细胞分泌的外泌体对帕金森病有一定的治疗作用，可以将45只正常小鼠随机分为A、B、C三组，每组15只，其中B、C两组腹腔注射MPTP溶液，制备成急性帕金森病小鼠模型。 ②A组腹腔注射生理盐水（正常对照），B组腹腔注射生理盐水（模型对照），C组腹腔注射缓冲液配制的外泌体溶液（治疗组）。将小鼠置于相同且适宜条件下饲养，并在T1、T2、T3天进行旋转试验，记录各组小鼠的转圈数。由此设计表格可以记录实验数据， 。 ③因为帕金森模型（B组）酶表达下降，外泌体治疗（C组）部分恢复，正常组（A组）最高。所以预测酪氨酸羟化酶表达量为A组 > C组 > B组 。通过基因治疗提高酪氨酸羟化酶基因的表达量可治疗帕金森病。 9．（2025·浙江·二模）某科研团队为了验证农杆菌转化植物的功能，利用长冠瘿瘤的葡萄植株根据科学史上一系列研究进行了以下实验。请回答下列问题： (1)切下冠瘿瘤的一部分，经 后，取液体部分，稀释后利用 法接种至LB固体培养基中，获得较好分散度的单菌落。 (2)分别取平板上的每个单菌落制成菌悬液后，侵染植物愈伤组织，结果发现只有部分菌落的菌种能致瘤，说明 。接种一段时间后杀死农杆菌，发现冠瘿瘤的生长不再依赖于农杆菌，且冠瘿组织的无限生长不需要外源的植物激素，原因是 。 (3)取其中致瘤的农杆菌菌种，接种至LB液体培养基进行 ，48h后提取其中的DNA并通过 分离纯化得到其中的质粒DNA，发现质粒DNA分子量大于处在相同位置的线性Marker DNA，说明等分子量的 迁移速率更大。 (4)科研团队还研究了质粒中Vir系列基因的作用，发现敲除农杆菌内质粒上的VirC与VirD基因后，无法合成 酶从而无法在农杆菌内切割与复制得到游离的T-DNA。而将农杆菌内质粒上的VirE基因敲除后，侵染愈伤组织发现不再致瘤，且农杆菌胞内会出现被自身核酸酶切割后的不等长T-DNA片段，说明VirE基因表达产物的作用是 。 (5)将农杆菌分为两组，分别将GFP（绿色荧光蛋白）基因连接至甲组农杆菌质粒的T-DNA内部基因启动子下游与乙组农杆菌质粒的T-DNA外部基因启动子下游。侵染愈伤组织后，可在甲组 中检测到绿色荧光，乙组 中检测到绿色荧光，原因是 。 【答案】(1) 研磨（破碎） 与过滤（离心） 稀释涂布平板 (2) 冠瘿瘤表面或内部含有农杆菌与其他微生物 农杆菌中的T-DNA已经转移至植物细胞内 ，且T-DNA中含有相关植物激素合成基因并能在植物细胞内成功表达 (3) 扩大培养 电泳 质粒/环状DNA (4) 限制酶与DNA聚合酶 保护T-DNA，避免被农杆菌自身的核酸酶降解 (5) 愈伤组织/植物细胞 农杆菌细胞 T-DNA内部基因启动子在植物细胞内发挥作用而T-DNA外部基因启动子在农杆菌中发挥作用 【分析】1、微生物接种方法： （1）平板划线接种法：平板划线接种法主要用于分离和纯化微生物，通过划线使微生物在琼脂平板上分散生长，形成单个菌落。  ‌分区划线法‌：将平板分为四个区域，依次划线，每划完一个区域后需烧灼接种环以稀释菌液，最终在第四区获得单个菌落；连续划线法‌：在平板上连续划线，无需分区，适用于菌液浓度较低的情况； （2）稀释涂布平板法：将一定量的菌液滴加在平板上，用无菌涂布耙均匀涂布，使菌液分散至整个平板表面，培养后挑取单个菌落，适用于菌液浓度较低或需要均匀分布的情况； 2、基因表达载体包括目的基因、标记基因、启动子和终止子。标记基因的作用是为了鉴别受体细胞中是否含有目的基因，从而将含有目的基因的细胞筛选出来； 3、土壤农杆菌是一种革兰氏阴性土壤杆菌，感染双子叶植物会产生根瘤，其致瘤特性是由 Ti 质粒介导的。质粒是根癌农杆菌诱发冠瘿瘤的决定因素； 4、天然的质粒不能直接作为表达载体，必须加以改造才能作为载体利用。 【详解】（1）切下冠瘿瘤的一部分后，需要进行研磨（破碎） 与过滤（离心），这样可以使微生物分散在液体中，便于后续操作。要获得较好分散度的单菌落，常用的接种方法是稀释涂布平板法。因为稀释涂布平板法可以将菌液均匀地涂布在固体培养基表面，从而使单个微生物在培养基上形成单菌落； （2）只有部分菌落的菌种能致瘤，这说明冠瘿瘤表面或内部含有农杆菌与其他微生物；接种一段时间后杀死农杆菌，冠瘿瘤的生长不再依赖于农杆菌且不需要外源植物激素，原因是致瘤农杆菌将Ti质粒上的T - DNA整合到了植物细胞的染色体DNA上，T-DNA上含有控制合成植物激素的基因，这些基因在植物细胞中表达，使植物细胞能够自主合成植物激素，从而维持冠瘿组织的无限生长； （3）将致瘤的农杆菌菌种接种至LB液体培养基进行扩大培养（或液体培养），液体培养基可以为微生物提供充足的营养物质，使其大量繁殖；提取DNA后通过电泳分离纯化得到其中的质粒DNA。电泳是根据DNA分子的大小、形状和电荷等特性，在电场作用下使其在凝胶中迁移，从而实现分离；发现质粒DNA分子量大于处在相同位置的线性Marker DNA，说明在相同条件下，质粒（或环状DNA）迁移得更快，也就是等分子量的质粒（或环状DNA）迁移速率更大； （4）由题意可知，敲除农杆菌内质粒上的VirC与VirD基因后无法在农杆菌内切割与复制得到游离的T-DNA，这一过程需要的酶是切割T-DNA的相关酶和DNA复制有关的酶，通常是限制性核酸内切酶（限制酶）和DNA聚合酶；敲除VirE基因后，农杆菌胞内会出现被自身核酸酶切割后的不等长T-DNA片段，且不再致瘤，这说明VirE基因表达产物能够保护T-DNA不被农杆菌自身的核酸酶降解； （5）甲组将GFP基因连接至农杆菌质粒的T-DNA内部基因启动子下游，T-DNA会整合到愈伤组织细胞的染色体DNA上，随着染色体DNA的转录和翻译，可在愈伤组织细胞的细胞核（因为基因转录主要在细胞核进行，且整合到染色体DNA上 ）中检测到绿色荧光；乙组将GFP基因连接至农杆菌质粒的T-DNA外部基因启动子下游，T-DNA不会整合到愈伤组织细胞的染色体DNA上，但是由于启动子能启动转录，所以在农杆菌自身细胞内（因为基因在农杆菌质粒上，在农杆菌内进行转录和翻译 ）可检测到绿色荧光。 原因：只有当GFP基因位于T-DNA内部时，T-DNA才能整合到愈伤组织细胞的染色体DNA上并在细胞内表达，而位于T -DNA外部时，不会整合到愈伤组织细胞染色体DNA上，只能在农杆菌自身细胞内表达。 10．（2024·浙江台州·一模）研究发现，N基因表达的N蛋白在维持胚胎干细胞自我更新和多向分化潜能中具有非常重要的作用。为获得N蛋白进行了如下实验。回答下列问题： (1)根据基因数据库中小鼠N基因的序列及质粒载体的图谱，设计一对PCR引物，并在两条引物的5’端设计不同的限制酶识别序列，确保构建融合表达载体时 。为减少对小鼠组织器官的伤害，可提取 的DNA作为模板进行PCR扩增，该过程由 提供原料和能量。加样时，用移液器将PCR产物和上样缓冲液吹吸混匀，上样缓冲液中含溴酚蓝，其作用是指示电泳的进程，以便适时 。 (2)电泳后可以对琼脂糖凝胶进行 ，从而达到使PCR产物纯化的目的，再将纯化后的PCR产物和质粒分别进行 ，在DNA连接酶的作用下将两者连接起来，构建融合表达载体。 (3)在适宜的条件下，将融合表达载体转入 大肠杆菌，将转化后的大肠杆菌涂布接种在含抗生素的平板培养基上，培养一段时间后，挑取 接种到LB液体培养基，在37℃的摇床中振摇培养适宜时间。为快速鉴定是否为阳性菌种，可直接利用 作为模板进行PCR，若电泳条带正确，可对PCR产物进行测序，再通过 来进一步确定。 (4)诱导表达及条件优化。 ①利用IPTG（诱导剂）对将含有融合表达载体的大肠杆菌进行诱导培养，提取蛋白质进行电泳分析，结果如图甲所示。由图可知，N蛋白的分子量约为 kD。 ②为优化培养条件，分别加入不同浓度的IPTG进行诱导培养，并在不同时间分别取样检测，结果如图乙、丙所示，说明在 条件下，N蛋白的表达量最大。③对菌体进行破碎、离心后，分别收集上清液和沉淀中的蛋白质进行电泳，结果如图丁所示，说明 。 【答案】(1) N基因以正确的方向连接 外周血（或白细胞） dNTP 终止电泳 (2) 切割回收 双酶切/酶切 (3) 感受态/经CaCl2处理的 单菌落（或菌块） 菌液 序列比对 (4) 37 IPTG浓度为0.8mmol·L-1、诱导时间5h 重组蛋白主要存在于沉淀中（或重组蛋白为不溶性蛋白） 【分析】PCR原理：在解旋酶作用下，打开DNA双链，每条DNA单链作为母链，以4种游离脱氧核苷酸为原料，合成子链，在引物作用下，DNA聚合酶从引物3'端开始延伸DNA链，即DNA的合成方向是从子链的5'端自3'端延伸的。实际上就是在体外模拟细胞内DNA的复制过程。DNA的复制需要引物，其主要原因是DNA聚合酶只能从3′端延伸DNA链。 【详解】（1）在两条引物的端设计不同的限制酶识别序列，确保构建融合表达载体时目的基因（N基因）能以正确的方向连接（防止目的基因自身环化及反向连接等情况）；为减少对小鼠组织器官的伤害，可提取小鼠外周血（或白细胞）的DNA作为模板进行PCR扩增，因为取小鼠外周血（或白细胞）相对伤害小；PCR反应体系中的dNTP在DNA聚合酶的作用下，按照碱基互补配对原则逐个连接到延伸的DNA链上，同时dNTP水解时释放能量用于推动PCR反应的进行，因此PCR过程由dNTP（脱氧核苷酸三磷酸）提供原料和能量；加样时，用移液器将PCR产物和上样缓冲液吹吸混匀，上样缓冲液中含溴酚蓝，其作用是指示电泳的进程，以便适时终止电泳； （2）电泳后可以对琼脂糖凝胶进行切割回收，从而达到使PCR产物纯化的目的。在琼脂糖凝胶电泳中，不同大小的DNA片段会被分离开来，通过切割含有目标DNA片段的凝胶区域，然后利用特殊的试剂盒或方法将DNA从凝胶中洗脱出来，就可以得到纯化的PCR产物。再将纯化后的PCR产物和质粒分别进行双酶切（或酶切）。双酶切可以使PCR产物和质粒产生相同的黏性末端或者平末端，以便在DNA连接酶的作用下将两者连接起来，构建融合表达载体； （3）在适宜的条件下，将融合表达载体转入感受态（或经CaCl2处理的）大肠杆菌。感受态细胞是经过特殊处理（如用氯化钙处理）后的大肠杆菌细胞，其细胞膜的通透性增加，能够更容易地摄取外源DNA（如融合表达载体）；将转化后的大肠杆菌涂布接种在含抗生素的平板培养基上，培养一段时间后，挑取单菌落接种到LB液体培养基。在含抗生素的平板上，只有成功转入融合表达载体（载体上含有抗生素抗性基因）的大肠杆菌才能生长形成菌落，挑取单菌落可以保证得到的是单一的转化子；为快速鉴定是否为阳性菌种，可直接利用菌液作为模板进行PCR。因为如果菌液中的大肠杆菌含有目的基因（即阳性菌种），那么以菌液为模板进行PCR就能够扩增出相应的目的基因片段；若电泳条带正确，可对PCR产物进行测序，再通过序列比对来进一步确定。将测序得到的序列与已知的目的基因序列进行比对，如果两者高度一致，则可以确定该菌种为含有正确目的基因的阳性菌种； （4）在蛋白质电泳图中，分子量标准（Marker）可以用来估算目的蛋白的分子量，根据目的蛋白条带与分子量标准条带的相对位置，可以大致判断目的蛋白的分子量大小，由图甲可知，N蛋白的分子量约为37kD；从图乙中可以看到不同IPTG浓度下N蛋白表达量的变化趋势，图丙中显示不同诱导时间下N蛋白的表达量变化，综合两者可得出在IPTG浓度为0.8mmol/L、诱导时间为5h条件下，N蛋白的表达量最大；在菌体破碎离心后，上清液和沉淀分别含有可溶蛋白和不可溶蛋白（如包涵体形式的蛋白），根据电泳图中N蛋白条带在沉淀中的分布情况说明重组蛋白主要存在于沉淀中（或重组蛋白为不溶性蛋白）。 1 学科网（北京）股份有限公司 $$ 大题06 生物技术与工程专练 （一）基因工程 1. 工具酶与载体 限制酶：识别特定核苷酸序列（如EcoRⅠ识别GAATTC），切割产生黏性末端或平末端。 DNA连接酶：连接双链DNA片段，需区分T4 DNA连接酶（连接黏性末端和平末端）与E·coli DNA连接酶（仅连接黏性末端）。 载体选择：质粒需含复制原点、启动子、终止子、标记基因（如氨苄青霉素抗性基因）。 2. 操作流程 目的基因获取：PCR技术（引物设计需含限制酶识别序列）、cDNA文库构建（逆转录法）。 重组载体构建：双酶切（避免载体自连）→ 连接→ 转化（Ca²⁺处理大肠杆菌）。 检测与鉴定： 分子水平：PCR（引物特异性检测）、DNA分子杂交（探针标记）。 个体水平：抗虫接种实验、抗除草剂实验。 3. 典型案例 CRISPR/Cas9基因编辑：向导RNA（gRNA）引导Cas9酶切割DNA，需警惕脱靶效应（通过优化gRNA设计或使用碱基编辑器减少风险）。 疫苗制备：如新冠病毒蛋白疫苗，通过基因工程表达抗原蛋白，激活机体免疫反应。 （二）细胞工程 1. 植物细胞工程 组织培养： 脱分化：生长素/细胞分裂素比例高，形成愈伤组织。 再分化：细胞分裂素/生长素比例高，诱导芽分化。 体细胞杂交：PEG诱导原生质体融合，杂种细胞筛选（如通过荧光标记）。 2. 动物细胞工程 细胞培养：需血清（提供生长因子）、胰蛋白酶处理（分散细胞）、CO₂培养箱（维持pH）。 单克隆抗体： 杂交瘤细胞制备：B淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合，HAT培养基筛选。 抗体纯化：利用抗原-抗体特异性结合。 3. 干细胞技术 胚胎干细胞（ES细胞）：具有发育全能性，可用于器官再生。 诱导多能干细胞（iPSC）：通过导入Oct4等转录因子重编程体细胞。 （三）发酵工程 1. 微生物代谢调控 初级代谢产物：如乙醇、氨基酸，与微生物生长同步。 次级代谢产物：如抗生素，在稳定期大量合成。 2. 发酵条件控制 温度：影响酶活性（如酵母菌发酵最适温度28℃）。 pH：如谷氨酸棒状杆菌产谷氨酸需pH 7.0~8.0。 溶氧量：需氧发酵（如青霉素生产）需通入无菌空气，厌氧发酵（如酒精发酵）需密封。 3. 产物分离纯化 离心：分离菌体与发酵液。 萃取：如用有机溶剂提取脂溶性产物。 1．（2025·浙江·高考真题）3-磷酸甘油脱氢酶（GPD）是酵母细胞中甘油合成的关键酶。利用某假丝酵母菌株为材料，克隆具有高效催化效率的3-磷酸甘油脱氢酶的基因（Gpd）。采用的方案是：先通过第1次PCR扩增出该基因的中间部分，再通过第2次PCR分别扩增出该基因的两侧，经拼接获得完整基因的序列，如图所示，回答下列问题：    (1)分析不同物种的GPD蛋白序列，确定蛋白质上相同的氨基酸区段，依据这些氨基酸所对应的 ，确定DNA序列，进而设计1对引物。以该菌株基因组DNA为模板进行第1次PCR，利用 凝胶电泳分离并纯化DNA片段，进一步测定PCR产物的序列。在制备PCR反应体系时，每次用微量移液器吸取不同试剂前，需要确认或调整刻度和量程，还需要 。 (2)若在上述PCR扩增结果中，除获得一条阳性条带外，还出现了另外一条条带，不可能的原因是__________。 