2026届高三生物一轮复习课件：第51讲 基因工程的基本工具和基本操作程序

2025高考一轮复习 第51讲 基因工程的基本工具和基本操作程序 3 1 2 重组DNA技术的基本工具 基因工程的基本操作程序 DNA片段的扩增及电泳鉴定 DNA的粗提取与鉴定 4 目 录 contents 重组DNA技术的基本工具 考点1 考点梳理 考点1 重组DNA技术的基本工具 1、基因工程的概念 基因工程是指按照人们的愿望，通过转基因等技术，赋予生物新的遗传特性，创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。从技术操作层面看，由于基因工程是在DNA分子水平上进行设计和施工的，因此又叫作重组DNA技术。 变异原理 操作环境 操作对象 操作水平 结果 基因重组 生物体外 基因 DNA分子水平 赋予生物新的遗传特性，创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品 定向改造生物性状 拼接的基础 ①DNA的基本组成单位相同（四种脱氧核苷酸） 表达的基础 ②都遵循碱基互补配对原则 ③DNA分子的空间结构都是规则的双螺旋结构 ①基因是控制生物性状的结构与功能单位 ②遗传信息的传递都遵循中心法则 ③生物界几乎共用一套遗传密码 不同生物的基因为什么能拼接？为什么一种生物的基因可以在另一种生物细胞内表达? 考点1 重组DNA技术的基本工具 考点1 重组DNA技术的基本工具 2、重组DNA技术的基本工具 （1）限制性内切核酸酶（简称“限制酶”）—“分子手术刀” ①主要来源：__________。 ②种类：分离的限制酶有______种。 ③特点(专一性)：识别双链DNA分子的________________。使每一条链中特定部位的____________断开。 ④识别序列长度： 原核生物 数千 特定核苷酸序列　 磷酸二酯键　 限制酶不是一种酶，而是一类酶 一般为4个、8个或其他数量的核苷酸，最常见的为6个核苷酸。 一种限制酶可能识别多种核苷酸序列 T G C C G T A A 5' 3' 5' 3' 考点1 重组DNA技术的基本工具 磷酸二酯键　 磷酸二酯键的断裂是水解反应，断裂1个磷酸二酯键消耗1个H2O分子。　 磷酸基团　 羟基 （1）存在于原核生物中的限制酶的作用是什么？__________________________________________________。 （2）限制酶来源于原核生物，为什么不能切割自身的DNA分子？_____________________________________________________________ ________________________________。 切割外源DNA以保证自身安全，防止外来病原物的危害　 原核生物的DNA分子中不存在该酶的识别序列或识别序列已经被甲基化等修饰，使限制酶不能将其切开 题型剖析 ⑤结果： 考点1 重组DNA技术的基本工具 错位切 平切 突出的部位为黏性末端 任意两平末端都能连接 ⑤结果： a.不同DNA分子用同一种限制酶切割产生的黏性末端都相同，同一种DNA分子用不同的限制酶切割，产生的黏性末端也可能相同。 识别的序列不同，但切割后产生相同黏性末端的一类限制酶称为同尾酶，且切割产生的黏性末端可以相互配对。 考点1 重组DNA技术的基本工具 考点1 重组DNA技术的基本工具 ⑤结果： b.判断两个末端是否相同的方法：将其中一个末端旋转180°，若与另一个完全相同，则说明这两个末端是相同末端，可能是同一种限制酶或同尾酶切割。 从切割处向内看均为AATT，则两个末端是相同末端。 考点1 重组DNA技术的基本工具 ⑥限制酶的命名 EcoRⅠ 属名Escherichia首字母 种名coli前两个字母 R型菌株 从中分离的第一个限制酶 BamHⅠ EcoRⅠ________________________ Hind Ⅲ Bgl Ⅱ ________________________ -G -CCTAG 1.写出下列限制酶切割形成的末端序列 -G -CTTAA -A -TTCGA -A -TCTAG 和 GATCC- G- 和 AATTC- G- 和 AGCTT- A- 和 GATCT- A- 题型剖析 2.现有一段DNA，含有g1、g2、g3，若要获取目的基因g2，如何操作？ 限制酶需要切割几次？ 2 产生几个末端？共产生几个磷酸基团？ 4 4 识别序列G AATTC g1 g2 g3 CT TCATG AATTCCCTAA GAAGTACTTAA GGGAT T GGCATCTTAA AATTCCGTAG 5‘ 5‘ 3‘ 3‘ 将一个基因从DNA分子内部切割下来需要切割两次，断开4个磷酸二酯键，消耗4个水分子，同时产生4个末端。 题型剖析 考点1 重组DNA技术的基本工具 （2）DNA连接酶 ——“分子缝合针” 磷酸二酯键 大肠杆菌 黏性末端 黏性末端 但连接平末端效率较低。 DNA连接酶和DNA聚合酶的比较： DNA连接酶 DNA聚合酶 相同点 作用实质 化学本质 不 同 点 模板 作用对象 作用结果 用途 都能催化形成磷酸二酯键 都是蛋白质 不需要 需要DNA的一条链作模板 形成完整的重组DNA分子 形成DNA的一条链 基因工程 DNA复制 只能将单个核苷酸连接到已有的DNA片段上，形成磷酸二酯键 在两个DNA片段之间形成磷酸二酯键 考点1 重组DNA技术的基本工具 与DNA有关的几种酶的比较： DNA片段　 脱氧核苷酸　 考点1 重组DNA技术的基本工具 与DNA有关的几种酶的比较： 氢键　 脱氧核苷酸 考点1 重组DNA技术的基本工具 单个 考点1 重组DNA技术的基本工具 （3）载体 ①作用： ②载体（质粒）的特点： a.携带外源DNA片段的质粒进入受体细胞，能够在宿主细胞中进行自我复制或整合到受体染色体DNA上，随受体DNA同步复制。 b.具一个或多个限制酶切点，供外源DNA片段（目的基因）插入其中。 