3.2.1基因工程的基本操作程序课件-2024-2025学年高二下学期生物人教版（2019）选择性必修3

3.2基因工程的基本操作程序 第1课时 目的基因的筛选与获取 抗虫棉 Bt抗虫蛋白 苏云金杆菌 首先要在体外对含有所需要基因的DNA分子进行“切割”、改造和“拼接”；然后，将重组DNA分子导入棉花体细胞内，并使其在细胞中表达。 体外 导入 载体 棉花细胞的DNA不进行切割 DNA连接酶 重组DNA 限制酶 从社会中来—教材P76 1997年，我国政府首次批准商业化种植转基因抗虫棉。到2015年，我国已育成转基因抗虫棉新品种100多个，减少农药用量40万吨，增收节支社会经济效益450亿元。 目的基因的筛选与获取 基因表达载体的构建 将目的基因导入受体细胞 目的基因的检测与鉴定 从社会中来—教材P76 转基因抗虫棉抗虫的机制是什么？培育转基因抗虫棉一般需要哪些步骤? 在基因工程的设计和操作中，用于改变受体细胞性状或获得预期表达产物等的基因就是目的基因。 培育转基因抗虫棉用到的Bt抗虫蛋白基因，简称Bt基因。 苏云金芽孢杆菌 产生 Bt基因 伴胞晶体蛋白 (Bt抗虫蛋白) 表达 破坏鳞翅目昆虫的消化系统 杀死棉铃虫 导入 抗虫棉 培育 棉花细胞 1.概念： 2.实例： 主要是编码特定蛋白质的基因，也可以是具有调控作用的因子 目的基因的筛选与获取 目的基因的筛选与获取 转基因番木瓜，它可以抵御番木瓜环斑病毒 转基因抗除草剂植物 重组人胰岛素注射液 （1）从相关已知结构和功能清晰的基因中进行筛选是较为有效的方法之一。 （2）利用序列数据库和序列比对工具进行筛选。 苏云金杆菌的杀虫作用与Bt基因有关 掌握了Bt基因的序列信息 Bt蛋白分解为多肽后，与害虫肠上皮细胞的特异性受体结合，导致细胞膜穿孔，造成害虫死亡。 Bt蛋白只有在某类昆虫肠道的碱性环境中才表现出毒性，人和牲畜的胃液呈酸性，肠道细胞也没有特异性受体。 方法： 目的基因的筛选与获取 筛选合适的目的基因 前提： 方法： 基因比较小、核苷酸序列已知 通过DNA合成仪用化学方法直接合成 DNA合成仪 蛋白质的 氨基酸序列 mRNA的 核苷酸序列 基因的 核苷酸序列 目的基因 推测 推测 化学合成 1.人工合成目的基因 2.常用PCR特异性地快速扩增目的基因 获取目的基因的方法 目的基因的筛选与获取 PCR是聚合酶链式反应的缩写。它是一项在体外提供参与DNA复制的各种组分与反应条件，对目的基因的核苷酸序列进行大量复制的技术。 DNA半保留复制 穆里斯 解旋 合成子链 复旋 1.概念： 2.原理： 目的基因的筛选与获取 利用PCR获取和扩增目的基因 体内DNA复制所需的基本条件 目的基因的筛选与获取 参与的组分 在DNA复制中的作用 解旋酶 DNA母链 4种脱氧核苷酸 DNA聚合酶 引物 打开DNA双链 提供DNA复制的模板 合成DNA子链的原料 催化合成DNA子链 使DNA聚合酶能够从引物的3’端开始连接脱氧核苷酸 体外复制怎么改进？ 目的基因的筛选与获取 参与的组分 在DNA复制中的作用 解旋酶 打开DNA双链 DNA母链 提供DNA复制的模板 4种脱氧核苷酸 合成DNA子链的原料 DNA聚合酶 催化合成DNA子链 引物 使DNA聚合酶能够从引物的3’端开始连接脱氧核苷酸 体外用高温代替 体外需用耐高温的DNA聚合酶 dNTP（dATP、dTTP、dCTP、dGTP） 复制的原料实为dNTP（dATP、dTTP、dCTP、dGTP），同时水解产生能量为合成DNA子链提供能量，因此体系中不需要添加ATP。 体外复制的引物一般为DNA单链。 引物是一小段能与DNA母链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸。用于PCR的引物长度通常为20〜30个核苷酸。 