2025届高三生物一轮复习课件PCR技术拓展应用

PCR的应用 5’ 3’ 3’ 5’ 引物2 5’ 3’ 引物1 5’ 3’ R Q 荧光基团 淬灭荧光基团 探针 探针完整时，荧光基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收，不产生荧光； 1．实时荧光定量PCR技术检测病毒核酸 病毒感染的常规检测方法是通过实时荧光PCR鉴定。实时荧光PCR扩增目的基因，需额外添加荧光标记探针(一小段单链DNA，可与目的基因中部序列特异性结合)。 2 3 4 PCR定点突变技术 反向PCR技术 PCR技术拓展应用 PCR技术拓展应用 重叠延伸PCR 大引物PCR 清楚两种PCR的大致过程，能看懂图示作答 过程 意义 5’ 3’ 3’ 5’ 引物2 5’ 3’ 引物1 5’ 3’ R Q 荧光基团 淬灭荧光基团 探针 探针完整时，荧光基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收，不产生荧光； 1．实时荧光定量PCR技术检测病毒核酸 荧光基团R连接在探针的5’端 3 3 4 5’ 3’ 3’ 5’ 引物2 5’ 3’ 引物1 5’ 3’ R Q 荧光基团 淬灭荧光基团 探针 在PCR过程中，DNA聚合酶沿模板利用酶的外切酶活性将与目的基因结合的探针降解，报告基团与淬灭基团分离，报告基团发出荧光。 1．实时荧光定量PCR技术检测病毒核酸 4 3 4 5’ 3’ 3’ 5’ 引物2 5’ 3’ 引物1 5’ 3’ R 荧光基团 淬灭荧光基团 探针 Q 1．实时荧光定量PCR技术检测病毒核酸 该反应体系中并未加入ATP，但新链的合成需要消耗能量，解旋的能量来自于高温，聚合的能量来自于原料。 在PCR过程中，DNA聚合酶沿模板利用酶的外切酶活性将与目的基因结合的探针降解，报告基团与淬灭基团分离，报告基团发出荧光。 每扩增一次，就有一个荧光分子产生。 5 1．实时荧光定量PCR技术检测病毒核酸 荧光强度主要与扩增次数、病毒初始数量 通过实时荧光PCR检测某冠状病毒感染时，检测到的荧光强度变化如图乙，荧光到达预先设定阈值的循环数(Ct值)越小，说明病毒核酸浓度越高。 荧光扩增曲线图中平台期出现的原因： 试剂盒中的原料、引物、探针数量有限 在该反应中TaqDNA聚合酶有两个作用，一是催化DNA子链的延伸，形成子链的磷酸二酯键，二是催化探针水解，破坏磷酸二酯键 √ 1.荧光定量PCR技术可定量检测样本中某种DNA的含量，其原理是在PCR体系中每加入一对引物的同时加入一个与某条模板链互补的荧光探针，当耐高温的DNA聚合酶催化子链延伸至探针处，会水解探针，使荧光监测系统接收到荧光信号，即每扩增一次，就有一个荧光分子生成。下列叙述错误的是(　　) A．引物与探针均具有特异性，与模板结合时遵循碱基互补配对原则 B．反应最终的荧光强度与起始状态模板DNA含量呈负相关 C．耐高温的DNA聚合酶催化DNA合成的方向总是从子链的5′端到3′端 D．若用上述技术检测某基因的转录水平，则需要用到逆转录酶 解析：引物与探针均具有特异性，与模板结合时遵循碱基互补配对原则，A正确； 模板DNA含量越高，PCR扩增过程中形成的荧光分子越多，荧光强度越大，即反应最终的荧光强度与起始状态模板DNA含量呈正相关，B错误； 耐高温的DNA聚合酶催化DNA合成的方向总是从子链的5′端到3′端，C正确； 若要用荧光定量PCR技术检测某基因的转录水平，即检测细胞中mRNA的含量，则先要将mRNA逆转录形成DNA再检测，故需要用到逆转录酶，D正确。 典例分析 2．荧光PCR法根据化学发光原理可以分为染料法和探针法。染料法中特殊染料本身不发光，但是当PCR扩增的时候，染料能够与DNA双链结合从而发光，如图1所示。探针法中除了引物外另外设置了一个探针，在探针的两端分别带上发光基团和淬灭基团，此时发光基团并不发光，但是当DNA通过引物合成的时候，探针被酶切降解释放出发光基团和淬灭基团，两种基团分开后产生荧光，如图2所示。下列说法不正确的是(　　) 典例分析 2．下列说法不正确的是(　　) A．两种方法均可用于目标DNA的定量分析 B．与染料法相比，探针法的特异性更强 C．