c.具有多个标记基因，便于进行鉴定和选择。 d.对受体细胞无害。 携带外源DNA片段进入受体细胞，并在受体细胞内对目的基因进行复制和表达 考点1 重组DNA技术的基本工具 ③种类： 与膜载体的区别：基因工程中的载体是DNA分子，能将目的基因导入受体细胞内，并利用它在宿主细胞内对目的基因进行大量复制；膜载体是蛋白质，与细胞膜的通透性有关。 a.质粒：质粒是一种裸露的、结构简单、独立于真核细胞细胞核或原核细胞拟核DNA之外，并具有自我复制能力的环状双链DNA分子。 b.病毒：噬菌体、动植物病毒等。 质粒是基因工程中最常用的载体，载体≠质粒。 考点1 重组DNA技术的基本工具 ④标记基因的作用： 标记基因一般是某种抗生素的抗性基因或荧光蛋白基因；作用：鉴别受体细胞中是否含有目的基因，从而将含有目的基因的细胞筛选出来。 [教材新命题点思考] 1.天然的DNA分子是否可以直接用作基因工程载体？为什么？ 不可以。含有复制原点、含有一种或多种限制酶的识别序列、有标记基因等特点的DNA分子才可以直接用作基因工程的载体。实际上，天然的DNA分子一般不完全具备上述条件，往往需要进行人工改造后才能用于基因工程操作。 2.实践中常用某些病毒载体作为基因工程工具，除具备普通质粒载体的条件外，还应具有的条件是______________________________________ __________________(答出两点即可)。 对靶细胞具有较高的转化效率、不能增殖、对细胞无害 题型剖析 3.限制酶EcoRⅠ只能识别序列—GAATTC—，并只能在G与A之间切割。若在某目的基因的两侧各有1个EcoRⅠ的切点，请画出目的基因两侧被限制酶EcoRⅠ切割后所形成的黏性末端。 —G　　　AATTC……G　　　　AATTC— —CTTAA G……CTTAA　　　　G— 　　　　　　目的基因 题型剖析 考点1 重组DNA技术的基本工具 3、选择限制酶的方法 (1)根据目的基因两端的限制酶切割位点确定限制酶的种类 ①应选择切割位点位于目的基因两端的限制酶， 以便将目的基因“切出”，如图可选择Pst Ⅰ。 ②不能选择切割位点位于目的基因内部的限制酶， 防止破坏目的基因，如图不能选择Sma Ⅰ。 使用一种DNA限制酶进行切割，是否只会得到一种重组DNA？有何缺点？怎么改进？ 载体 目的基因 自连 两个片段间的连接 目的基因自连 质粒自连 目的基因与质粒连接 目的基因与目的基因连接 质粒与质粒连接 正向连接 反向连接 1 1’ 2 2’ 1 2 2’ 1’ 2 2’ 1’ 1 单酶切缺点： ①质粒、目的基因自身环化；②质粒与目的基因反向连接 如何解决这一问题？ 双酶切 考点1 重组DNA技术的基本工具 (1)根据目的基因两端的限制酶切割位点确定限制酶的种类 ③为避免目的基因和质粒的自身环化和正反向连接，也可使用不同的限制酶切割目的基因和质粒(双酶切)，如图可选择用PstⅠ和EcoRⅠ两种限制酶(但要确保质粒上也有这两种限制酶的切割位点，而且这两种限制酶切割后不会完全破坏标记基因)。 总结：a.能切下目的基因且不破坏目的基因 b.双酶切 考点1 重组DNA技术的基本工具 (2)根据质粒的特点确定限制酶的种类 总结： a.不破坏重要结构 b.启动子和终止子之间 考点1 重组DNA技术的基本工具 (3)根据Ti质粒的T-DNA片段选择限制酶 图中甲、乙、丁Ti质粒均不宜选取，丙Ti质粒宜选取(设切割目的基因的限制酶为XbaⅠ和SacⅠ)。 总结：在T-DNA上 1．基因工程的原理是基因重组，不过这种变异是定向的。( ) 2．重组DNA技术所需要的工具酶有限制酶、DNA连接酶和载体。( ) 3．DNA连接酶可以连接目的基因与载体的氢键，形成重组DNA。( ) 4．E.coli DNA连接酶既能连接黏性末端，又能连接平末端。( ) 5．载体的种类有质粒、噬菌体、动植物病毒等，其中动植物病毒必须是DNA病毒。( ) 6．载体质粒通常采用抗生素合成基因作为筛选标记基因(　　) √ √ × × × × 题型剖析 [经典·基础·诊断] 1. (2024·山东济南高三期末)下列关于生物学中常见的几种酶的叙述，正确的是(　　) A．DNA连接酶将目的基因的黏性末端与载体的黏性末端之间的碱基黏合 B．用限制性内切核酸酶从质粒上切下一个目的基因需消耗4个水分子 C．利用PCR仪扩增DNA分子时常用一种耐高温的DNA连接酶 D．在解离根尖分生区细胞时加入纤维素酶有利于提高解离的效果 B 题型剖析 3.(2024·广东深圳高三检测)右图为某种质粒的简图，小箭 头所指分别为限制性内切核酸酶EcoRⅠ、BamHⅠ的酶 切位点，P为转录的启动部位。已知目的基因的两端有 EcoRⅠ、BamHⅠ的酶切位点，受体细胞为无任何抗药 性的原核细胞。下列有关叙述正确的是(　　) A．将含有目的基因的DNA与质粒分别用EcoRⅠ酶切，在DNA连接酶作用下，生成的由两个DNA片段连接形成的产物有两种 B．DNA连接酶的作用是将酶切后得到的黏性末端连接起来，形成一个重组质粒时形成两个磷酸二酯键 C．为了防止目的基因反向连接和质粒自身环化，酶切时可选用的酶是EcoRⅠ和BamH Ⅰ D．受体细胞能在含青霉素的培养基中生长，表明目的基因已成功导入该细胞 C 题型剖析 1．(2023·湖北等级考)用氨苄青霉素抗性基因(AmpR)、四环素抗性基因(TetR)作为标记基因构建的质粒如下图所示。用含有目的基因的DNA片段和用不同限制酶酶切后的质粒，构建基因表达载体(重组质粒)，并转化到受体菌中。下列叙述错误的是(　　) A．若用Hind Ⅲ酶切，目的基因转录的产物可能不同 B．若用Pvu Ⅰ酶切，在含Tet(四环素)培养基中的菌 落，不一定含有目的基因 C．若用Sph Ⅰ酶切，可通过DNA凝胶电泳技术鉴定重 组质粒构建成功与否 D．若用Sph Ⅰ酶切，携带目的基因的受体菌在含Amp(氨苄青霉素)和Tet的培养基中能形成菌落 D 题型剖析 2.