3.PCR扩增所需的基本条件 微量离心管 缓冲液 PCR反应需要在一定的缓冲溶液中才能进行。真核细胞和细菌的DNA聚合酶都需要Mg 2+ 激活。因此，PCR反应缓冲溶液中一般要添加Mg 2+ 。 DNA模板 四种脱氧核苷酸(dNTP) 引物 分别与两条模板链结合的2种引物 耐高温的DNA聚合酶 （Taq酶） PCR仪 PCR扩增所需的基本条件 PCR扩增技术 当温度超过90℃时，双链DNA解聚为单链。 当温度下降到50℃左右时，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合。 当温度上升到72℃左右时，溶液中的4种脱氧核苷酸在耐高温的DNA聚合酶的作用下，根据碱基互补配对原则合成新的DNA链。 变性 延伸 复性 4.PCR反应过程： PCR扩增技术 非目标DNA数目 目标DNA数目 循环次数 1 2 3 4 5 6 7 2 4 6 8 10 12 14 0 0 2 8 22 52 114 非目标DNA数目 目标DNA数目 循环次数 1 2 0 2 4 0 3 6 2 4 8 8 5 10 22 6 12 52 7 14 114 n 2n 2n-2n 任务一：PCR扩增技术 图1、图2分别是PCR扩增技术相关过程，请思考回答下列问题： 探究—学习笔记P60 1.PCR扩增的 (填“是”或“不是”)完整的模板DNA分子，理由是 。 不是 PCR扩增的仅仅是两种引物之间所对应的特定DNA片段 探究—学习笔记P60 5’ 3’ 5’ 5’ 第一次循环 第二次循环 3’ 5’ 第三次循环 3’ 3’ 2.图1所示利用PCR技术扩增目的基因，在第 轮循环产物中开始出现两条脱氧核苷酸链等长的DNA片段，这种DNA所占的比例是 。 3 1/4 探究—学习笔记P60 4.图2是某同学设计的两组引物(只标注了部分碱基序列)都不合理，第1组不合理的原因是 。第2组不合理的原因是______________________________________________ 。 引物Ⅰ和引物Ⅱ会因局部发生碱基互补配对而失效 引物Ⅰ′自身折叠后会因出现局部碱基互补配对而 失效 探究—学习笔记P60 3.如果已知某目的基因的序列和结构，利用PCR筛选和扩增出该目的基因的关键是_________________________________________。 根据目的基因两端的核苷酸序列设计引物 5.要保证目的基因能与载体相连接，要在两种引物的 分别添加 。 6.如果循环n次，则共需消耗 对引物。 5′端 限制酶的识别序列 2n－1 探究—学习笔记P60 PCR中的数量关系 (1)引物与DNA分子中间部位结合时 复制次数 1 2 3 n DNA分子数 2 4 8 2n 含引物的DNA分子数 2 4 8 2n 含其中一种引物的DNA分子数 1＝21－1 3＝22－1 7＝23－1 2n－1 同时含两种引物的DNA分子数 0＝21－2 2＝22－2 6＝23－2 2n－2 共消耗引物的对数 1＝21－1 3＝22－1 7＝23－1 2n－1 含脱氧核苷酸链等长的DNA分子数 0＝21－2 0＝22－4 2＝23－6 2n－2n 探究—学习笔记P60 PCR中的数量关系 (2)引物与DNA分子端部结合时 ①若一条引物从DNA分子端部结合，另一条引物从DNA分子中间部位结合，则第二轮PCR循环结束时出现两条单链等长的目的片段(如图)。 ②若两条引物均从 DNA分子端部结合，则第一轮PCR循环结束时出现两条单链等长的目的片段。 探究—学习笔记P60 由于一个循环得到的产物又可以作为下一个循环的模板，因而每一次循环后目的基因的量可以增加一倍。 即成 形式扩增（约为 ，其中n为扩增循环的次数）。 