通过适当延长引物长度和降低复性温度可提高荧光PCR的特异性 D．用荧光PCR法检测人体是否感染病毒前不一定要先进行逆转录 C 染料法中“染料能够与DNA双链结合从而发光”，探针法中“两种基团分开后产生荧光”，荧光强度和DNA含量成正相关，A正确。染料法中，染料不与单链DNA链结合，只要掺入DNA双链中就可以发光；探针法中，只有探针结合的片段上发生扩增才能发光，探针法的特异性更强，B正确。适当延长引物长度，和引物互补配对的特定DNA序列更长，能提高荧光PCR的特异性；降低复性温度，则引物和DNA序列更容易结合，可能发生错误配对，降低荧光PCR的特异性，C错误。检测人体是否感染病毒前不一定要先进行逆转录，D正确。 3.(2023·河北唐山一中高三模拟)“实时荧光定量qPCR”是新冠疫情防控的一把利刃，通常在1～2 h内即可得到检测结果。Taqman探针是实时荧光定量RT—PCR技术中的一种常用探针(如图1)，其5′端连接荧光基团(R)，3′端连接淬灭剂(Q)。当探针完整时，R发出的荧光信号被Q吸收而不发荧光。 (1)结合图1和图2分析，“荧光RT—PCR技 术”所用的试剂盒中通常都应该含有_____ ____酶、_____________酶、Taqman探针、引物、dNTP、Mg2＋、缓冲剂等。这种分子 录 逆转 TaqDNA聚合 层面的荧光RT—PCR检测具有特异性和灵敏性都很高的特点，主要与试剂盒中的_____、________ ______有关。 引物 Taqman 探针 典例分析 (2)根据Taqman探针功能分析，探针中碱基序列的设计应主要依据______________________ __________________________________________________。新冠病毒是冠状病毒大家庭中新 新冠病毒RNA内部的一 段序列(或新冠病毒RNA逆转录形成的DNA的部分序列) 的一员，其碱基序列与引起SARS的冠状病毒碱基序列有79.5%的相似性，与流感病毒碱基相似度也较高，因此在设计Taqman探针时应筛选出该病毒特有的序列，以避免_______(填“假阴性”或“假阳性”)的出现。 假阳性 (3)虽然荧光RT—PCR是当前被广泛认可的检测手段之一，但是不断有“假阴性”现象报道，通过上述过程分析，“假阴性”的可能原因有_____(填字母)。 a.通过咽拭子取样不规范或取样所获样本量不足 b.在样本运输、检测中出现了损坏和污染 c.病毒相应关键序列发生了基因突变 abc 典例分析 2．PCR定点突变——重叠延伸PCR技术 15 大引物PCR 拟突变位点 引物4 引物3 引物1 引物2 2．PCR定点突变——重叠延伸PCR技术 16 重叠延伸PCR 大引物PCR 拟突变位点 引物4 引物3 引物1 引物2 拟突变位点 引物1 引物2 PCR1 使用引物1和引物2 拟突变位点 引物4 引物3 PCR2 使用引物3和引物4 PCR定点突变技术 17 重叠延伸PCR 大引物PCR 拟突变位点 引物4 引物3 引物1 引物2 拟突变位点 引物1 引物2 PCR1 使用引物1和引物2 拟突变位点 引物4 引物3 PCR2 使用引物3和引物4 拟突变位点 引物1 引物2 第一次 第一次 拟突变位点 引物4 引物3 18 重叠延伸PCR 大引物PCR 拟突变位点 引物4 引物3 引物1 引物2 拟突变位点 引物1 引物2 PCR1 使用引物1和引物2 拟突变位点 引物4 引物3 PCR2 使用引物3和引物4 拟突变位点 引物1 引物2 第一次 第一次 拟突变位点 引物4 引物3 第二次 引物2 引物1 第二次 引物3 混合，变性后杂交 引物4 19 重叠延伸PCR 大引物PCR 拟突变位点 引物4 引物3 引物1 引物2 拟突变位点 引物1 引物2 PCR1 使用引物1和引物2 拟突变位点 引物4 引物3 PCR2 使用引物3和引物4 拟突变位点 引物1 引物2 第一次 第一次 拟突变位点 引物4 引物3 第二次 引物2 引物1 第二次 引物3 混合，变性后杂交 引物2 引物3 方案一： 引物1 引物4 引物4 方案二： Taq酶 Taq酶 Taq酶 Taq酶 引物4 引物1 分别带有引物1和引物4（非重叠）的杂交链才是我们需要的。 