(2024·辽宁丹东高三质检)图1是某基因工程中构建重组质粒的过程示意图，载体质粒P0具有四环素抗性基因(TetR)和氨苄青霉素抗性基因(AmpR)。请回答下列问题： (1)EcoRⅤ酶切位点为 ，EcoRⅤ酶切出来的线性载体P1为____末端。 平　 题型剖析 (2)用Taq DNA聚合酶进行PCR扩增获得的目的基因片段，其两端各自带有一个腺嘌呤脱氧核苷酸。载体P1用酶处理，在两端各添加了一个碱基为____________的脱氧核苷酸，形成P2；P2和目的基因片段在__________酶作用下，形成重组质粒P3。 胸腺嘧啶(T) DNA连接　 题型剖析 (3)为筛选出含有重组质粒P3的菌落，采用含有不同抗生素的平板进行筛选，得到A、B、C三类菌落，其生长情况见下表(“＋”代表生长，“－”代表不生长)。根据表中结果判断，应选择的菌落是____(填表中字母)类，另外两类菌落质粒导入情况分别是_______________、___________________。 平板类型 菌落类型 A B C 无抗生素 ＋ ＋ ＋ 氨苄青霉素 ＋ ＋ － 四环素 ＋ － － 氨苄青霉素＋四环素 ＋ － － B　 A类菌落含有P0　 C类菌落未导入质粒　 题型剖析 (4)为鉴定筛选出的菌落中是否含有正确插入目的基因的重组质粒，拟设计引物进行PCR鉴定。图2所示为甲、乙、丙3条引物在正确重组质粒中的相应位置，PCR鉴定时应选择的一对引物是__________。某学生尝试用图中另外一对引物，结果从某一菌落的质粒中扩增出了400 bp 片段，原因是___________________。 乙、丙　 目的基因反向连接 题型剖析 基因工程的基本操作程序 考点2 考点梳理 培育转基因抗虫棉的简要过程 普通棉花 （无抗虫特性） 棉花细胞 抗虫棉 提取 表达Bt基因 导入 与载体拼接 重组DNA分子 1.目的基因的筛选与获取 2.基因表达载体的构建 （核心） 3.将目的基因导入受体细胞 4.目的基因的检测与鉴定 Bt基因 苏云金杆菌 考点2 基因工程的基本操作程序 1、目的基因的筛选与获取 （1）目的基因概念 （2）筛选合适的目的基因 在基因工程的设计和操作中，用于改变受体细胞 或获得预期 等的基因。主要指的是编码蛋白质的基因，如Bt基因。 ①从相关的已知 的基因中进行筛选是较为有效的方法之一。 ②利用测序技术、 和序列比对工具进行筛选。 表达产物 结构和功能清晰 序列数据库 性状 也可以是具有调控作用的因子 考点2 基因工程的基本操作程序 【思考】Bt毒蛋白如何杀死害虫？对人有害吗？ 当Bt抗虫蛋白被分解为多肽后，多肽与害虫肠上皮细胞的特异性受体结合，导致细胞膜穿孔，最后造成害虫死亡。 Bt抗虫蛋白只有在某类昆虫肠道的碱性环境中才能表现出毒性，而人和牲畜的胃液呈酸性，肠道细胞也没有特异性受体。因此，Bt抗虫蛋白不会对人畜产生上述影响。 （3）基因的结构： ①真核细胞的基因结构 考点2 基因工程的基本操作程序 考点2 基因工程的基本操作程序 （3）基因的结构： ②原核细胞的基因结构 考点2 基因工程的基本操作程序 典型的真核细胞基因的结构示意图 典型的原核细胞基因的结构示意图 考点2 基因工程的基本操作程序 （3）基因的结构 原核细胞 真核细胞 不同点 编码区是______的 编码区是间隔的、______的 相同点 都由能够编码蛋白质的_________和具有调控作用的_________区组成的 连续 不连续 编码区 非编码 真核细胞与原核细胞中基因表达过程示意图 真核细胞： 原核细胞： 【思考】如果把一个真核生物的基因导入原核细胞中表达，一定会产生原来的蛋白质吗? 【思考】如果把真核基因导入原核细胞中表达，不考虑蛋白质加工的问题，如何产生与原来结构相同的蛋白质吗? 1.(选择性必修3 P79旁栏思考)PCR不可以扩增mRNA的原因是_________________________________________________________________________________________________________________。 PCR是以DNA双链作模板的，不能直接用单链RNA进行PCR，必须把mRNA逆转录成cDNA之后再进行PCR 题型剖析 （4）目的基因的获取 条件： 基因比较小，且目的基因核苷酸序列已知。 仪器： DNA合成仪。 ①人工合成目的基因。 考点2 基因工程的基本操作程序 ②通过构建 来获取目的基因。 ③利用PCR 或扩增目的基因 基因文库 获取 cDNA文库 基因组文库 有一段已知目的基因的核苷酸序列，以便根据这一序列设计引物 条件： 无内含子； 基因组文库 cDNA文库 考点2 基因工程的基本操作程序 （5）利用PCR获取和扩增目的基因 ①PCR(聚合酶链式反应)： ③仪器： 是一项根据 的原理，在体外提供参与DNA复制的各种 与反应条件，对目的基因的核苷酸序列进行 的技术。 DNA半保留复制 组分 大量复制 ②PCR反应的条件： 一定的 、DNA模板、2种 、4种___________________、 DNA聚合酶，通过控制 使DNA复制在体外反复进行。 缓冲溶液 引物 脱氧核苷酸（dNTP） 耐高温的 温度 PCR扩增仪（PCR仪） 参与的组分 在PCR中的作用 高温 模板DNA 4种脱氧核苷酸dNTP 耐高温的DNA聚合酶 引物 一定的缓冲溶液 (含Mg2＋) 使DNA双链间的氢键断裂，打开DNA双链 提供DNA复制的模板（含目的基因） 催化合成DNA子链 主要是一小段DNA单链，为DNA聚合酶提供了游离的3′端，使DNA聚合酶能够从引物的3′端延伸子链。 提供合适的酸碱度和离子，真核细胞和细菌的DNA聚合酶均需要Mg2＋激活 合成DNA子链的原料；为DNA的合成提供能量 ②PCR反应的条件： 考点2 基因工程的基本操作程序 考点2 基因工程的基本操作程序 关于引物： ②引物是一小段能与DNA母链的3′端的一段碱基序列互补配对的短单链核酸。用于PCR的引物通常为20~30个核苷酸。在细胞中为一段单链RNA，在PCR中为一段人工合成的单链DNA。