指数 2n 常采用琼脂糖凝胶电泳来鉴定PCR的产物。 变性 90℃以上 延伸 72℃左右 复性 50℃左右 基本过程 5.PCR的结果： 6.PCR产物的鉴定： PCR扩增技术 (1)PCR反应中温度的周期性改变是为了DNA聚合酶催化不同的反应(　　) 提示　PCR反应中温度的周期性改变是为了变性、复性、延伸，DNA聚合酶催化子链的延伸。 (2)PCR扩增技术中，需用解旋酶使双链DNA解聚(　　) 提示　PCR扩增技术中，高温使双链DNA解聚。 (3)PCR过程使用的DNA聚合酶的特点是耐高温(　　) (4)PCR技术中，DNA模板链上碱基G和C的比例越高，DNA变性解链的温度就越高(　　) × × √ √ 判断正误—学习笔记P60 1.(2023·太原高二诊断)下列有关获取目的基因的叙述，错误的是 A.目的基因就是编码蛋白质的基因 B.获取目的基因是基因工程的第一步 C.来自苏云金杆菌的Bt抗虫蛋白基因可作为转基因抗虫棉的目的基因 D.序列比对工具的应用为科学家找到合适的目的基因提供了更多的机会 √ 落实—学习笔记P61 2.如图表示利用PCR技术扩增目的基因的部分过程，其原理与细胞内DNA复制类似。下列有关叙述错误的是 A.耐高温的DNA聚合酶总将游 离的脱氧核苷酸连接到3′端 B.在第三轮循环产物中开始出 现两条脱氧核苷酸链等长的 DNA片段 C.引物之间或引物自身发生碱 基互补配对，则不能有效扩增目的基因 D.从理论上推测，第三轮循环产物中含有引物A的DNA片段占3/4 √ 任务二：分析基因表达载体构建的目的和方法 1.获取Bt基因后不能直接将它导入受体细胞，是因为游离的DNA进入受体细胞，一般会 ，即使可以转录翻译成蛋白质，游离的DNA片段也无法随着 而进行复制，导致子代细胞中____________ ______。因此，获取Bt基因后，还需要 ，才能使棉花植株获得抗虫特性。 直接被分解 细胞分裂 不再含有目的 基因 借助载体将其导入棉花细胞 探究—学习笔记P62 基因工程的核心工作：构建基因表达载体 使目的基因在受体细胞中稳定存在，且可以遗传给下一代； 使目的基因能够在受体细胞中表达和发挥作用。 1.目的： 基因表达载体的构建 2.组成： DNA复制的起始位点 位于基因的上游；RNA聚合酶识别和结合的部位，驱动基因转录出mRNA。 位于基因的下游；终止转录 便于重组DNA分子的筛选和鉴定。 能控制表达所需要的特殊性状 2.真、原核细胞基因的结构和表达 (1)基因的结构 拓展延伸—学习笔记P63 (2)基因表达遗传信息 ①原核生物基因 拓展延伸—学习笔记P63 非编码区：不参与转录和翻译 ②真核生物基因 拓展延伸—学习笔记P63 外显子：编码蛋白质的序列称为外显子 内含子：外显子之间不能编码蛋白质的序列称为内含子（参与转录不参与翻译） 启动子的位置： 启动子的功能： RNA聚合酶识别和结合的部位，驱动基因转录出mRNA，最终获得蛋白质。 基因的首端（一段有特殊结构的DNA片段） 基因表达载体的构建 终止子的位置： 终止子的功能： 基因的尾端（一段特殊的DNA片断） 终止mRNA的转录 2.构建基因表达载体时目的基因插入的位置应该在___________________ ，因为 。 启动子下游和终止子 上游 只有插入在启动子和终止子之间，目的基因才可以正常表达 探究—学习笔记P62 1.启动子的类型 根据启动子的转录模式，可分为： ①组成型启动子，能够调控基因的表达，使其基本恒定在一定程度上，从而使基因在不同部位或组织中的表达水平不存在明显差异。这类启动子一般来自管家基因，可连续不断地启动基因的表达。 ②组织特异性启动子，其调控作用使得基因往往只在某些特定器官或组织中表达，且表现出发育调节的特性。