此处不需要引物 互为模板和引物 20 重叠延伸PCR 大引物PCR 拟突变位点 引物4 引物3 引物1 引物2 拟突变位点 引物1 引物2 PCR1 使用引物1和引物2 拟突变位点 引物4 引物3 PCR2 使用引物3和引物4 拟突变位点 引物1 引物2 第一次 第一次 拟突变位点 引物4 引物3 第二次 引物2 引物1 第二次 引物3 ? 引物2 引物3 方案一： 引物1 引物4 引物4 方案二： Taq酶 Taq酶 Taq酶 Taq酶 引物4 引物1 PCR3 引物4 引物1 使用引物1和引物4 大量 21 引物4 引物1 拟突变位点 引物4 引物3 引物1 引物2 突变前： 突变后： 引物3 ？ ？ 引物2 ？ ？ 互补 互补 GGGTTC突变成TTCGGG ① ② ③ ④ 引物2（①）的序列和突变后的序列④完全相同 怎么快速判断引物的碱基序列？ 22 2．PCR定点突变——重叠延伸PCR技术 G C 互为模板和引物 AT突变成GC 体系1 体系2 体系3 23 2024南昌一模试题（节选） 2024南昌一模试题（节选） mRNA: 5’ 3’ ACC UCU GUG 248 249 250 丝氨酸 5’ 3’ ACC ? ? ? GUG 248 249 250 丙氨酸 定点突变 2024南昌一模试题（节选） mRNA: 5’ 3’ ACC UCU GUG 248 249 250 丝氨酸 5’ 3’ ACC GCU GUG 248 249 250 丙氨酸 定点突变 DNA1: 3’ 5’ TGG AGA CAC DNA2: 5’ 3’ ACC TCT GTG 3’ 5’ TGG CGA CAC 5’ 3’ ACC GCT GTG 定点突变 TGG GA CAC C 5’ 3’ 3’ 5’ ACC CT GTG G 反向PCR技术 PCR技术拓展应用 PCR技术拓展应用 荧光定量PCR 2．PCR定点突变——重叠延伸PCR技术 重叠延伸PCR技术的主要设计思路是用具有互补配对片段的引物(图中的引物2和3，突起处代表与模板链不能互补的突变位点)，分别进行PCR，获得有重叠链的两种DNA片段，再在随后的扩增反应中通过重叠链的延伸获得想要的目的基因。如某科研团队运用重叠延伸PCR技术在水蛭素基因中的特定位点引入特定突变，使水蛭素第47位的天冬酰胺(密码子为AAC、AAU)替换为赖氨酸(密码子为AAA、AAG)，从而提高水蛭素的抗凝血活性。原理如下图所示。 DNA1: 3’ 5’ TTG TTA mRNA: 5’ 3’ AAC AAU DNA2: 3’ 5’ TTT TTC mRNA: 5’ 3’ AAA AAG 定点突变 G变T A变C A变T 27 典例分析 解析：DNA的合成方向是从子链的5′端向3′端延伸，据此可知，图中限制酶a和限制酶b的识别位点分别加在引物1和引物2的5′端，A错误；PCR反应体系中需要加入脱氧核苷酸、耐高温的DNA聚合酶和扩增缓冲液(含Mg2＋)等物质，B错误；第2轮PCR中，引物1与图中②结合形成两条链不等长的突变基因，C错误；在第3轮PCR结束后，会产生23＝8个DNA分子，其中含突变碱基对且两条链等长的DNA分子有两个，其他的DNA分子均是不等长的，故含突变碱基对且两条链等长的DNA分子所占的比例为1/4，D正确。故选D。 1.重叠延伸PCR是一种通过寡聚核苷酸链之间重叠的部分互相搭桥、互为模板，经过多次PCR扩增，获得目的基因的方法。该技术在扩增较长片段的DNA、不同来源的DNA片段拼接、基因的定点诱变等方面具有广泛的应用前景，下图表示利用重叠延伸PCR技术扩增某目的基因的过程。下列叙述错误的是(　　) A．引物中G＋C的含量越高，引物与模板DNA结合的稳定性越高 B．在第一阶段由于引物2和引物3发生碱基互补配对，因此两者置于不同反应系统中 置于不同体系原因是：引物2和引物3中存在互补配对的片段，置于同一反应体系中时，它们会发生结合而失去作用 典例分析 解析：DNA的合成方向是从子链的5′端向3′端延伸，据此可知，图中限制酶a和限制酶b的识别位点分别加在引物1和引物2的5′端，A错误；PCR反应体系中需要加入脱氧核苷酸、耐高温的DNA聚合酶和扩增缓冲液(含Mg2＋)等物质，B错误；第2轮PCR中，引物1与图中②结合形成两条链不等长的突变基因，C错误；在第3轮PCR结束后，会产生23＝8个DNA分子，其中含突变碱基对且两条链等长的DNA分子有两个，其他的DNA分子均是不等长的，故含突变碱基对且两条链等长的DNA分子所占的比例为1/4，D正确。