A．DNA模板被其他酵母细胞的基因组DNA污染 B．每个引物与DNA模板存在2个配对结合位点 C．在基因组中Gpd基因有2个拷贝 D．在基因组中存在1个与Gpd基因序列高度相似的其他基因 (3)为获得完整的Gpd基因，分别用限制性核酸内切酶PstⅠ和SalⅠ单酶切基因组DNA后，各自用DNA连接酶连接形成环形DNA，再用苯酚-氯仿抽提除去杂质，最后加入 沉淀环形DNA。根据第一次PCR产物测定获得的序列，重新设计一对引物，以环形DNA为模板进行第二次PCR，最后进行测序。用于第二次PCR的一对引物，其序列应是DNA链上的 （A．P1和P2  B．P3和P4 C．P1和P4 D．P2和P3）。根据测序结果拼接获得完整的Gpd基因序列，其中的启动子和终止子具有 功能。 (4)为确定克隆获得的Gpd基因的准确性，可将获得的基因序列与已建立的 进行比对。将Gpd基因的编码区与 连接，构建重组质粒，再将重组质粒导入酿酒酵母细胞中，实现利用酿酒酵母高效合成甘油的目的。 2．（2024·浙江·高考真题）植物体在干旱、虫害或微生物侵害等胁迫过程中会产生防御物质，这类物质属于次生代谢产物。次生代谢产物在植物抗虫、抗病等方面发挥作用，也是药物、香料和色素等的重要来源。次生代谢产物X的研发流程如下： 筛选高产细胞→细胞生长和产物X合成关系的确定→发酵生产X 回答下列问题： (1)获得高产细胞时，以X含量高的植物品种的器官和组织作为 ，经脱分化形成愈伤组织，然后通过液体振荡和用一定孔径的筛网进行 获得分散的单细胞。 (2)对分离获得的单细胞进行 培养，并通过添加 或营养缺陷培养方法获取细胞周期同步、遗传和代谢稳定、来源单一的细胞群。为进一步提高目标细胞的X含量，将微生物菌体或其产物作为诱导子加入到培养基中，该过程模拟了 的胁迫。 (3)在大规模培养高产细胞前，需了解植物细胞生长和产物合成的关系。培养细胞生产次生代谢产物的模型分为3种，如图所示。若X只在细胞生长停止后才能合成，则X的合成符合图 （填“甲”“乙”“丙”），根据该图所示的关系，从培养阶段及其目标角度，提出获得大量X的方法。 (4)多种次生代谢产物在根部合成与积累，如人参、三叶青等药用植物，可通过 培养替代细胞悬浮培养生产次生代谢产物。随着基因组测序和功能基因组学的发展，在全面了解生物体合成某次生代谢产物的 和 的基础上，可利用合成生物学的方法改造酵母菌等微生物，利用 工程生产植物的次生代谢产物。 3．（2024·浙江·高考真题）小鼠毛囊中表达F蛋白。为研究F蛋白在毛发生长中的作用，利用基因工程技术获得了F基因敲除的突变型纯合体小鼠，简称f小鼠，突变基因用f表示。f小鼠皮毛比野生型小鼠长50%，表现出毛绒绒的样子，其它表型正常。（注：野生型基因用++表示；f杂合子基因型用+f表示） 回答下列问题： (1)F基因敲除方案如图甲。在F基因的编码区插入了一个DNA片段P，引起F基因产生 ，导致mRNA提前出现终止密码子，使得合成的蛋白质因为缺失了 而丧失活性。要达到此目的，还可以对该基因的特定碱基进行 和 。 (2)从野生型、f杂合子和f小鼠组织中分别提取DNA，用限制酶HindⅢ酶切，进行琼脂糖电泳，用DNA探针检测。探针的结合位置如图甲，检测结果如图乙，则f小鼠和f杂合子对应的DNA片段分别位于第 泳道和第 泳道。 (3)g小鼠是长毛隐性突变体（gg），表型与f小鼠相同。f基因和g基因位于同一条常染色体上。f杂合子小鼠与g小鼠杂交，若杂交结果是 ，则g和f是非等位基因；若杂交结果是 ，则g和f是等位基因。（注：不考虑交叉互换；野生型基因用++表示；g杂合子基因型用+g表示） (4)确定g和f为等位基因后，为进一步鉴定g基因，分别提取野生型（++）、g杂合子（+g）和g小鼠（gg）的mRNA，反转录为cDNA后用（2）小题同样的DNA探针和方法检测，结果如图丙。g小鼠泳道没有条带的原因是 。组织学检查发现野生型和g杂合子表达F蛋白，g小鼠不表达F蛋白，因此推测F蛋白具有的作用 。 4．（2024·浙江·高考真题）锌转运蛋白在某种植物根部细胞特异性表达并定位于细胞质膜，具有吸收和转运环境中Zn2+的功能。为研究该植物2种锌转运蛋白M和N与吸收Zn2+相关的生物学功能，在克隆M、N基因基础上，转化锌吸收缺陷型酵母，并进行细胞学鉴定。回答下列问题： (1)锌转运蛋白基因M、N克隆。以该植物 为材料提取并纯化mRNA，反转录合成cDNA。根据序列信息设计引物进行PCR扩增，PCR每个循环第一步是进行热变性处理，该处理的效果类似于生物体内 的作用效果。PCR产物琼脂糖凝胶电泳时，DNA分子因为含 而带负电荷，凝胶点样孔端应靠近电泳槽负极接口；当2个PCR产物分子量接近时，若延长电泳时间，凝胶中这2个条带之间的距离会 。回收DNA片段，连接至克隆载体，转化大肠杆菌，测序验证。 (2)重组表达载体构建。分别将含M、N基因的重组质粒和酵母表达载体同时进行双酶切处理，然后利用 连接，将得到的重组表达载体转化大肠杆菌。用PCR快速验证重组转化是否成功。此反应可以用大肠杆菌悬液当模板的原因是 。 (3)酵母菌转化。取冻存的锌吸收缺陷型酵母菌株，直接在固体培养基进行 培养，活化后接种至液体培养基，采用 以扩大菌体数量，用重组表达载体转化酵母菌。检测M、N基因在受体细胞中的表达水平，无显著差异。 (4)转基因酵母功能鉴定。分别将转化了M、N基因的酵母菌株于液体培养基中培养至OD600为0.6。将菌液用 法逐级稀释至OD600为0.06、0.006和0.0006，然后各取10μL菌液用涂布器均匀涂布在固体培养基上，培养2天，菌落生长如图。该实验中阴性对照为 。由实验结果可初步推测：转运蛋白M和N中，转运Zn2+能力更强的是 ，依据是 。 注：OD600为波长600nm下的吸光值，该值越大，菌液浓度越高；空载体为未插入M或N基因的表达载体。 5．（2023·浙江·高考真题）赖氨酸是人体不能合成的必需氨基酸，而人类主要食物中的赖氨酸含量很低，利用生物技术可提高食物中赖氨酸含量。回答下列问题： (1)植物细胞合成的赖氨酸达到一定浓度时，能抑制合成过程中两种关键酶的活性，导致赖氨酸含量维持在一定浓度水平，这种调节方式属于 。根据这种调节方式，在培养基中添加 ，用于筛选经人工诱变的植物悬浮细胞，可得到抗赖氨酸类似物的细胞突变体，通过培养获得再生植株。 (2)随着转基因技术与动物细胞工程结合和发展，2011年我国首次利用转基因和体细胞核移植技术成功培育了高产赖氨酸转基因克隆奶牛。其基本流程为： ①构建乳腺专一表达载体。随着测序技术的发展，为获取富含赖氨酸的酪蛋白基因（目的基因），可通过检索 获取其编码序列，用化学合成法制备得到。再将获得的目的基因与含有乳腺特异性启动子的相应载体连接，构建出乳腺专一表达载体。 ②表达载体转入牛胚胎成纤维细胞（BEF）。将表达载体包裹到磷脂等构成的脂质体内，与BEF膜发生 ，表达载体最终进入细胞核，发生转化。 ③核移植。将转基因的BEF作为核供体细胞，从牛卵巢获取卵母细胞，经体外培养及去核后作为 。将两种细胞进行电融合，电融合的作用除了促进细胞融合，同时起到了 重组细胞发育的作用。 ④重组细胞的体外培养及胚胎移植。重组细胞体外培养至 ，植入代孕母牛子宫角，直至小牛出生。 ⑤检测。DNA水平检测：利用PCR技术，以非转基因牛耳组织细胞作为阴性对照，以 为阳性对照，检测到转基因牛耳组织细胞中存在目的基因。