其最大的优势是其启动的外源基因在受体中仅在需要的部位特异表达，克服了组成型启动子启动的外源基因在受体植物中非特异、持续、高效表达所造成的浪费，增加了转基因的效果。 ③诱导型启动子，当诱导物存在时，可以激活或抑制目的基因的表达。 拓展延伸—学习笔记P62 1.区分启动子和终止子与起始密码子和终止密码子 启动子和终止子位于DNA上，是基因表达载体必需的部分，而起始密码子和终止密码子位于mRNA上，决定翻译的开始和结束。 核心归纳—学习笔记P62 ① 用一定的限制酶切割载体，使其出现一个切口。 ② 用同种限制酶或能产生相同末端的限制酶切割含有目的基因的DNA片段。 ③ 将切下的Bt基因片段拼接到载体的切口处，再加入适量DNA连接酶，形成了一个重组DNA分子。 载体 基因表达载体 3.构建过程： 基因表达载体的构建 3.请结合图示，回答下列问题： (1)构建基因表达载体时， (填“能”或“不能”)用SmaⅠ酶切割质粒，因为_______________________________________________________ 。 不能 SmaⅠ会破坏质粒的抗生素抗性基因(标记基因)，不利于重组 DNA分子的筛选 探究—学习笔记P62 (2)与只使用EcoRⅠ相比较，使用BamHⅠ和Hind Ⅲ 两种限制酶同时处理质粒、外源DNA的优点是________________________________________ 。 可以防止载体和目的基因的自身环化以及目的 基因与载体的反向连接 探究—学习笔记P62 2.图解限制酶的选择原则 核心归纳—学习笔记P62 (1)不破坏目的基因原则：如图甲中可选择PstⅠ，而不选择SmaⅠ。 (2)保留标记基因、启动子、终止子、复制原点原则：质粒作为载体必须具备标记基因，所以所选择的限制酶尽量不要破坏这些结构，如图乙中不选择SmaⅠ。若载体上有两个及以上的标记基因，则可合理对其中一些标记基因进行酶切破坏，从而达到比1个标记基因更高的筛选成功率，防止只有1个标记基因时出现的“假阳性”(即未成功导入目的基因的载体也能正常表达标记基因，造成无效筛选)。 氨苄青霉素抗性基因 LacZ基因 目的基因 注：LacZ基因表达产物可以分解X-gal产生蓝色物质，使菌落呈蓝色；否则菌落呈白色。 问题：哪种大肠杆菌可以在含X-gal和青霉素的固体培养基上形成蓝色菌落 ? 核心归纳—学习笔记P62 载体 目的基因 自连 （环化） 片段间的连接 目的基因自连 质粒自连 目的基因与质粒连接 目的基因与目的基因连接 质粒与质粒连接 正向连接 反向连接 1 1’ 2 2’ 1 2 2’ 1’ 2 2’ 1’ 1 思考：使用一种限制酶进行切割，共有几种连接情况？ 核心归纳—学习笔记P62 (3)善用“双酶切”，注意方向性：目的基因所在序列和载体上存在多种酶切位点时，一般需要选择在目的基因所在序列和载体上都存在切割位点的两种不同的限制酶，对目的基因所在序列和载体进行剪切，即“双酶切法”。其优点和作用是：①防止目的基因环化；②避免目的基因与载体反向连接，即DNA连接酶连接后形成的重组DNA分子上，目的基因和载体启动子的方向(或描述为“RNA聚合酶的移动方向”)必须是相同的。否则目的基因导入后无法正常转录、 表达。如图甲、乙也可选择PstⅠ 和EcoRⅠ两种限制酶。 核心归纳—学习笔记P62 (4)巧用“同尾酶”：同尾酶指来源不同，但能产生相同黏性末端的限制酶。当不适合选择某种限制酶时，可用其同尾酶替换，以获得相同的黏性末端。 核心归纳—学习笔记P62 科学家利用基因工程生产人胰岛素过程中所使用的质粒和目的基因的部分结构如下图所示。请回答下列问题： 经典题 (1)基因工程的核心是基因表达载体的构建，图中质粒上的____________可作为标记基因将含有目的基因的细胞筛选出来。 