故选D。 1.重叠延伸PCR是一种通过寡聚核苷酸链之间重叠的部分互相搭桥、互为模板，经过多次PCR扩增，获得目的基因的方法。该技术在扩增较长片段的DNA、不同来源的DNA片段拼接、基因的定点诱变等方面具有广泛的应用前景，下图表示利用重叠延伸PCR技术扩增某目的基因的过程。下列叙述错误的是(　　) C．引物1、2组成的反应系统和引物3、4组成的反应系统中均进行一次复制后，共产生4种双链DNA分子 D．在引物1、2组成的反应系统中，经第一阶段要形成图示双链DNA，至少要经过2次复制 √ 3种 2．幽门螺杆菌是一种常见的人类致病菌，其骨架蛋白MreB通过影响脲酶活性而参与调控其致病性。为了更准确地分离出MreB蛋白，用重叠延伸PCR技术(指在PCR的基础上，采用具有互补末端的引物，使PCR产物形成重叠链，通过重叠链的延伸，将不同来源的片段重叠拼接起来的一项技术)将幽门螺杆菌MreB基因中编码终止密码子前的DNA序列与TAP标签(可以标记幽门螺杆菌基因组中任何一个基因，且不会影响基因的表达)进行连接，构建了融合表达蛋白MreB和TAP标签的质粒，实验流程如下图所示。 (1)重组质粒的构建 ①为将带有标签的MreB基因定向插入pK18mobsacB质粒中，需要在引物末端添加限制酶识别序列，据图分析，在引物1末端添加的序列所对应的限制酶是________，在引物4末端添加的序列所对应的限制酶是_________。 SmaⅠ XhoⅠ 典例分析 典例3.利用重叠延伸PCR技术进行定点突变可以实现对纤维素酶基因进行合理性改造，其过程如下图所示。下列分析不正确的是（      ） A.PCR1过程中的产物AB是依赖引物a和引物b扩增的结果 B.引物c和引物b上均含有与模板链不能互补的碱基 C.①过程需要先加热至90 ℃以上后再冷却至50 ℃左右 D.②过程需要利用引物a和引物d获得突变产物AD D 典例分析 在第3轮PCR结束后，含突变碱基对且两条链等长的DNA占1/4(　　) √ 4．通过引物设计，运用PCR技术可以实现目的基因的定点诱变，如图为基因工程中获取突变基因的过程，其中引物1序列中含有一个碱基T不能与目的基因片段配对，但不影响引物与模板链的整体配对，反应体系中引物1和引物2分别设计增加限制酶a和限制酶b的识别位点。 典例分析 在第3轮PCR结束后，会产生23＝8个DNA分子，其中含突变碱基对且两条链等长的DNA分子有两个，其他的DNA分子均是不等长的，故含突变碱基对且两条链等长的DNA分子所占的比例为1/4。 拟突变位点 常规下游引物 突变上游引物 常规上游引物 PCR1 使用常规下游引物 和突变上游引物 3．PCR定点突变——大引物PCR技术 大引物PCR需要用到三条引物进行两轮PCR，这三条引物分别是突变上游引物、常规上游引物和常规下游引物。 拟突变位点 常规下游引物 突变上游引物 常规上游引物 大引物PCR PCR定点突变技术 PCR1 使用常规下游引物 和突变上游引物 常规下游引物 突变上游引物 第一次复制 3．PCR定点突变——大引物PCR技术 拟突变位点 常规下游引物 突变上游引物 常规上游引物 大引物PCR PCR定点突变技术 PCR1 使用常规下游引物 和突变上游引物 常规下游引物 突变上游引物 第一次复制 第二次复制 突变上游引物 常规下游引物 作为下一轮PCR的大引物 大引物是诱变引物的互补链 PCR体系1得到不完整的含有突变位点的DNA片段 不选另一条链作为大引物的原因是：以野生型DNA作为模板，另一条链作为大引物时无法延伸出新的子链。 