RNA水平检测：从非转基因牛乳汁中的脱落细胞、转基因牛乳汁中的脱落细胞和转基因牛耳组织细胞，提取总RNA，对总RNA进行 处理，以去除DNA污染，再经逆转录形成cDNA，并以此为 ，利用特定引物扩增目的基因片段。结果显示目的基因在转基因牛乳汁中的脱落细胞内表达，而不在牛耳组织细胞内表达，原因是什么？ 。 6．（2023·浙江·高考真题）甲植物细胞核基因具有耐盐碱效应，乙植物细胞质基因具有高产效应。某研究小组用甲、乙两种植物细胞进行体细胞杂交相关研究，基本过程包括获取原生质体、诱导原生质体融合、筛选融合细胞、杂种植株再生和鉴定，最终获得高产耐盐碱再生植株。回答下列问题： (1)根据研究目标，在甲、乙两种植物细胞进行体细胞杂交前，应检验两种植物的原生质体是否具备 的能力。为了便于观察细胞融合的状况，通常用不同颜色的原生质体进行融合，若甲植物原生质体采用幼苗的根为外植体，则乙植物可用幼苗的 为外植体。 (2)植物细胞壁的主要成分为 和果胶，在获取原生质体时，常采用相应的酶进行去壁处理。在原生质体融合前，需对原生质体进行处理，分别使甲原生质体和乙原生质体的 失活。对处理后的原生质体在显微镜下用 计数，确定原生质体密度。两种原生质体1∶1混合后，通过添加适宜浓度的PEG进行融合；一定时间后，加入过量的培养基进行稀释，稀释的目的是 。 (3)将融合原生质体悬浮液和液态的琼脂糖混合，在凝固前倒入培养皿，融合原生质体分散固定在平板中，并独立生长、分裂形成愈伤组织。同一块愈伤组织所有细胞源于 。下列各项中能说明这些愈伤组织只能来自于杂种细胞的理由是哪几项？ A ．甲、乙原生质体经处理后失活，无法正常生长、分裂 B．同种融合的原生质体因甲或乙原生质体失活而不能生长、分裂 C．培养基含有抑制物质，只有杂种细胞才能正常生长、分裂 D．杂种细胞由于结构和功能完整可以生长、分裂 (4)愈伤组织经 可形成胚状体或芽。胚状体能长出 ，直接发育形成再生植株。 (5)用PCR技术鉴定再生植株。已知甲植物细胞核具有特异性DNA序列a，乙植物细胞质具有特异性DNA序列b；M1、M2为序列a的特异性引物，N1、N2为序列b的特异性引物。完善实验思路： Ⅰ．提取纯化再生植株的总DNA，作为PCR扩增的 。 Ⅱ．将DNA提取物加入PCR反应体系， 为特异性引物，扩增序列a；用同样的方法扩增序列b。 Ⅲ．得到的2个PCR扩增产物经 后，若每个PCR扩增产物在凝胶中均出现了预期的 个条带，则可初步确定再生植株来自于杂种细胞。 7．（2022·浙江·高考真题）回答下列（一）、（二）小题： （一）红曲霉合成的红曲色素是可食用的天然色素，具有防腐、降脂等功能。研究者进行了红曲色素的提取及红色素的含量测定实验，流程如下： (1)取红曲霉菌种斜面，加适量 洗下菌苔，制成菌悬液并培养，解除休眠获得 菌种。经液体发酵，收集红曲霉菌丝体，红曲霉菌丝体与70%乙醇溶液混合，经浸提、 ，获得的上清液即为红曲色素提取液。为进一步提高红曲色素得率，可将红曲霉细胞进行 处理。 (2)红曲色素包括红色素、黄色素和橙黄色素等，红色素在390nm、420nm和505nm波长处均有较大吸收峰。用光电比色法测定红曲色素提取液甲的红色素含量时，通常选用505nm波长测定的原因是 。测定时需用 作空白对照。 (3)生产上提取红曲色素后的残渣，经 处理后作为饲料添加剂或有机肥，这属于废弃物的无害化和 处理。 （二）我国在新冠疫情方面取得了显著的成效，但全球疫情形势仍然非常严峻、尤其是病毒出现了新变异株——德尔塔、奥密克戎，更是威胁着全人类的生命健康。 (4)新冠病毒核酸定性检测原理是：以新冠病毒的单链RNA为模板，利用 酶合成DNA，经PCR扩增，然后在扩增产物中加入特异的 ，如果检测到特异的杂交分子则核酸检测为阳性。 (5)接种疫苗是遏制新冠疫情蔓延的重要手段。腺病毒疫苗的制备技术要点是：将腺病毒的复制基因敲除；以新冠病毒的 基因为模板合成的DNA插入腺病毒基因组，构建重组腺病毒。重组腺病毒在人体细胞内表达产生新冠病毒抗原，从而引发特异性免疫反应。在此过程中，腺病毒的作用是作为基因工程中目的基因的 。将腺病毒复制基因敲除的目的是 。 (6)单克隆抗体有望用于治疗新冠肺炎。单克隆抗体的制备原理是：取免疫阳性小鼠的 细胞与骨髓瘤细胞混合培养，使其融合，最后筛选出能产生特定抗体的杂交瘤细胞。与植物组织培养相比，杂交瘤细胞扩大培养需要特殊的成分，如胰岛素和 。 8．（2021·浙江·高考真题）回答下列（一）、（二）小题： （一）回答与甘蔗醋制作有关的问题： （1）为了获得酿造甘蔗醋的高产菌株，以自然发酵的甘蔗渣为材料进行筛选。首先配制醋酸菌选择培养基：将适量的葡萄糖、KH2PO4、MgSO4溶解并定容，调节pH，再高压蒸汽灭菌，经 后加入3%体积的无水乙醇。然后将10 g自然发酵的甘蔗渣加入选择培养基，振荡培养24 h。用 将少量上述培养液涂布到含CaCO3的分离培养基上，在30 ℃培养48h。再挑取分离培养基上具有 的单菌落若干，分别接种到与分离培养基成分相同的 培养基上培养24 h后，置于4 ℃冰箱中保存。 （2）优良产酸菌种筛选。将冰箱保存的菌种分别接入选择培养基，培养一段时间后，取合适接种量的菌液在30 ℃、150 r/min 条件下振荡培养。持续培养至培养液中醋酸浓度不再上升，或者培养液中 含量达到最低时，发酵结束。筛选得到的优良菌种除了产酸量高外，还应有 （答出2点即可）等特点。 （3）制醋过程中，可将甘蔗渣制作成固定化介质，经 后用于发酵。其固定化方法为 。 （二）斑马鱼是一种模式动物，体外受精发育，胚胎透明、便于观察，可用于水质监测，基因功能分析以及药物毒性与安全性评价等。 （1）由于人类活动产生的生活污水日益增多，大量未经处理的污水直接排入河流、湖泊会引起水体 ，导致藻类大量繁殖形成水华。取水样喂养斑马鱼，可用斑马鱼每周的体重和死亡率等指标监测水体污染程度。 （2）为了研究某基因在斑马鱼血管发育过程中的分子调控机制，用 DNA 连接酶将该基因连接到质粒载体形成 ，导入到大肠杆菌菌株 DH5α 中。为了能够连接上该目的基因、并有利于获得含该目的基因的 DH5α 阳性细胞克隆，质粒载体应含有 （答出2点即可）。提取质粒后，采用 法，将该基因导入到斑马鱼受精卵细胞中，培养并观察转基因斑马鱼胚胎血管的发育情况。 （3）为了获取大量斑马鱼胚胎细胞用于药物筛选，可用 分散斑马鱼囊胚的内细胞团，取分散细胞作为初始材料进行 培养。培养瓶中添加成纤维细胞作为 ，以提高斑马鱼胚胎细胞克隆的形成率。 1．（2024·广西·高考真题）M蛋白与“记忆”的形成密切相关。科研人员制备了M基因表达可控的实验模型小鼠，主要制作流程见下图，实验模型小鼠通过特异性表达Cre重组酶来敲除两个LoxP位点间的序列，同时利用体内表达的蛋白A激活诱导型T启动子。利用融合绿色荧光蛋白基因的M基因（M-GFP）的表达，恢复小鼠自身被敲除的M基因功能，同时便于示踪。回答下列问题： 注：基因型A/+指的是A基因被嵌合在细胞同源染色体中的一条，即可表示为Aa；两端添加上LoxP位点的M基因称为floxM。 (1)在PCR扩增片段①和②时，通常会在所用引物的一端添加被限制酶识别的序列，该序列添加的位置位于引物 （选填“3'端”或“5'端”）。在构建载体1时，为了阻断A基因的表达，从转录水平考虑，连接的片段可以是 ；而从翻译水平考虑，连接的片段可以是 。