LacZ和AmpR (2)科学家从胰岛B细胞中获取总RNA，为得到大量的人胰岛素基因，需要用到__________________酶，获得的人胰岛素基因序列中___________（填“含有”或“不含有”）启动子。 逆转录酶和耐高温的DNA聚合酶 不含有 科学家利用基因工程生产人胰岛素过程中所使用的质粒和目的基因的部分结构如下图所示。请回答下列问题： 经典题 (3)为了使人胰岛素基因和质粒正确连接，应选择___________（填限制酶）切割质粒，在通过PCR技术扩增人胰岛素基因时，可在引物1和引物2的5'端分别添加___________和____________（填限制酶）的识别序列，以使目的基因和质粒具有相同的黏性末端。 MunⅠ和SalⅠ XhoI EcoRⅠ 科学家利用基因工程生产人胰岛素过程中所使用的质粒和目的基因的部分结构如下图所示。请回答下列问题： 经典题 (4)β-半乳糖苷酶可分解无色的X-gal并产生蓝色的产物，使菌落呈现蓝色，否则菌落为白色。将大肠杆菌与基因表达载体混合培养一段时间后，将大肠杆菌接种到添加________的培养基上培养，待长出菌落后，应挑选___________的菌落作为工程菌生产人胰岛素。 氨苄青霉素和X-gal 白色 (1)基因工程操作程序的核心步骤是目的基因的获取(　　) 提示　基因工程操作程序的核心步骤是基因表达载体的构建。 (2)基因表达载体中有的含有启动子和终止密码子(　　) 提示　基因表达载体中有的含有启动子和终止子，终止密码子位于mRNA上。 (3)标记基因不一定是抗生素抗性基因(　　) × × √ 判断正误—学习笔记P61 3.(2023·新课标，6改编)某同学拟用限制酶(酶1、酶2、酶3和酶4)、DNA连接酶为工具，将目的基因(两端含相应限制酶的 识别序列和切割位点)和质粒进行切割、连接，以 构建重组表达载体。限制酶的切割位点如图所示。 下列重组表达载体构建方案合理且效率最高的是 落实—学习笔记P63 A.质粒和目的基因都用酶3切割，常用E.coli DNA连接酶连接 B.质粒用酶3切割、目的基因用酶1切割，用T4 DNA连接酶连接 C.质粒和目的基因都用酶1和酶2切割，用T4 DNA 连接酶连接 D.质粒和目的基因都用酶2和酶4切割，用E.coli DNA 连接酶连接 √ 落实—学习笔记P63 4.(2023·湖北，4改编)用氨苄青霉素抗性基因(AmpR)、四环素抗性基因(TetR)作为标记基因构建的质粒如图所示。用含有目的基因的DNA片段和用不同限制酶酶切后的质粒，构建基因表达载体(重组质粒)，并转化到受体菌中。下列叙述错误的是 A.若用Hind Ⅲ酶切，目的基因转录的产物可能不同 B.若用PvuⅠ酶切，在含Tet(四环素)培养基中的菌落，不一定含有目的基因 C.若用ScaⅠ酶切，携带目的基因的受体菌在含 Tet(四环素)的培养基中能形成菌落 D.若用SphⅠ酶切，携带目的基因的受体菌在含 Amp(氨苄青霉素)和Tet的培养基中能形成菌落 √ 网络构建 1.目的基因主要是指编码蛋白质的基因，如与生物抗逆性、生产药物、毒物降解、工业用酶等相关的基因。 2.PCR是聚合酶链式反应的缩写。它是一项根据DNA半保留复制的原理，在体外提供参与DNA复制的各种组分与反应条件，对目的基因的核苷酸序列进行大量复制的技术。 3.PCR反应需要在一定的缓冲液中进行，需提供DNA模板、2种引物、4种脱氧核苷酸和耐高温的DNA聚合酶。 4.基因工程操作程序的核心步骤是基因表达载体的构建。 要语必背 1. 。因此，PCR反应缓冲液中一般要添加Mg2＋。引物是一小段___________________________________ ____________________。 2.耐高温的DNA聚合酶的作用是 。 3.