拟突变位点 常规下游引物 突变上游引物 常规上游引物 大引物PCR PCR定点突变技术 PCR1 使用常规下游引物 和突变上游引物 常规下游引物 突变上游引物 第一次复制 第二次复制 突变上游引物 常规下游引物 作为下一轮PCR的大引物 PCR2 用原始的DNA模板使用常规上游引物和大引物 第一次复制 常规下游引物 大引物 拟突变位点 常规下游引物 突变上游引物 常规上游引物 大引物PCR PCR定点突变技术 PCR1 使用常规下游引物 和突变上游引物 常规下游引物 第一次复制 PCR2 使用常规上游引物和大引物 第一次复制 常规下游引物 大引物 第二次复制 大引物 常规上游引物 得到完整的含有突变位点的DNA片段。 大引物PCR PCR定点突变技术 典例分析 1.抗生素的长期使用易导致病菌产生严重的耐药性。抗菌肽以其快速杀菌活性、低耐药可能性、免疫调节特性和促进伤口愈合的潜力成为最有前景的抗菌药物。研究发现将抗菌肽第 52 位的脯氨酸(密码子为 CCA)替换成苏氨酸(密码子为 ACA)可增强抗菌肽的杀菌活性。科研人员利用大引物 PCR 定点诱变技术对抗菌肽基因进行改造的过程如图所示。 (1)将抗菌肽第52位的脯氨酸换成苏氨酸，需要将mRNA的对应碱基序列中第    位的碱基替换，且基因模板链对应的碱基改变为       。 154 G变为T 典例分析 【详解】A、第一轮PCR中，需要先合成一条链，再用这条链合成互补链，至少需要2个循环才能获得相应的大引物模板，A正确； B、第一轮产物作第二轮PCR扩增的大引物外，第二轮PCR仍需加入的引物是另一种侧翼引物，以便进行另一条链的延伸，B错误； C、若要使得目的基因可以表达出蛋白质，则需要在PCR扩增的定点诱变产物上具备启动子和终止子，诱导基因转录，C正确； D、为了使两轮PCR反应在同一支试管中进行，引物设计时应考虑不同的退火温度，第二轮PCR的退火温度应该比第一轮高，D正确。 故选B。   反向PCR技术 PCR技术拓展应用 PCR技术拓展应用 荧光定量PCR PCR定点突变技术 1.抗生素的长期使用易导致病菌产生严重的耐药性。抗菌肽以其快速杀菌活性、低耐药可能性、免疫调节特性和促进伤口愈合的潜力成为最有前景的抗菌药物。研究发现将抗菌肽第 52 位的脯氨酸(密码子为 CCA)替换成苏氨酸(密码子为 ACA)可增强抗菌肽的杀菌活性。科研人员利用大引物 PCR 定点诱变技术对抗菌肽基因进行改造的过程如图所示。 回答下列问题： (2)PCR过程中温度的控制至关重要，若变性时温度偏低则会导致反应效率降低，原因是                                             。 温度偏低时DNA 双链解旋不充分，延伸时模板减少，产生的产物量偏少 典例分析 【详解】A、第一轮PCR中，需要先合成一条链，再用这条链合成互补链，至少需要2个循环才能获得相应的大引物模板，A正确； B、第一轮产物作第二轮PCR扩增的大引物外，第二轮PCR仍需加入的引物是另一种侧翼引物，以便进行另一条链的延伸，B错误； C、若要使得目的基因可以表达出蛋白质，则需要在PCR扩增的定点诱变产物上具备启动子和终止子，诱导基因转录，C正确； D、为了使两轮PCR反应在同一支试管中进行，引物设计时应考虑不同的退火温度，第二轮PCR的退火温度应该比第一轮高，D正确。 故选B。   反向PCR技术 PCR技术拓展应用 PCR技术拓展应用 荧光定量PCR 1.抗生素的长期使用易导致病菌产生严重的耐药性。抗菌肽以其快速杀菌活性、低耐药可能性、免疫调节特性和促进伤口愈合的潜力成为最有前景的抗菌药物。研究发现将抗菌肽第 52 位的脯氨酸(密码子为 CCA)替换成苏氨酸(密码子为 ACA)可增强抗菌肽的杀菌活性。科研人员利用大引物 PCR 定点诱变技术对抗菌肽基因进行改造的过程如图所示。 (3)据图分析“大引物PCR 定点诱变”技术中设计的“诱变引物”应为        。 5’…CCTGTTAT…3’ 典例分析 (4)产物1最早出现在PCR1的第   轮循环；PCR2的产物除改良的抗菌肽基因外，还有               ；通过PCR3 快速扩增时应选用的引物是            。 3            引物1和引物2 诱变前的抗菌肽基因 典例分析 PCR定点突变技术 1.抗生素的长期使用易导致病菌产生严重的耐药性。抗菌肽以其快速杀菌活性、低耐药可能性、免疫调节特性和促进伤口愈合的潜力成为最有前景的抗菌药物。