第1章 第2节 第2课时 微生物分离、纯化和培养的无菌技术-（课件PPT+Word教案）【步步高】2024-2025学年高二生物学选择性必修第三册教师用书（苏教版2019）

第2课时 微生物分离、纯化和培养的无菌技术 第一章 发酵工程 <<< 学习目标 1.概述平板划线法分离和纯化微生物的过程。 2.概述稀释涂布平板法分离和纯化微生物的过程。 3.进行土壤中分解尿素的细菌的分离和计数。 内容索引 一、平板划线法分离和纯化微生物 二、稀释涂布平板法分离和纯化微生物 课时对点练 平板划线法分离和纯化微生物 一 4 梳理　教材新知 1.平板划线法 (1)概念：是指把含有多种微生物的 样品，通过在特定的琼脂平板表面 ，从而获得 的方法。 杂菌 划线稀释 单个菌落 (2)操作步骤 皿 底 第1 第2 过火灭菌 点到线 由 倒置 菌落 2.通过平板划线法获得纯化的酵母菌菌落 (1)实验目的 尝试通过平板划线法获得纯化的酵母菌菌落。 (2)实验原理 ① 培养基能满足酵母菌生长、繁殖的营养需要。 ②采用 及 能够获得纯化的酵母菌菌落。 (3)实验器材和试剂 酵母菌样本(菌种)，接种环、酒精灯、恒温培养箱、高压蒸汽灭菌锅，马铃薯葡萄糖琼脂培养基。 马铃薯葡萄糖琼脂 无菌操作技术 平板划线法 (4)实验步骤 高压蒸汽灭菌锅 50 ℃ 灭菌 倒置 恒温箱 (5)结果与分析 ①酵母菌被纯化的标准：培养24 h后，在划线的 出现 的单个菌落。 ②纯化失败的原因 a.接种环灭菌后未 直接在斜面上挑取菌体，菌体可能因为接触高温接种环而 。 b.第一次划线前挑取的菌体 ，则也有可能无法获得由一个酵母菌形成的单个菌落。 末端 不连续 冷却 死亡 过多 (1)若皿盖和皿底之间溅上培养基，这个培养基不可再用(　　) (2)倒平板操作后再进行高压蒸汽灭菌(　　) √ 提示　培养基应先高压蒸汽灭菌后再倒平板。 (3)平板划线法接种时，每一次划线前都要挑取菌体(　　) × √ 提示　平板划线法接种时，只在第一次划线前挑取菌体，其余划线前从上次划线的末端开始划线。 (4)培养微生物的温度因菌种不同而稍有差异(　　) × 判断正误 11 任务一：平板划线法与微生物纯化过程的分析 1.平板冷凝后，为什么要将平板倒置？ 探究　核心知识 提示　防止水分过快挥发，防止皿盖上的水珠落入培养基。 2.下列接种过程正确的顺序是 。 b、a、e、f、c、g、d 3.第一次以及每次划线之前、划线操作结束都要灼烧接种环，请完善下方的表格，分析灼烧接种环的目的。 灼烧时期 目的 取菌种前 杀死接种环上_____________ 每次划线前 杀死上次划线时残留的菌种，使下一次划线的菌种直接来源于_______________，从而使_______________________ _____，直至得到__________ 束后 杀死接种环上残留的菌种，避免污染环境和感染操作者 原有的微生物 上次划线的末端 每次划线时菌种数目逐渐 减少 单个菌落 4.若接种结要按照如图d进行划线，那么在接种划线的操作过程中，共灼烧了几次接种环？ 提示　图d中共划了5个区域，在每次划线前后均需要对接种环灼烧灭菌，因此共需要灼烧接种环6次。 5.为什么最后一次的划线与第一次的划线不能相连？ 提示　最后一次的划线已经将微生物稀释成单个的细胞，如果与第一次的划线相连则增加了微生物的数目，达不到纯化的效果。 6.设置未接种平板组的意义是什么？ 提示　通过观察未接种平板是否有菌落存在以确定培养基是否被污染或灭菌是否彻底。 核心归纳 1.培养基灭菌及倒平板的注意事项 (1)如果需要调节培养基的pH，应该在定容完成之后、灭菌之前进行操作。 (2)培养基灭菌后要冷却到50 ℃左右时开始倒平板，原因是琼脂是一种多糖，在98 ℃以上熔化，在44 ℃以下凝固，倒平板时温度过高会烫手，太低时琼脂会凝固。 (3)倒平板时，要使锥形瓶的瓶口迅速通过火焰进行灼烧灭菌，防止瓶口的微生物污染培养基。 核心归纳 2.实验结果的分析 (1)在接种酵母菌的培养基上可观察到独立的菌落，这些菌落在颜色、形状和大小上相似，酵母菌菌落一般表面光滑，多呈乳白色。 (2)若在培养基中观察到不同形态的菌落，原因可能是菌液不纯，混入了其他杂菌，或在实验操作过程中被杂菌污染。 1.(2024·南京高二期中)如图为实验室培养和纯化大肠杆菌过程中的部分操作步骤，下列说法正确的是 A.制备①步骤使用的培养基的过程是先灭菌再调pH B.②③④步骤操作时不需要在酒精灯火焰附近进行 C.操作②到④的过程中，接种环共灼烧处理了5次 D.接种结束后，将④倒置培养，皿底上标注菌种及接种日期等信息 √ 落实　思维方法 ①步骤表示倒平板，该过程使用的培养基的配制需要先调节pH后灭菌，A错误； 接种环在每次接种前和接种结束后都要通过灼烧来灭菌，步骤④中5次划线操作前都要灼烧灭菌，接种结束后还需灼烧灭菌1次，防止造成污染，由此可见，操作②到④的过程中共需灼烧接种环6次，C错误。 2.(多选)(2020·江苏，19改编)为纯化菌种，在鉴别培养基上划线接种纤维素降解细菌，培养结果如图所示。下列叙述正确的是 A.倒平板后需间歇晃动，以保证表面平整 B.图中Ⅰ、Ⅱ区的细菌数量均太多，应从Ⅲ区挑取 单菌落 C.该实验因单菌落太多，不能达到菌种纯化的目的 D.应对微生物培养物进行灭菌处理后再进行回收 √ √ 倒平板后不需要间歇晃动，A错误； 图中Ⅰ、Ⅱ区的细菌数量太多，Ⅲ区中存在单菌 落，该实验结果能达到菌种纯化的目的，C错误； 应对微生物培养物进行灭菌处理后再进行回收， 以免造成污染，D正确。 稀释涂布平板法分离和纯化微生物 二 22 1.稀释涂布平板法 (1)过程和用途 ①过程：将待分离的材料做一系列的 ，再取一定量的某一稀释度的菌液 ，然后用无菌的 将菌液均匀地涂布在整个平板表面，使其中的微生物 分散，培养后在平板培养基表面形成多个单菌落。 ②用途：既可用于菌种的 ，还可以用于 。 梳理　教材新知 梯度稀释 涂布平板 涂布器 充分 分离和纯化 微生物计数 (2)混合平板法：将稀释的少量菌悬液与 左右的培养基混合均匀后倒入无菌培养皿中，再将培养皿置于合适温度下培养，这样在培养基表面和内部均可长出 。 (3)计数原理：如果经稀释涂布平板法培养出的都是 增殖形成的菌落，那么统计这些 数目，即可计算出单位体积样品中的微生物数量。 50 ℃ 单个菌落 单个细胞 菌落 2.分离土壤中分解尿素的细菌并进行计数 (1)实验目的 ①学会配制选择培养基，以分离出能分解尿素的细菌。 ②学会采用 分离和培养分解尿素的细菌，并进行计数。 (2)实验原理 ①由于不同微生物对 等的要求不同，利用 培养基可以筛选和分离某种微生物。 稀释涂布平板法 营养成分、氧、pH 选择 ②在 的条件下，于固体培养基上培养该微生物，形成 菌落。单个菌落即为 ，通过对菌落数量的统计，可以计算出样品中的含菌数。 (3)实验器材和试剂 ①土壤样品。 ②灭菌处理过的各种工具。 ③配制以 为氮源的1 000 mL选择培养基的试剂以及调节pH的相关试剂。 高度稀释 单个 纯化培养物 尿素 (4)实验步骤 3~5 无菌水 氮源 无菌水 污染 最低 3 倒置 24 30~300 稀释 体积 ③使用步骤 水位标记线 1/3 排气阀 冷空气 103 121 15~20 “0” 温度 (5)结果与分析：菌落数目在30～300的一组平板上一般可以获得单个分解尿素的细菌菌落。 (1)稀释涂布平板法能分离微生物，也能计数，而平板划线法只能分离微生物，不能计数(　　) (2)采用稀释涂布平板法培养和计算得到的微生物的数量一般比稀释液中实际微生物的数量要少(　　) (3)稀释涂布平板法中所用的涂布器、移液管、锥形瓶等器材都需要进行湿热灭菌，而培养基则需要干热灭菌(　　) √ √ 提示　稀释涂布平板法中所用的涂布器、移液管、锥形瓶等器材都需要进行干热灭菌，而培养基则需要湿热灭菌。 × 判断正误 30 (4)所有稀释倍数的稀释菌液涂布成的培养基都能观察到和分离出单菌落(　　) 提示　稀释倍数较低的稀释菌液涂布成的培养基上菌落相互连接，难以观察到和分离出单菌落。 × 判断正误 31 任务二：稀释涂布平板法与微生物筛选计数的分析 1.微生物的选择培养和计数 图A和图B为接种培养结果，判断哪个为稀释涂布平板法接种培养？为什么稀释涂布平板法可以用于细菌计数而平板划线法不能进行计数？ 探究　核心知识 提示　图B为稀释涂布平板法接种培养。稀释涂布平板法会进行等比稀释，在合适的稀释倍数下，均匀涂布得到的菌落互不接触，可以确定菌类的密度，再通过计算可以得知原液的菌落数；而平板划线法最开始的划线很可能菌类会长成一片，导致无法计数，此外灼烧接种环时也会杀死一部分菌类。 2.在做分解尿素的细菌的筛选与统计菌落数目的实验时，A同学从对应的106倍稀释的培养基中筛选出大约150个菌落，但是其他同学在同样的稀释度下只选择出大约50个菌落。其他同学认为A同学的培养基被污染了或混入了其他的含氮物质，而A同学认为自己所选土样不同。你能否通过设置对照，帮助A同学排除上述两个可以影响实验结果的因素？ 提示　方案一：其他同学用与A同学相同的土样进行实验。若结果与A同学一致，则证明A同学无误；若结果不同，则证明A同学存在操作失误或培养基的配制不当等问题。 方案二：将A同学配制的培养基在不加土样的情况下进行培养，作为空白对照，以证明培养基是否受到污染或灭菌不彻底。 3.据如图所示信息，计算4号试管每克土样中分解尿素细菌的数目，思考为什么统计的活菌数目往往比实际数目低？ 提示　1.1×108个。当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落。 纯化方法的比较 核心归纳 方法 平板划线法 稀释涂布平板法 混合平板法 主要步骤 接种环在固体培养基表面连续划线 系列梯度稀释操作和涂布平板操作 取稀释的少量菌悬液与50 ℃左右的培养基混合均匀倒入无菌培养皿中 接种工具 接种环 涂布器 － 能否用于计数 不能计数 可以计数，但是操作复杂，需涂布多个平板 － 核心归纳 方法 平板划线法 稀释涂布平板法 混合平板法 培养 结果     菌落仅在平板表面 菌落出现在平板表面和内部 共同点 都能将微生物分散到固体培养基表面，以获得单细胞菌落，达到分离纯化微生物的目的，也可用于观察菌落特征 3.(多选)稀释涂布平板法是微生物培养中的一种常用的接种方法。下列相关叙述错误的是 A.操作中需要将菌液进行一系列的梯度稀释 B.需将不同稀释度的菌液分别涂布到液体培养基表面 C.不同浓度的菌液均可在培养基表面形成单个的菌落 D.操作过程中对培养基和涂布器等均需进行严格灭菌处理 √ 落实　思维方法 √ 操作中需要将菌液进行一系列的梯度稀释，然后将不同稀释度的菌液分别涂布到固体培养基表面，进行培养；在稀释度足够高的菌液里，聚集在一起的微生物将被分散成单个细胞，从而能在培养基表面形成单个的菌落；操作过程中培养基和涂布器等均需进行严格灭菌处理。 4.将微生物接种到平板培养基上的方法主要有平板划线法和稀释涂布平板法等。下列相关叙述正确的是 A.平板划线法只能用于微生物的分离纯化，稀释涂布平板法只能用于微 　生物的计数 B.平板划线法使用无菌接种针接种，稀释涂布平板法使用无菌涂布器涂布 C.采用两种方法接种后，通常需要在皿盖上注明相关信息 D.采用两种方法接种后，都需要将平板倒置放入恒温培养箱中培养 √ 平板划线法和稀释涂布平板法均可用于微生物的分离纯化，但只有稀释涂布平板法能用于微生物的计数，A错误； 平板划线法使用无菌接种环接种，稀释涂布平板法使用无菌涂布器涂布，B错误； 采用两种方法接种后，通常需要在皿底上注明相关信息，C错误。 网络构建 课时对点练 三 43 题组一　平板划线法分离和纯化微生物 1.下列有关用平板划线法接种的操作，错误的是 A.将接种环放在火焰上灼烧 B.用已冷却的接种环挑取菌体 C.挑取菌体和划线都要在火焰旁进行 D.接种环划线要将最后一区的划线与第一区的划线相连 √ 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 划线时，不能将最后一区的划线与第一区的划线相连，D错误。 对点训练 2.下列有关倒平板的操作，错误的是 A.将灭过菌的培养皿放在火焰旁的桌面上 B.使打开的锥形瓶瓶口迅速通过火焰 C.将培养皿打开，培养皿盖倒放在桌面上 D.待培养基冷却到50 ℃左右时进行倒平板操作 √ 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 倒平板时，培养皿的盖不能完全打开。 对点训练 3.在酵母菌的纯化实验中，划线接种(图甲)、培养结果(图乙)如图，且图甲、乙的对应位置不变。下列有关叙述错误的是 A.配制培养基时需进行湿热灭菌 B.连续划线的目的是获得单个酵母菌形成的菌落 C.图示接种过程中接种环至少灼烧了5次 D.图甲中a区域为划线的起始位置 √ 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 对点训练 由于每次使用接种环前后都要灼烧灭菌，从图甲中4次划线接种就可推断出，接种过程中接种环至少灼烧了5次，C正确； 起始划线的区域长出的菌落多且密，根据甲、乙对应区域的对应位置对比，图甲中a区域为划线的结束位置，D错误。 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 对点训练 题组二　稀释涂布平板法分离和纯化微生物 4.如图是从土壤中筛选具有较强降解磷能力菌株过程中的一些操作。下列相关叙述错误的是 A.倒平板后的培养皿需进行灭菌 B.培养时培养皿的放置应如图乙中a 所示 C.在火焰旁操作，可以防止杂菌污染 D.