基因表达载体的构建的目的是：___________________________________ 。基因表达载体是载体的一种，除 外，它还必须有启动子、终止子等。 4.启动子的作用：_________________________________________________。 真核细胞和细菌的DNA聚合酶都需要Mg2＋激活 能与DNA母链的一段碱基序列互补 配对的短单链核酸 催化以单链DNA为模板的DNA子链的延伸 使目的基因在受体细胞中稳定存在，并 且遗传给下一代，同时，使目的基因能够表达和发挥作用 目的基因、标记基因 是RNA聚合酶识别和结合的部位，有了它才能驱动基因转录出mRNA，最终表达出人类需要的蛋白质 长句表达 5.如图1、2分别是质粒和目的基因的结构模式图。在构建基因表达载体时，科学家们常选择双酶切(同时用两种限制酶切割含目的基因的DNA和质粒)，需要用限制酶 ，不选用其他限制酶的原因是_________________________________________________________________ ___________。实践中，双酶切与单酶切相比，优点是________________ 。 　 BclⅠ和HindⅢ BamHⅠ会破坏四环素抗性基因和氨苄青霉素抗性基因，Sau3AⅠ不能 切割质粒 防止质粒和目的基 因的自身环化及质粒和目的基因的反向连接 Lavf58.45.100 Packed by Bilibili XCoder v2.0.2 $$3.2基因工程的基本操作程序 第1课时 目的基因的筛选与获取 抗虫棉 Bt抗虫蛋白 苏云金杆菌 首先要在体外对含有所需要基因的DNA分子进行“切割”、改造和 “拼接”；然后，将重组DNA分子导入棉花体细胞内，并使其在细胞 中表达。 体外 导入 载体棉花细胞的DNA 不进行切割 DNA连接酶 重组DNA 限制酶 从社会中来—教材P76 1997年，我国政府首次批准商业化 种植转基因抗虫棉。到2015年，我国已 育成转基因抗虫棉新品种100多个，减少 农药用量40万吨，增收节支社会经济效 益450亿元。 目的基因的 筛选与获取 基因表达载 体的构建 将目的基因导 入受体细胞 目的基因的 检测与鉴定 从社会中来—教材P76 在基因工程的设计和操作中，用于改变受体细胞性状或获得预 期表达产物等的基因就是目的基因。 培育转基因抗虫棉用到的Bt抗虫蛋白基因，简称Bt基因。 苏云金芽孢杆菌 产生 Bt基因 伴胞晶体蛋白 (Bt抗虫蛋白) 表达 破坏鳞翅目昆 虫的消化系统 杀死棉铃虫 导入 抗虫棉 培育 棉花细胞 1.概念： 2.实例： 主要是编码特定蛋白质的基因， 也可以是具有调控作用的因子 目的基因的筛选与获取 目的基因的筛选与获取 转基因番木瓜， 它可以抵御番 木瓜环斑病毒 转基因抗除 草剂植物 重组人胰岛素注射液 （1）从相关已知结构和功 能清晰的基因中进行筛选是 较为有效的方法之一。 （2）利用序列数据库和序列 比对工具进行筛选。 苏云金杆 菌的杀虫 作用与Bt 基因有关 掌握了Bt基因的序列信息 Bt蛋白分解为多肽后，与害虫肠 上皮细胞的特异性受体结合，导 致细胞膜穿孔，造成害虫死亡。 Bt蛋白只有在某类昆虫肠道的碱 性环境中才表现出毒性，人和牲 畜的胃液呈酸性，肠道细胞也没 有特异性受体。 方法： 目的基因的筛选与获取 筛选合适的目的基因 前提： 方法： 基因比较小、核苷酸序列已知 通过DNA合成仪用化学方法直接合成 DNA合成仪 蛋白质的 氨基酸序列 mRNA的 核苷酸序列 基因的 核苷酸序列 目的基因 推测 推测 化学合成 1.人工合成目的基因 2.常用PCR特异性地快速扩增目的基因 获取目的基因的方法 目的基因的筛选与获取 PCR是聚合酶链式反应的缩写。