研究发现将抗菌肽第 52 位的脯氨酸(密码子为 CCA)替换成苏氨酸(密码子为 ACA)可增强抗菌肽的杀菌活性。科研人员利用大引物 PCR 定点诱变技术对抗菌肽基因进行改造的过程如图所示。 (5) In-Fusion酶能够识别任何具有15bp相同末端序列的线性DNA分子并使其形成黏性末端，实现目的基因和载体的连接。科研人员将载体(320bp)两端连接上与改良的抗菌肽基因:(180bp) 两端相同的序列(15bp) 并利用 In-Fusion酶实现两者的连接,如图所示。最终获得的重组DNA 分子长度为        。与传统方法相比，这种技术的优点是              ______________________。 插入位点不受限制酶识别序列限制；能够实现目的基因在载体任意位点上的插入；避免限制酶切割对质粒功能区的破坏等 500bp 典例分析 2．大引物PCR定点突变常用来研究蛋白质结构改变导致的功能变化。单核苷酸的定点诱变仅需进行两轮PCR即可获得，第一轮加诱变引物和侧翼引物，第一轮产物作第二轮PCR扩增的大引物，如图表示利用大引物PCR对基因M进行定点诱变，回答下列问题。 ①第一轮PCR中，至少需要___个循环才能获得相应的大引物模板。 ②扩增的定点诱变产物通常需具备_____ __________等结构才能进行转录 ③为了使两轮PCR在同一支试管中进行，设计引物时应考虑不同的复性温度( ) 1和2；3和4均可以和原始模板链结合，且1，2，3不互补，所以可以放在一个体系中 常规下游引物2 常规上游引物1 大引物 第二轮PCR为避免1，2结合模板，而3引物很长，可稳定结合，因此适当延长1长度，并提高退火温度 2 启动子 终止子 √ 3 4．反向PCR扩增已知序列两侧的未知序列 当DNA的某些序列已知，而需要扩增已知序列两端的未知序列时，可采用反向PCR技术。原理是用限制酶消化该DNA，随后使用DNA连接酶将获得的酶切产物环化，这样就获得了已知序列两侧携带有未知序列的环状DNA分子。以该已知序列为模板设计一对相反方向的特异性引物，该引物对已知序列反向，但对未知序列却是相向的，从而得以扩增出未知序列。原理如下图所示。 限制酶 DNA连接酶 PCR定点突变技术 PCR技术拓展应用 PCR技术拓展应用 荧光定量PCR 重叠延伸PCR 大引物PCR 清楚两种PCR的大致过程，能看懂图示作答 已知序列 未知序列 未知序列 用EcoRⅠ限制酶切割 已知序列 未知序列 未知序列 自身环化 4．反向PCR技术扩增已知序列两侧的未知序列 注意：限制酶不可用已知序列内部的限制酶，还要产生相同粘性末端 48 反向PCR技术 已知序列 未知序列 未知序列 用EcoRⅠ限制酶切割 已知序列 未知序列 未知序列 自身环化 引物1 引物2 引物3 引物4 引物1 引物2 引物3 引物4 反向连接选哪种引物？ 新形成的子链无法成环（PCR缺少DNA连接酶） 引物2 引物1 引物4 49 反向PCR技术 已知序列 未知序列 未知序列 用EcoRⅠ限制酶切割 已知序列 未知序列 未知序列 自身环化 引物1 引物2 引物3 引物4 反向连接选哪种引物？ 引物1 引物2 引物3 引物4 复制完后 展开成链状 复制完后 展开成链状 引物1 引物2 引物3 引物4 反向PCR技术 引物1和引物2 继续扩增 大量 引物3和引物4 继续扩增 大量 50 例：已知基因a的一条单链序列为 5‘—GCAATGCGTAGCCTCT…AACTATGCGCTCATGA­—3′ (虚线处省略了部分核苷酸序列)， （1）则在步骤Ⅲ中选用的PCR引物是__________。 A．5'—­AACTATGCGCTCATGA­—3′ B．5'—­TTGATACGCGAGTACT­—3′ C．5'­—GCAATGCGTAGCCTCT­—3′ D．5'­—AGAGGCTACGCATTGC—­3′ AD EcoRI D （2） 5．巢式PCR 首先将目标的DNA模板与第一套引物(外引物)结合。第一套引物也可能结合到其他具有相似结合位点的片段上并扩增多种产物。但只有一种产物是目的片段(图中未显示可能的多种产物)。然后使用第二套引物(内引物)对第一轮PCR扩增的产物进行第二轮PCR扩增。