引物过短，产生的非特异性条带增多。 ①引物作用：为DNA聚合酶提供游离的3′端，使DNA聚合酶从3′端开始连接脱氧核苷酸，延伸子链（DNA聚合酶不具有从头合成子链的功能），所以原料（4种脱氧核苷酸）应添加在引物的3 ′端。 考点2 基因工程的基本操作程序 关于引物： ③引物要求：引物内部不能发生过多局部互补配对；2种引物之间不能发生互补配对，形成引物二聚体。 ④限制酶识别序列应添加在引物5 ′端，原因：使引物的3′端与模板链严格互补配对，且不影响子链的延伸。 6.设计引物是PCR技术关键步骤之一。某同学设计的两组引物(只标注了部分碱基序列)都不合理(如下图)，请分别说明理由。 ①第1组：________________________________________________； ②第2组：________________________________________________。 引物Ⅰ和引物Ⅱ局部发生碱基互补配对而失效　 引物Ⅰ′自身折叠后会出现局部碱基互补配对而失效 题型剖析 考点2 基因工程的基本操作程序 ③过程 两种引物 复性温度过低，产生的非特异性条带增多。 ③过程 耐高温的DNA 聚合酶 考点2 基因工程的基本操作程序 4种脱氧核苷酸加到引物的 。 3’端 第一轮 第二轮 第三轮 考点2 基因工程的基本操作程序 ④PCR结果 首次得到等长核苷酸链（完整目的基因）轮数： 由于一个循环得到的产物又可以作为下一个循环的模板，因而每一次循环后目的基因的量可以增加一倍。 即成 形式扩增（约为 ，其中n为扩增循环的次数）。 指数 2n ⑤PCR扩增中相关DNA数目的规律 第3轮 复制次数 n DNA分子数（DNA片段） DNA链数 首次得到完整目的基因轮数 含引物的DNA分子数 共消耗的引物数 含a或b引物的DNA分子数 同时含两种引物的DNA分子数 第n次复制需要的引物数 2n 2n+1 第3轮 2n 2n+1－2 2n－1 2n－2 2n ⑤PCR扩增中相关DNA数目的规律（1个模板DNA分子PCR中的数量关系） 考点2 基因工程的基本操作程序 考点2 基因工程的基本操作程序 ⑤PCR扩增中相关DNA数目的规律（1个模板DNA分子PCR中的数量关系） 复制次数 n 长单链数 中单链数 短单链数 等长的DNA分子数 2 2n 2n+1－2-2n 2n－2n 2 8 6 2 3 2 2 2 4 2 2 1 等长的DNA分子数 =总DNA数-不等长DNA数 =总DNA数-中单链数 =2n－2n 整个体系中有 种链， 种DNA分子。 3 5 考点2 基因工程的基本操作程序 ⑥产物鉴定：采用 来鉴定PCR的产物。 琼脂糖凝胶电泳 DNA分子电泳仪 电泳结果 考点2 基因工程的基本操作程序 （6）PCR技术和DNA复制的比较： （6）PCR技术和DNA复制的比较： 考点2 基因工程的基本操作程序 7.新冠病毒是一种单链RNA病毒，常用“荧光RT—PCR技术”进行检测，方法是取检测者的mRNA逆转录出cDNA，并大量扩增时，用荧光标记的新冠病毒核酸探针来检测PCR产物中是否含有新冠病毒的cDNA，请回答下列问题： (1)“荧光RT—PCR技术”所用的试剂盒中通常都应该含有：________、___________________________________、荧光标记的核酸探针、引物、dNTP、缓冲体系。 逆转录酶　 耐高温的DNA聚合酶(Taq DNA聚合酶)　 题型剖析 (2)如果要同时扩增两种基因，则试剂盒中的引物应该有____种。下图为新冠病毒的“ORFlab基因”对应的cDNA片段结构示意图，则与之对应的引物结合的部位应该是图中的______(子链延伸方向为其自身的5′→3′，用图中数字作答)。若已知该基因的引物Ⅰ，能否依据其碱基序列设计出另一种引物Ⅱ？______，理由是_________________________________ _____________________。 4　 4、1　 两段引物的碱基序列没有相关性(既不相同，也不互补) 不能　 题型剖析 2、基因表达载体的构建—基因工程的核心 （1）目的： （2）基因表达载体组成 考点2 基因工程的基本操作程序 ①使目的基因 ； 在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传给下一代 ②使目的基因能够表达和发挥作用。 ①启动子 ②终止子 ③标记基因 ④复制原点 ⑤限制酶切割位点 ⑥目的基因 2.(选择性必修3 P80 旁栏思考)为什么不直接把目的基因导入受体细胞，而要用载体？____________________________________________ _________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________。 游离的DNA片段进入受体细胞，一般会直接被分解，就算可以进行转录并翻译成蛋白质，游离的DNA片段也无法随着细胞分裂而进行复制，导致子代细胞中不再含有目的基因。若将目的基因插入载体，由于载体可以在细胞内复制，随着细胞分裂，载体会带着目的基因存在于每个子代细胞中。这样，基因工程才有意义 题型剖析 （2）基因表达载体组成 考点2 基因工程的基本操作程序 ①启动子 基因的上游，RNA聚合酶识别和结合的部位；驱动基因转录出mRNA ④终止子 ③限制酶切割位点 基因的下游，能终止mRNA的转录 ⑥标记基因 鉴别受体细胞中是否含有目的基因，筛选含有目的基因的细胞 ⑤复制原点 ②目的基因 DNA复制起始位点 目的基因应插入启动子和终止子之间的部位 （2）基因表达载体组成 例：如果转基因棉花植株中Bt毒蛋白含量偏低，取食后的棉铃虫可通过激活肠干细胞分裂和产生新的肠道细胞，修复损伤的肠道，由此导致杀虫效果下降。请据此提出一项可提高转基因棉花杀虫效果的改进思路： 考点2 基因工程的基本操作程序 诱导型启动子 诱导物 作用 激活或抑制 目的基因表达 诱导型启动子： 在基因表达载体中加入人工构建的诱导型启动子（增强子），激活Bt毒蛋白的表达，使其表达量增多来提高杀虫效果。 （3）启动子、终止子、起始密码子、终止密码子对比 考点2 基因工程的基本操作程序 项目 启动子 终止子 起始密码子 终止密码子 位置 DNA分子上 DNA分子上 mRNA分子上 mRNA分子上 功能 RNA聚合酶识别和结合的部位，驱动基因转录出mRNA 使转录在所需要的地方停下来 翻译的起始信号(编码氨基酸) 翻译的结束信号(不编码氨基酸) （4）基因表达载体的构建过程： 考点2 基因工程的基本操作程序 若考虑两两相连，则DNA连接酶连接DNA片段会出现三种情况：目目；目质；质质；需筛选出重组质粒。 含目的基因 3、将目的基因导入受体细胞 （1）将目的基因导入植物细胞 ①花粉管通道法（我国科学家独创） 考点2 基因工程的基本操作程序 方法2：在植物受粉后的一定时间内，剪去柱头，将DNA溶液滴加在花柱切面上，使目的基因借助花粉管通道进入胚囊。 方法1：用微量注射器将含目的基因的DNA溶液直接注入子房中； 目的基因 （1）将目的基因导入植物细胞 ②农杆菌转化法 考点2 基因工程的基本操作程序 a.农杆菌特点： 易感染双子叶植物和裸子植物，对大多数单子叶植物没有感染能力。 Ti质粒上的T-DNA可以转移到被侵染的受体细胞，并将其整合到宿主细胞染色体DNA上。 b.原理： c.转化： 目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程。与肺炎链球菌的转化相同，实质是基因重组。 表达 ②农杆菌转化法 d.实施方法 考点2 基因工程的基本操作程序 目的基因 Ti质粒 表 达 载 体 农杆菌 植物细胞 植物细胞 染色体DNA 新性状植株 构建 转入 导入 插入 筛选 注意：是筛选植株不是筛选转基因的农杆菌 ②农杆菌转化法 考点2 基因工程的基本操作程序 两次拼接： 第一次拼接：将目的基因拼接到Ti质粒的T-DNA上； 第二次拼接(非人工操作)：被插入目的基因的T-DNA拼接到受体细胞染色体DNA上。 两次导入： 第一次导入：将含目的基因的重组Ti质粒导入农杆菌； 第二次导入(非人工操作)：含目的基因的T-DNA导入受体细胞。 感染烟草细胞，把目的基因插入到烟草细胞的染色体DNA上。 农杆菌的作用： （2）将目的基因导入动物细胞 ①显微注射法 考点2 基因工程的基本操作程序 构建基因表达载体并提纯 利用显微注射法将基因表达载体注入动物的受精卵中 早期胚胎培养 胚胎移植（移植到同期发情的母畜子宫内） 获得具有新性状的动物 a.体积大，易操作； b.全能性高，易培养成完整个体。 ②病毒介导法 考点2 基因工程的基本操作程序 科学家也用病毒DNA与目的基因一起构建的载体，去感染受体动物细胞，也能使目的基因导入动物细胞内。如用腺病毒载体，搭载新冠病毒S基因，进入人体内，使人体产生对S蛋白的免疫记忆。 原核细胞（常选择大肠杆菌） 优点：繁殖快，多为单细胞，遗传物质相对较少，易于培养。 （3）将目的基因导入微生物细胞—Ca2+处理法 ①受体细胞： ②Ca2+处理目的：制备感受态细胞 考点2 基因工程的基本操作程序 使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态。 种类项目 　　 植物细胞 动物细胞 微生物细胞 常用方法 农杆菌转化法； 花粉管通道法 显微注射法 Ca2＋处理法 受体细胞 受精卵或体细胞 受精卵 常用原核细胞 转化过程 目的基因插入Ti质粒的T-DNA上→转入农杆菌→导入植物细胞→整合到受体细胞DNA中→表达 目的基因表达载体提纯→取受精卵→显微注射→受精卵发育→获得具有新性状的动物 Ca2＋处理细胞→感受态细胞→表达载体与感受态细胞混合→感受态细胞吸收DNA分子 考点2 基因工程的基本操作程序 4、目的基因的检测与鉴定 （1）目的： 检测目的基因进入受体细胞后，是否稳定维持和表达其遗传特性。 （2）检测内容及方法 ①分子水平的检测： DNA、mRNA、蛋白质 ②个体生物学水平的鉴定： 性状 考点2 基因工程的基本操作程序 ①分子水平的检测： a.目的基因是否插入到受体细胞染色体DNA上 方法一：利用PCR技术 考点2 基因工程的基本操作程序 转基因生物 提取DNA DNA作为模板 PCR操作 是否扩增出目的基因 电泳操作 a.目的基因是否插入到受体细胞染色体DNA上 方法二：DNA分子杂交法（利用探针） 探针是放射性同位素或荧光标记的含目的基因的单链核酸片段。 考点2 基因工程的基本操作程序 目的基因 放射性 标记 探针 探针与受体中的DNA分子杂交 出现杂交带：已插入 不出现杂交带：未插入 原理：碱基互补配对原则 注意：探针与解旋的单链目的基因结合 ①分子水平的检测： b.目的基因是否转录出了mRNA 方法一：利用PCR技术 考点2 基因工程的基本操作程序 转基因生物 PCR操作 是否扩增出目的基因 逆转录 cDNA 提取RNA mRNA作为模板 b.目的基因是否转录出了mRNA 方法二：DNA分子杂交法（利用探针） 考点2 基因工程的基本操作程序 目的基因 放射性 标记 探针 探针与受体中的mRNA杂交 出现杂交带：已转录 不出现杂交带：未转录 原理：碱基互补配对原则 提取蛋白 电泳分离 提取 Bt毒蛋白 注射小鼠体内 抗体 标记抗体 抗原 抗体 杂交 脱分化 苏云金杆菌 ①分子水平的检测： c.目的基因是否翻译成相应的蛋白质 方法：抗原-抗体杂交技术 考点2 基因工程的基本操作程序 ②个体生物学水平的鉴定： 对照组：普通个体无抗性存在 实验组：转基因个体有抗性存在 如饲喂法，通过采摘抗虫棉的叶片饲喂棉铃虫来确定Bt基因是否赋予了棉花抗虫特性以及抗性的程度。 考点2 基因工程的基本操作程序 类型 检测内容 方法 分子水平 的检测 个体生物学水平的鉴定 受体细胞的染色体DNA上是否插入了目的基因 目的基因是否转录出了mRNA PCR等技术 目的基因是否翻译成蛋白质 抗原-抗体杂交技术 个体是否具有相应性状 抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等 考点2 基因工程的基本操作程序 3．