进行菌落计数时，一般选择菌落数在30～300的平板 √ 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 对点训练 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 培养基灭菌后再倒平板，倒平板后的培养皿不再进行灭菌，A错误； 等待平板冷却凝固后，应将平板倒过来放置，如图乙中a所示，B正确。 对点训练 5.用平板划线法或稀释涂布平板法都可以纯化大肠杆菌，二者的共同点有 A.都需要使用接种环进行接种 B.接种后都需要进行湿热灭菌 C.都需要在酒精灯火焰旁进行接种 D.都可以用来计数活菌数 √ 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 对点训练 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 平板划线法采用接种环进行操作，而稀释涂布平板法采用涂布器进行操作，A错误； 接种后不能再灭菌，B错误； 接种时，要进行无菌操作，需要在酒精灯火焰旁接种，避免空气中的微生物混入培养基，C正确； 稀释涂布平板法可以用来进行微生物的计数，而平板划线法不能，D错误。 对点训练 6.研究小组利用稀释涂布平板法来探究某河流中大肠杆菌的数量。每一个浓度涂布四个平板，并且设置空白对照组。下列关于操作步骤的叙述，正确的是 A.涂布前，将沾有少量酒精的涂布器在火焰上引燃，燃尽后还要冷却 B.涂布完成后，将培养皿倒置于室温培养1～2 d C.计算平板上的菌落数时，四个培养皿上的菌落数无论多少，都要全部平均 D.若空白对照组上有5个菌落，则实验组数据基础上减去5，以获得最准 确数据 √ 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 对点训练 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 涂布完成后，将培养皿倒置于37 ℃恒温箱中培养1～2 d，B错误； 计算平板上的菌落数时，应选择菌落数在30～300的平板进行计数，并取其平均值，C错误； 若空白对照组上有5个菌落，说明培养基灭菌不彻底，需要重新进行实验，D错误。 对点训练 题组三　土壤中分解尿素的细菌的分离与计数 7.下列与土壤中尿素分解菌的分离与计数实验相关的叙述，正确的是 A.可以通过设置空白对照组来检验培养基是否受到了杂菌的污染 B.对样品中的尿素分解菌进行计数时可采用平板划线法进行接种 C.统计尿素分解菌的数目时应该选择菌落数多的培养基进行计数 D.空白对照组的培养基制备时不需要倒置 √ 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 对点训练 该实验可设置空白对照组，以检验培养基是否受到杂菌污染，同时也能确定培养基是否符合要求；对样品中的尿素分解菌进行计数时可采用稀释涂布平板法进行接种；统计尿素分解菌的数目时，选取菌落数为30～300的平板进行计数，求其平均值。 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 对点训练 8.(2024·盐城高二期中)如图为能分解尿素的微生物的获取过程，下列有关叙述错误的是 A.①②③的目的是选择能够分解尿素 的微生物并且增加该微生物的数量 B.过程④需在酒精灯火焰旁进行，其中接种环一共需要灼烧6次 C.通过选择培养得到的不一定都是能够分解尿素的微生物，所以还需做 进一步的鉴定 D.通过④获得纯种微生物后，再利用涂布平板法接种至试管斜面培养基 上进行保存 √ 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 对点训练 过程④需在酒精灯火焰旁进行，以 免造成污染，接种前后接种环均要 进行灼烧灭菌，共接种5次，需要灼 烧6次，B正确； 通过选择培养得到的不一定都是能够分解尿素的微生物，比如有些微生物能利用尿素分解菌的代谢产物进行生长繁殖，所以还需根据菌落特征等做进一步的鉴定，C正确； 斜面接种是常用的菌种传代和低温下保存菌种的方法，D错误。 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 对点训练 9.(2022·江苏，3)下列是某同学分离高产脲酶菌的实验设计，不合理的是 A.选择农田或公园土壤作为样品分离目的菌株 B.在选择培养基中需添加尿素作为唯一氮源 C.适当稀释样品是为了在平板上形成单菌落 D.可分解酚红指示剂使其褪色的菌株是产脲酶菌 √ 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 对点训练 农田或公园土壤中含有较多的产脲酶的微生物，A不符合题意； 为了筛选可分解尿素的细菌，配制的培养基应选择尿素作为唯一氮源，能合成脲酶的微生物在该培养基上能生长，B不符合题意； 当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌，C不符合题意； 在细菌分解尿素的化学反应中，细菌合成的脲酶将尿素分解成氨，氨会使培养基的pH升高，酚红指示剂将变红，因此在以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂，能对分离的菌种做进一步鉴定，D符合题意。 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 对点训练 10.(2024·镇江高二检测)幽门螺杆菌具有活性很高的脲酶，调查幽门螺杆菌感染可采用尿素呼气试验，用幽门螺杆菌的数量表示感染情况。现从待测人员体内采集样本并制成菌液后，按如下步骤进行分离培养，下列叙述正确的是 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 A.灭菌之前应先将培养基的pH调节至中性或弱酸性 B.图中X步骤可以使用平板划线法或稀释涂布平板法 C.目的菌接种到培养基后应立即将倒置的平板放入30～37 ℃恒温箱中 D.培养基中加入的酚红指示剂使平板上有的菌落周围出现红色透明圈 √ 综合强化 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 幽门螺杆菌生活在人体胃液中，胃液为酸性环境(pH为1.5左右)，因此灭菌之前应先将培养基的pH调节至酸性，A错误； 根据题意可知，用幽门螺杆菌的数量表示感染情况，因此图示接种方法应能统计幽门螺杆菌的数量，图中X步骤为接种，需用稀释涂布平板法才能计数，B错误； 目的菌接种到培养基后，待涂布的菌液被培养基吸收后，才能将平板倒置，C错误； 综合强化 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 幽门螺杆菌含有脲酶，脲酶将尿素分解成氨，氨会使培养基的pH升高，因此如果在培养基中加入酚红指示剂，若有幽门螺杆菌，则菌落周围会出现红色透明圈，D正确。 