它是一项在体外 提供参与DNA复制的各种组分与反应条件，对目 的基因的核苷酸序列进行大量复制的技术。 DNA半保留复制 穆里斯 解旋 合成子链 复旋 1.概念： 2.原理： 目的基因的筛选与获取 利用PCR获取和扩增目的基因 体内DNA复制所需的基本条件 目的基因的筛选与获取 参与的组分 在DNA复制中的作用 解旋酶 DNA母链 4种脱氧核苷酸 DNA聚合酶 引物 打开DNA双链 提供DNA复制的模板 合成DNA子链的原料 催化合成DNA子链 使DNA聚合酶能够从引物的 3’端开始连接脱氧核苷酸 体外复制怎么改进？ 目的基因的筛选与获取 参与的组分 在DNA复制中的作用 解旋酶 打开DNA双链 DNA母链 提供DNA复制的模板 4种脱氧核苷酸 合成DNA子链的原料 DNA聚合酶 催化合成DNA子链 引物 使DNA聚合酶能够从引物的3’端开始连接脱氧核苷酸 体外用高温代替 体外需用耐高温 的DNA聚合酶 dNTP（dATP、dTTP、 dCTP、dGTP） 复制的原料实为dNTP（dATP、dTTP、dCTP、dGTP），同时水解产 生能量为合成DNA子链提供能量，因此体系中不需要添加ATP。 体外复制的引物 一般为DNA单链。 引物是一小段能与DNA母链的一段碱基序列互补配对的短单 链核酸。用于PCR的引物长度通常为20〜30个核苷酸。 3.PCR扩增所需的基本条件 微量离心管 缓冲液 PCR反应需要在一定的缓 冲溶液中才能进行。真核 细胞和细菌的DNA聚合酶 都需要Mg 2+ 激活。因此， PCR反应缓冲溶液中一般 要添加Mg 2+ 。 DNA模板 四种脱氧 核苷酸 (dNTP) 引物 分别与两条模 板链结合的2种 引物 耐高温的 DNA聚合酶 （Taq酶） PCR仪 PCR扩增所需的基本条件 PCR扩增技术 当温度超过 90℃时，双 链DNA解聚 为单链。 当温度下降到50℃左 右时，两种引物通过 碱基互补配对与两条 单链DNA结合。 当温度上升到72℃左右时，溶液 中的4种脱氧核苷酸在耐高温的 DNA聚合酶的作用下，根据碱基 互补配对原则合成新的DNA链。 变性 延伸复性 4.PCR反应过程： PCR扩增技术 非目标 DNA 数目 目标 DNA 数目 循环 次数 1 2 3 4 5 6 7 2 4 6 8 10 12 14 0 0 2 8 22 52 114 非目标 DNA 数目 目标 DNA 数目 循环 次数 1 2 0 2 4 0 3 6 2 4 8 8 5 10 22 6 12 52 7 14 114 n 2n 2n-2n 任务一：PCR扩增技术 图1、图2分别是PCR扩增技术相关过程，请思考回答下列问题： 探究—学习笔记P60 1.PCR扩增的 (填“是”或“不是”)完整的模板DNA分子，理由 是 。 不是 PCR扩增的仅仅是两种引物之间所对应的特定DNA片段 探究—学习笔记P60 5’ 3’ 5’ 5’ 第一次循环二 3’ 5’ 三 3’ 3’ 2.图1所示利用PCR技术扩增目的基因，在第 轮循环产物中开始出现两 条脱氧核苷酸链等长的DNA片段，这种DNA所占的比例是 。 3 1/4 探究—学习笔记P60 4.图2是某同学设计的两组引物(只标注了部分碱基序列)都不合理，第1 组不合理的原因是 。 第2组不合理的原因是______________________________________________ 。 引物Ⅰ和引物Ⅱ会因局部发生碱基互补配对而失效 引物Ⅰ′自身折叠后会因出现局部碱基互补配对而 失效 探究—学习笔记P60 3.如果已知某目的基因的序列和结构，利用PCR筛选和扩增出该目的基 因的关键是_________________________________________。根据目的基因两端的核苷酸序列设计引物 5.