(2024·武汉高三调研)由于某目的基因酶切后的末端为平末端，载体E只有产生黏性末端的酶切位点，需借助中间载体P将目的基因接入载体E。据图分析，下列叙述正确的是(　　) A．通过PCR扩增获取目的基因是基因 工程的核心工作 B．为了便于该目的基因接入载体E，可 用限制酶EcoRⅤ或SmaⅠ切割载体P C．载体P只能作为中间载体，是因为其没有表达该目的基因的启动子与终止子 D．若受体细胞表现出抗性基因的相应性状，则表明重组载体成功导入受体细胞 C 题型剖析 2. (2024·江苏百校联考)重叠延伸PCR是一种通过寡聚核苷酸链之间重叠的部分互相搭桥、互为模板，经过多次PCR扩增，获得目的基因的方法。该技术在扩增较长片段的DNA、不同来源的DNA片段拼接、基因的定点诱变等方面具有广泛的应用前景，下图表示利用重叠延伸PCR技术扩增某目的基因的过程。下列叙述错误的是(　　) A．引物中G＋C的含量越高，引物与模板 DNA结合的稳定性越高 B．在第一阶段由于引物2和引物3发生碱基 互补配对，因此两者置于不同反应系统中 题型剖析 2. (2024·江苏百校联考)重叠延伸PCR是一种通过寡聚核苷酸链之间重叠的部分互相搭桥、互为模板，经过多次PCR扩增，获得目的基因的方法。该技术在扩增较长片段的DNA、不同来源的DNA片段拼接、基因的定点诱变等方面具有广泛的应用前景，下图表示利用重叠延伸PCR技术扩增某目的基因的过程。下列叙述错误的是(　　) C．引物1、2组成的反应系统和引物 3、4组成的反应系统中均进行一次 复制后，共产生4种双链DNA分子 D．在引物1、2组成的反应系统中， 经第一阶段要形成图示双链DNA， 至少要经过2次复制 C 题型剖析 小本-T11．(2024·华中师大一附中高三模拟)幽门螺杆菌是一种常见的人类致病菌，其骨架蛋白MreB通过影响脲酶活性而参与调控其致病性。为了更准确地分离出MreB蛋白，用重叠延伸PCR技术(指在PCR的基础上，采用具有互补末端的引物，使PCR产物形成重叠链，通过重叠链的延伸，将不同来源的片段重叠拼接起来的一项技术)将幽门螺杆菌MreB基因中编码终止密码子前的DNA序列与TAP标签(可以标记幽门螺杆菌基因组中任何一个基因，且不会影响基因的表达)进行连接，构建了融合表达蛋白MreB和TAP标签的质粒，实验流程如下图所示。据图回答下列问题： 题型剖析 题型剖析 (1)重叠PCR获得带有标签的MreB基因 ①获得两种具有重叠片段DNA的过程中，PCR1和PCR2必须在不同的反应体系中，原因是_________________________________________________ ____________________________________。 ②PCR3反应体系中所加入的引物是__________________。 引物2和引物3中存在互补配对的片段，置于同一反应体系中时，它们会发生结合而失去作用 引物1、引物4　 题型剖析 (2)重组质粒的构建 ①为将带有标签的MreB基因定向插入pK18mobsacB质粒中，需要在引物末端添加限制酶识别序列，据图分析，在引物1末端添加的序列所对应的限制酶是________，在引物4末端添加的序列所对应的限制酶是_________。 经过这两种酶酶切的带有标签的MreB基因和pK18mobsacB质粒进行连接时，可选用__________________(填“E.coli DNA连接酶”或“T4 DNA连接酶”)。 ②重组质粒中，KmR的作用是_______________________________________ ______________________________________。 SmaⅠ 　T4 DNA连接酶 XhoⅠ 鉴别受体细胞中是否含有目的基因，从而将含有目的基因的细胞筛选出来 题型剖析 3.(2023·山东等级考)科研人员构建了可表达J－V5融合蛋白的重组质粒并进行了检测，该质粒的部分结构如图甲所示，其中V5编码序列表达标签短肽V5。 (1)与图甲中启动子结合的酶是___________。除图甲中标出的结构外，作为载体，质粒还需具备的结构有____________________________________ ________________________(答出2个结构即可)。 RNA聚合酶 限制酶切割位点、标记基因、复制原点(答出2个结构即可)　 题型剖析 4．(2024·湖北高三联考)基因敲减主要是指从转录水平或翻译水平使基因表达失活的技术，其中RNA干扰技术是常用的基因敲减技术，该技术首先要根据目的基因序列设计出反义RNA和正义RNA构建成双链RNA(shRNA)，然后用相关酶切割shRNA形成反义RNA片段，其可与目的基因转录的mRNA碱基互补配对，进而诱导相关酶水解mRNA，实现对基因的敲减。为检测设计出的shRNA是否能成功敲减基因还需要利用荧光酶报道基因系统进行验证。图1表示敲减载体构建，图2表示荧光酶报道基因系统检测的原理。回答下列问题： 题型剖析 题型剖析 的shRNA基因能够和质粒构建敲减载体，在设计引物时需在引物的_____ (填“5′”或“3′”)端分别添加_________________酶能够识别的序列。 (1)据图1分析，若要从含shRNA基因的DNA分子中扩增出shRNA基因并能使其在受体细胞中表达，则需要用到的引物是______________，为使扩增出 引物2、引物5　 5′　 BamHⅠ、Hind Ⅲ 题型剖析 (2)已知mRNA末端缺失会导致mRNA水解。荧光酶报道基因与欲敲减的目的基因串联可构成荧光酶报道基因系统，荧光酶报道基因与目的基因的连接点是终止密码子对应的序列，而不是终止子，其原因是________________ __________________________________________________________。 (3)荧光酶报道基因系统与敲减载体一同导入受体细胞中可以根据荧光的有无检测敲减载体是否成功敲减目的基因，其机理是____________________________________________________________________________________________________________________________。 转录过程在终止子处会终止，若连接点为终止子则不能实现两基因的mRNA的串联 若敲减载体能够敲减目的基因，则荧光酶报道基因和目的基因转录形成的mRNA会被水解，荧光酶报道基因不能正常表达，无法检测到荧光 题型剖析 (2)构建重组质粒后，为了确定J基因连接到质粒中且插入方向正确，需进行PCR检测，若仅用一对引物，应选择图甲中的引物_________________。已知J基因转录的模板链位于b链，由此可知引物F1与图甲中J基因的______(填“a链”或“b链”)相应部分的序列相同。 F2和R1(或F1和R2)　 a链　 题型剖析 (3)重组质粒在受体细胞内正确表达后，用抗J蛋白抗体和抗V5抗体分别检测相应蛋白是否表达以及表达水平，结果如图乙所示。其中，出现条带1证明细胞内表达了________________，条带2所检出的蛋白_______(填“是”或“不是”)由重组质粒上的J基因表达的。 J－V5融合蛋白　 不是 题型剖析 小本-T2．用限制酶EcoR Ⅴ单独切割某普通质粒，可产生14 kb(1 kb即1 000个碱基对)的长链，而同时用限制酶EcoR Ⅴ和Mbo Ⅰ联合切割该质粒，可得到三种长度的DNA片段，见下图(其中*表示EcoR Ⅴ限制酶切割后的一个黏性末端)。若用Mbo Ⅰ限制酶单独切割该普通质粒，则产生的DNA片段的长度为(　　) A．2.5和5.5 B．2.5和6 C．5.5和8 D．6和8 D 题型剖析 13．(2024·山东潍坊一模)报告基因是指一类易于检测且实验材料本身不具备的基因。阿尔茨海默病(AD)是由淀粉样前体蛋白(APP)过量表达导致的神经系统退变性疾病，用增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因作为报告基因，将EGFP基因与APP基因融合，可方便、经济、快速地筛选出促进人APP基因 mRNA降解的药物。研究表明，EGFP基因与APP基因融合后，虽能全部转录但仅可合成EGFP。EGFP基因与APP基因融合过程如下图所示。回答下列问题： 题型剖析 (1)APP751、EGFP基因的cDNA是以其mRNA为模板经_______过程形成的。 (2)据图分析，Klenow酶的作用是___________________________________ ____________。切割pcDNA 3.1质粒获得APP751基因时，研究人员没有选择直接用HindⅢ、Xba Ⅰ同时切割，而是历经①→②→③的复杂过程，原因是___________________________________________________________ _________________________________________________________________________________________________。 (3)COS-7细胞来源于非洲绿猴肾成纤维细胞，培养这类细胞时，为保证细胞生长，应在合成培养基中添加__________。 将Xba Ⅰ切割获得的黏性末端催化产生平末端　 若直接用Hind Ⅲ、Xba Ⅰ同时切割，产物两端都是黏性末端，而经过①→②→③可使目的基因两端分别为平末端和黏性末端，能与被Sma Ⅰ和Hind Ⅲ酶切的载体连接 逆转录　 血清 题型剖析 DNA的粗提取与鉴定 考点3 考点梳理 考点3 DNA的粗提取与鉴定 1、实验原理 （1）提取 （2）鉴定 初步分离DNA和蛋白质 溶解DNA 鉴定DNA DNA不溶于酒精，某些蛋白质溶于酒精 DNA能溶于物质的量浓度为2mol/L的NaCl溶液 一定温度下，DNA遇二苯胺试剂呈现蓝色 DNA + 二苯胺 沸水浴 蓝色 考点3 DNA的粗提取与鉴定 2、实验材料及用具 （1）选材：DNA含量相对较高的生物组织，如新鲜洋葱、香蕉、菠菜、菜花、鸡血和猪肝等。 能否选用牛、羊、马、猪等哺乳动物的红细胞做实验材料？ 不能。因为哺乳动物成熟的红细胞没有细胞核和线粒体，几乎不含DNA。 考点3 DNA的粗提取与鉴定 （2）试剂： 研磨液 体积分数为95%的酒精 二苯胺 2mol/L 的NaCl溶液 蒸馏水 溶解DNA，破碎细胞膜 析出DNA 溶解DNA 鉴定DNA，要现配现用、水浴加热 研磨液成分 作用 SDS 使蛋白质变性 EDTA 抑制DNA水解酶 Tris-HCl缓冲液 稳定DNA 考点3 DNA的粗提取与鉴定 3、方法步骤 （1） 研磨 如果研磨不充分会对实验结果产生怎样的影响？ 研磨不充分，会使DNA分子不能从细胞核中释放出来，从而影响提取的DNA含量。 考点3 DNA的粗提取与鉴定 3、方法步骤 （2） 上清液 4℃ 过滤能否用滤纸代替纱布？ 不可以。因为DNA会被吸附到滤纸上而大量损失，影响最终提取的DNA含量。 考点3 DNA的粗提取与鉴定 3、方法步骤 （3） 95% 一 个方向 加入酒精和用玻璃棒搅拌时，动作要轻缓，以免加剧DNA分子的断裂，导致DNA分子不能形成丝状沉淀。 预冷的酒精的优点：可抑制核酸水解酶的活性，进而抑制DNA降解；抑制DNA分子运动，使DNA易形成沉淀析出；低温有利于增加DNA的柔韧性，减少其断裂。 若不是白色说明杂质较多，DNA纯度不高 3、方法步骤 （4） 2 mol/L 二苯胺 5 min 蓝色 考点3 DNA的粗提取与鉴定 蓝色的深浅可以粗略反映DNA含量的多少，蓝色越深DNA越多。 