综合强化 11.(多选)(2021·江苏，18)为提高一株石油降解菌的净化能力，将菌涂布于石油为唯一碳源的固体培养基上，以致死率为90%的辐照剂量诱变处理。下列叙述不合理的是 A.将培养基分装于培养皿中后灭菌，可降低培养基污染的概率 B.涂布用的菌浓度应控制在30～300个/mL C.需通过预实验考察辐射时间对存活率的影响，以确定最佳诱变时间 D.挑取培养基上长出的较大单菌落，纯化后进行降解效率分析 √ 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 √ 综合强化 培养基应先灭菌再分装于培养皿中，A不合理； 涂布时所用菌液一般为0.1 mL，平板上的菌落数目应介于30～300个，涂布用的菌浓度应控制在300～3 000个/mL，B不合理； 需通过预实验考察辐射时间对存活率的影响，再进行正式实验，以确定最佳诱变时间，C合理； 石油降解菌能分解石油获得碳源，形成菌落，挑取培养基上长出的较大单菌落，纯化后进行降解效率分析，以获得能高效降解石油的菌种，D合理。 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 综合强化 12.(多选)酵母菌的纯化培养过程中，完成稀释涂布平板后，将接种后的平板和一个未接种的平板倒置，放入28 ℃左右的恒温箱中培养。下列相关叙述正确的是 A.用未接种的平板共同培养，其目的是检验培养过程中是否有杂菌污染 B.完成稀释涂布平板接种后，需将平板倒置后放入恒温箱中 C.倒置培养有利于减少水分蒸发，避免杂菌污染，方便观察计数 D.上述培养结束后若出现了不同形态、大小的菌落，可能的原因是接种 环未灼烧 √ 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 √ √ 综合强化 用未接种的平板共同培养，可以检验培养过程中是否有杂菌污染，若有污染，则平板上会有微生物生长，A正确； 将培养皿倒置培养有利于减少水分蒸发，防止冷凝水滴落冲散单菌落，避免杂菌污染，方便观察计数，C正确； 稀释涂布平板法中用不到接种环，D错误。 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 综合强化 13.酵母的蛋白质含量可达自身干重的一半，可作为饲料蛋白的来源。有些酵母可以利用工业废甲醇作为碳源进行培养，这样既可减少污染又可降低生产成本。研究人员拟从土壤样品中分离该类酵母，并进行大量培养。如图所示为操作流程，请回答下列问题： 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 综合强化 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 (1)配制培养基时，按照培养基配方准确称量各组分，将其溶解、定容后，调节培养基的_____，及时对培养基进行分装，并进行________________灭菌。 pH 湿热(高压蒸汽) 配制培养基时，按照培养基配方准确称取各组分之后，溶解定容，再调节培养基的pH，一般情况下，采用湿热灭菌法对培养基进行灭菌。 综合强化 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 (2)取步骤②中不同梯度的稀释液加入标记好的无菌培养皿中，在步骤③中将温度约_______(填“25 ℃”“50 ℃”或“80 ℃”)的培养基倒入培养皿混匀，冷凝后倒置培养。 50 ℃ 综合强化 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 (3)挑取分离平板中长出的单菌落，按步骤④所示进行划线。下列叙述合理的有_________(多选)。 a.为保证无菌操作，接种针、接种环使用前都必须灭菌 b.划线时应避免划破培养基表面，以免不能形成正常菌落 c.挑取菌落时，应挑取多个菌落，分别测定酵母细胞中甲醇的含量 d.可以通过逐步提高培养基中甲醇的浓度，获得甲醇高耐受株 a、b、d 综合强化 在对酵母菌进行划线纯化时，为保证无菌操作，接种针、接种环使用前都必须灭菌；且在划线时应避免划破培养基表面，以免不能形成正常菌落；本实验是为了获得能以工业废甲醇作为碳源的酵母，故在实验过程中可以通过逐步提高培养基中甲醇的浓度，获得甲醇高耐受株。 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 综合强化 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 (4)步骤⑤中，为使酵母数量迅速增加，培养过程中需保证充足的营养和_______供应。为监测酵母的活细胞密度，将发酵液稀释1 000倍后，经等体积台盼蓝染液染色，用25×16型血球计数板计数5个中格中的细胞数，理论上_____色细胞的个数应不少于_____个，才能达到每毫升3×109个活细胞的预期密度。 氧气 无 30 综合强化 酵母菌是兼性厌氧型真菌，在有氧条件下大量繁殖。酵母菌扩大培养时，需保证充足的营养和氧气供应。“用等体积台盼蓝染液染色”，即计数室中培养液体积实际只有0.1÷2＝0.05 mm3，设5个中方格中无色(活细胞不被台盼蓝染色)细胞数目为x个，则3×109＝x/5×25×1 000 ×1 000÷0.05，解得x＝30。 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 综合强化 14.(2024·南通高二调研)饲养动物常用的植物饲料中含有难溶的植酸钙等物质，很难被动物吸收利用，还影响对其他营养物质的利用。若在饲料中添加植酸酶，则能催化植酸钙水解成为动物可以吸收利用的磷酸盐等。以下是科研人员从作物根部土壤中分离、计数产植酸酶菌株的过程示意图。请回答下列问题： 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 综合强化 (1)图示培养基中除了添加______________以外，应含有碳源、氮源、水、其他无机盐等基本营养物质。 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 植酸钙、琼脂 科研人员要从作物根部土壤中分离产植酸酶的菌株，所以培养基要添加植酸钙，按照图示，选用培养基应为固体培养基，应该加入琼脂。 综合强化 (2)图1所示操作称为________，该操作之前，培养基应该先______。 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 倒平板 图1所示操作称为倒平板，该操作之前，培养基应该先进行灭菌。 