为了鉴定载体2是否构建成功，需要限制酶切割载体后，再进行 。 (2)培养小鼠胚胎干细胞需定时更换培养液，其目的是 （至少答2方面）。 (3)为了快速高效繁育出含有4对基因（遵循自由组合定律）的实验模型小鼠，应将培育出的基因型Cre/+A/+小鼠和M-GFP/+floxM/+小鼠分别与基因型floxM/floxM小鼠杂交，杂交获得的子代，再进行一代杂交后最终获得基因型为 实验模型小鼠。 (4)为了实现M基因的表达可控，在实验模型小鼠喂食时，可添加竞争性结合A蛋白的四环素，抑制T启动子的活性。添加四环素与未添加相比，目的是 。 2．（2024·天津·高考真题）金黄色葡萄球菌（简称Sa）是人体重要致病细菌、不规范使用抗生素易出现多重抗药性Sa。 (1)Sa产生抗药性可遗传变异的来源有 （至少答出2点）。 (2)推测Sa产生头孢霉素抗性与其R基因有关。为验证该推测，以图1中R基因的上、下游片段和质粒1构建质粒2，然后通过同源重组（质粒2中的上、下游片段分别与Sa基因组中R基因上、下游片段配对，并发生交换）敲除Sa的R基因。    ①根据图1信息，简述质粒2的构建过程（需包含所选引物和限制酶）： ，然后回收上、下游片段，再与SacII酶切质粒1所得大片段连接，获得质粒2。 ②用质粒2转化临床分离的具有头孢霉素抗性、对氯霉素敏感的Sa，然后涂布在含 的平板上，经培养获得含质粒2的Sa单菌落。 ③将②获得的单菌落多次传代以增加同源重组敲除R基因的几率，随后稀释涂布在含 的平板上，筛选并获得不再含有质粒2的菌落。从这些菌落分别挑取少许菌体，依次接种到含 的平板上，若无法增殖，则对应菌落中细菌的R基因疑似被敲除。 ④以③获得的菌株基因组为模板，采用不同引物组合进行PCR扩增，电泳检测结果如图2，表明R基因已被敲除的是 。    3．（2024·福建·高考真题）病毒感染初期，机体会分泌干扰素并作用于细胞受体IFNAR来应对感染。麻疹是由麻疹病毒感染引起的急性传染病。已知人白细胞分化抗原46（hCD46）是麻疹病毒入侵细胞的主要受体，小鼠没有该受体，科研人员构建hCD46转基因小鼠用于相关研究，部分流程如图所示。 回答下列问题： (1)利用PCR技术获取目的基因hCD46，复性温度下发生的扩增过程是 。 (2)将hCD46接入质粒应选用的限制酶组合是 。为提高转基因效率，同时避免标记基因进入胚胎体内，应选用 限制酶组合将重组质粒变为线性DNA。 (3)为获取大量胚胎用于移植，可用激素处理小鼠a，使其 。将胚胎移植到小鼠c的子宫中，应选用桑葚胚的原因是 。 (4)利用PCR技术对子代小鼠进行hCD46基因检测，应设置不加DNA模板的对照组，目的是 。 (5)若能进一步构建既表达hCD46受体又敲除IFNAR基因的小鼠，则该小鼠对麻疹病毒具有高易感性，原因是 。 4．（2024·海南·高考真题）酿酒酵母是重要的发酵菌种，广泛应用于酿酒、食品加工及生物燃料生产等。研究人员对酿酒酵母菌株A进行基因工程改造以提高发酵中的乙醇产量。回答下列问题： (1)酿酒酵母在有氧和无氧的条件下都能生存，属于 微生物，在无氧条件下能进行 发酵，可用于制作果酒等。 (2)传统发酵中，新鲜水果不接种酿酒酵母也能制备果酒，原因是 。 (3)工业上常采用单一菌种发酵生产食品。菌株A存在于环境中，实验室获得该单一菌种的分离方法有 和 。 (4)菌株A含有1个FLO基因，其表达的FLO蛋白可提高发酵中乙醇产量，且FLO蛋白量与乙醇产量成正相关，研究人员基于菌株A构建得到菌株B、C、D（如图）。该实验中，构建菌株B的目的是 ，预期菌株A、B、C、D发酵中乙醇产量的高低为 。 (5)菌株A中，X和Y基因的表达均可以提高发酵中乙醇产量。研究人员将X和Y基因融合在一起，构建了XY融合基因能表达的菌株E（如图），其在发酵中具有更高的乙醇产量。菌株E中无单独的X和Y基因，且其他基因未被破坏。简要写出由菌株A到菌株E的构建思路 。 5．（2024·江苏·高考真题）为了高效纯化超氧化物歧化酶（SOD），科研人员将ELP50片段插入pET-SOD构建重组质粒pET-SOD-ELP50，以融合表达SOD-ELP50蛋白，过程如图1。其中，ELP50是由人工合成的DNA片段，序列为：限制酶a识别序列-（GTTCCTGGTGTTGGC）50-限制酶b识别序列，50为重复次数。请回答下列问题：    (1)步骤①双酶切时，需使用的限制酶a和限制酶b分别是 。 (2)步骤②转化时，科研人员常用 处理大肠杆菌，使细胞处于感受态；转化后的大肠杆菌采用含有 的培养基进行筛选。用PCR技术筛选成功导入pET-SOD-ELP50的大肠杆菌，应选用的一对引物是 。 (3)步骤③大肠杆菌中RNA聚合酶与 结合，驱动转录，翻译SOD-ELP50蛋白。已知蛋白质中氨基酸残基的平均相对分子质量约为0.11kDa，将表达的蛋白先进行凝胶电泳，然后用SOD抗体进行杂交，显示的条带应是 （从图2的“A~D”中选填）。    (4)步骤④为探寻高效纯化SOD-ELP50蛋白的方法，科研人员研究了温度、NaCl对SOD-ELP50蛋白纯化效果的影响，部分结果如图3。    （ⅰ）20℃时，加入NaCl后实验结果是 。 （ⅱ）100℃时，导致各组中所有蛋白都沉淀的原因是 。 （ⅲ）据图分析，融合表达SOD-ELP50蛋白的优点有 。 6．（2024·重庆·高考真题）大豆是重要的粮油作物，提高大豆产量是我国农业领域的重要任务。我国研究人员发现，基因S在大豆品种DN（种子较大）中的表达量高于品种TL（种子较小），然后克隆了该基因（两品种中基因S序列无差异）及其上游的启动子序列，并开展相关研究。 (1)基因S启动子的基本组成单位是 。 (2)通过基因工程方法,将DN克隆的“启动子D+基因S”序列导入无基因S的优质大豆品种YZ。根据题19图所示信息（不考虑未标明序列）判断构建重组表达载体时，为保证目标序列的完整性，不宜使用的限制酶是 ；此外，不宜同时选用酶SpeⅠ和XbaⅠ。原因是 。 (3)为验证“启动子D+基因S”是否连接在表达载体上，可用限制酶对重组表达载体酶切后进行电泳。电泳时，对照样品除指示分子大小的标准参照物外，还应有 。经验证的重组表达载体需转入农杆菌，检测转入是否成功的技术是 。 (4)用检测后的农杆菌转化品种YZ所得再生植株YZ-1的种子变大。同时将从TL克隆的“启动子T+基因S”序列成功导入YZ，所得再生植株YZ-2的种子也变大，但小于YZ-1。综合分析，大豆品种DN较TL种子大的原因是 。 7．（2024·贵州·高考真题）研究者用以蔗糖为唯一碳源的液体培养基，培养真菌A的野生型（含NV基因）、突变体（NV基因突变）和转基因菌株（转入NV基因），检测三种菌株NV酶的生成与培养液中的葡萄糖含量，结果如表所示（表中“+”表示有，“—”表示无）。 检测用菌株 蔗糖 NV酶 葡萄糖（培养液中） 野生型 + + + 野生型 — — — 突变体 + — — 转基因菌株 + + + 回答下列问题。 (1)据表可推测 诱导了NV基因表达。NV酶的作用是 。检测NV酶活性时，需测定的指标是 （答出1点即可）。 (2)表中突变体由T-DNA随机插入野生型菌株基因组DNA筛选获得。从野生型与突变体中分别提取基因组DNA作为模板，用与 （选填“T-DNA”或“NV基因”）配对的引物进行PCR扩增。