要保证目的基因能与载体相连接，要在两种引物的 分别添 加 。 6.如果循环n次，则共需消耗 对引物。 5′端 限制酶的识别序列 2n－1 探究—学习笔记P60 PCR中的数量关系 (1)引物与DNA分子中间部位结合时 复制次数 1 2 3 n DNA分子数 2 4 8 2n 含引物的DNA分子数 2 4 8 2n 含其中一种引物的DNA分子数 1＝21－1 3＝22－1 7＝23－1 2n－1 同时含两种引物的DNA分子数 0＝21－2 2＝22－2 6＝23－2 2n－2 共消耗引物的对数 1＝21－1 3＝22－1 7＝23－1 2n－1 含脱氧核苷酸链等长的DNA 分子数 0＝21－2 0＝22－4 2＝23－6 2n－2n 探究—学习笔记P60 PCR中的数量关系 (2)引物与DNA分子端部结合时 ①若一条引物从DNA分子端部结合，另 一条引物从DNA分子中间部位结合，则 第二轮PCR循环结束时出现两条单链等 长的目的片段(如图)。 ②若两条引物均从 DNA分子端部结合， 则第一轮PCR循环结束时出现两条单链 等长的目的片段。 探究—学习笔记P60 由于一个循环得到的产物又可以作为下一个循环的模板，因而每一次 循环后目的基因的量可以增加一倍。 即成 形式扩增（约为 ，其中n为扩增循环的次数）。指数 2n 常采用琼脂糖凝胶电泳来鉴定PCR 的产物。 基本过程 5.PCR的结果： 6.PCR产物的鉴定： PCR扩增技术 (1)PCR反应中温度的周期性改变是为了DNA聚合酶催化不同的反 应(　　) 提示　PCR反应中温度的周期性改变是为了变性、复性、延伸， DNA聚合酶催化子链的延伸。 (2)PCR扩增技术中，需用解旋酶使双链DNA解聚(　　) 提示　PCR扩增技术中，高温使双链DNA解聚。 (3)PCR过程使用的DNA聚合酶的特点是耐高温(　　) (4)PCR技术中，DNA模板链上碱基G和C的比例越高，DNA变性 解链的温度就越高(　　) × × √ √ 判断正误—学习笔记P60 1.(2023·太原高二诊断)下列有关获取目的基因的叙述，错误的是 A.目的基因就是编码蛋白质的基因 B.获取目的基因是基因工程的第一步 C.来自苏云金杆菌的Bt抗虫蛋白基因可作为转基因抗虫棉的目的基因 D.序列比对工具的应用为科学家找到合适的目的基因提供了更多的机会 √ 落实—学习笔记P61 2.如图表示利用PCR技术扩增目的基因的部分过程，其原理与细胞内 DNA复制类似。下列有关叙述错误的是 A.耐高温的DNA聚合酶总将游 离的脱氧核苷酸连接到3′端 B.在第三轮循环产物中开始出 现两条脱氧核苷酸链等长的 DNA片段 C.引物之间或引物自身发生碱 基互补配对，则不能有效扩增目的基因 D.从理论上推测，第三轮循环产物中含有引物A的DNA片段占3/4√ 任务二：分析基因表达载体构建的目的和方法 1.获取Bt基因后不能直接将它导入受体细胞，是因为游离的DNA进入受 体细胞，一般会 ，即使可以转录翻译成蛋白质，游离的 DNA片段也无法随着 而进行复制，导致子代细胞中____________ ______。因此，获取Bt基因后，还需要 ， 才能使棉花植株获得抗虫特性。 直接被分解 细胞分裂 不再含有目的 基因 借助载体将其导入棉花细胞 探究—学习笔记P62 基因工程的核心工作：构建基因表达载体 使目的基因在受体细胞中稳定存在，且可以遗传给下一代； 使目的基因能够在受体细胞中表达和发挥作用。 1.目的： 基因表达载体的构建 2.组成： DNA复制的起始位点 位于基因的上游； RNA聚合酶识别和结 合的部位，驱动基因 转录出mRNA。 位于基因的下游； 终止转录 便于重组DNA分 子的筛选和鉴定。 能控制表达所需 要的特殊性状 2.真、原核细胞基因的结构和表达 (1)基因的结构 拓展延伸—学习笔记P63