由于第二套引物位于第一轮PCR产物内部，而非目的片段包含两套引物结合位点的可能性极小，因此第二套引物不可能扩增非目的片段。这种巢式PCR扩增确保第二轮PCR产物几乎或者完全没有引物配对特异性不强造成的非特异性扩增的污染。原理如下图所示。 二 轮 专 题 复 习 √ 3．为减少引物与模板之间的非特异性配对，人们对普通PCR进行了改良，发明了巢式PCR，其原理是利用两套引物进行两轮PCR扩增。首先利用第一对引物(外引物)对目的基因所在的DNA进行第一轮扩增(经过15～30次循环)，第二轮扩增以第一轮扩增产物为模板，利用第二对引物(内引物或巢式引物)结合在第一轮扩增产物内部，经过15～30次循环，获得第二轮扩增片段(即目的基因)，最终第二轮扩增片段短于第一轮，基本过程如下图所示。下列叙述错误的是(　　) A．两对引物的碱基序列不相同，但均应为单链DNA片段 B．使用外引物至少经过3次循环，才能得到图示的第一轮扩增产物 C．若第一轮扩增产生错误片段，则其进入第二轮扩增的概率极低 D．与巢式PCR相比，普通PCR特异性更强，错误率更高 二 轮 专 题 复 习 解析：两对引物的碱基序列不相同，但均应为单链DNA片段，以便与模板互补配对，A正确； 根据DNA的半保留复制的特点，可知PCR前2次循环产生的四个DNA分子的两条链均不等长，第3次循环产生的DNA分子存在等长的两条核苷酸链，即仅含引物之间的序列，因此，至少经过3次循环才能得到图示的第一轮扩增产物，B正确； 由于内引物扩增模板是外引物扩增后的产物，第二轮反应能否进行，也是对第一轮反应正确性的鉴定，如果第一轮扩增产生了错误片段，那么第二轮能在错误片段上进行引物配对并扩增的概率极低，C正确； 巢式PCR中加入的组分与常规PCR相同，都含有模板、引物、耐高温的DNA聚合酶、四种游离的脱氧核苷酸、缓冲液、Mg2＋等，第一轮扩增中，外引物用以产生扩增产物，此产物在内引物的存在下进行第二轮扩增，从而提高反应的特异性，获得的产物特异性更强，D错误。 二 轮 专 题 复 习 1.临床上常采用RT-PCR技术(以mRNA为模板逆转录为cDNA，再进行PCR扩增)对受试者的咽拭子取样后进行新冠病毒核酸检测。 Q：利用RT-PCR技术获取的目的基因不能在物种间进行交流 × 判断物种间的基因交流主要依据为:一个物种的基因在另一个物种体内能否正常表达(即转录翻译出相应的蛋白质) .cDNA文库是根据mRNA序列进行逆转录而建立的，其中保存的基因在任何物种体内都能连续编码相应的氨基酸,从而合成出正常的蛋白质. (绝大多数生物共用一套遗传密码) .所以不同物种之间可以通过cDNA文库进行基因交流. 但是基因组文库是直接从一种生物体内提取DNA而建立的.而原核生物与真核生物的基因结构是不同的.原核生物的基因是连续的，全部都可以编码蛋白质.但真核生物的基因是不连续的,分为外显子和内含子.只有外显子才能编码蛋白质，而内含子是与外显子交错分布的. 由于真核生物的基因中,编码蛋白质的区域是不连续的.所以原核生物的基因在原核生物或真核生物之间都可以正常表达，从而可以进行物种间的基因交流.但是真核生物的基因只有在真核生物体内才能通过真核生物特有的机制正常表达,在原核生物体内不能正常表达.所以基因组文库只能进行部分物种间的基因交流.即原核-原核，真核-真核，原核-真核生物间可以交流，但真核-原核间不能交流. 2．(2024·武汉高三质检)IKK激酶参与动物体内免疫细胞的分化。临床上发现某重症联合免疫缺陷(SCID)患儿IKK基因编码区第1 183位碱基T突变为C，导致IKK激酶上第395位酪氨酸被组氨酸代替。为研究该患儿发病机制，研究人员利用纯合野生鼠应用大引物PCR定点诱变技术培育出SCID模型小鼠(纯合)，主要过程如图甲、乙所示，分析并回答下列问题： (1)在图甲获取突变基因过程中，需要以下3种引物： 引物A 5′—CCCAACCGGAAAGTGTCA—3′ (下划线字母为突变碱基) 引物B 5′—TAAGCTTCGAACATCCTA—3′ (下划线部分为限制酶HindⅢ识别序列) 引物C 5′—GTGAGCTCGCTGCCCCAA—3′ (下划线部分为限制酶SacⅠ识别序列) 则PCR1中使用的引物有____________，PCR2中使用的引物有______和图中大引物的____(填“①”或“②”)链。 