若突变体扩增片段长度 （选填“>”“=”或“<”）野生型扩增片段长度，则表明突变体构建成功，从基因序列分析其原因是 。 (3)为进一步验证NV基因的功能，表中的转基因菌株是将NV基因导入 细胞获得的。在构建NV基因表达载体时，需要添加新的标记基因，原因是 。 8．（2024·江西·高考真题）聚对苯二甲酸乙二醇酯（PET）是一种聚酯塑料，会造成环境污染。磷脂酶可催化PET降解。为获得高产磷脂酶的微生物，研究人员试验了2种方法。回答下列问题： (1)方法1从土壤等环境样品中筛选高产磷脂酶的微生物。以磷脂酰乙醇酯（一种磷脂类物质）为唯一碳源制备 培养基，可提高该方法的筛选效率。除碳源外，该培养基中至少还应该有 、 、 等营养物质。 (2)方法2采用 技术定向改造现有微生物，以获得高产磷脂酶的微生物。除了编码磷脂酶的基因外，该技术还需要 、 、 等“分子工具”。 (3)除了上述2种方法之外，还可以通过 技术非定向改造现有微生物，筛选获得能够高产磷脂酶的微生物。 (4)将以上获得的微生物接种到鉴别培养基（在牛肉膏蛋白胨液体培养基中添加2%的琼脂粉和适量的卵黄磷脂）平板上培养，可以通过观察卵黄磷脂水解圈的大小，初步判断微生物产磷脂酶的能力，但不能以水解圈大小作为判断微生物产磷脂酶能力的唯一依据。从平板制作的角度分析，其原因可能是 。 9．（2024·北京·高考真题）学习以下材料，回答（1）～（4）题。 筛选组织特异表达的基因 筛选组织特异表达的基因，对研究细胞分化和组织、器官的形成机制非常重要。“增强子捕获”是筛选组织特异表达基因的一种有效方法。 真核生物的基本启动子位于基因5'端附近，没有组织特异性，本身不足以启动基因表达。增强子位于基因上游或下游，与基本启动子共同组成基因表达的调控序列。基因工程所用表达载体中的启动子，实际上包含增强子和基本启动子。 很多增强子具有组织特异的活性，它们与特定蛋白结合后激活基本启动子，驱动相应基因在特定组织中表达（图A）。基于上述调控机理，研究者构建了由基本启动子和报告基因组成的“增强子捕获载体”（图B），并转入受精卵。捕获载体会随机插入基因组中，如果插入位点附近存在有活性的增强子，则会激活报告基因的表达（图C）。 获得了一系列分别在不同组织中特异表达报告基因的个体后，研究者提取每个个体的基因组DNA，通过PCR扩增含有捕获载体序列的DNA片段。对PCR产物进行测序后，与相应的基因组序列比对，即可确定载体的插入位点，进而鉴定出相应的基因。 研究者利用各种遗传学手段，对筛选得到的基因进行突变、干扰或过表达，检测个体表型的改变，研究其在细胞分化和个体发育中的作用，从而揭示组织和器官形成的机理。 (1)在个体发育中，来源相同的细胞在形态、结构和功能上发生 的过程称为细胞分化，分化是基因 的结果。 (2)对文中“增强子”的理解，错误的是________。 A．增强子是含有特定碱基序列的DNA片段 B．增强子、基本启动子和它们调控的基因位于同一条染色体上 C．一个增强子只能作用于一个基本启动子 D．很多增强子在不同组织中的活性不同 (3)研究者将增强子捕获技术应用于斑马鱼，观察到报告基因在某幼体的心脏中特异表达。鉴定出捕获载体的插入位点后，发现位点附近有两个基因G和H，为了确定这两个基因是否为心脏特异表达的基因，应检测 。 (4)真核生物编码蛋白的序列只占基因组的很少部分，因而在绝大多数表达报告基因的个体中，增强子捕获载体的插入位点位于基因外部，不会造成基因突变。研究者对图B所示载体进行了改造，期望改造后的载体随机插入基因组后，在“捕获”增强子的同时，也造成该增强子所调控的基因发生突变，以研究基因功能。请画图表示改造后的载体，并标出各部分名称 （略）。 10．（2024·北京·高考真题）啤酒经酵母菌发酵酿制而成。生产中，需从密闭的发酵罐中采集酵母菌用于再发酵，而直接开罐采集的传统方式会损失一些占比很低的独特菌种。研究者探究了不同氧气含量下酵母菌的生长繁殖及相关调控，以优化采集条件。 (1)酵母菌是兼性厌氧微生物，在密闭发酵罐中会产生 和CO2。有氧培养时，酵母菌增殖速度明显快于无氧培养，原因是酵母菌进行有氧呼吸，产生大量 。 (2)本实验中，采集是指取样并培养4天。在不同的气体条件下从发酵罐中采集酵母菌，统计菌落数（图甲）。由结果可知，有利于保留占比很低菌种的采集条件是 。 (3)根据上述实验结果可知，采集酵母菌时O2浓度的陡然变化会导致部分菌体死亡。研究者推测，酵母菌接触O2的最初阶段，细胞产生的过氧化氢（H2O2）浓度会持续上升，使酵母菌受损。已知H2O2能扩散进出细胞。研究者在无氧条件下从发酵罐中取出酵母菌，分别接种至含不同浓度H2O2的培养基上，无氧培养后得到如图乙所示结果。请判断该实验能否完全证实上述推测，并说明理由 。 (4)上述推测经证实后，研究者在有氧条件下从发酵罐中取样并分为两组，A组菌液直接滴加到H2O2溶液中，无气泡产生；B组菌液有氧培养4天后，取与A组活菌数相同的菌液，滴加到H2O2溶液中，出现明显气泡。结果说明，酵母菌可通过产生 以抵抗H2O2的伤害。 1．（2025·浙江·二模）某二倍体两性植物，抗病与感病、高产与低产、糯性与非糯性分别由A/a、B/b、D/d三对等位基因控制。研究发现在正常条件下，基因表达正常。在干旱环境胁迫下，紧密连锁的基因会受到调控因子的调控而不成功表达。为研究上述性状的遗传特性，进行了如表所示的杂交实验。(不考虑突变和交叉互换；各相对性状呈完全显隐性关系) 组别 环境条件 亲本杂交组合 F₁的表型及比例。 甲 正常条件 抗病高产非糯性×感病低产糯性 全部为抗病高产非糯性 乙 干旱胁迫 抗病高产非糯性×感病低产糯性 全部为抗病低产非糯性 (1)据表分析： ①能判断显隐性的是 组，判断理由是 。 ②甲组F₁随机交配，若子代中抗病高产植株占比为 ，则能推断A与B基因紧密连锁。 (2)在干旱条件下，用乙组 F₁自交获得的F₂中所有抗病低产糯性植株的叶片为材料，通过 PCR 检测每株个体中控制这3种性状的所有等位基因，以辅助确定这些基因在染色体上的相对位置关系。预期对被检测群体中所有个体按PCR 产物的电泳条带组成(即基因型)相同的原则归类后，该群体电泳图谱只有类型I或类型II，如图所示，其中条带④和⑤分别代表基因b和d。 (注：各基因的 PCR 产物通过电泳均可区分) ①图中条带③代表的基因是 ； ②若电泳图谱为类型II，则被检测群体在 F₂中占比为 。 (3)研究发现DR基因产生的调控因子(sRNA)，通过靶向介导紧密连锁基因转录后mRNA的切割实现对高产基因表达的调控，从而使得产量降低。为了获得在干旱条件下的高产品种，利用PCR 技术对DR 基因进行点突变改造，使其不影响高产基因的表达。其过程如图： ①DR 基因的表达包括 过程，其产物通过影响基因表达的 过程实现调控。 ②据图分析，若使A-T突变为G-C，引物2中突变位点(突起)处应设计为 (填“碱基”)。第二阶段，杂交后的DNA分子首先在 酶作用下延伸，然后使用 (引物1、引物2、引物3、引物4)进行PCR 扩增得到突变后的基因。 2．（2025·浙江·二模）甲流病毒是一种RNA 包膜病毒。机体感染后容易表现为口渴、高热、肌肉酸痛等症状。下图是其引发高热过程的部分示意图。 (注：a表示某物质；①表示某种神经；EP：内源性致热源；PGE：前列腺素)    (1)甲流病毒通过表面的蛋白质与细胞膜上的 结合后侵入宿主细胞。当机体感染时，识别感染源的淋巴细胞主要在 截获抗原，并启动特异性免疫应答。 (2)下面对发热症状者进行检测的方法中，能确诊感染甲流病毒的有 A．核酸检测 B．血常规检测 C．抗原检测 D．血清检测 (3)据图分析，能直接使体温调节中枢“调定点”上移的条件有 ，①属于 (填“交感”、“副交感”)神经，发热者出现肌肉酸痛的可能原因是 。 (4)研究发现前列腺素受体激动剂(W)也能影响体温且不同剂量的W对体温的影响不同。研究人员欲通过脑室注射手术的方法探究其作用机制及与PGE的关联性。请完善下列实验：实验材料及试剂：若干体重相同的雄性大鼠、人工脑脊液、用人工脑脊液配制的高(200 ng/ rat)、中(100 ng/ rat)、低(50ng/ rat)三种剂量的 W溶液、PGE(150ng/ rat)及手术相关器具。 实验材料及器具的预处理： ①动物的适应与分组：实验室环境及模拟实验操作1 周，正式实验前两天同一时间分别测定直肠温度(Tr)，与实验当天同一时间 Tr 的 作为基础体温，同时舍弃3次 Tr中最高值与最低值之差大于0.5℃的大鼠。符合要求的大鼠随机分成七组。 ②防污染措施：所用玻璃器材及手术器械等耐热器具经 180℃、2h干热消毒；液体制剂经 滤过灭菌。 实验分组及操作： 第1组：正常大鼠组(不做任何操作)； 第2组: ; 第3组: ; 第4、5、6组：高浓度 W组、中浓度W组、低浓度 W组； 第7组: PGE组。 用微量进样器侧脑室注射相应制剂，总体积为10uL，推注时间30s。侧脑室注射后连续观察体温2h, 测温间隔30min。计算 。实验的结果：    实验结论: (答2点) 3．（2025·浙江·二模）灵芝是一种药用真菌，它的多糖和三萜类化合物是主要的活性物质，具有抗氧化、抗癌、抗衰老等多种生理功能。科研者通过多种育种方式的结合选育出具有优良性状的菌种，再利用液态深层发酵技术生产功能活性物质。 (1)育种 ①获得原生质体：活化的原始菌种培养4-5天，对发酵液进行 操作，取菌体加入已灭菌的溶壁酶和较高渗透压的甘露醇溶液进行酶解获得原生质体，利用 (填仪器)对其进行显微镜观察计数。 ②人工诱导变异：对原生质体进行化学诱导选育出高产多糖的菌种A和高产三萜类化合物的B，其育种原理是 。相对于整个细胞，诱导原生质体更容易达到目的，原因是 。 ③诱导原生质体融合：对菌种A、B的原生质体加入聚乙二醇和 Ca²⁺辅助诱导剂诱导融合，进一步 出具有同时高产多糖和三萜类化合物的新菌种Y。Ca²⁺辅助诱导剂作用机理可能是 。 (2)深层液体发酵 基本过程：菌种Y→试管斜面培养→摇瓶种子培养→繁殖罐培养→发酵罐培养→发酵产品处理。 ①菌种是发酵工业的关键，用于发酵生产的菌种Y除了高产多糖和三萜类化合物外，还应满足的条件有 A．菌种发酵产物易于分离            B．培养基来源充足且廉价，被转化的效率高 C．菌种遗传特性和生产能力稳定      D．菌种对环境没有明显危害 ②摇瓶培养的目的是 。深层发酵技术相较于传统农业栽培具有 等方面的优势。 ③优化培养条件是发酵生产高效顺利进行的重要措施。科研者以葡萄糖、蛋白胨、pH值三个因素为自变量，以获得较高灵芝浸膏多糖产量，实验结果见表。 试验序号 A．葡萄糖浓度(%) B．蛋白胨(%) C． pH值 灵芝浸膏多糖含量(%) 菌丝干重(g/100mL) 1 1(2%) 1(0.2%) 1(pH5.0) 10.3 14.9 2 1(2%) 2(0.4%) 2(pH6.0) 11.2 16.5 3 1(2%) 3(0.6%) 3(pH7.0) 10.8 15.2 4 2(3%) 1(0.2%) 3(pH7.0) 8.9 10.6 5 2(3%) 2(0.4%) 2(pH6.0) 9.2 12.4 6 2(3%) 3(0.6%) 1(pH5.0) 7.1 9.9 7 3(4%) 1(0.2%) 2(pH6.0) 8.1 10.2 8 3(4%) 2(0.4%) 3(pH7.0) 7.2 8.6 9 3(4%) 3(0.6%) 1(pH5.0) 6.8 8.4 从表中可得，对灵芝浸膏多糖含量影响最重要的因素为 。当培养基组成为 为最优条件组合。 4．（2024·浙江嘉兴·一模）小鼠淋巴细胞常作为免疫学研究的模型。回答下列问题： (1)淋巴细胞都起源于造血干细胞分化而来的 细胞。T淋巴细胞在 中成熟，该过程包括早期发育、阳性选择和阴性选择三个阶段。其中阳性选择保留了能识别自身MHC分子的T淋巴细胞，其余T细胞将通过 而淘汰；通过阴性选择，将能与 （填“自身抗原-MHC复合体”“异体抗原-MHC复合体”）结合的T淋巴细胞淘汰，一定程度上避免了自身免疫病的发生。 (2)获取小鼠淋巴细胞的主要步骤如下：Ⅰ将小鼠脾脏置于冰缓冲液（PBS）研磨，获得细胞悬液；Ⅱ细胞悬液中加入分离液后离心，分为上层、中间层和底层；Ⅲ吸取中间层，加入含多种离子的等渗的红细胞裂解液，红细胞吸水涨破；Ⅳ经离心获得淋巴细胞。 ①步骤Ⅰ中，加入缓冲液的目的是维持pH和 的稳定。 ②步骤Ⅱ中，上层液体除PBS、分离液外，还来自于血浆、组织液、淋巴和 ；底层主要是 。 ③步骤Ⅲ中，红细胞比淋巴细胞更易 ，细胞内渗透压增大，红细胞吸水涨破。 (3)利用小鼠B淋巴细胞制备的单克隆抗体（鼠源抗体）注入人体，可能引起HAMA效应（人抗鼠反应），这是因为人体内活化了的B淋巴细胞分泌抗 的抗体。B淋巴细胞的活化需要鼠源抗体与人B淋巴细胞表面的 结合，还需要与 细胞表面受体结合作为第二信号以及细胞因子的作用。 5．（2024·浙江嘉兴·一模）愈创木烷型内酯具有药用活性，在植物中含量很低，其内酯基团决定其药用价值。在特种细胞色素作用下，细胞内化合物可以形成内酯基团。中国科研人员将这一特种细胞色素基因导入了酵母细胞，结合大根香叶烯A酸合成通路的引入，发现人工构建的酵母工程菌能够合成具有药用价值的内酯化合物。回答下列问题： (1)酵母细胞的转化流程大致如下：低浓度醋酸锂溶液处理酵母细胞；加入重组质粒和35%的聚乙二醇并在30℃水浴1小时；42℃转化5分钟；室温下培养筛选。用低浓度锂离子溶液处理酵母细胞的目的，是使酵母细胞暂时进入 ，有利于重组质粒的导入。聚乙二醇的作用是保护细胞膜和促进 黏附于酵母细胞膜表面。 (2)鉴定转基因酵母细胞时常采用核酸分子杂交法，大致流程如下图。 电泳前需利用 酶处理获取的DNA．变性和转膜的目的是将凝胶中的DNA变成单链并转移至硝酸纤维素膜上，DNA变成单链的目的是便于与 结合。硝酸纤维素膜可通过静电吸附DNA，因为DNA具有 而带负电。检测时应洗去 ，再观察结果。 (3)转基因酵母的工业发酵受很多因素影响。发酵过程中多采用补加氨水的方法来调节发酵液中的 ，同时氨水也可以作为酵母菌的 ，使菌体快速生长。发酵罐中溶解氧回升，表明酵母细胞处于“饥饿”状态，需要及时补充 。 6．（2024·浙江绍兴·模拟预测）科研人员对蓝细菌的光合放氧、呼吸耗氧、ATP含量和14C固定率等进行了系列研究。图1是蓝细菌光合作用部分过程，图2是蓝细菌相对密度对光合放氧和呼吸耗氧影响的曲线图。回答下列问题： (1)蓝细菌类囊体膜的成分除了磷脂、蛋白质以外还应具有 ，图1中结构a具有 的功能，光反应产生的ATP和NADPH在 中将C3转变为（CH2O）。 (2)将蓝细菌培养液进行一定浓度梯度稀释，用 对蓝细菌进行计数。在相应密度下测定氧气变化速率，建立相关曲线如图2，其中光合放氧的曲线是 ，理由为 。 (3)已知NH4Cl可消除类囊体膜内外的质子梯度（△H+），科研人员利用不同浓度的NH4Cl溶液处理蓝细菌，测定ATP的相对含量，结果如图3所示。 ①实验结果： 。 ②出现上述结果的原因： 。 (4)蓝细菌在高密度培养时，由于互相遮挡，菌体环境也会出现光线强弱变化，从而影响光合速率。为验证该现象选用如下______条件组合进行实验，定时测定14C固定率和胞内ATP浓度。 A．持续光照 B．光暗交替 C．培养基中加入NaH14CO3 D．培养基中加入14C6H12O6 7．（2024·浙江绍兴·模拟预测）研究人员利用基因编辑技术和体细胞克隆技术成功获得了载脂蛋白E（ApoE）基因和低密度脂蛋白受体（LDLR）基因双敲除（即两个基因都失活）的五指山小型猪，该小型猪在饲喂普通饲料的情况下会出现高血脂，并能自发产生明显的动脉粥样硬化（AS），为后继研究提供了重要的AS动物模型。 回答下列问题： (1)基因编辑载体构建。从 中获取猪的ApoE和LDLR基因序列，设计相应引物，人工合成。将pX458质粒酶切后电泳，加样孔在 极一端，上样缓冲液中需要加入少许 ，它迁移速度较快，在其迁移出凝胶前停止电泳。胶回收产物与引物连接，转化处于 的大肠杆菌，经过筛选、DNA测序确认目标大肠杆菌，将菌液扩增培养，提取质粒备用。 (2)体细胞电转和鉴定。用 擦拭30日龄雌性和雄性猪耳朵消毒，剪取耳组织，眼科剪剪碎，用胰蛋白酶或 等分散耳组织，筛选分散细胞中的成纤维细胞作为初始材料进行 培养。贴壁细胞达到生长基质80%表面面积后，37.5℃，用0.1%胰蛋白酶处理2分钟，加入5倍体积的细胞培养液以 ，制成细胞悬液。将质粒和成纤维细胞置于离心管中，用电击法处理，分选、鉴定、 得到目标成纤维细胞株。 (3)细胞核移植。从屠宰场收集卵巢，人工抽取卵母细胞，在培养液中培养42~44小时至其 ，去除细胞核，将目标成纤维细胞与去核卵细胞进行电融合，电融合可以促进细胞融合，同时还起到 的作用。 (4)胚胎移植。由于 ，胚胎移植成为胚胎工程中获得后代的唯一方法。选择手术移植前一天开始 的母猪作为代孕母体，将发育良好的囊胚植入输卵管，共出生健康的F0代雌性仔猪22头，雄性仔猪10头。 (5)仔猪鉴定、检测和繁育。提取仔猪耳部细胞DNA，PCR扩增目的基因，PCR时预变性时间较长的目的是 ，以利于引物更好的和模板结合。通过凝胶电泳回收扩增产物，测序结果显示32头仔猪均为ApoE和LDLR两基因双敲猪。使用普通饲料饲养克隆猪，产生了明显的AS，这属于 水平的检测。F0代新生仔猪自然交配，F1代仔猪都是ApoE和LDLR两基因双敲猪，表明 ，为医学应用提供理想的实验群体。 8．（2025·浙江温州·二模）帕金森病是常见的中枢神经系统疾病。酪氨酸羟化酶在帕金森病中起着关键作用，其表达水平的下降与帕金森病的病理过程密切相关。当前研究发现由干细胞分泌的外泌体对该病有一定的治疗作用，回答下列问题。    (1)如图所示，外泌体是一类包含有复杂成分的小膜泡，干细胞分泌外泌体的方式为 ，这种方式体现了细胞膜具有 的结构特点。外泌体与其他细胞膜上的 结合后，将信息传递给靶细胞，发挥调节作用。 (2)为验证干细胞分泌的外泌体对帕金森病有一定的治疗作用，根据以下材料和用具，完善实验思路，设计实验记录表。 材料和用具：正常小鼠若干只，生理盐水配制的MPTP溶液（腹腔注射，用于制备急性帕金森小鼠模型），缓冲液配制的外泌体溶液（静脉注射），生理盐水，缓冲液等。 （要求与说明：实验中涉及的剂量不作具体要求。旋转试验可用于评估小鼠神经系统的功能，其结果可用转圈数进行表示。） ①完善实验思路： 将45只正常小鼠随机分为A、B、C三组，每组15只，其中B、C两组 ，制备成急性帕金森病小鼠模型； A组、B组 ，C组 。 将小鼠置于相同且适宜的条件下饲养，并在T1、T2、T3天， 。 进行数据的统计与分析。 ②设计一张表格，用于记录实验数据。 。 ③实验结果表明，使用外泌体治疗后，在一定时间范围内帕金森病小鼠转圈数明显减少，说明外泌体对帕金森病有一定的治疗作用。请结合信息预测A、B、C三组小鼠体内酪氨酸羟化酶的表达量大小： 。结合上述研究，除注射外泌体外，请再提出1种可能的治疗帕金森病的思路： 。 9．（2025·浙江·二模）某科研团队为了验证农杆菌转化植物的功能，利用长冠瘿瘤的葡萄植株根据科学史上一系列研究进行了以下实验。请回答下列问题： (1)切下冠瘿瘤的一部分，经 后，取液体部分，稀释后利用 法接种至LB固体培养基中，获得较好分散度的单菌落。 (2)分别取平板上的每个单菌落制成菌悬液后，侵染植物愈伤组织，结果发现只有部分菌落的菌种能致瘤，说明 。接种一段时间后杀死农杆菌，发现冠瘿瘤的生长不再依赖于农杆菌，且冠瘿组织的无限生长不需要外源的植物激素，原因是 。 (3)取其中致瘤的农杆菌菌种，接种至LB液体培养基进行 ，48h后提取其中的DNA并通过 分离纯化得到其中的质粒DNA，发现质粒DNA分子量大于处在相同位置的线性Marker DNA，说明等分子量的 迁移速率更大。 (4)科研团队还研究了质粒中Vir系列基因的作用，发现敲除农杆菌内质粒上的VirC与VirD基因后，无法合成 酶从而无法在农杆菌内切割与复制得到游离的T-DNA。而将农杆菌内质粒上的VirE基因敲除后，侵染愈伤组织发现不再致瘤，且农杆菌胞内会出现被自身核酸酶切割后的不等长T-DNA片段，说明VirE基因表达产物的作用是 。 (5)将农杆菌分为两组，分别将GFP（绿色荧光蛋白）基因连接至甲组农杆菌质粒的T-DNA内部基因启动子下游与乙组农杆菌质粒的T-DNA外部基因启动子下游。侵染愈伤组织后，可在甲组 中检测到绿色荧光，乙组 中检测到绿色荧光，原因是 。 10．（2024·浙江台州·一模）研究发现，N基因表达的N蛋白在维持胚胎干细胞自我更新和多向分化潜能中具有非常重要的作用。为获得N蛋白进行了如下实验。回答下列问题： (1)根据基因数据库中小鼠N基因的序列及质粒载体的图谱，设计一对PCR引物，并在两条引物的5’端设计不同的限制酶识别序列，确保构建融合表达载体时 。为减少对小鼠组织器官的伤害，可提取 的DNA作为模板进行PCR扩增，该过程由 提供原料和能量。加样时，用移液器将PCR产物和上样缓冲液吹吸混匀，上样缓冲液中含溴酚蓝，其作用是指示电泳的进程，以便适时 。 (2)电泳后可以对琼脂糖凝胶进行 ，从而达到使PCR产物纯化的目的，再将纯化后的PCR产物和质粒分别进行 ，在DNA连接酶的作用下将两者连接起来，构建融合表达载体。 (3)在适宜的条件下，将融合表达载体转入 大肠杆菌，将转化后的大肠杆菌涂布接种在含抗生素的平板培养基上，培养一段时间后，挑取 接种到LB液体培养基，在37℃的摇床中振摇培养适宜时间。为快速鉴定是否为阳性菌种，可直接利用 作为模板进行PCR，若电泳条带正确，可对PCR产物进行测序，再通过 来进一步确定。 (4)诱导表达及条件优化。 ①利用IPTG（诱导剂）对将含有融合表达载体的大肠杆菌进行诱导培养，提取蛋白质进行电泳分析，结果如图甲所示。由图可知，N蛋白的分子量约为 kD。 ②为优化培养条件，分别加入不同浓度的IPTG进行诱导培养，并在不同时间分别取样检测，结果如图乙、丙所示，说明在 条件下，N蛋白的表达量最大。③对菌体进行破碎、离心后，分别收集上清液和沉淀中的蛋白质进行电泳，结果如图丁所示，说明 。 1 学科网（北京）股份有限公司 $$