灭菌 综合强化 (3)图2所示接种方法是________________，在操作过程中要利用的接种器具是________。接种后，待菌液被培养基吸收后，再将培养皿_____，并在______(填“皿底”或“皿盖”)做好标记。 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 稀释涂布平板法 涂布器 倒置 皿底 综合强化 图2所示接种方法是稀释涂布平板法，在操作过程中要利用的接种器具是涂布器。接种后，待菌液被培养基吸收后，再将培养皿倒置，并在皿底做好标记。 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 综合强化 (4)在3个平板上分别接入0.1 mL稀释液，经适当培养后，3个平板上菌落数分别是38、42、40，则1 g土壤中的活菌数约为_________个。统计菌落获得的菌落数比实际活菌数_____(填“多”或“少”)，原因是_________________________________________________________。 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 4×108 少 当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落 综合强化 将1 g土壤加入999 mL的无菌水中，再经过3次10倍的稀释，最后取0.1 mL进行涂布，则培养基上的活菌数已经进行106倍稀释，3个平板上菌落数分别是38、42、40，平均值为40，则1 g土壤中的活菌数约为40/0.1×106＝4×108(个)。该方法统计获得的菌落数比实际的活菌数低，因为当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落。 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 综合强化 (5)图3是科研人员利用不同于图2方法分离产植酸酶菌株的示意图。下列对其操作及结果的叙述错误的是______(多选)。 A.每次划线前均需在酒精灯火焰旁 蘸取菌液 B.划线时带有菌种的接种环不能插 入培养基中 C.只有在5区域中才能得到所需菌落 D.整个过程需要对接种环进行6次灼烧 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 AC 综合强化 除第一次划线前需在酒精灯火焰旁蘸取菌液外，第二次划线从第一次划线的末端开始(即第二次之后的划线都从上次划线的末端开始)，A错误； 在5个区域中，只要有单个活细菌，通过培养即可获得所需菌落，C错误。 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 综合强化 第一章 发酵工程 <<< ―→―→―→―→ $$ 第2课时　微生物分离、纯化和培养的无菌技术 [学习目标]　1.概述平板划线法分离和纯化微生物的过程。2.概述稀释涂布平板法分离和纯化微生物的过程。3.进行土壤中分解尿素的细菌的分离和计数。 一、平板划线法分离和纯化微生物 1．平板划线法 (1)概念：是指把含有多种微生物的杂菌样品，通过在特定的琼脂平板表面划线稀释，从而获得单个菌落的方法。 (2)操作步骤 2．通过平板划线法获得纯化的酵母菌菌落 (1)实验目的 尝试通过平板划线法获得纯化的酵母菌菌落。 (2)实验原理 ①马铃薯葡萄糖琼脂培养基能满足酵母菌生长、繁殖的营养需要。 ②采用无菌操作技术及平板划线法能够获得纯化的酵母菌菌落。 (3)实验器材和试剂 酵母菌样本(菌种)，接种环、酒精灯、恒温培养箱、高压蒸汽灭菌锅，马铃薯葡萄糖琼脂培养基。 (4)实验步骤 (5)结果与分析 ①酵母菌被纯化的标准：培养24 h后，在划线的末端出现不连续的单个菌落。 ②纯化失败的原因 a．接种环灭菌后未冷却直接在斜面上挑取菌体，菌体可能因为接触高温接种环而死亡。 b．第一次划线前挑取的菌体过多，则也有可能无法获得由一个酵母菌形成的单个菌落。 判断正误 (1)若皿盖和皿底之间溅上培养基，这个培养基不可再用(　　) (2)倒平板操作后再进行高压蒸汽灭菌(　　) (3)平板划线法接种时，每一次划线前都要挑取菌体(　　) (4)培养微生物的温度因菌种不同而稍有差异(　　) 答案　(1)√　(2)×　(3)×　(4)√ 提示　(2)培养基应先高压蒸汽灭菌后再倒平板。(3)平板划线法接种时，只在第一次划线前挑取菌体，其余划线前从上次划线的末端开始划线。 任务一：平板划线法与微生物纯化过程的分析 1．平板冷凝后，为什么要将平板倒置？ 提示　防止水分过快挥发，防止皿盖上的水珠落入培养基。 2．下列接种过程正确的顺序是b、a、e、f、c、g、d。 3．第一次以及每次划线之前、划线操作结束都要灼烧接种环，请完善下方的表格，分析灼烧接种环的目的。 灼烧时期 目的 取菌种前 杀死接种环上原有的微生物 每次划线前 杀死上次划线时残留的菌种，使下一次划线的菌种直接来源于上次划线的末端，从而使每次划线时菌种数目逐渐减少，直至得到单个菌落 束后 杀死接种环上残留的菌种，避免污染环境和感染操作者 4.若接种结要按照如图d进行划线，那么在接种划线的操作过程中，共灼烧了几次接种环？ 提示　图d中共划了5个区域，在每次划线前后均需要对接种环灼烧灭菌，因此共需要灼烧接种环6次。 5．为什么最后一次的划线与第一次的划线不能相连？ 提示　最后一次的划线已经将微生物稀释成单个的细胞，如果与第一次的划线相连则增加了微生物的数目，达不到纯化的效果。 6．设置未接种平板组的意义是什么？ 提示　通过观察未接种平板是否有菌落存在以确定培养基是否被污染或灭菌是否彻底。 1．培养基灭菌及倒平板的注意事项 (1)如果需要调节培养基的pH，应该在定容完成之后、灭菌之前进行操作。 (2)培养基灭菌后要冷却到50 ℃左右时开始倒平板，原因是琼脂是一种多糖，在98 ℃以上熔化，在44 ℃以下凝固，倒平板时温度过高会烫手，太低时琼脂会凝固。 (3)倒平板时，要使锥形瓶的瓶口迅速通过火焰进行灼烧灭菌，防止瓶口的微生物污染培养基。 2．实验结果的分析 (1)在接种酵母菌的培养基上可观察到独立的菌落，这些菌落在颜色、形状和大小上相似，酵母菌菌落一般表面光滑，多呈乳白色。 (2)若在培养基中观察到不同形态的菌落，原因可能是菌液不纯，混入了其他杂菌，或在实验操作过程中被杂菌污染。 1．(2024·南京高二期中)如图为实验室培养和纯化大肠杆菌过程中的部分操作步骤，下列说法正确的是(　　) A．制备①步骤使用的培养基的过程是先灭菌再调pH B．②③④步骤操作时不需要在酒精灯火焰附近进行 C．操作②到④的过程中，接种环共灼烧处理了5次 D．