引物A和引物B 引物C 　② (3)研究人员经鉴定、筛选获得一只转基因杂合鼠F0，并确认突变基因已经稳定同源替代IKK基因。利用杂合鼠F0，通过杂交获得SCID模型鼠，请将实验步骤补充完整； ①杂交亲本：________________，杂交得F1； ②________________得F2； ③提取F2每只小鼠的基因组DNA，采用分子生物学方法，利用IKK基因探针和突变基因探针进行筛选，则____________________________________ ______________________________________的为模型鼠。 F0×野生鼠 F1雌雄鼠随机交配 IKK基因探针检测未出现杂交带， 突变基因探针检测出现杂交带 3．在利用PCR扩增目的基因时，通常在引物一端添加限制酶识别序列，以便将目的基因连接到载体上。如图所示，TA克隆法可以将PCR产物直接连接到具有3′—T突出末端的载体上，这是因为普通Taq DNA聚合酶具有末端连接酶的活性，可在每个PCR扩增产物的3′端自动添加一个碱基，通常为A，这样扩增产物就可以与有3′—T突出末端的载体连接。高保真Taq DNA聚合酶可切掉PCR扩增过程中产生的错配碱基，保证扩增的准确性。 (1)PCR依据的原理是______________，该技术通常需要2种引物，引物的具体作用是_________________________________。 DNA半保留复制　 使DNA聚合酶能够从引物的3′端开始连接脱氧核苷酸 二 轮 专 题 复 习 (2)题述构建重组质粒的方法_______(填“需要”或“不需要”)限制酶，________ (填“需要”或“不需要”)DNA连接酶，原因是__________________________________________________________________________________________________。 需要　 PCR扩增产物的3′端有一个碱基A，T载体有3′—T突出末端，二者可以在DNA连接酶的作用下直接连接　 3．在利用PCR扩增目的基因时，通常在引物一端添加限制酶识别序列，以便将目的基因连接到载体上。如图所示，TA克隆法可以将PCR产物直接连接到具有3′—T突出末端的载体上，这是因为普通Taq DNA聚合酶具有末端连接酶的活性，可在每个PCR扩增产物的3′端自动添加一个碱基，通常为A，这样扩增产物就可以与有3′—T突出末端的载体连接。高保真Taq DNA聚合酶可切掉PCR扩增过程中产生的错配碱基，保证扩增的准确性。 不需要　 二 轮 专 题 复 习 解析：PCR扩增目的基因时在3′端开始添加脱氧核苷酸，所以通常在引物的5′端添加特定限制酶识别序列。基因工程中使用的载体除质粒外，还有噬菌体和动植物病毒等。依据题意，普通Taq DNA聚合酶具有末端连接酶的活性，可在每个PCR扩增产物的3′端自动添加一个碱基，通常为A，这样扩增产物就可以与有3′—T突出末端的载体在DNA连接酶的作用下直接连接，所以利用TA克隆法构建重组质粒不需要限制酶，需要DNA连接酶。 二 轮 专 题 复 习 3．在利用PCR扩增目的基因时，通常在引物一端添加限制酶识别序列，以便将目的基因连接到载体上。如图所示，TA克隆法可以将PCR产物直接连接到具有3′—T突出末端的载体上，这是因为普通Taq DNA聚合酶具有末端连接酶的活性，可在每个PCR扩增产物的3′端自动添加一个碱基，通常为A，这样扩增产物就可以与有3′—T突出末端的载体连接。高保真Taq DNA聚合酶可切掉PCR扩增过程中产生的错配碱基，保证扩增的准确性。 (3)高保真Taq DNA聚合酶不会使PCR扩增产物产生A尾，高保真PCR扩增后，如何加工才能进行TA克隆？__________________________________ ____________________________________________________。 先进行PCR产物回收，将其作为模板，再加入dATP、普通TaqDNA聚合酶等延伸一段时间 二 轮 专 题 复 习 $$