考点3 DNA的粗提取与鉴定 （4）DNA的鉴定： 试管编号 A（对照组） B（实验组） 步骤1 2mol/L的NaC1溶液5mL 步骤2 不进行任何处理 步骤3 步骤4 沸水浴加热5min 实验现象 实验结论 加丝状物或沉淀物 加4mL的二苯胺试剂 溶液逐渐变蓝 DNA在沸水浴的情况下遇二苯胺试剂会被染成蓝色 溶液不变蓝色 考点3 DNA的粗提取与鉴定 4、实验分析 实验结果不明显的可能原因： ①材料中的核物质没有充分释放出来，如研磨不充分或蒸馏水的量不够。 ②加入酒精后摇动或搅拌时过猛，DNA被破坏。 ③二苯胺最好现用现配，否则二苯胺变成浅蓝色，影响鉴定效果。 DNA片段的扩增及电泳鉴定 考点4 考点梳理 1、实验原理 （1）PCR原理： （2）电泳原理： 考点4 DNA片段的扩增及电泳鉴定 DNA分子具有可解离的基团，这些基团可以带上正电荷或负电荷。在电场的作用下，这些带电分子会向着与它所带电荷 的电极移动，这个过程就是电泳。 DNA的热变性、DNA半保留复制 相反 DNA一般带负电，向正极移动 考点4 DNA片段的扩增及电泳鉴定 1、实验原理 （3）PCR产物鉴定原理： PCR的产物一般通过琼脂糖凝胶电泳来鉴定。在凝胶中DNA分子的迁移速率与凝胶的浓度、DNA分子的 等有关。凝胶中的DNA分子通过染色，可以在波长300 nm的紫外灯下被检测出来。 大小和构象 凝胶的浓度越大，迁移速率越慢 DNA分子越大，迁移速率越慢 DNA分子构像有环状、链状等 2、材料用具 （1）仪器 考点4 DNA片段的扩增及电泳鉴定 PCR仪 微量离心管 电泳装置 微量移液器 自动控温，实现DNA的扩增 是进行PCR反应的实际场所 用于向微量离心管转移PCR配方中的液体 包括电泳仪、电泳槽等 2、材料用具 （2）材料 考点4 DNA片段的扩增及电泳鉴定 ①4种脱氧核苷酸等量混合液、2种引物、TaqDNA聚合酶、模板DNA、扩增缓冲液、无菌水。 ③PCR反应体系的配方(见教材) ②电泳缓冲液-加到电泳槽中（TAE或TBE）、凝胶载样缓冲液-加到点样样品中（内含指示剂—溴酚蓝）、琼脂糖和核酸染料-加到琼脂糖凝胶中（常用核酸染料为EB即溴化乙锭）等。 3、实验操作步骤 （1）PCR实验操作步骤 考点4 DNA片段的扩增及电泳鉴定 微量移液器 底部 离心管 3、实验操作步骤 （1）PCR实验操作步骤 考点4 DNA片段的扩增及电泳鉴定 循环程序 变性 复性 延伸 预变性 94℃,5min 30次 94℃,30s 55℃,30s 72℃,1min 最后一次 94℃,1min 55℃,30s 72℃,1min / / 可根据目的片段长度适当调整延伸时间 预变性：使DNA充分变性，以利于引物更好地和模板结合。 126 3、实验操作步骤 （2）DNA片段的电泳鉴定 考点4 DNA片段的扩增及电泳鉴定 配制琼脂糖溶液 根据待分离DNA片段的大小，用电泳缓冲液配制琼脂糖溶液，一般配制质量体积比0.8%～1.2%的琼脂糖溶液。在沸水浴或微波炉内加热至琼脂糖熔化。稍冷却后，加入适量的核酸染料混匀 制备凝胶 将温热的琼脂糖溶液迅速倒入模具，并插入合适大小的梳子，以形成加样孔。待凝胶溶液完全凝固，小心拔出梳子，取出凝胶放入电泳槽内。将电泳缓冲液加入电泳槽中，电泳缓冲液没过凝胶1mm为宜 （2）DNA片段的电泳鉴定 考点4 DNA片段的扩增及电泳鉴定 加样 将扩增得到的PCR产物与凝胶载样缓冲液（内含指示剂）混合，再用微量移液器将混合液缓慢注入凝胶的加样孔内。留一个加样孔加入指示分子大小的标准参照物 电泳 接通电源，根据电泳槽阳极至阴极之间的距离来设定电压，一般为1～5V/cm。待指示剂前沿迁移接近凝胶边缘时，停止电泳 观察记录 取出凝胶置于紫外灯下观察和照相 4、结果分析 考点4 DNA片段的扩增及电泳鉴定 （1）未出现扩增条带可能原因有： ①TaqDNA聚合酶失活； ②引物出现质量问题； ③变性时温度低，变性时间短； ④Mg2+浓度过低。 （2）出现非特异性条带可能原因有： ①引物特异性不强、引物过短或容易聚合成二聚体； ②复性时的温度过低； ③DNA聚合酶的浓度过高； ④模板DNA出现污染； ⑤Mg2+浓度过高。 注意： 考点4 DNA片段的扩增及电泳鉴定 ①为避免外源DNA等因素的污染，PCR实验中使用的微量离心管、枪头和蒸馏水等在使用前必须进行高压灭菌处理。 ②该实验所需材料可以直接从公司购买，缓冲液和酶应分装成小份,并在-20℃储存。使用前，将所需试剂从冰箱拿出，放在冰块上缓慢融化。 ③在向微量离心管中添加反应组分时，每吸取一种试剂后，移液器上的枪头都必须更换。 ④在进行操作时，一定要戴好一次性手套。 ⑤PCR扩增不能随意加大试剂用量。 1.荧光定量PCR技术可定量检测样本中DNA含量，其原理是：在PCR反应体系中加入引物的同时，加入与某条模板链互补的荧光探针，当TaqDNA聚合酶催化子链延伸至探针处会水解探针，使荧光监测系统接收到荧光信号，即每扩增一次，就有一个荧光分子生成(如图)。Ct值(循环阈值)的含义为：每个反应管内的荧光信号到达设定阈值时所经历的循环数。下列说法不正确的是( ) A.检测新冠病毒时，需加入逆转录酶 将新冠病毒RNA转化为cDNA B.PCR每个循环包括变性、复性(引物 和模板结合)、延伸3个阶段 C.Ct值越大表示被检测样本中病毒数 目越多，患者危险性更高 D.若样本被污染，RNA酶将病毒RNA降解，检测结果可能为阴性 C 题型剖析 2.大引物PCR定点突变常用来研究蛋白质结构改变导致的功能变化。单核苷酸的定点诱变仅需进行两轮PCR反应即可获得，第一轮加诱变引物和侧翼引物，第一轮产物作第二轮PCR扩增的大引物，过程如图所示。下列有关叙述错误的是( ) A.PCR扩增的定点诱变产物通常需要连接到载体分 子上才能表达出相应的性状，需具备启动子、终 止子等结构才能进行转录和翻译 B.单核苷酸的定点诱变所属变异类型为基因突变 C.第二轮PCR所用的引物都是第一轮PCR产物DNA的两条链 D.利用该技术将某功能蛋白的结构改变属于蛋白质工程 C 题型剖析 加 油！ 学 习 $$