接种结束后，将④倒置培养，皿底上标注菌种及接种日期等信息 答案　D 解析　①步骤表示倒平板，该过程使用的培养基的配制需要先调节pH后灭菌，A错误；接种环在每次接种前和接种结束后都要通过灼烧来灭菌，步骤④中5次划线操作前都要灼烧灭菌，接种结束后还需灼烧灭菌1次，防止造成污染，由此可见，操作②到④的过程中共需灼烧接种环6次，C错误。 2．(多选)(2020·江苏，19改编)为纯化菌种，在鉴别培养基上划线接种纤维素降解细菌，培养结果如图所示。下列叙述正确的是(　　) A．倒平板后需间歇晃动，以保证表面平整 B．图中Ⅰ、Ⅱ区的细菌数量均太多，应从Ⅲ区挑取单菌落 C．该实验因单菌落太多，不能达到菌种纯化的目的 D．应对微生物培养物进行灭菌处理后再进行回收 答案　BD 解析　倒平板后不需要间歇晃动，A错误；图中Ⅰ、Ⅱ区的细菌数量太多，Ⅲ区中存在单菌落，该实验结果能达到菌种纯化的目的，C错误；应对微生物培养物进行灭菌处理后再进行回收，以免造成污染，D正确。 二、稀释涂布平板法分离和纯化微生物 1．稀释涂布平板法 (1)过程和用途 ①过程：将待分离的材料做一系列的梯度稀释，再取一定量的某一稀释度的菌液涂布平板，然后用无菌的涂布器将菌液均匀地涂布在整个平板表面，使其中的微生物充分分散，培养后在平板培养基表面形成多个单菌落。 ②用途：既可用于菌种的分离和纯化，还可以用于微生物计数。 (2)混合平板法：将稀释的少量菌悬液与50_℃左右的培养基混合均匀后倒入无菌培养皿中，再将培养皿置于合适温度下培养，这样在培养基表面和内部均可长出单个菌落。 (3)计数原理：如果经稀释涂布平板法培养出的都是单个细胞增殖形成的菌落，那么统计这些菌落数目，即可计算出单位体积样品中的微生物数量。 2．分离土壤中分解尿素的细菌并进行计数 (1)实验目的 ①学会配制选择培养基，以分离出能分解尿素的细菌。 ②学会采用稀释涂布平板法分离和培养分解尿素的细菌，并进行计数。 (2)实验原理 ①由于不同微生物对营养成分、氧、pH等的要求不同，利用选择培养基可以筛选和分离某种微生物。 ②在高度稀释的条件下，于固体培养基上培养该微生物，形成单个菌落。单个菌落即为纯化培养物，通过对菌落数量的统计，可以计算出样品中的含菌数。 (3)实验器材和试剂 ①土壤样品。 ②灭菌处理过的各种工具。 ③配制以尿素为氮源的1 000 mL选择培养基的试剂以及调节pH的相关试剂。 (4)实验步骤 (5)结果与分析：菌落数目在30～300的一组平板上一般可以获得单个分解尿素的细菌菌落。 判断正误 (1)稀释涂布平板法能分离微生物，也能计数，而平板划线法只能分离微生物，不能计数(　　) (2)采用稀释涂布平板法培养和计算得到的微生物的数量一般比稀释液中实际微生物的数量要少(　　) (3)稀释涂布平板法中所用的涂布器、移液管、锥形瓶等器材都需要进行湿热灭菌，而培养基则需要干热灭菌(　　) (4)所有稀释倍数的稀释菌液涂布成的培养基都能观察到和分离出单菌落(　　) 答案　(1)√　(2)√　(3)×　(4)× 提示　(3)稀释涂布平板法中所用的涂布器、移液管、锥形瓶等器材都需要进行干热灭菌，而培养基则需要湿热灭菌。(4)稀释倍数较低的稀释菌液涂布成的培养基上菌落相互连接，难以观察到和分离出单菌落。 任务二：稀释涂布平板法与微生物筛选计数的分析 1．微生物的选择培养和计数 图A和图B为接种培养结果，判断哪个为稀释涂布平板法接种培养？为什么稀释涂布平板法可以用于细菌计数而平板划线法不能进行计数？ 提示　图B为稀释涂布平板法接种培养。稀释涂布平板法会进行等比稀释，在合适的稀释倍数下，均匀涂布得到的菌落互不接触，可以确定菌类的密度，再通过计算可以得知原液的菌落数；而平板划线法最开始的划线很可能菌类会长成一片，导致无法计数，此外灼烧接种环时也会杀死一部分菌类。 2．在做分解尿素的细菌的筛选与统计菌落数目的实验时，A同学从对应的106倍稀释的培养基中筛选出大约150个菌落，但是其他同学在同样的稀释度下只选择出大约50个菌落。其他同学认为A同学的培养基被污染了或混入了其他的含氮物质，而A同学认为自己所选土样不同。你能否通过设置对照，帮助A同学排除上述两个可以影响实验结果的因素？ 提示　方案一：其他同学用与A同学相同的土样进行实验。若结果与A同学一致，则证明A同学无误；若结果不同，则证明A同学存在操作失误或培养基的配制不当等问题。 方案二：将A同学配制的培养基在不加土样的情况下进行培养，作为空白对照，以证明培养基是否受到污染或灭菌不彻底。 3．据如图所示信息，计算4号试管每克土样中分解尿素细菌的数目，思考为什么统计的活菌数目往往比实际数目低？ 提示　1.1×108个。当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落。 　纯化方法的比较 方法 平板划线法 稀释涂布平板法 混合平板法 主要步骤 接种环在固体培养基表面连续划线 系列梯度稀释操作和涂布平板操作 取稀释的少量菌悬液与50 ℃左右的培养基混合均匀倒入无菌培养皿中 接种工具 接种环 涂布器 － 能否用于计数 不能计数 可以计数，但是操作复杂，需涂布多个平板 － 培养结果 菌落仅在平板表面 菌落出现在平板表面和内部 共同点 都能将微生物分散到固体培养基表面，以获得单细胞菌落，达到分离纯化微生物的目的，也可用于观察菌落特征 3．(多选)稀释涂布平板法是微生物培养中的一种常用的接种方法。下列相关叙述错误的是(　　) A．操作中需要将菌液进行一系列的梯度稀释 B．需将不同稀释度的菌液分别涂布到液体培养基表面 C．不同浓度的菌液均可在培养基表面形成单个的菌落 D．操作过程中对培养基和涂布器等均需进行严格灭菌处理 答案　BC 解析　操作中需要将菌液进行一系列的梯度稀释，然后将不同稀释度的菌液分别涂布到固体培养基表面，进行培养；在稀释度足够高的菌液里，聚集在一起的微生物将被分散成单个细胞，从而能在培养基表面形成单个的菌落；操作过程中培养基和涂布器等均需进行严格灭菌处理。 4．将微生物接种到平板培养基上的方法主要有平板划线法和稀释涂布平板法等。下列相关叙述正确的是(　　) A．平板划线法只能用于微生物的分离纯化，稀释涂布平板法只能用于微生物的计数 B．平板划线法使用无菌接种针接种，稀释涂布平板法使用无菌涂布器涂布 C．采用两种方法接种后，通常需要在皿盖上注明相关信息 D．采用两种方法接种后，都需要将平板倒置放入恒温培养箱中培养 答案　D 解析　平板划线法和稀释涂布平板法均可用于微生物的分离纯化，但只有稀释涂布平板法能用于微生物的计数，A错误；平板划线法使用无菌接种环接种，稀释涂布平板法使用无菌涂布器涂布，B错误；采用两种方法接种后，通常需要在皿底上注明相关信息，C错误。 课时对点练　[分值：100分] 第1～8题，每题5分；第9～12题，每题6分，共64分。 题组一　平板划线法分离和纯化微生物 1．下列有关用平板划线法接种的操作，错误的是(　　) A．将接种环放在火焰上灼烧 B．用已冷却的接种环挑取菌体 C．挑取菌体和划线都要在火焰旁进行 D．接种环划线要将最后一区的划线与第一区的划线相连 答案　D 解析　划线时，不能将最后一区的划线与第一区的划线相连，D错误。 2．下列有关倒平板的操作，错误的是(　　) A．将灭过菌的培养皿放在火焰旁的桌面上 B．使打开的锥形瓶瓶口迅速通过火焰 C．将培养皿打开，培养皿盖倒放在桌面上 D．待培养基冷却到50 ℃左右时进行倒平板操作 答案　C 解析　倒平板时，培养皿的盖不能完全打开。 3．在酵母菌的纯化实验中，划线接种(图甲)、培养结果(图乙)如图，且图甲、乙的对应位置不变。下列有关叙述错误的是(　　) A．配制培养基时需进行湿热灭菌 B．连续划线的目的是获得单个酵母菌形成的菌落 C．图示接种过程中接种环至少灼烧了5次 D．图甲中a区域为划线的起始位置 答案　D 解析　由于每次使用接种环前后都要灼烧灭菌，从图甲中4次划线接种就可推断出，接种过程中接种环至少灼烧了5次，C正确；起始划线的区域长出的菌落多且密，根据甲、乙对应区域的对应位置对比，图甲中a区域为划线的结束位置，D错误。 题组二　稀释涂布平板法分离和纯化微生物 4．如图是从土壤中筛选具有较强降解磷能力菌株过程中的一些操作。下列相关叙述错误的是(　　) A．倒平板后的培养皿需进行灭菌 B．培养时培养皿的放置应如图乙中a所示 C．在火焰旁操作，可以防止杂菌污染 D．进行菌落计数时，一般选择菌落数在30～300的平板 答案　A 解析　培养基灭菌后再倒平板，倒平板后的培养皿不再进行灭菌，A错误；等待平板冷却凝固后，应将平板倒过来放置，如图乙中a所示，B正确。 5．用平板划线法或稀释涂布平板法都可以纯化大肠杆菌，二者的共同点有(　　) A．都需要使用接种环进行接种 B．接种后都需要进行湿热灭菌 C．都需要在酒精灯火焰旁进行接种 D．都可以用来计数活菌数 答案　C 解析　平板划线法采用接种环进行操作，而稀释涂布平板法采用涂布器进行操作，A错误；接种后不能再灭菌，B错误；接种时，要进行无菌操作，需要在酒精灯火焰旁接种，避免空气中的微生物混入培养基，C正确；稀释涂布平板法可以用来进行微生物的计数，而平板划线法不能，D错误。 6．研究小组利用稀释涂布平板法来探究某河流中大肠杆菌的数量。每一个浓度涂布四个平板，并且设置空白对照组。下列关于操作步骤的叙述，正确的是(　　) A．涂布前，将沾有少量酒精的涂布器在火焰上引燃，燃尽后还要冷却 B．涂布完成后，将培养皿倒置于室温培养1～2 d C．计算平板上的菌落数时，四个培养皿上的菌落数无论多少，都要全部平均 D．若空白对照组上有5个菌落，则实验组数据基础上减去5，以获得最准确数据 答案　A 解析　涂布完成后，将培养皿倒置于37 ℃恒温箱中培养1～2 d，B错误；计算平板上的菌落数时，应选择菌落数在30～300的平板进行计数，并取其平均值，C错误；若空白对照组上有5个菌落，说明培养基灭菌不彻底，需要重新进行实验，D错误。 题组三　土壤中分解尿素的细菌的分离与计数 7．下列与土壤中尿素分解菌的分离与计数实验相关的叙述，正确的是(　　) A．可以通过设置空白对照组来检验培养基是否受到了杂菌的污染 B．对样品中的尿素分解菌进行计数时可采用平板划线法进行接种 C．统计尿素分解菌的数目时应该选择菌落数多的培养基进行计数 D．空白对照组的培养基制备时不需要倒置 答案　A 解析　该实验可设置空白对照组，以检验培养基是否受到杂菌污染，同时也能确定培养基是否符合要求；对样品中的尿素分解菌进行计数时可采用稀释涂布平板法进行接种；统计尿素分解菌的数目时，选取菌落数为30～300的平板进行计数，求其平均值。 8．(2024·盐城高二期中)如图为能分解尿素的微生物的获取过程，下列有关叙述错误的是(　　) A．①②③的目的是选择能够分解尿素的微生物并且增加该微生物的数量 B．过程④需在酒精灯火焰旁进行，其中接种环一共需要灼烧6次 C．通过选择培养得到的不一定都是能够分解尿素的微生物，所以还需做进一步的鉴定 D．通过④获得纯种微生物后，再利用涂布平板法接种至试管斜面培养基上进行保存 答案　D 解析　过程④需在酒精灯火焰旁进行，以免造成污染，接种前后接种环均要进行灼烧灭菌，共接种5次，需要灼烧6次，B正确；通过选择培养得到的不一定都是能够分解尿素的微生物，比如有些微生物能利用尿素分解菌的代谢产物进行生长繁殖，所以还需根据菌落特征等做进一步的鉴定，C正确；斜面接种是常用的菌种传代和低温下保存菌种的方法，D错误。 9．(2022·江苏，3)下列是某同学分离高产脲酶菌的实验设计，不合理的是(　　) A．选择农田或公园土壤作为样品分离目的菌株 B．在选择培养基中需添加尿素作为唯一氮源 C．适当稀释样品是为了在平板上形成单菌落 D．可分解酚红指示剂使其褪色的菌株是产脲酶菌 答案　D 解析　农田或公园土壤中含有较多的产脲酶的微生物，A不符合题意；为了筛选可分解尿素的细菌，配制的培养基应选择尿素作为唯一氮源，能合成脲酶的微生物在该培养基上能生长，B不符合题意；当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌，C不符合题意；在细菌分解尿素的化学反应中，细菌合成的脲酶将尿素分解成氨，氨会使培养基的pH升高，酚红指示剂将变红，因此在以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂，能对分离的菌种做进一步鉴定，D符合题意。 10．(2024·镇江高二检测)幽门螺杆菌具有活性很高的脲酶，调查幽门螺杆菌感染可采用尿素呼气试验，用幽门螺杆菌的数量表示感染情况。现从待测人员体内采集样本并制成菌液后，按如下步骤进行分离培养，下列叙述正确的是(　　) ―→―→―→―→ A．灭菌之前应先将培养基的pH调节至中性或弱酸性 B．图中X步骤可以使用平板划线法或稀释涂布平板法 C．目的菌接种到培养基后应立即将倒置的平板放入30～37 ℃恒温箱中 D．培养基中加入的酚红指示剂使平板上有的菌落周围出现红色透明圈 答案　D 解析　幽门螺杆菌生活在人体胃液中，胃液为酸性环境(pH为1.5左右)，因此灭菌之前应先将培养基的pH调节至酸性，A错误；根据题意可知，用幽门螺杆菌的数量表示感染情况，因此图示接种方法应能统计幽门螺杆菌的数量，图中X步骤为接种，需用稀释涂布平板法才能计数，B错误；目的菌接种到培养基后，待涂布的菌液被培养基吸收后，才能将平板倒置，C错误；幽门螺杆菌含有脲酶，脲酶将尿素分解成氨，氨会使培养基的pH升高，因此如果在培养基中加入酚红指示剂，若有幽门螺杆菌，则菌落周围会出现红色透明圈，D正确。 11．(多选)(2021·江苏，18)为提高一株石油降解菌的净化能力，将菌涂布于石油为唯一碳源的固体培养基上，以致死率为90%的辐照剂量诱变处理。下列叙述不合理的是(　　) A．将培养基分装于培养皿中后灭菌，可降低培养基污染的概率 B．涂布用的菌浓度应控制在30～300个/mL C．需通过预实验考察辐射时间对存活率的影响，以确定最佳诱变时间 D．挑取培养基上长出的较大单菌落，纯化后进行降解效率分析 答案　AB 解析　培养基应先灭菌再分装于培养皿中，A不合理；涂布时所用菌液一般为0.1 mL，平板上的菌落数目应介于30～300个，涂布用的菌浓度应控制在300～3 000个/mL，B不合理；需通过预实验考察辐射时间对存活率的影响，再进行正式实验，以确定最佳诱变时间，C合理；石油降解菌能分解石油获得碳源，形成菌落，挑取培养基上长出的较大单菌落，纯化后进行降解效率分析，以获得能高效降解石油的菌种，D合理。 12．(多选)酵母菌的纯化培养过程中，完成稀释涂布平板后，将接种后的平板和一个未接种的平板倒置，放入28 ℃左右的恒温箱中培养。下列相关叙述正确的是(　　) A．用未接种的平板共同培养，其目的是检验培养过程中是否有杂菌污染 B．完成稀释涂布平板接种后，需将平板倒置后放入恒温箱中 C．倒置培养有利于减少水分蒸发，避免杂菌污染，方便观察计数 D．上述培养结束后若出现了不同形态、大小的菌落，可能的原因是接种环未灼烧 答案　ABC 解析　用未接种的平板共同培养，可以检验培养过程中是否有杂菌污染，若有污染，则平板上会有微生物生长，A正确；将培养皿倒置培养有利于减少水分蒸发，防止冷凝水滴落冲散单菌落，避免杂菌污染，方便观察计数，C正确；稀释涂布平板法中用不到接种环，D错误。 13．(14分)酵母的蛋白质含量可达自身干重的一半，可作为饲料蛋白的来源。有些酵母可以利用工业废甲醇作为碳源进行培养，这样既可减少污染又可降低生产成本。研究人员拟从土壤样品中分离该类酵母，并进行大量培养。如图所示为操作流程，请回答下列问题： (1)配制培养基时，按照培养基配方准确称量各组分，将其溶解、定容后，调节培养基的__________，及时对培养基进行分装，并进行______________灭菌。 (2)取步骤②中不同梯度的稀释液加入标记好的无菌培养皿中，在步骤③中将温度约___________(填“25 ℃”“50 ℃”或“80 ℃”)的培养基倒入培养皿混匀，冷凝后倒置培养。 (3)挑取分离平板中长出的单菌落，按步骤④所示进行划线。下列叙述合理的有________(多选)。 a．为保证无菌操作，接种针、接种环使用前都必须灭菌 b．划线时应避免划破培养基表面，以免不能形成正常菌落 c．挑取菌落时，应挑取多个菌落，分别测定酵母细胞中甲醇的含量 d．可以通过逐步提高培养基中甲醇的浓度，获得甲醇高耐受株 (4)步骤⑤中，为使酵母数量迅速增加，培养过程中需保证充足的营养和________供应。为监测酵母的活细胞密度，将发酵液稀释1 000倍后，经等体积台盼蓝染液染色，用25×16型血球计数板计数5个中格中的细胞数，理论上________色细胞的个数应不少于____________个，才能达到每毫升3×109个活细胞的预期密度。 答案　(1)pH　湿热(高压蒸汽)　(2)50 ℃　(3)a、b、d　(4)氧气　无　30 解析　(1)配制培养基时，按照培养基配方准确称取各组分之后，溶解定容，再调节培养基的pH，一般情况下，采用湿热灭菌法对培养基进行灭菌。(3)在对酵母菌进行划线纯化时，为保证无菌操作，接种针、接种环使用前都必须灭菌；且在划线时应避免划破培养基表面，以免不能形成正常菌落；本实验是为了获得能以工业废甲醇作为碳源的酵母，故在实验过程中可以通过逐步提高培养基中甲醇的浓度，获得甲醇高耐受株。(4)酵母菌是兼性厌氧型真菌，在有氧条件下大量繁殖。酵母菌扩大培养时，需保证充足的营养和氧气供应。“用等体积台盼蓝染液染色”，即计数室中培养液体积实际只有0.1÷2＝0.05 mm3，设5个中方格中无色(活细胞不被台盼蓝染色)细胞数目为x个，则3×109＝x/5×25×1 000×1 000÷0.05，解得x＝30。 14．(22分)(2024·南通高二调研)饲养动物常用的植物饲料中含有难溶的植酸钙等物质，很难被动物吸收利用，还影响对其他营养物质的利用。若在饲料中添加植酸酶，则能催化植酸钙水解成为动物可以吸收利用的磷酸盐等。以下是科研人员从作物根部土壤中分离、计数产植酸酶菌株的过程示意图。请回答下列问题： (1)图示培养基中除了添加________________以外，应含有碳源、氮源、水、其他无机盐等基本营养物质。 (2)图1所示操作称为__________，该操作之前，培养基应该先__________。 (3)图2所示接种方法是________________，在操作过程中要利用的接种器具是__________。接种后，待菌液被培养基吸收后，再将培养皿__________，并在__________(填“皿底”或“皿盖”)做好标记。 (4)在3个平板上分别接入0.1 mL稀释液，经适当培养后，3个平板上菌落数分别是38、42、40，则1 g土壤中的活菌数约为__________个。统计菌落获得的菌落数比实际活菌数______(填“多”或“少”)，原因是________________________________________________。 (5)图3是科研人员利用不同于图2方法分离产植酸酶菌株的示意图。下列对其操作及结果的叙述错误的是__________(多选)。 A．每次划线前均需在酒精灯火焰旁蘸取菌液 B．划线时带有菌种的接种环不能插入培养基中 C．只有在5区域中才能得到所需菌落 D．整个过程需要对接种环进行6次灼烧 答案　(1)植酸钙、琼脂　(2)倒平板　灭菌　(3)稀释涂布平板法　涂布器　倒置　皿底　(4)4×108　少　当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落　(5)AC　 解析　(1)科研人员要从作物根部土壤中分离产植酸酶的菌株，所以培养基要添加植酸钙，按照图示，选用培养基应为固体培养基，应该加入琼脂。(2)图1所示操作称为倒平板，该操作之前，培养基应该先进行灭菌。(3)图2所示接种方法是稀释涂布平板法，在操作过程中要利用的接种器具是涂布器。接种后，待菌液被培养基吸收后，再将培养皿倒置，并在皿底做好标记。(4)将1 g土壤加入999 mL的无菌水中，再经过3次10倍的稀释，最后取0.1 mL进行涂布，则培养基上的活菌数已经进行106倍稀释，3个平板上菌落数分别是38、42、40，平均值为40，则1 g土壤中的活菌数约为40/0.1×106＝4×108(个)。该方法统计获得的菌落数比实际的活菌数低，因为当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落。(5)除第一次划线前需在酒精灯火焰旁蘸取菌液外，第二次划线从第一次划线的末端开始(即第二次之后的划线都从上次划线的末端开始)，A错误；在5个区域中，只要有单个活细菌，通过培养即可获得所需菌落，C错误。 学科网（北京）股份有限公司 $$